CN101820891A

CN101820891A - 一种卡介菌多糖核酸提取物及其制备方法

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Publication number: CN101820891A
Application number: CN200780053623A
Authority: CN
Inventors: 宁云山; 关继峰
Original assignee: Hunan Jiuzhitang Siqi Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Hunan Siqi Biopharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2007-12-14
Filing date: 2007-12-14
Publication date: 2010-09-01
Anticipated expiration: 2027-12-14
Also published as: CN101820891B; WO2009079822A1

Abstract

提供了一种卡介菌多糖核酸提取物。在提取物中，水分含量小于10％(W/W)，多糖含量为70-78％(W/W)，核酸含量为12-20％(W/W)，残留的卡介菌菌体蛋白含量为0-0.5％(W/W)，苯酚的残留量为零以及杂菌数为0-20个/克。还提供了一种卡介菌多糖核酸提取物的制备方法，包括以下步骤：对卡介菌进行培养；采用物理方法破碎培养物获得卡介菌多糖核酸混悬液；使用热酚法及高速离心法处理卡介菌多糖核酸混悬液获得卡介菌多糖核酸混合物；通过凝胶柱层析法从卡介菌多糖核酸混合物分离出卡介菌多糖核酸提取液；以及纯化卡介菌多糖核酸提取液以获得卡介菌多糖核酸提取物。

Description

一种卡介菌多糖核酸提取物及其制备方法技术领域本发明涉及生物制药领域。具体说，本发明涉及一种多糖核酸提取物及其制备方法。背景技术卡介菌为牛型减毒结核菌，无致病性，有免疫原性，用卡介菌接种代替结核菌初次感染而获得对结核病的免疫力，是目前世界上应用最广泛的菌苗之一。

1882年， Robert成功分离出结核杆菌，确定了肺结核的病原菌。 1908 年，法国巴斯德研究所的 Calnette和 Guerin成功培育出一株弱毒牛型结核杆菌，并命名为卡介菌（BCG)。 1921年， Wdll-Halle成功地将该菌应用于人体，防治结核病。 1971年，长沙防治气管炎研究组首先采用死卡介菌划痕法防治慢性支气管炎、哮喘、风湿性关节炎取得了较好的效果。

1987年，湖南九芝堂斯奇生物制药有限公司（原长沙神箭制药厂）与长沙市医工所合作在湖南医科大学著名呼吸道疾病专家谭礼智教授研究的基础上，进行了卡介菌（BCG)提取物的研究，采用热酚法去掉菌体蛋白质，再用乙醇沉淀提取菌体多糖和核酸及少量的蛋白质混合物而制成，在临床应用上取得了显著的效果。 1994年湖南九芝堂斯奇生物制药有限公司与中国生物制品检定所合作，改进工艺，提高质量标准，进一步降低了本制品的副反应，研制成新一代的卡介菌提取物，并使该产品进入了 95 版、 2000版《中国生物制品规程》，并命名为卡介菌多糖核酸注射液，该制剂为多糖核酸及蛋白混合物，其中多糖为 70%〜80%左右，核酸为 10%〜 20%, 菌体蛋白含量小于 1%左右。自从卡介菌多糖核酸注射液上市以后，就成为临床应用研究的热点。国内临床研究表明，卡介菌多糖核酸注射液具有广泛的免疫调节作用，除了能增强人体细胞免疫功能外，还具有双向免疫调节作用。在预防和治疗感冒、哮喘、变应性鼻炎等呼吸道疾病及湿疹、荨麻疹、扁平疣、寻常疣、尖锐湿疣等皮肤疾病有较好的疗效。

目前已上市的卡介菌多糖核酸注射液是通过从卡介菌培养经热酚法提取的精制卡介菌多糖核酸提取物配置而成，现行的精制卡介菌多糖核酸提取物质量标准和工艺按 2000版《中国生物制品规程》执行。 2000版《中国生物制品规程》规定的精制卡介菌多糖核酸提取物质量标准为：该制剂为多糖、核酸及蛋白混合物，其中多糖为 70%〜80%左右，核酸为 10%〜 20%，卡介菌菌体蛋白含量小于 1%，杂菌数不超过为 100个 /克。符合上述质量标准的卡介菌多糖核酸提取物虽然能用于人体，但因其仍存在一定量的杂质，所以存在一定的副作用，例如由于原精制卡介菌多糖核酸提取物中含有较高比例的卡介菌菌体蛋白和杂菌，相对人体而言，卡介菌菌体蛋白和杂菌是异源抗原或毒性物质，可引起较强的免疫排斥反应和毒性反应，表现为临床上使用该制剂时常出现病人注射部位发生严重溃烂，同时约有 5-10%的病人出现发烧现象，少数病人出现严重的过敏反应。

