发明内容:
为了保护2岁以内的儿童免受伤寒的侵扰,制造一种可用于3月龄以上儿童及成人使用的伤寒/副伤寒疫苗是人群防病需要的。本发明即提供了一种这样的疫苗,本发明将纯化的伤寒/副伤寒外膜蛋白制成联合疫苗或单独的疫苗,疫苗成分为蛋白质,属T细胞依赖性抗原,动物实验表明,该疫苗可使受试动物产生高效价的中和抗体,能抵御致死剂量的同种细菌的攻击,再次加强免疫时,动物可产生较强的抗体回忆反应。
本发明所述的伤寒杆菌外膜蛋白可以用Tris-HCl缓冲液提取,也可以用含脱氧胆酸钠、Triton-100、或Zwittergent-3-14等表面活性剂的Tris-HCl缓冲液或其他适宜的缓冲液提取。与既往文献报道不同的是本发明在处理菌体的过程中不使用超声波、高压破碎机、或高速球磨机等设备的机械外力破坏菌体的细胞壁。本发明所使用的提取外膜蛋白的方法属于较温和的方法,不破坏细菌的细胞壁,细胞内容物也不会释放到提取液中,所提取的外膜蛋白中基本不含核酸等杂质的污染。
本发明的疫苗是通过以下方法制备的:
步骤1、细菌培养;
步骤2、杀菌,并收集菌体;
步骤3、从菌体提取外膜蛋白;
步骤4、提取液超滤,浓缩;得到外膜蛋白溶液;
步骤5、以得到的外膜蛋白溶液为原料,制备成疫苗。
具体可以采用以下步骤:
步骤1、
所述细菌选自伤寒沙门氏杆菌、甲型副伤寒沙门氏杆菌、乙型副伤寒沙门氏杆菌,培养步骤为:
将细菌接种于半固体琼脂斜面培养管中,培养过夜,转种于含液体培养基的三角瓶中,待培养至OD650=0.6~1.0时,转种到全自动发酵罐中,培养过程中和杀菌前取样进行细菌浓度测定及纯菌试验,涂片做革兰氏染色镜检,如发现污染杂菌,应废弃。培养物于对数生长后期/静止期前期收获。一般培养8-12小时为宜(根据菌种接种量及所用培养基种类而异)。
步骤2、
加入甲醛溶液杀菌,其最终浓度为0.5-2.0%(ml/ml)。杀菌后,离心收集菌体,弃掉上清液。菌体沉淀用含磷酸盐缓冲液的生理盐水洗涤两次,离心收集沉淀,得到菌体。
步骤3、
提取外膜蛋白采用下列方法中的任何一种均可。
方法(1)用100mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体,2-8℃搅拌24-72小时,离心收集上清液;
方法(2)用含0.1-0.5%脱氧胆酸钠的100mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体,2-8℃搅拌24-72小时,离心收集上清液;
方法(3)用含0.1-1.0% Triton的100mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体,2-8℃搅拌24-72小时,离心收集上清液;
方法(4)用含0.1-0.5% Zwittergent 3-14的100mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体,2-8℃搅拌24-72小时,离心收集上清液。
步骤4、
用截流分子量为30KD或100KD的超滤膜包超滤步骤3的离心上清液,浓缩,当浓缩至原体积的1/5时,加入4倍体积的Tris-HCl缓冲液,反复超滤浓缩4次,收集浓缩液,将以上外膜蛋白溶液分别用G3烧结玻璃滤器过滤,收集滤液,再用10~40mM的磷酸盐缓冲液透析或超滤,然后用GE Health Care公司的除热原填料除去热原物质,所收集的蛋白溶液用0.22μm的无菌滤膜过滤,即为纯化的外膜蛋白溶液。用Lowry法测定蛋白含量。
步骤5、
将步骤4的外膜蛋白溶液调整到适当的蛋白浓度,加入氢氧化铝佐剂后分装即可。
对于步骤3,优选的是首先使用缓冲液洗涤发酵培养的菌体,离心或过滤除去培养基中的蛋白成分,接着用Tris-HCl-EDTA或磷酸盐缓冲液等(pH6.0~8.5)重悬菌体,充分搅拌。离心后收集上清液,然后用30KD/100KD的超滤膜超滤所提取的上清液,收集浓缩液。其中所用的缓冲液中可以加入脱氧胆酸钠(DOC)、Triton-100、Zwittergent-3-14等表面活性剂,加入表面活性剂后可以明显提高外膜蛋白的得率。加入的各种表面活性剂可以通过透析或反复超滤除去。所述的外膜蛋白主要为分子量大于100KD的蛋白,约占溶液中总蛋白含量的50%以上,该外膜蛋白主要由10KD以上的蛋白质(或亚基)组成,且主要由10~65KD的菌体外膜蛋白质(或亚基)所形成。
以上方法启始原料所用细菌可以是伤寒沙门氏杆菌、甲型副伤寒沙门氏杆菌或乙型副伤寒沙门氏杆菌,不同细菌得到对应的外膜蛋白,如伤寒外膜蛋白,甲型伤寒外膜蛋白,乙型伤寒外膜蛋白。
以上得到的外膜蛋白可以根据需要制备成不同的疫苗,如伤寒外膜蛋白制成伤寒外膜蛋白疫苗,甲型伤寒外膜蛋白制成甲型伤寒外膜蛋白疫苗,乙型伤寒外膜蛋白制成乙型伤寒外膜蛋白疫苗。也可将他们结合制成联合疫苗。
联合疫苗可以是:
伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒三价联合疫苗,其中外膜蛋白浓度各10~100μg/ml,每剂含伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白各5-50μg/ml。
