CN106620689A - 一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液 - Google Patents

一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液 Download PDF

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液，每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含以下中药多糖组分：桑叶多糖1‑8g、云芝多糖0.1‑5g、地黄多糖1‑5g和胸腺五肽0.1‑5g。本发明具有以下有益效果：一方面可以降低疫苗批次间的差异性，提高整体免疫水平，另一方面延长疫苗保护期，可大幅度提高猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的免疫效果。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起猪的一种高度接触性传染病，不同年龄、品种和性别的猪均可感染，该病以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道症状、免疫抑制、高感染率、高死亡率为特征的一种高致病性疫病。该病已给全球养猪业造成严重的经济损失。
为了有效地控制猪繁殖与呼吸综合征，国内已开发多种用于预防PRRS的疫苗。在PRRS活疫苗研制中，疫苗毒株、病毒培养条件和免疫增强剂是研发有效疫苗的关键，其中，添加免疫增强剂是提高疫苗效力的有效途径。疫苗稀释剂是指用于对疫苗进行稀释并用于免疫的试剂，不仅可以对疫苗进行稀释，还可以对疫苗有保护作用和提高疫苗的免疫效果。
PRRS活疫苗在使用时需要用疫苗稀释剂进行稀释，目前通常选用注射用水或生理盐水，但这样稀释出的疫苗，免疫效价整齐度不高，不同批次疫苗间的差异较大，且接种发病猪后存在应激反应和过敏反应，大大降低了PRRS活疫苗的免疫效果。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液，该稀释液可有效减少不同批次疫苗间的差异，提高疫苗抗体效价整齐度，减少接种发病猪的应激反应和过敏反应。
为解决上述技术问题，本发明包括磷酸盐缓冲液以及溶解于磷酸盐缓冲液的中药多糖组分，其中每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含以下中药多糖组分：桑叶多糖1-8g、云芝多糖0.1-5g、地黄多糖1-5g和胸腺五肽0.1-5g。
进一步的，作为优选本发明每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含以下中药多糖组分：桑叶多糖2-6g、云芝多糖0.5-2g、地黄多糖1-3g和胸腺五肽0.5-1g。
其中，本发明中所述桑叶多糖的制备包括以下步骤：
（1）将桑叶粉碎后过70-100目筛，得桑叶粉末，置于干燥环境中贮存备用；
（2）将步骤（1）中所得桑叶粉末按料液比1:20-50g/ml加入75-85℃水中浸提100-120min，每间隔20-30min搅拌一次；
（3）对步骤（2）中浸提完毕的料液进行过滤，收集滤液；对所得滤液进行减压浓缩得浓缩液，减压浓缩条件为：温度50-60℃，转速50r/min,真空度600-700mmHg；
（4）向步骤（3）中所得浓缩液中加入无水乙醇，于4℃冰箱中醇沉20-24h后，以5000-6000 r/min的转速离心15-20min，收集不溶物；
（5）利用无水乙醚对步骤（4）中所得不溶物浸洗5-8次，再加入蒸馏水，离心，收集澄清液；
（6）对步骤（5）中所得澄清液进行真空冷冻干燥，得桑叶多糖。
本发明中所述云芝多糖的制备包括以下步骤：
a. 将干燥的云芝碎片置于90-100℃水中煮提9-10h，过滤，收集滤液；
b．将步骤a中所得滤液浓缩至原体积的1/2，再加入3-4倍体积的95%乙醇，置于25-27℃环境中静置沉淀20-24h，得沉淀液；
c．将步骤b中所得沉淀液3000-4000r/min的转速离心15-20min，将所得沉淀物置于常温下干燥，即得云芝多糖。
本发明中所述地黄多糖的制备包括以下步骤：
A．称取地黄，按料液比1：30-40g/ml加入蒸馏水，加热至90-110℃，浸提2-3h，过滤，收集滤液；