原精制卡介菌多糖核酸提取物的生产工艺中，有一步关键工艺为 "透析"，主要目的是通过透析以除去料液中的苯酚及其他小分子物质。该工艺存在自身无法克服的缺点：（1 )该工艺为手工操作，工艺技术原始落后，造成精制卡介菌多糖核酸提取物中残留的卡介菌菌体蛋白和苯酚的残留较高，影响产品的安全性；（2)工艺不稳定，造成精制卡介菌多糖核酸提取物批间差异大；（3 )生产周期长、生产效率低，（4)生产过程中料液易受污染，杂菌数常常超过规定范围，造成不合格批次大量出现，影响产品质量和成本；（5) 由于生产过程需要使用高浓度苯酚，该透析工艺为手工操作且生产周期长，因此给操作者造成的危害较大。

苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能。吸入高浓度苯酚蒸气可致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等。误服引起消化道灼伤，出现烧灼痛，呼出气带酚味，呕吐物或大便可带血液，有胃肠穿孔的可能，可出现休克、肺水肿、肝或肾损害，出现急性肾功能衰竭，可死于呼吸衰竭。眼接触可致灼伤。可经灼伤皮肤吸收经一定潜伏期后引起急性肾功能衰竭。

因此，需要提供一种新的制备卡介菌多糖核酸提取物的工艺，其不仅能克服上述工艺的缺点，而且能提供质量较高、副作用较小的卡介菌多糖核酸提取物。发明内容本发明的一个目的是提供一种质量较高、副作用较小的卡介菌多糖核酸提取物。本发明的另一个目的是提供一种制备该卡介菌多糖核酸提取物的方法，该方法具有自动化程度高、生产周期短、生产工艺稳定、劳动强度低、生产环境更安全等特点。

为达以上目的，本发明一方面提供一种卡介菌多糖核酸提取物，其含有多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和质量百分含量小于 10% (W/W) 的水分，其特征在于：多糖质量百分含量为 70-78% (W/W), 核酸质量百分含量为 12-20% (W/W),残留的卡介菌菌体蛋白质量百分含量为 0-0.5% (W/W), 苯酚的残留量为零。优选地，其中的杂菌数为 0-20个 /克。

本发明另一方面还提供一种制备卡介菌多糖核酸提取物的方法，该方法包括以下步骤：

(a) .对卡介菌进行培养，并收获卡介菌培养物；

(b) .釆用物理方法对上述卡介菌培养物进行破碎，得到卡介菌多糖核酸混悬液；

(c) .利用加 30-100°C苯酚结合高速离心法对上述卡介菌多糖核酸混悬液进行处理，得到卡介菌多糖核酸混合物；

(d) .通过凝胶柱层析法对上述卡介菌多糖核酸混合物进行分离，得到卡介菌多糖核酸提取液，从该卡介菌多糖核酸提取液中进一步分离得到卡介菌多糖核酸提取物。

优选地，上述步骤 (b)中所述的物理方法选自超声、研磨、机械捣碎、高速匀浆中的一种或多种；上述步骤 (c)最好可以包括：向卡介菌多糖核酸混悬液中加入 0.5-2.0 倍体积 30-100°C苯酚并充分搅拌，然后采用高速离心法对所得混悬液进行分离，所得上清液即为卡介菌多糖核酸混合物；其中，在向卡介菌多糖核酸混悬液中加入 0.5-2.0倍体积 30-100°C苯酚并充分搅拌之后、采用高速离心对所得混悬液进行分离之前，还可以先使混悬液自然沉降，吸取上清液，然后再采用高速离心对吸取的上清液进行进一步分离，所得上清液即为卡介菌多糖核酸混合物。