甲型/乙型副伤寒外膜蛋白二价联合疫苗,其中甲型/乙型伤寒外膜蛋白各10~100μg/ml,每剂含甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白各5-50μg/ml。
以上疫苗必要时可以加入氢氧化铝佐剂。
上述疫苗可以按照制剂学常规技术制备成疫苗制剂,如制备冷冻干燥的疫苗制剂。
制备不同的疫苗制剂可以采用以下方法:
将上述外膜蛋白溶液调整到适当的蛋白浓度(例如含伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白各10~100μg/ml),加入冻干稳定剂后混匀,每瓶分装量0.5ml,冷冻干燥,即为每剂含伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白各5~50μg的冻干疫苗。
将伤寒外膜蛋白溶液调整到适当的蛋白浓度(例如含伤寒外膜蛋白10~100μg/ml),加入冻干稳定剂后混匀,每瓶分装量0.5ml,冷冻干燥,即为每剂含伤寒外膜蛋白5~50μg的冻干疫苗。
将甲型、乙型副伤寒外膜蛋白溶液调整到适当的蛋白浓度(例如含甲型/乙型伤寒外膜蛋白各10~100μg/ml),加入冻干稳定剂后混匀,每瓶分装量0.5ml,冷冻干燥,即为每剂含甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白各5~50μg的冻干疫苗。
本发明的伤寒、甲型、乙型副伤寒外膜蛋白疫苗的使用方法为肌肉注射。本发明的疫苗适合于各年龄组的人使用,用于人群预防伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒的感染。
本发明的伤寒、甲型/乙型副伤寒外膜蛋白疫苗的主要成分不同于既往报道的伤寒外膜蛋白,以往报道的有关伤寒外膜蛋白免疫原性的研究主要是针对微孔蛋白A(分子量36/41KD)进行的,且在提取外膜蛋白的过程中均使用了超声波等机械手法破碎菌体,破碎的菌液中含细胞内的疏水性蛋白质,给后续的蛋白纯化带来了技术上的障碍,且一般多采用多次的超高速离心操作才能获得少量的外膜蛋白。采用本发明的方法制备的伤寒、甲型/乙型副伤寒外膜蛋白疫苗的主要成分为分子量在100~400KD的蛋白质复合体,该蛋白复合体由分子量在10~100KD之间的多种可溶性菌体外膜蛋白(或亚基)组成,该外膜蛋白复合体的直径在30~150nm之间,属于纳米级颗粒状蛋白复合体,动物实验的结果显示本发明的外膜蛋白疫苗在抵御超大致死剂量(约1000~2500LD50)的活菌攻击时,能很好的保护受试动物。采用本发明的方法制备的外膜蛋白复合体疫苗热原含量低于5EU/μg蛋白,极大的提高了疫苗使用的安全性。
具体实施方式:
以下通过实施例进一步说明本发明
实施例1
伤寒杆菌外膜蛋白的制备方法:
启开伤寒菌种,接种于半固体培养基,然后接种于3L种子培养基中,将培养瓶置37℃恒温摇床上,200转/分钟振摇,培养至A650=0.6~1.0时,转接到含30L培养基的50L全自动生物反应器中,培养至刚到对数生长期后(约8~12小时),加入终浓度至1%的甲醛溶液杀菌1小时,4℃、11000转/分钟离心,得伤寒菌体(约200~300克湿重),加入2000毫升100mM TRIS-HCl(pH7.5~8.5,含20mM EDTA)缓冲液溶解,电动搅拌机搅拌,转速约500转/分,搅拌30分钟,使菌体充分悬浮,然后加入2.5%脱氧胆酸钠(DOC)溶液500毫升,将转速调整到约250-300转/分,4℃搅拌24~72小时。
自4℃冷库中取出伤寒菌体悬液,4℃、11000RPM离心25分钟,收集离心后的上清液于一2500毫升玻璃瓶中,取样5毫升,备检(HPLC/SDS-PAGE)。加入1%的硫柳汞钠至终浓度约0.01%,4℃放置。
用截留分子量为100KD的超滤膜包超滤收集的离心上清液,当浓缩至500毫升左右时,加入2000毫升的Tris-HCl缓冲液,反复超滤浓缩4次,收集浓缩液,其中所含的主要为分子量大于100KD的外膜蛋白;将滤出液用10KD超滤膜浓缩至约1500毫升,此浓缩液中所含的主要为分子量在10-100KD的外膜蛋白。
将以上外膜蛋白溶液与GE Health Care公司的除热原填料混匀,G3烧结玻璃漏斗过滤凝胶颗粒,所收集的蛋白溶液中加入1%硫柳汞至终浓度0.01%,再用0.22μm的无菌滤膜过滤,即为纯化的外膜蛋白溶液。取样检定用Lowry法测定蛋白含量及进行HPLC检定。
HPLC检测结果表明100KD超滤膜浓缩液中伤寒外膜蛋白的分子量大约为200~400KD,为对称的单一峰型;12%还原型SDS-PAGE检测结果显示其主要为分子量在10~65KD的蛋白,约占70~80%,68KD分子量以上的蛋白约占15~20%,小于10KD的蛋白质约占5~10%。本结果提示在天然的状态下,这些外膜蛋白质分子(或蛋白亚基)间可能靠氢键或二硫键结合在一起,形成一免疫原性较强的高分子蛋白质复合体(见动物实验结果)。