B．将步骤A中所得滤液浓缩至原体积的1/3-1/2，用sevag试剂法除去蛋白，上清液加氯仿离心，水层加80%-90%乙醇沉淀，沉淀物分别用丙酮和乙醇洗涤2 次，真空干燥得地黄多糖。
本发明中所述pH=7的磷酸盐缓冲液的制备方法如下：
d．称取下列原料组分：氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g和六水氯化镁0.05-0.2g，混合均匀备用；
e．向步骤d中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
中药多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力。本发明所采用胸腺五肽购于浙江华尔成生物药业股份有限公司。
本发明的有益效果：
本发明所提供的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液包括配比科学合理的多糖组分，不仅可以降低疫苗批间差异性，提高整体免疫水平，还可以提高疫苗的免疫效果，延长疫苗保护期。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体说明，本发明中所述实施例仅用于说明解释本发明而不对本发明的范围构成限制。本发明中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
实施例1:
1、制备桑叶多糖，包括以下步骤：
（1）将桑叶粉碎后过70目筛，得桑叶粉末，置于干燥环境中贮存备用；
（2）将步骤（1）中所得桑叶粉末按料液比1:20g/ml加入75℃水中浸提120min，每间隔20min搅拌一次；
（3）对步骤（2）中浸提完毕的料液进行过滤，收集滤液；对所得滤液进行减压浓缩得浓缩液，减压浓缩条件为：温度50℃，转速50r/min，真空度600mmHg；
（4）向步骤（3）中所得浓缩液中加入无水乙醇，于4℃冰箱中醇沉20后，以5000 r/min的转速离心20min，收集不溶物；
（5）利用无水乙醚对步骤（4）中所得不溶物浸洗5次，再加入蒸馏水，离心，收集澄清液；
（6）对步骤（5）中所得澄清液进行真空冷冻干燥，得桑叶多糖。
2、制备云芝多糖的制备包括以下步骤：
a. 将干燥的云芝碎片置于90℃水中煮提10h，过滤，收集滤液；
b．将步骤a中所得滤液浓缩至原体积的1/2，再加入3倍体积的95%乙醇，置于25℃环境中静置沉淀20h，得沉淀液；
c．将步骤b中所得沉淀液3000r/min的转速离心20min，将所得沉淀物置于常温下干燥，即得云芝多糖。
3、制备地黄多糖的制备包括以下步骤：
A．称取地黄，按料液比1：30g/ml加入蒸馏水，加热至90℃，浸提3h，过滤，收集滤液；
B．将步骤A中所得滤液浓缩至原体积的1/3，用sevag试剂法除去蛋白，上清液加氯仿离心，水层加80%乙醇沉淀，沉淀物分别用丙酮和乙醇洗涤2 次，真空干燥得地黄多糖。
4、配制pH=7的磷酸盐缓冲液：
d．称取下列原料组分：氯化钠6g、氯化钾0.05g、磷酸氢二钠1g、磷酸二氢钾0.05g、氯化钙0.05g和六水氯化镁0.05g，混合均匀备用；
e．向步骤d中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
5、制备稀释液
f．称取中药多糖组分：桑叶多糖2g、云芝多糖0.5g、地黄多糖1g和胸腺五肽0.5g；
g．将步骤f中所称取的中药多糖组分依次加入1000ml pH=7的磷酸盐缓冲液中，振荡水化，过滤除菌，即得猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液。
实施例2：
1、制备桑叶多糖，包括以下步骤：
（1）将桑叶粉碎后过100目筛，得桑叶粉末，置于干燥环境中贮存备用；
（2）将步骤（1）中所得桑叶粉末按料液比1:50g/ml加入85℃水中浸提100min，每间隔30min搅拌一次；
（3）对步骤（2）中浸提完毕的料液进行过滤，收集滤液；对所得滤液进行减压浓缩得浓缩液，减压浓缩条件为：温度60℃，转速50r/min，真空度700mmHg；
（4）向步骤（3）中所得浓缩液中加入无水乙醇,于4℃冰箱中醇沉24h后，以6000 r/min的转速离心15min，收集不溶物；
（5）利用无水乙醚对步骤（4）中所得不溶物浸洗8次，再加入蒸馏水，离心，收集澄清液；
（6）对步骤（5）中所得澄清液进行真空冷冻干燥，得桑叶多糖。
2、制备云芝多糖的制备包括以下步骤：