上述步骤 (d)中所述通过凝胶柱层析法对上述卡介菌多糖核酸混合物进行处理优选采用工业化凝胶过滤层析介质，利用凝胶过滤柱层析方法对经 30-100°C苯酚和高速离心处理的卡介菌多糖核酸混合物进行分离。上述工业化凝胶过滤层析介质应该能用于工业化或大规模生产，该类凝胶介质应能长期耐受 100°C以下、质量浓度小于或等于 70%的苯酚，该类凝胶介质的分离范围优选为 0.1KD-1000KD; 所述凝胶柱层析优选为分子排阻层析，更优选地为 GH-25凝胶介质。

此外，上述步骤 (d)中所述从卡介菌多糖核酸提取液中进一步分离得到卡介菌多糖核酸提取物可以包括：对该卡介菌多糖提取液进行醇沉，收集沉淀物，沉淀物洗涤后干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物。更具体地说，该工艺可以为：向卡介菌多糖核酸提取液中加入乙醇进行醇沉，含醇量为 70-75%重量，自然沉淀后收集沉淀物，沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均勾、离心洗涤 2-5次，然后用乙醚洗涤离心 2-5次后，放至干燥器干燥，干燥物即为精制卡介菌多糖核酸提取物。

本发明的^ J备方法，与原透析工艺相比，其主要优点如下-

( 1 )工艺自动化程度高、生产周期明显缩短：新工艺从上样、分离、收集、洗脱均由系统自动完成，系统可自动完成数据记录、存储、图谱绘制等，便于对生产全过程进行监控，同时由于工艺自动化程度高，原三天完成的除酚工艺，新方法只需 5个小时就可完成。

(2) 工艺稳定，质量明显提高：由于新工艺自动化程度高，从而保证了精制卡介菌多糖核酸提取物批间差异大大减少，同时，由于新工艺不仅能完全除去料液中的苯酚，而且可有效去除了部分卡介菌杂蛋白，从而明显提高精制卡介菌多糖核酸提取物质量，提高了终产品的安全性；

(3)解决了原生产工艺中料液易受污染的难题：原有的透析工艺是料液用透析袋包扎好之后以自来水进行流水透析，时间也很长，料液被污染的几率很大；而新工艺自动化程度高料液从上样到收集都是在一个相对密闭的条件下进行的，几乎不会受到污染。

(4) 减少苯酚对操作者的伤害：原透析法基本是采用手工操作，操作者受苯酚的危害几率大，而新工艺为全自动操作，操作者只需用电脑进行监控即可，无疑很大程度上减少了苯酚对操作者的危害。

本发明提供的卡介菌多糖核酸提取物与公知技术所得的卡介菌多糖核酸提取物相比，质量较高、副作用较小。具体实施方式以下通过具体实施例和试验结果详细介绍本发明的创新和应用意义所在，以帮助阅读者更好地理解利用的精神和实质，但不构成对本发明实施范围的限定。实施例一卡介菌的培养和收获

1. 菌体培养：将液体低温保藏的菌种（中国卡介苗制备用卡介菌株 D2PB302, 中国药品生物制品检定所）室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基， 37°C连续培养 14-20天；或在 37°C连续培养 15天后转种于改良的液体苏通培养基， 37°C连续培养 14-20天。

其中，马铃薯苏通培养基的制备方法可以是-

( 1 )取洗净新鲜土豆 (1个)，用穿刺器穿成圆柱，再用刀切成 4公分长斜面；用流动饮用水冲洗土豆斜面 1小时，再用纯化水冲洗土豆斜面块；用苏通培养基冲洗斜面块，取苏通培养基 20ml，加入 100ml灭菌大管中；

(2) 将冲洗后的土豆斜面放入装有苏通培养基的灭菌大管中；

(3) O.llMPa的大气压 121°C，灭菌 20分钟。放冷至室温待接种。苏通培养基配制比例:

每 1000ml :

0.5g 磷酸氢二钾 1.04g 味精 8.0g 枸橼酸 2.0g

甘油 60ml 10%柠檬酸铁铵 0.5ml 加纯化水至 000ml 水调至 pH8.0左右

2.菌体收集：待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，加入适量去离子蒸熘水洗涤，压干后称重。实施例二卡介菌多糖核酸混合物的制备