HPLC检测结果表明10~100KD超滤膜浓缩液中伤寒外膜蛋白溶液出现3个主要的峰(分别约占总蛋白含量的58%、19%、15%),其含量最大的峰的分子量大约为250KD,为对称的单一峰型;12%还原型SDS-PAGE检测结果表明,其主要为分子量在10~65KD的蛋白,约占85~90%,68KD分子量以上的蛋白约占5%以内,小于10KD的蛋白质约占5~10%。
以上为采用含脱氧胆酸钠的缓冲液提取伤寒杆菌外膜蛋白的结果,除此之外,同时还进行了用两性表面活性剂Zwittergent-3-14、非离子型表面活性剂Triton-100及不加任何表面活性剂提取伤寒杆菌外膜蛋白的研究,结果显示不论采取何种提取液进行提取,其主要提取物均为分子量约在200~400KD的高分子物质(占蛋白总含量的40%以上)。用以上所述的各种提取液提取伤寒外膜蛋白时,外膜蛋白的获得量由高到低的顺序为Zwittergent-3-14>DOC>Triton-100>单纯的Tris-HCl缓冲液。
采用以上各种方法制备的伤寒杆菌外膜蛋白溶液中蛋白质复合体的直径主要分布在30-150nm之间。
实施例2
甲型副伤寒杆菌外膜蛋白的制备方法
启开甲型副伤寒菌种,接种于半固体培养基,然后接种于3L种子培养基中,将培养瓶置37℃恒温摇床上,200转/分钟,培养至A650=0.6~0.8时,转接到含30L培养基的50L全自动生物反应器中,培养至刚到对数生长期后(约8~14小时),加入终浓度至1.5%的甲醛溶液杀菌1小时,4℃、11000转/分钟离心,得伤寒菌体(约200~250克湿重),加入2000毫升100mM TRIS-HCl(pH7.5~8.5,含20mM EDTA)缓冲液溶解,电动搅拌机搅拌,转速约500转/分,搅拌30分钟,然后加入2.5% Zwittergen-3-14溶液500毫升,将转速调整到约250-300转/分,4℃搅拌24~72小时。
自4℃冷库中取出菌体悬液,4℃、8000RPM离心25分钟,收集离心后的上清液于一2500毫升玻璃瓶中,取样5毫升,备检(HPLC/SDS-PAGE)。加入1%的硫柳汞钠至终浓度约0.01%,4℃放置。
用截留分子量为30KD的超滤膜包超滤收集的离心上清液,当浓缩至1000毫升左右时,加入2000毫升的Tris-HCl缓冲液,反复超滤浓缩6次,收集浓缩液约2000毫升,其中所含的主要为分子量约为200KD以上的外膜蛋白复合物(HPLC检测含量大于60%)。
将以上外膜蛋白溶液与GE Health Care公司的除热原填料混匀,G3烧结玻璃漏斗过滤凝胶颗粒,所收集的蛋白溶液中加入1%硫柳汞至终浓度0.01%,再用0.22μm的无菌滤膜过滤,即为纯化的外膜蛋白溶液。该外膜蛋白溶液中蛋白质复合体的直径主要分布在30-150nm之间。
实施例3
乙型副伤寒杆菌外膜蛋白的制备方法
启开乙型副伤寒菌种,接种于半固体培养基,然后接种于3L种子培养基中,将培养瓶置37℃恒温摇床上,200转/分钟,培养至A650=0.4~0.8时,转接到含30L培养基的50L全自动生物反应器中,培养至刚到对数生长期后(约8~14小时),加入终浓度至1.5%的甲醛溶液杀菌1小时,4℃、11000转/分钟离心,得伤寒菌体(约200~300克湿重),加入2000毫升100mM TRIS-HCl(pH7.5~8.5,含20mM EDTA)缓冲液溶解,电动搅拌机搅拌,转速约500转/分,搅拌30分钟,然后加入2.5%脱氧胆酸钠(DOC)溶液500毫升,将转速调整到约250-300转/分,4℃搅拌48~72小时。自4℃冷库中取出菌体悬液,4℃、8000RPM离心25分钟,收集离心后的上清液于一2500毫升玻璃瓶中,取样5毫升,备检(HPLC/SDS-PAGE)。加入1%的硫柳汞钠至终浓度约0.01%,4℃放置。
用截留分子量为30KD的超滤膜包超滤收集的离心上清液,当浓缩至1500毫升左右时,加入4500毫升的Tris-HCl缓冲液,反复超滤浓缩4次,收集浓缩液,其中所含的主要为分子量约为200KD的外膜蛋白复合体(HPLC检测含量大于60%)。
将以上外膜蛋白溶液与GE Health Care公司的除热原填料混匀,G3烧结玻璃漏斗过滤凝胶颗粒,所收集的蛋白溶液中加入1%硫柳汞至终浓度0.01%,再用0.22μm的无菌滤膜过滤,即为纯化的外膜蛋白溶液。该外膜蛋白溶液中蛋白质复合体的直径主要分布在30-150nm之间。
实施例4
1、伤寒杆菌外膜蛋白动物免疫及攻击保护实验
SPF级BALB/c小鼠,体重16-18克,购自北京维通利华实验动物科技有限公司。于0、14天按表1标示的剂量皮下注射免疫动物,0.5ml/只,表中的OMP100代表用分子量100KD的超滤膜纯化的外膜蛋白内液,OMP10代表用分子量10~100KD超滤膜纯化的伤寒杆菌外膜蛋白。同时设伤寒Vi多糖疫苗(成都生物制品研究所)及生理盐水对照组。分别于第二次免疫后的第10天每只小鼠腹腔注射1×108个伤寒活菌进行攻击试验,于攻击后的当天、第1-10天观察动物的死亡情况。
表1、伤寒外膜蛋白免疫后攻击试验小鼠死亡情况
