CN104873971A

CN104873971A - 一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液

Info

Publication number: CN104873971A
Application number: CN201510311127.XA
Authority: CN
Inventors: 沈建军; 张秀文; 李阳
Original assignee: ZHEJIANG MIBOLERONE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ZHEJIANG MIBOLERONE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-06-09
Filing date: 2015-06-09
Publication date: 2015-09-02

Abstract

一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液，属于兽用生物制品技术领域。该稀释液每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖15～50g、中药黄酮20～60g、维生素5～10g、法氏囊素5～40mg，所述的中药多糖和中药黄酮从以下中药组合物中提取得到：连翘、拳参、贯众、大蓟、地榆、山豆根、羚羊角和紫花地丁。采用本发明稀释液稀释疫苗免疫机体后，能促进机体B淋巴细胞前体的分化、增殖，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B细胞产生和分泌抗体能力加强，从而可提高机体免疫力。

Description

一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液。

背景技术

猪瘟（CSF）是国际动物卫生组织（OIE）和中国的A类法定传染病，是我国强制性免疫的重大动物疫病之一，是危害我国养猪业的“第一杀手”。猪瘟是由猪瘟病毒引起的，无法用药物进行控制，疫苗免疫是最有效的办法。

目前国内外市售的猪瘟疫苗主要有猪瘟脾淋苗、猪瘟细胞苗以及猪瘟亚单位疫苗，但市场上猪瘟疫苗的主流产品仍然是猪瘟脾淋苗和猪瘟细胞苗。作为疫苗中的经典-精制猪瘟脾淋源活疫苗仍具有不可替代的作用。

猪瘟脾淋源活疫苗选用中国猪瘟兔化弱毒株（C株），该疫苗株能激发机体快速产生免疫力、遗传稳定、毒力不返强，是国际上公认的目前世界上最为安全有效的弱毒疫苗株。采用该毒株接种优良家兔，收获感染家兔的脾脏制成乳剂，与冻干保护剂混匀后经过冷冻真空干燥制成猪瘟脾淋源活疫苗。

目前市场认为猪瘟脾淋源活疫苗免疫效果不理想，对猪瘟脾淋活疫苗的认识仍存在误区，这主要和目前国内猪瘟脾淋源活疫苗使用方法不当、混合感染猪只免疫后应激过大，以及质量参差不齐等情况有关。

多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力，同时多糖也具有很好的耐热效果，多种实验表明中药多糖可作为耐热保护剂添加于活疫苗冻干保护剂中。

维生素是机体代谢中必不可少的有机化合物。机体犹如一座极为复杂的化工厂，不断地进行着各种生化反应。其反应与酶的催化作用有密切关系。酶要产生活性，必须有辅酶参加。已知许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子。因此，维生素是维持和调节机体正常代谢的重要物质。

黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类物质，也是自然界药用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。

法氏囊素(bursin，BS) 是从禽类特有的体液免疫中枢淋巴器官法氏囊(Bursa of fabricius) 中分离出来的一种活性三肽物质，其结构为L-Lys-His-Gly-NH2。研究表明，BS能促进禽类和哺乳动物B淋巴细胞前体的分化、增殖，能提高B细胞系Daudi细胞内第二信使cAMP和cGMP水平，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B细胞产生和分泌抗体能力加强。

基于上述背景技术，本发明提出一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液。该保护剂主要由中药多糖、中药黄酮、维生素、法氏囊素等组成。本发明所制备的疫苗稀释液一方面可以特异性的提高猪瘟脾淋疫苗的使用效果，同时还兼具了提高机体免疫力的功效。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液的技术方案，该稀释液能够大幅度提高了机体的免疫力，提高体液免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。

所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液，其特征在于该稀释液每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖15～50g、中药黄酮20～60g、维生素5～10g、法氏囊素5～40mg，所述的中药多糖和中药黄酮从以下中药组合物中提取得到：连翘、拳参、贯众、大蓟、地榆、山豆根、羚羊角和紫花地丁。

所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液,其特征在于该冻干保护剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖25～40g、中药黄酮30～50g、维生素6～8g、法氏囊素10～30mg。

所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液,其特征在于所述的中药多糖和中药黄酮通过以下步骤制得：

a、按连翘20～40份、拳参10～20份、贯众10～30份、大蓟10～30份、地榆10～30份、山豆根10～20份、羚羊角10～30份和紫花地丁10～20份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖，上清即为粗制中药黄酮；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按通过活性炭柱进行内毒素吸附，收集滤出液；

e、将d中上滤出液通过sevag法除去蛋白；

f、将e中中药多糖进行真空冷冻干燥制得中药多糖；

g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后经冷冻真空干燥制得中药黄酮。

所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液,其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织， pH7.2灭菌冷PBS洗净；按1：1比例加入pH 7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆；匀浆液中加入2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀；上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液；粗提液经冷冻真空干燥制得法氏囊素。

所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液,其特征在于所述的维生素包括D-生物素70～80mg、叶酸20～30mg、烟酰胺2～5g和维生素E 2～5g。

上述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液，设计合理，与传统的稀释液相比其具有以下优点：

1.采用本发明冻干疫苗稀释液在免疫注射时可以减少猪只疼痛感，降低猪只的应激反应。

2.采用本发明稀释液，可以大大提高活疫苗的使用效果，快速的产生中和抗体，减少免疫空档期，降低猪只发病几率，提高机体抵御疾病的能力。

3.采用本发明稀释液稀释疫苗免疫机体后，能促进机体B淋巴细胞前体的分化、增殖，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B细胞产生和分泌抗体能力加强，从而可提高机体免疫力。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