1.菌体破碎和热酚处理：将收集的菌体按 10： 1的比例加入纯化水，以组织捣碎勾浆机 (12000rpm/min)破碎菌体， 3 minx3次，将菌体捣碎，然后再加入破碎菌悬液 0.5-2.0倍体积量的热苯酚（30〜100°C )，在低速搅拌中保温 30分钟〜 1小时。

2.卡介菌多糖核酸混合物的提取：将热酚好的混合液自然沉淀 1〜10 天，吸取上清液，管式离心机高速离心后，上清经 0.45um无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合物。实施例三精制卡介菌多糖核酸提取物的制备

1.透析法精制卡介菌多糖核酸提取物

将卡介菌多糖核酸混合物人工装入透析袋 (截流分子量 >5000道尔顿）中在 100倍体积的纯化水中透析 7〜10天，每天更换透析池中纯化水，每天从透析袋中抽样检测苯酚残留量。将透析好的卡介菌多糖核酸混合物中加入适量乙醇使含醇量 60〜85%，自然沉淀 1〜10天后，沉淀物用无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤 3次。然后用乙醚洗涤离心 3次后，放至干燥器干燥，干燥 2〜5天即为精制卡介菌多糖核酸提取物。

2.凝胶柱层析法精制卡介菌多糖核酸提取物采用美国密里博（ LLIPORE)公司制造的 K- PRIME 40 II凝胶层析过滤系统和 GH-25凝胶介质进行卡介菌多糖核酸、苯酚及卡介菌蛋白的分离。该系统为国际上最先进的纯化分离系统，具有效率高、自动数据记录、存储、图谱绘制等特点，可以自动化对生产全过程进行监控。具体的制备过程如下：

( 1 )打开主机及监控电脑，将系统预热 20至 30分钟，并检查管道，柱体是否畅通完好，是否存在气泡。

(2)平衡：用 0.9%生理盐水以 lOOOmL/分钟经柱正向流动，直至柱前柱后电导、 PH—致时结束平衡过程。

(3 )上样：将卡介菌多糖核酸混合物经上样系统进行上样，上样速度为 600mL/分钟。

(4)洗脱：上样结束后，用 0.9%生理盐水以 800mL/分钟速度进行洗脱，采用紫外分光仪（波长采用 260 nm或 280nm)检测流出液，收集目的峰，将收集的目的峰通过 0.45um无菌滤器过滤，即为精制卡介菌多糖核酸提取液。

(5)清洗：洗脱后用注射用水对系统进行清洗直至柱前、柱后电导接近于零时为止。

(6)将所收集的精制卡介菌多糖核酸提取液进行醇沉，在精制卡介菌多糖核酸提取液中加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为 70-75%。自然沉淀 4天后，收集沉淀物。沉淀物通过无水乙醇充分搅泮均匀、离心洗涤 3 次，然后用乙醚洗漆离心 3次后，放至干燥器干燥，干燥物即为精制卡介菌多糖核酸提取物。实施例四两种方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物的检测通过原方法和本方法分别制备的九批精制卡介菌多糖核酸提取物按照 2000版《中国生物制品规程》和 2005版《中国药典》进行检测，结果如下表 1、表 2和表 3所示。表 1两种方法制备的三批精制卡介菌多糖核酸提取物检测结果

表 2两种方法制备的三批精制卡介菌多糖核酸提取物检测结果

表 3两种方法制备的三批精制卡介菌多糖核酸提取物检测结果

注 *表示按 2005版《中国药典》检测结果为阴性实施例五两种方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物的安全性评价一、急性毒性试验

1.试验目的

观察单次给予精制卡介菌多糖核酸对动物所产生的急性毒性反应和死亡情况。

2.药物与材料

2.1受试药物

两种方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物各三批，以生理盐水溶解、配制成适宜浓度。

2.2动物

昆明小白鼠（体重 18〜22 g)，雌雄各半，由中南大学实验动物学部提供。

3.试验方法

小鼠按性别体重随机分组，每组 10只。本方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物分别按 500 mg/kg, 1000 mg/kg和 2000 mg/kg三种不同剂量经腹腔或肌肉注射，注射量为 0.4 ml/20g。给药后连续观察 14天，记录动物异常病变与死亡数目；原方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物分别按 100 mg/kg, 200 mg/kg和 500 mg/kg三种不同剂量经腹腔或肌肉注射，注射量为 0.4 ml/20g。给药后连续观察 14天，记录动物异常病变与死亡数目。