抗原类别 |
免疫剂量(μg/只) |
Balb/c小鼠 |
0天 |
1天 |
2天 |
10天 |
死亡总数 |
保护率(%) |
组号 |
性别 |
数量 |
上午 |
下午 |
OMP10 | 20 | 1 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 1 | 90 |
♀ |
5 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
10 | 2 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 1 | 90 |
♀ |
5 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
5 | 3 |
♂ |
5 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 | 1 | 90 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
OMP100 | 20 | 4 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
10 | 5 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
5 | 6 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
OMP10+佐剂 | 10 | 7 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
5 | 8 |
♂ |
5 |
1 |
0 |
0 |
0 |
0 | 2 | 80 |
♀ |
5 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
OMP100+佐剂 | 10 | 9 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
5 | 10 |
♂ |
5 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 | 5 | 50 |
♀ |
5 |
0 |
4 |
0 |
0 |
0 |
Vi多糖 | 5 | 11 |
♂ |
5 |
0 |
3 |
0 |
0 |
0 | 6 | 40 |
♀ |
5 |
0 |
3 |
0 |
0 |
0 |
OMP | 10 | 12 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| 5 | 13 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 1 | 90 |
♀ |
5 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
生理盐水对照 | 14 |
♂ |
5 |
0 |
4 |
1 |
- |
- | 10 | 0 |
♀ |
5 |
1 |
3 |
1 |
- |
- |
每只小鼠用1×108个伤寒活菌进行攻击试验后的动物死亡情况见表1,从表中的结果可以发现未加铝佐剂的伤寒OMP100的各组试验动物用伤寒杆菌攻击后均存活,对试验动物的保护率为100%;OMP10的各组试验动物用伤寒杆菌攻击后均出现1只死亡,对试验动物的保护率为90%;OMP 5μg组的保护率为90%,OMP10μg组的保护率为100%;加铝佐剂后的最低剂量组与不加铝佐剂的同剂量组相比,动物死亡数量较多,对动物的攻击保护不如未加铝佐剂组。伤寒外膜蛋白免疫后小鼠对抗伤寒杆菌攻击的效果明显优于伤寒Vi多糖疫苗组。
分别于免疫前、第2次免疫后7天、攻击试验后的第11天采集血液,分离血清,ELISA法测定血清抗伤寒外膜蛋白抗体的效价。加铝佐剂组动物免疫后的血清效价明显高于同剂量的不加佐剂组,结果见表2。
表2、伤寒外膜蛋白免疫后及活菌攻击后的血清抗体效价
抗原类别 |
免疫剂量μg/只 |
动物只数 |
抗体效价(GMT) |
备注(攻击后10天时存活动物只数) |
免疫前 |
2次免疫后7天 |
攻击后10天* |
OMP10 |
20 |
10 |
1.6 |
1131 |
6400 |
9 |
10 |
10 |
1.0 |
429 |
4703 |
9 |
5 |
10 |
1.0 |
325 |
2743 |
9 |
OMP100 |
20 |
10 |
1.6 |
2425 |
9700 |
10 |
10 |
10 |
1.0 |
1056 |
8445 |
10 |
5 |
10 |
1.6 |
348 |
2111 |
10 |
OMP10+佐剂 |
10 |
10 |
1.0 |
1600 |
11173 |
10 |
5 |
10 |
1.6 |
594 |
7611 |
8 |