a. 将干燥的云芝碎片置于100℃水中煮提9h，过滤，收集滤液；
b．将步骤a中所得滤液浓缩至原体积的1/2，再加入4倍体积的95%乙醇，置于25-27℃环境中静置沉淀24h，得沉淀液；
c．将步骤b中所得沉淀液4000r/min的转速离心15min，将所得沉淀物置于常温下干燥，即得云芝多糖。
3、制备地黄多糖的制备包括以下步骤：
A．称取地黄，按料液比1：40加入蒸馏水，加热至110℃，浸提2h，过滤，收集滤液；
B．将步骤A中所得滤液浓缩至原体积的1/2，用sevag试剂法除去蛋白，上清液加氯仿离心，水层加90%乙醇沉淀，沉淀物分别用丙酮和乙醇洗涤2 次，真空干燥得地黄多糖。
4、配制pH=7的磷酸盐缓冲液：
d．称取下列原料组分：氯化钠10g、氯化钾0.5g、磷酸氢二钠1.2g、磷酸二氢钾0.5g、氯化钙0.2g和六水氯化镁0.2g，混合均匀备用；
e．向步骤d中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
5、制备稀释液
f．称取中药多糖组分：桑叶多糖4g、云芝多糖2g、地黄多糖3g和胸腺五肽1g；
g．将步骤f中所称取的中药多糖组分依次加入1000ml pH=7的磷酸盐缓冲液中，振荡水化，过滤除菌，即得猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液。
实施例3：
1、制备桑叶多糖，包括以下步骤：
（1）将桑叶粉碎后过85目筛，得桑叶粉末，置于干燥环境中贮存备用；
（2）将步骤（1）中所得桑叶粉末按料液比1:35g/ml加入80℃水中浸提110min，每间隔25min搅拌一次；
（3）对步骤（2）中浸提完毕的料液进行过滤，收集滤液；对所得滤液进行减压浓缩得浓缩液，减压浓缩条件为：温度55℃，转速50r/min，真空度650mmHg；
（4）向步骤（3）中所得浓缩液中加入无水乙醇，于4℃冰箱中醇沉22h后，以550 r/min的转速离心18min，收集不溶物；
（5）利用无水乙醚对步骤（4）中所得不溶物浸洗6次，再加入蒸馏水，离心，收集澄清液；
（6）对步骤（5）中所得澄清液进行真空冷冻干燥，得桑叶多糖。
2、制备云芝多糖的制备包括以下步骤：
a. 将干燥的云芝碎片置于95℃水中煮提10h，过滤，收集滤液；
b．将步骤a中所得滤液浓缩至原体积的1/2，再加入4倍体积的95%乙醇，置于25℃环境中静置沉淀22h，得沉淀液；
c．将步骤b中所得沉淀液3500r/min的转速离心18min，将所得沉淀物置于常温下干燥，即得云芝多糖。
3、制备地黄多糖的制备包括以下步骤：
A．称取地黄，按料液液比1：35加入蒸馏水，加热至100℃，浸提3h，过滤，收集滤液；
B．将步骤A中所得滤液浓缩至原体积的1/2，用sevag试剂法除去蛋白，上清液加氯仿离心，水层加85%乙醇沉淀，沉淀物分别用丙酮和乙醇洗涤2 次，真空干燥得地黄多糖。
4、配制pH=7的磷酸盐缓冲液：
d．称取下列原料组分：氯化钠8g、氯化钾0.35g、磷酸氢二钠1.1g、磷酸二氢钾0.25g、氯化钙0.12g和六水氯化镁0.15g，混合均匀备用；
e．向步骤d中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
5、制备稀释液
f．称取中药多糖组分：桑叶多糖6g、云芝多糖2g、地黄多糖3g和胸腺五肽5g；
g．将步骤f中所称取的中药多糖组分依次加入1000ml pH=7的磷酸盐缓冲液中，振荡水化，过滤除菌，即得猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液。
免疫效果对比试验：
利用本发明实施例1至3所制备的3种不同批次（a、b、c）的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液分别将猪繁殖与呼吸综合征活疫苗稀释至1头份/ml，备用。将50头28日龄健康断奶仔猪分为五组，每组10头，A组注射实施例1制得的稀释液稀释后的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗1.0ml/头；B组注射实施例2制得的稀释液稀释后的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗1.0ml/头；C组注射实施例3制得的稀释液稀释后的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗1.0ml/头；D组注射用pH=7的磷酸盐缓冲液稀释后的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗1.0ml/头；E组作为空白对照组，注射pH=7的磷酸盐缓冲液1.0ml/头。各组均在首免第14 d 、21d、28d、35 d、45d、60d、90d、120d、180d 采血并分离血清，用ELISA方法进行测定，测定结果如表1所示。