4.结果

在 14天的观察期，所测试的两种方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物腹腔和肌肉注射所引起动物死亡及异常反应（见表 4和表 5)。结果表明：本方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物在小鼠腹腔和肌肉途径最小致死量均大于 2000 mg/kg;而原方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物在小鼠腹腔和肌肉途径最小致死量均为 100 mg/kg; 本方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物在小鼠腹腔和肌肉途径的最小致死量比原方法提高了 20倍，表明长期使用本方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物比原方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物更安全。表 4本方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物急性毒性试验

表 5 原方法制备的精制卡介茵多糖核酸提取物急性毒性试验

二、异常毒性试验

1.药物与材料

1.1 受试药物

本方法和原方法制备的卡介菌多糖核酸注射液共三批次，规格： 1.0 ml/支（以 0.5 mg本方法和原方法制备的精制卡介苗多糖核酸粉溶于 1 ml 生理盐水）。 1.2动物

昆明小白鼠（体重 18〜22 g)和豚鼠（体重 250〜350 g)，雌雄各半，由中南大学实验动物学部提供。

2.试验方法

按《中国生物制品规程》 2000年版中 "卡介菌多糖核酸制剂制造及检定规程 "中"生物制品异常毒性试验规程 "的实验要求进行试验。实验分为实验组和对照组，实验组和对照组各分为低剂量和高剂量两个组，小鼠每组 30只，每批样品 10只；豚鼠每组 15只，每批样品 5只。

实验组（低剂量组），每只小鼠腹腔注射本方法制备的卡介菌多糖核酸注射液样品 0.5 ml，每只豚鼠腹腔注射 5ml，观察 7天；实验组（高剂量组），每只小鼠腹腔注射本方法制备的卡介菌多糖核酸注射液样品 1.0 ml, 每只豚鼠腹腔注射 10ml，观察 7天。在观察期内，试验动物如全部健存，无异常反应，且到期每只动物体重增加，判为合格。

对照组（低剂量组），每只小鼠腹腔注射原方法制备的卡介菌多糖核酸注射液样品 0.5 ml, 每只豚鼠腹腔注射 5ml，观察 7天；实验组（高剂量组），每只小鼠腹腔注射原方法制备的卡介菌多糖核酸注射液样品 1.0 ml, 每只豚鼠腹腔注射 10ml，观察 7天。在观察期内，试验动物如全部健存，无异常反应，且到期每只动物体重增加，判为合格。

3.结果

在 7天的观察期，实验组低剂量组（L) 和高剂量组（H) 小鼠和豚鼠全部健存，未见异常反应。与给药前比较，给药后第 7天每只动物体重均增加，表明所测试的三批本方法制备的卡介菌多糖核酸注射液异常毒性

对照组低剂量组小鼠和豚鼠全部健存，未见异常反应，与给药前比较，给药后第 7天每只动物体重均增加，所测试的三批原方法制备的卡介菌多糖核酸注射液均无异常毒性；但高剂量组小鼠和豚鼠部分死亡，且体重均减少（见表 6和表 7);因此高剂量组所测试的三批原方法制备的卡介菌多糖核酸注射液出现异常毒性。上述结果表明：长期使用本方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物比原方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物更安全。

表 6两方法制备的卡介菌多糖核酸注射液对小鼠体重的影响小鼠体重 (g)

供试品

动物 1 动物 2 动物 3 动物 4 动物 5 本方法给药前 20 19 19 20 20

001 -L 给药后 28 29 22 28 25 本方法给药前 24 23 24 24 21

001-H 给药后 29 25 29 31 22 本方法给药前 22 19 19 19 19

002-L 给药后 28 25 25 26 26 本方法给药前 21 18 21 18 23

002-H 给药后 27 24 27 26 26 本方法给药前 24 24 24 24 24

003-L 给药后 36 28 33 25 31 本方法给药前 24 24 24 18 19

003-H 给药后 28 26 33 20 21 原方法给药前 19 18 19 21 19

001-L 给药后 21 22 23 27 23 原方法给药前 24 24 24 24 24

001-H 给药后死亡 22 21 死亡 22 原方法给药前 21 22 20 24 24

002-L 给药后 28 26 29 25 31 原方法给药前 24 18 23 24 20

002-H 给药后 22 死亡 20 20 19 原方法给药前 24 18 23 24 20

003-L 给药后 32 19 24 25 21 原方法给药前 24 18 23 24 20

003-H 给药后 22 15 死亡死亡 19 表 7两方法制备的卡介菌多糖核酸注射液对豚鼠体重的影响豚鼠体重 (g) 豚鼠体重 (g) 供试品 (批号） - 供试品 (批号） - 动物 1 动物 2 动物 1 动物 2 本方法给药前 300 344 原方法给药前 339 287