OMP100+佐剂 |
10 |
10 |
1.0 |
2111 |
23886 |
10 |
5 |
10 |
1.0 |
1300 |
9700 |
5 |
Vi多糖 |
5 |
10 |
1.6# |
245# |
342# |
4 |
OMP |
10 |
10 |
1.0 |
1916 |
8925 |
10 |
5 |
10 |
1.0 |
342 |
2328 |
9 |
生理盐水 |
- |
10 |
- |
- |
- |
0 |
*血清抗体滴度依据备注中的动物数计算。
#Vi多糖抗体效价
2、甲型副伤寒杆菌外膜蛋白动物免疫及攻击实验
SPF级BALB/c小鼠,体重16-18克,购自北京维通利华实验动物科技有限公司。于0、14天按表3标示的剂量皮下注射免疫动物,0.5ml/只,同时设生理盐水对照组。
分别于第二次免疫后的第10天每只小鼠腹腔注射1×108个伤寒活菌进行攻击试验,于攻击后的当天、第1~10天观察动物的死亡情况,结果见表3。
每只小鼠用1×108个甲型副伤寒活菌进行攻击试验后的动物死亡情况见表3,从表中的结果可以发现未加铝佐剂的甲型副伤寒OMP的20、10μg剂量组试验动物攻击后均存活,对试验动物的保护率为100%;加氢氧化铝佐剂的疫苗对试验动物的保护性较差。
表3、甲型副伤寒外膜蛋白免疫后攻击试验小鼠死亡情况
抗原类别 |
免疫剂量(μg/只) |
Balb/c小鼠 |
0天 |
1天 |
2天 |
10天 |
死亡总数 |
保护率(%) |
组号 |
性别 |
数量 |
上午 |
下午 |
甲型副伤寒外膜蛋白 | 20 | 1 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
10 | 2 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
5 | 3 |
♂ |
5 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 | 1 | 90 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
2.5 | 4 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 | 3 | 70 |
♀ |
5 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
甲型副伤寒外膜蛋白+铝佐剂 | 20 | 5 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
10 | 6 |
♂ |
5 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 | 3 | 70 |
♀ |
5 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
5 | 7 |
♂ |
5 |
1 |
2 |
0 |
0 |
0 | 6 | 40 |
♀ |
5 |
2 |
1 |
0 |
0 |
0 |
2.5 | 8 |
♂ |
5 |
0 |
3 |
0 |
0 |
0 | 7 | 30 |
♀ |
5 |
1 |
3 |
0 |
0 |
0 |
生理盐水对照 | 9 |
♂ |
5 |
1 |
3 |
1 |
- |
- | 10 | 0 |
♀ |
5 |
2 |
3 |
- |
- |
- |
分别于免疫前、第2次免疫后7天、攻击试验后的第11天采集血液,分离血清,ELISA法测定血清抗伤寒外膜蛋白抗体的效价,结果见表4。从表中的结果可以看出,加铝佐剂的各组试验动物所产生的抗体效价较高。
表4、甲型副伤寒外膜蛋白免疫后及活菌攻击后的血清抗体效价
抗原类别 |
免疫剂量μg/只 |
动物只数 |
抗体效价(GMT) |
备注(攻击后10天时存活动物只数) |
免疫前 |
2次免疫后7天 |
攻击后10天* |
甲型副伤寒外膜蛋白 |
20 |
10 |
1.58 |
2425 |
14703 |
10 |
10 |
10 |
1.00 |
1970 |
9701 |
10 |
5 |
10 |
1.00 |
1131 |
5926 |
9 |
2.5 |
10 |
1.00 |
528 |
3533 |
7 |
甲型副伤寒外膜蛋白+铝佐剂 |
20 |
10 |
1.00 |
14703 |
20794 |
10 |
10 | 10 | 1.58 | 7325 | 12800 | 7 |
5 |
10 |
1.00 |
2785 |
10763 |
4 |
2.5 |
10 |
1.00 |
2111 |
8063 |
3 |
生理盐水 |
- |
10 |
- |
- |
- |
0 |
*血清抗体滴度依据备注中的动物数计算。
3、乙型副伤寒杆菌外膜蛋白动物免疫及攻击保护实验
SPF级BALB/c小鼠,体重16~18克,购自北京维通利华实验动物科技有限公司。于0、14天按表3标示的剂量皮下注射免疫动物,0.5ml/只,同时设生理盐水对照组。