由表1可以看出，本发明所制备的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液可以降低疫苗批次间的差异性，提高整体免疫水平，提高猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的免疫效果。另一方面本发明还可延长疫苗保护期。
表1 28日龄健康断奶仔猪免疫试验结果

Claims (6)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液，其特征在于每1000ml pH=7的磷酸盐缓冲液中包含：桑叶多糖1-8g、云芝多糖0.1-5g、地黄多糖1-5g和胸腺五肽0.1-5g。
2.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液，其特征在于每1000ml pH=7的磷酸盐缓冲液中包含：桑叶多糖2-6g、云芝多糖0.5-2g、地黄多糖1-3g和胸腺五肽0.5-1g。
3.根据权利要求1或2所述的一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液，其特征在于所述桑叶多糖的制备包括以下步骤：
（1）将桑叶粉碎后过70-100目筛，得桑叶粉末，置于干燥环境中贮存备用；
（2）将步骤（1）中所得桑叶粉末按料液比1:20-50g/ml加入75-85℃水中浸提100-120min，每间隔20-30min搅拌一次；
（3）对步骤（2）中浸提完毕的料液进行过滤，收集滤液；对所得滤液进行减压浓缩得浓缩液，减压浓缩条件为：温度50-60℃，转速50r/min，真空度600-700mmHg；
（4）向步骤（3）中所得浓缩液中加入无水乙醇，于4℃冰箱中醇沉20-24h后，以5000-6000 r/min的转速离心15-20min，收集不溶物；
（5）利用无水乙醚对步骤（4）中所得不溶物浸洗5-8次，再加入蒸馏水，离心，收集澄清液；
（6）对步骤（5）中所得澄清液进行真空冷冻干燥，得桑叶多糖。
4.根据权利要求1或2所述的一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液，其特征在于所述云芝多糖的制备包括以下步骤：
a. 将干燥的云芝碎片置于90-100℃水中煮提9-10h，过滤，收集滤液；
b．将步骤a中所得滤液浓缩至原体积的1/2，再加入3-4倍体积的95%乙醇，置于25-27℃环境中静置沉淀20-24h，得沉淀液；
c．将步骤b中所得沉淀液3000-4000r/min的转速离心15-20min，将所得沉淀物置于常温下干燥，即得云芝多糖。
5.根据权利要求1或2所述的一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液，其特征在于所述地黄多糖的制备包括以下步骤：
A．称取地黄，按液固比30-40：1加入蒸馏水，加热至90-110℃，浸提2-3h，过滤，收集滤液；
B．将步骤A中所得滤液浓缩至原体积的1/3-1/2，用sevag试剂法除去蛋白，上清液加氯仿离心，水层加80%-90%乙醇沉淀，沉淀物分别用丙酮和乙醇洗涤2 次，真空干燥得地黄多糖。
6.根据权利要求1或2所述的一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗用稀释液，其特征在于所述pH=7的磷酸盐缓冲液的制备方法如下：
d．称取下列原料组分：氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g和六水氯化镁0.05-0.2g，混合均匀备用；
e．向步骤d中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
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