001-L 给药后 305 348 001-L 给药后 346 303 本方法给药前 314 344 原方法给药前 284 260

001 -H 给药后 320 353 001-H 给药后 268 死亡本方法给药前 350 268 原方法给药前 325 310

002-L 给药后 380 276 002-L 给药后 330 318 本方法给药前 340 317 原方法给药前 310 280

002-H 给药后 341 332 002-H 给药后死亡死亡本方法给药前 344 337 原方法给药前 305 308

003-L 给药后 366 340 003-L 给药后 312 320 本方法给药前 344 337 原方法给药前 344 337

003-H 给药后 366 340 003-H 给药后 320 死亡三、热原质试验

1.药物与材料

1.1 受试药物

原方法和本方法制备卡介菌多糖核酸注射液共三批次，规格： 1.0 ml/ 支（以 0.5 mg原方法和本方法制备的精制卡介苗多糖核酸粉溶于 1 ml生理盐水）。

1.2动物

健康家兔，体重 L8〜2.5 kg，雌雄各半，由中南大学实验动物学部提供。

2.试验方法

按《中国生物制品规程》 2000年版中"卡介菌多糖、核酸制剂制造及检定规程"中 "生物制品热源质试验规程"的实验要求进行试验。实验分为实验组 (以 0.5 mg本方法制备的精制卡介苗多糖核酸粉溶于 1 ml生理盐水)和对照组 (以 0.5 mg原方法制备的精制卡介苗多糖核酸粉溶于 l ml生理盐水)，实验组和对照组各分为低剂量和高剂量两个组，每组健康家兔 9只，每批样品 3只。

实验组和对照组低剂量组每批样品试验前用注射用生理盐水稀释成 0.1 mg/ml, 实验组和对照组高剂量组每批样品试验前用注射用生理盐水稀释成 0.25 mg/ml。每只动物按 0.1 mg/kg的剂量耳缘静脉缓慢注射预热至 38°C的稀释后样品 1 ml/kg，每隔 30分钟检测体温 1次，连测 6次。纪录每只动物的正常体温和给药后最高温度的差值（即为该兔的应答)，出现负值以零计算。如 3只兔升温均低于 0.60°C，并且 3只兔升温总和不超过 1.40°C，判为合格。

3、结果

实验前所有家兔体温稳定，两次测量体温相差均小于 0.2°C，且同组动物之间正常体温相差均小于 1.0°C。

实验组低剂量（L)和高剂量组（H)，各只动物的应答均低于 0.60°C，且同组 3只动物升温总和均小于 1.40°C。对照组低剂量组，各只动物的应答均低于 0.60°C，且同组 3只动物升温总和均小于 1.40°C，但高剂量组三只动物的体温均高于 0.80°C，其热源质判定不合格（结果见表 8)。

上述结果表明：长期使用本方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物比原方法制备的精制卡介菌多糖核酸提取物更安全。表 8两方法制备的卡介菌多糖核酸提取物热原质试验结果家兔的应答 CO

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家兔 1 家兔 2 家兔 3 总和本方法 001 -L 0.20 0.10 0.00 0.30 本方法 001-H 0.10 0.20 0.10 0.40 本方法 002-L 0.20 0.00 0.30 0.50 本方法 002-H 0 0.30 0.30 0.60 本方法 003-L 0.30 0.30 0.00 0.60 本方法 003-H 0.40 0.30 0.10 0.80 原方法 001-L 0.20 020 0.40 0.80 原方法 001-H 0.90 0.85 0.90 2.65 原方法 001-L 0.30 0.60 0.30 1.20 原方法 001-H 0.90 0.80 0.90 2.80 原方法 001-L 0.30 0.60 0.30 1.20 原方法 001-H 0.90 0.80 0.90 2.80