分别于第二次免疫后的第10天每只小鼠腹腔注射1×108个乙型副伤寒活菌进行攻击试验,于攻击后的当天、第1-10天观察动物的死亡情况,结果见表5。
每只小鼠用1×108个乙型副伤寒活菌进行攻击试验后的动物死亡情况见表5,从表中的结果可以发现各未加铝佐剂的乙型副伤寒OMP的20、10μg剂量组试验动物攻击后均存活,对试验动物的保护率为100%;加氢氧化铝佐剂疫苗对试验动物的保护性较差。
表5、乙型副伤寒外膜蛋白免疫后攻击试验小鼠死亡情况
抗原类别 |
免疫剂量(μg/只) |
Balb/c小鼠 |
0大 |
1天 | 2天 |
10天 | 死亡总数 | 保护率(%) |
组号 |
性别 |
数量 |
上午 |
上午 |
乙型副伤寒外膜蛋白 | 20 | 1 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
10 | 2 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
5 | 3 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
2.5 | 4 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 2 | 80 |
♀ |
5 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
乙型副伤寒外膜蛋白+铝佐剂 | 20 | 5 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
10 | 6 |
♂ |
5 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 | 3 | 70 |
♀ |
5 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
5 | 7 |
♂ |
5 |
1 |
2 |
0 |
0 |
0 | 5 | 50 |
♀ |
5 |
1 |
1 |
0 |
0 |
0 |
2.5 | 8 |
♂ |
5 |
1 |
2 |
0 |
0 |
0 | 7 | 30 |
♀ |
5 |
1 |
3 |
0 |
0 |
0 |
生理盐水对照 | 9 |
♂ |
5 |
0 |
4 |
1 |
- |
- | 10 | 0 |
♀ |
5 |
2 |
3 |
- |
- |
- |
表6、乙型副伤寒外膜蛋白免疫后及活菌攻击后的血清抗体效价
抗原类别 |
免疫剂量μg/只 |
动物只数 |
抗体效价(GMT) |
备注(攻击后10天时存活动物只数) |
免疫前 |
2次免疫后7天 |
攻击后10天* |
乙型副伤寒外膜蛋白 |
20 |
10 |
1.58 |
2785 |
12800 |
10 |
10 |
10 |
1.00 |
2111 |
9701 |
10 |
5 |
10 |
1.00 |
1213 |
6400 |
10 |
2.5 |
10 |
1.00 |
706 |
5382 |
8 |
乙型副伤寒外膜蛋白+铝佐剂 |
20 |
10 |
1.00 |
15758 |
18102 |
10 |
10 |
10 |
1.58 |
9051 |
12800 |
7 |
5 |
10 |
1.00 |
4851 |
11143 |
5 |
2.5 |
10 |
1.00 |
3200 |
10159 |
3 |
生理盐水 |
- |
10 |
- |
- |
- |
0 |
*血清抗体滴度依据备注中的动物数计算。
分别于免疫前、第2次免疫后7天、攻击试验后的第11天采集血液,分离血清,ELISA法测定血清抗伤寒外膜蛋白抗体的效价,结果见表6。从表中的结果可以看出,加铝佐剂的各组试验动物所产生的抗体效价高于未加铝佐剂的试验组。
4、伤寒、甲型/乙型副伤寒杆菌外膜蛋白动物免疫及攻击保护实验
SPF级性BALB/c小鼠,体重16~18克,购自北京维通利华实验动物科技有限公司。于0、14、28天按表7标示的剂量皮下注射免疫动物,0.5ml/只,所标示的免疫剂量为含伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白各自的量,同时设4组生理盐水对照组。
伤寒、甲型/乙型副伤寒外膜蛋白免疫动物组,于第三次免疫后的第10天每只小鼠腹腔注射1.5×108个活菌(含伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒各5×107个)进行攻击试验,于攻击后的当天、第1-10天观察动物的死亡情况。
伤寒外膜蛋白、甲型伤寒外膜蛋白、乙型伤寒外膜蛋白免疫各组试验动物每只小鼠用5×107个同型活菌攻击,于攻击后的当天、第1-10天观察动物的死亡情况。各组试验动物的死亡情况见表7。