实施例1：中药多糖和中药黄酮的制备

a、按连翘20份、拳参20份、贯众10份、大蓟10份、地榆30份、山豆根10份、羚羊角10份和紫花地丁20份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到中药多糖；

g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，再经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。

该实施例中步骤a中可以称取连翘30份、拳参15份、贯众20份、大蓟15份、地榆20份、山豆根15份、羚羊角20份和紫花地丁10份进行加工，也可以称取按连翘40份、拳参10份、贯众30份、大蓟30份、地榆10份、山豆根20份、羚羊角30份和紫花地丁20份进行加工。

实施例2：法氏囊素的制备

a、取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织， PH7.2灭菌冷PBS洗净。

b、称量法氏囊重量，按1：1（W：V）比例加入PH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆。

c、匀浆液中加入2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀。

d、上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液即为法氏囊素粗提液。

e、将d中粗提液通过0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥制成法氏囊素冻干粉。

实施例3：一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液的制备

在每1000ml磷酸缓冲液中加入中药多糖25g、中药黄酮40g、维生素7g（D-生物素70mg、叶酸30mg、烟酰胺4g和维生素E 2.9g）、法氏囊素20mg，即得到猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液。其中中药多糖和中药黄酮按照实施例1中的步骤制得，法氏囊素按照实施例2中的步骤制得。磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟得到。

实施例4：一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液的制备

在每1000ml磷酸缓冲液中加入中药多糖35g、中药黄酮30g、维生素5g（D-生物素80mg、叶酸20mg、烟酰胺2g和维生素E 2.9g）、法氏囊素30mg，即得到猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂。其中中药多糖和中药黄酮按照实施例1中的步骤制得，法氏囊素按照实施例2中的步骤制得。磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟得到。

实施例5：一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液的制备

在每1000ml磷酸缓冲液中加入中药多糖50g、中药黄酮60g、维生素10g（D-生物素70mg、叶酸30mg、烟酰胺3.9g和维生素E 6g）、法氏囊素40mg，即得到猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂。其中中药多糖和中药黄酮按照实施例1中的步骤制得，法氏囊素按照实施例2中的步骤制得。磷酸缓冲液由氯化钠6～10g，氯化钾0.05～0.5g，磷酸氢二钠1～1.2g，磷酸二氢钾0.05～0.5g，氯化钙0.05～0.2g，含6个结晶水的氯化镁0.05～0.2g溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟得到。

实施例6：稀释液的使用方法及对比试验

1.猪瘟脾淋源病毒悬液制备

（1）接种家兔的选择

选择生长状况良好、体重1.5-3kg的家兔100只。

（2）接种

取生产用毒种，用上述病毒稀释液作适当稀释（如10^-1.5或10^-2），每只家兔耳静脉接种1ml。接种后家兔正常饲养。

（3）测温观察

家兔接种后，上、下午各测体温一次，24小时后，每隔6小时测体温一次。测温至72小时。

（4）收获

选择定型热和轻热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀，以无菌手术采取脾脏。

（5）病毒悬液制备及检验

在无菌操作下剔除脂肪组织。将脾脏组织称重、剪碎，于同一容器内混合研磨，然后滤过，测定病毒含量，脾毒对家兔的最小感染量应≤10^-5/ml。

2.疫苗制备

将无菌检验和病毒含量检测合格的病毒悬液，混合于同一灭菌容器内，按1:1（V:V）比例加入蔗糖牛奶保护剂，充分混匀后定量分装，经冷冻真空干燥制成猪瘟脾淋源冻干活疫苗。

3.稀释液使用效果

（1）按实施例3-5制备的3批稀释液，作为实验组。

（2）常规灭菌生理盐水稀释液作为对照组。

（3）取40头猪瘟抗体阴性健康仔猪，分为四组，1、2、3组为实验组，第4组为对照组。实验组疫苗稀释时采用本发明稀释液，对照组疫苗稀释时采用灭菌生理盐水，免疫后3天起采血检测其中和抗体效价，结果见表1。

表1 免疫比较结果

Claims

1.一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液，其特征在于该稀释液每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖15～50g、中药黄酮20～60g、维生素5～10g、法氏囊素5～40mg，所述的中药多糖和中药黄酮从以下中药组合物中提取得到：连翘、拳参、贯众、大蓟、地榆、山豆根、羚羊角和紫花地丁。

2.如权利要求1所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液,其特征在于该冻干保护剂每1000ml磷酸缓冲液中含有中药多糖25～40g、中药黄酮30～50g、维生素6～8g、法氏囊素10～30mg。

3.如权利要求1或2所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液,其特征在于所述的中药多糖和中药黄酮通过以下步骤制得：

e、将d中上滤出液通过sevag法除去蛋白；

f、将e中中药多糖进行真空冷冻干燥制得中药多糖；

4.如权利要求1或2所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液,其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织， pH7.2灭菌冷PBS洗净；按1：1比例加入pH 7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆；匀浆液中加入2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀；上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液；粗提液经冷冻真空干燥制得法氏囊素。

5.如权利要求1或2所述的一种猪瘟脾淋源活疫苗用稀释液,其特征在于所述的维生素包括D-生物素70～80mg、叶酸20～30mg、烟酰胺2～5g和维生素E 2～5g。