Claims

权利要求书

7P99123-PCT

1.一种根据权利要求所述方法得到的卡介菌多糖核酸提取物，含有多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和质量百分含量小于 10%的水分，其特征在于：多糖质量百分含量为 70-78%，核酸质量百分含量为 12-20%，残留的卡介菌菌体蛋白质量百分含量为 0-0.5%，苯酚的残留量为零。
2.根据权利要求 1所述的卡介菌多糖核酸提取物，其特征在于：其中的杂菌数为 0-20个 /克。
3. —种制备卡介菌多糖核酸提取物的方法，其特征在于包括以下步

(a) .对卡介菌进行培养，并收获卡介菌培养物；

(b) .采用物理方法对上述卡介菌培养物进行破碎，得到卡介菌多糖核酸混悬液；

(c) .利用加入 30-100°C苯酚结合高速离心法对上述卡介菌多糖核酸混悬液进行处理，得到卡介菌多糖核酸混合物；

(d) .通过凝胶柱层析法对上述卡介菌多糖核酸混合物进行分离，得到卡介菌多糖核酸提取液，从该卡介菌多糖核酸提取液中进一步分离得到卡介菌多糖核酸提取物。
4.根据权利要求 3所述的制备卡介菌多糖核酸提取物的方法，其特征在于：步骤 (b)中所述的物理方法选自超声、研磨、机械捣碎、高速匀浆中的一种或多种。
5.根据权利要求 3所述的制备卡介菌多糖核酸提取物的方法，其特征在于，步骤 (c)包括：向卡介菌多糖核酸混悬液中加入 0.5-2.0倍体积 30-100Ό苯酚并充分搅拌，然后采用高速离心法对所得混悬液进行分离，所得上清液即为卡介菌多糖核酸混合物。
6.根据权利要求 5所述的制备卡介菌多糖核酸提取物的方法，其特征在于：在向卡介菌多糖核酸混悬液中加入 0.5-2.0倍体积 30-100°C苯酚并充分搅拌之后、采用高速离心对所得混悬液进行分离之前，先使混悬液自然沉降，吸取上清液，然后再采用高速离心对吸取的上清液进行进一步分离，所得上清液即为卡介菌多糖核酸混合物。
7.根据权利要求 3所述的制备卡介菌多糖核酸提取物的方法，其特征在于：步骤 (d)中所述通过凝胶柱层析法对上述卡介菌多糖核酸混合物进行处理是指，采用工业化凝胶过滤层析介质，利用凝胶过滤柱层析方法对经 30-100°C苯酚和高速离心处理的卡介菌多糖核酸混合物进行分离。
8.根据权利要求 7所述的制备卡介菌多糖核酸提取物的方法，其特征在于：所述工业化凝胶过滤层析介质可应用于工业化或大规模生产，其耐受 100 °C以下、质量浓度小于或等于 70%的苯酚，分离范围为
9.根据权利要求 3所述的制备卡介菌多糖核酸提取物的方法，其特征在于：步骤 (d)中所述凝胶柱层析法为分子排阻层析法。
10.根据权利要求 9所述的制备卡介菌多糖核酸提取物的方法，其特征在于：所述工业化凝胶过滤层析介质为 GH-25凝胶介质。
11. 根据权利要求 3所述的制备卡介菌多糖核酸提取物的方法，其特征在于，步骤 (d)中所述从卡介菌多糖核酸提取液.中进一步分离得到卡介菌多糖核酸提取物包括：对该卡介菌多糖提取液进行醇沉，收集沉淀物，沉淀物洗涤后干燥，千燥物即为卡介菌多糖核酸提取物。
12.根据权利要求 11所述的制备卡介菌多糖核酸提取物的方法，其特征在于，步骤 (d)中所述从卡介菌多糖核酸提取液中进一步分离得到卡介菌多糖核酸提取物包括：向卡介菌多糖核酸提取液中加入乙醇进行醇沉，含醇量为 70-75%重量，自然沉淀后收集沉淀物，沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤 2-5次，然后用乙醚洗涤离心 2-5次后，放至干燥器干燥，干燥物即为精制卡介菌多糖核酸提取物。