从表中的结果可以发现伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白联合免疫组各试验剂量(20、10、5、2.5μg)下的试验动物接受活菌攻击后均存活,对试验动物的保护率为100%。
表7、伤寒、甲型/乙型副伤寒外膜蛋白免疫后攻击试验小鼠死亡情况
抗原类别 |
免疫剂量*(μg/只) |
Balb/c小鼠 |
0天 |
1天 |
2天 |
10天 |
死亡总数 |
保护率(%) |
组号 |
性别 |
数量 |
上午 |
下午 |
伤寒、甲型/乙型副伤寒外膜蛋白 | 20 | 1 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
10 | 2 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
5 | 3 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
2.5 | 4 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
伤寒外膜蛋白 | 10 | 5 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
5 | 6 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
2.5 | 7 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 1 | 90 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
甲型副伤寒外膜蛋白 | 10 | 8 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
5 | 9 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
2.5 | 10 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
乙型副伤寒外膜蛋白 | 10 | 11 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
5 | 12 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 0 | 100 |
♀ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
2.5 | 13 |
♂ |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 | 2 | 80 |
♀ |
5 |
0 |
1 |
1 |
0 |
0 |
生理盐水对照 | 混合菌攻击 | 14 |
♂ |
5 |
1 |
2 |
2 |
- |
- | 10 | 0 |
♀ |
5 |
2 |
3 |
0 |
- |
- |
伤寒杆菌 | 15 |
♂ |
5 |
1 |
3 |
1 |
- |
- | 10 | 0 |
♀ |
5 |
2 |
3 |
0 |
- |
- |
甲型副伤寒 | 16 |
♂ |
5 |
1 |
2 |
2 |
- |
- | 10 | 0 |
♀ |
5 |
1 |
3 |
1 |
- |
- |
乙型副伤寒 | 17 |
♂ |
5 |
1 |
3 |
1 |
- |
- | 10 | 0 |
♀ |
5 |
2 |
3 |
0 |
- |
- |
*伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白各自的含量。
实施例5
伤寒、副伤寒外膜蛋白疫苗的制备
1、伤寒、甲型/乙型副伤寒外膜蛋白疫苗的制备
取已除菌过滤的伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白溶液,分别稀释成50~400μg/ml的蛋白溶液,按一定的比例混合后加入冻干保护剂,再加入磷酸盐缓冲液调整蛋白浓度在10~100μg/ml,每支分装0.5ml,冷冻干燥,所得制品即为每支含伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白各5~50μg的冻干疫苗。
取已除菌过滤的伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白溶液分别稀释成50~400μg/ml的蛋白溶液,按一定的比例混合后加入氢氧化铝/磷酸铝佐剂,再加入磷酸盐缓冲液调整各型的外膜蛋白浓度在10~100μg/ml,每支分装0.5ml,所得制品即为每支含伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白在5~50μg的铝佐剂吸附疫苗,该疫苗中铝佐剂对外膜蛋白的吸附率大于95%。
2、伤寒、甲型副伤寒外膜蛋白疫苗的制备
取已除菌过滤的伤寒、甲型副伤寒外膜蛋白溶液分别稀释成50~400μg/ml的蛋白溶液,按一定的比例混合后加入冻干保护剂,再加入磷酸盐缓冲液调整蛋白浓度在10~100μg/ml,每支分装0.5ml,冷冻干燥,所得制品即为每支含伤寒、甲型副伤寒外膜蛋白在5~50μg的冻干疫苗。
取已除菌过滤的伤寒、甲型副伤寒外膜蛋白溶液分别稀释成50~400μg/ml的蛋白溶液,按一定的比例混合后加入氢氧化铝/磷酸铝佐剂,再加入磷酸盐缓冲液调整各型的外膜蛋白浓度在10~100μg/ml,每支分装0.5ml,所得制品即为每支含伤寒、甲型副伤寒外膜蛋白在5~50μg的铝佐剂吸附疫苗,该疫苗中铝佐剂对外膜蛋白的吸附率大于95%。
3、伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白疫苗的制备
取已除菌过滤的伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白溶液分别稀释成50~400μg/ml的蛋白溶液,按一定的比例混合后加入冻干保护剂,再加入磷酸盐缓冲液调整蛋白浓度在10~100μg/ml,每支分装0.5ml,冷冻干燥,所得制品即为每支含伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白在5~50μg的冻干疫苗。
取已除菌过滤的伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白溶液分别稀释成50~400μg/ml的蛋白溶液,按一定的比例混合后加入氢氧化铝/磷酸铝佐剂,再加入磷酸盐缓冲液调整各型的外膜蛋白浓度在10~100μg/ml,每支分装0.5ml,所得制品即为每支含伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白在5~50μg的铝佐剂吸附疫苗,该疫苗中铝佐剂对外膜蛋白的吸附率大于95%。
4、甲型/乙型副伤寒外膜蛋白疫苗的制备
取已除菌过滤的甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白溶液,分别稀释成含50~400μg/ml的蛋白溶液,按一定的比例混合后加入冻干保护剂,再加入磷酸盐缓冲液调整蛋白浓度在10~100μg/ml,每支分装0.5ml,冷冻干燥,所得制品即为每支含甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白在5~50μg的冻干疫苗。
取已除菌过滤的甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白溶液分别稀释成50~400μg/ml的蛋白溶液,按一定的比例混合后加入氢氧化铝/磷酸铝佐剂,再加入磷酸盐缓冲液调整各型的外膜蛋白浓度在10~100μg/ml,每支分装0.5ml,所得制品即为每支含甲型副伤寒、乙型副伤寒外膜蛋白在5~50μg的铝佐剂吸附疫苗,该疫苗中铝佐剂对外膜蛋白的吸附率大于95%。
5、伤寒外膜蛋白疫苗的制备
取已除菌过滤的伤寒外膜蛋白溶液,稀释成含20~200μg/ml的蛋白溶液,按一定的比例加入冻干保护剂,再加入磷酸盐缓冲液调整蛋白浓度在10~100μg/ml,每支分装0.5ml,冷冻干燥,所得制品即为每支含伤寒外膜蛋白在5~50μg的冻干疫苗。
取已除菌过滤的伤寒外膜蛋白溶液,稀释成20~200μg/ml的蛋白溶液,按一定的比例加入氢氧化铝/磷酸铝佐剂,再加入磷酸盐缓冲液调整外膜蛋白浓度在10~100μg/ml,每支分装0.5ml,所得制品即为每支含伤寒外膜蛋白在5~50μg的铝佐剂吸附疫苗,该疫苗中铝佐剂对外膜蛋白的吸附率大于95%。
6、甲型副伤寒外膜蛋白疫苗的制备
取已除菌过滤的甲型副伤寒外膜蛋白溶液,稀释成含20~200μg/ml的蛋白溶液,按一定的比例加入冻干保护剂,再加入磷酸盐缓冲液调整蛋白浓度在10~100μg/ml,每支分装0.5ml,冷冻干燥,所得制品即为每支含甲型副伤寒外膜蛋白在5~50μg的冻干疫苗。
取已除菌过滤的甲型副伤寒外膜蛋白溶液,稀释成20~200μg/ml的蛋白溶液,按一定的比例加入氢氧化铝/磷酸铝佐剂,再加入磷酸盐缓冲液调整外膜蛋白浓度在10~100μg/ml,每支分装0.5ml,所得制品即为每支含甲型副伤寒外膜蛋白在5~50μg的铝佐剂吸附疫苗,该疫苗中铝佐剂对外膜蛋白的吸附率大于95%。
7、乙型副伤寒外膜蛋白疫苗的制备
取已除菌过滤的乙型副伤寒外膜蛋白溶液,稀释成含20~200μg/ml的蛋白溶液,按一定的比例加入冻干保护剂,再加入磷酸盐缓冲液调整蛋白浓度在10~100μg/ml,每支分装0.5ml,冷冻干燥,所得制品即为每支含乙型副伤寒外膜蛋白在5~50μg的冻干疫苗。
取已除菌过滤的乙型副伤寒外膜蛋白溶液,稀释成20~200μg/ml的蛋白溶液,按一定的比例加入氢氧化铝/磷酸铝佐剂,再加入磷酸盐缓冲液调整外膜蛋白浓度在10~100μg/ml,每支分装0.5ml,所得制品即为每支含乙型副伤寒外膜蛋白在5~50μg的铝佐剂吸附疫苗,该疫苗中铝佐剂对外膜蛋白的吸附率大于95%。