CN107661489A - 疫苗用中药免疫增强剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种疫苗用中药免疫增强剂，该疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖15‑30g、MEM干粉8‑18g、胸腺五肽2‑10g、HEPES 2‑3g，余量为水。本发明还公开了疫苗用中药免疫增强剂的制备方法及应用。本发明疫苗用中药免疫增强剂能调节或增强机体免疫功能，提高机体抗病能力，同时增强猪瘟活疫苗的免疫效果，制备工艺简单，易于推广。

Description

疫苗用中药免疫增强剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种疫苗用中药免疫增强剂及其制备方法与应用。
背景技术
免疫增强剂能激活一种或多种免疫活性细胞，增强机体特异性和非特异性免疫功能，使低下的免疫功能恢复正常；增强与之合用的抗原的免疫原性，加速诱导免疫应答反应；部分疫苗用中药免疫增强剂对机体的免疫功能产生双向调节作用，使过高或过低的免疫功能趋于正常。
猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，不同年龄、性别和品种的猪均能感染，死亡率高达80-90％。猪瘟也是危害我国养猪业的最重要疫病，中国学者培育成功的猪瘟兔化弱毒苗是目前世界上公认的安全和有效的疫苗，使用C株疫苗密集接种和综合防制措施已成为防治该病的最有效手段。
猪瘟疫苗在使用时需要用疫苗稀释剂稀释成混悬液，市场上通常选用注射用水、生理盐水或PBS(磷酸盐缓冲液)等作为稀释剂直接稀释猪瘟活疫苗。但在临床使用中也发现，猪瘟疫苗在制备、成品检验、运输及使用过程均符合要求的情况下，接种后仍出现免疫效果不佳，甚至免疫失败的案例。经研究，这些情况的出现与动物机体的免疫功能异常、猪瘟活疫苗在复苏过程遇环境突变造成抗原损失等有关。因此，本发明提供一种疫苗用中药免疫增强剂，该疫苗用中药免疫增强剂可调节机体免疫系统，增强动物机体的免疫功能；减小复苏过程抗原损失；同时有效刺激机体产生保护性应答，增强猪瘟活疫苗免疫效果。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种疫苗用中药免疫增强剂及其制备方法。本发明的疫苗用中药免疫增强剂可调节机体免疫系统，增强动物机体的免疫功能；减小复苏过程抗原损失；同时有效刺激机体产生保护性应答，增强猪瘟活疫苗免疫效果。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖15-30g、MEM干粉8-18g、胸腺五肽2-10g、HEPES 2-3g，余量为水。
根据上述的疫苗用中药免疫增强剂，优选地，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖25g、MEM干粉13.4g、胸腺五肽5g、HEPES2.38g，余量为水。
根据上述的疫苗用中药免疫增强剂，所述水优选为注射用水，更优选为灭菌注射用水。
根据上述的疫苗用中药免疫增强剂，优选地，所述牛膝多糖的制备方法为：取新鲜牛膝根晒干(含水率<7％)，经粉碎后加水进行提取，得到水提液，向水提液中加入95％乙醇进行沉淀，抽滤后再向滤液中加入1％鞣酸进行沉淀，抽滤后的滤液经活性炭脱色、过滤透析、真空浓缩、乙醇沉淀、丙酮脱水、真空干燥等处理后得到牛膝多糖粗粉；牛膝多糖粗粉再分别经DEAE-Sepharose fast-flow色谱柱、SephadexG-150色谱柱纯化，透析脱盐，减压浓缩，冷冻干燥，得到牛膝多糖。
上述疫苗用中药免疫增强剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)按上述的疫苗用中药免疫增强剂的原料组成称取各原料组分，备用；
(2)取总用量85％的水，向其中加入将牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽和HEPES，搅拌溶解均匀，得到混合溶液，调节其PH为7.2-7.4(用0.01mol/l HCL或NaOH溶液调节混合溶液的PH值)；对混合溶液进行过滤除杂(用0.45μm滤膜进行过滤除杂)，然后用余量的水将混合溶液的体积补足至1000ml，过滤除菌(用0.22μm滤膜进行过滤除菌)，即得疫苗用中药免疫增强剂。
本发明的另一目的是提供了上述疫苗用中药免疫增强剂的应用：
本发明的疫苗用中药免疫增强剂可以作为日常提高猪抵抗力和免疫力的注射针剂使用(提高猪对疫病的抵抗力)；其用量为：每头猪肌肉注射1-2ml本发明疫苗用中药免疫增强剂，每月使用一次。
本发明的疫苗用中药免疫增强剂还可以作为疫苗稀释剂使用；所述疫苗优选为猪瘟活疫苗(猪瘟活疫苗指兔源、细胞源)。本发明疫苗用中药免疫增强剂作为猪瘟活疫苗稀释剂使用时，其用量为：每头份猪瘟活疫苗用1-2ml疫苗用中药免疫增强剂进行稀释。
本发明的疫苗用中药免疫增强剂也可以作为修复或激活猪机体免疫系统，提高猪机体的免疫应答的注射针剂使用。可以在猪瘟活疫苗(猪瘟活疫苗采用本领域常用的稀释液稀释)免疫前后1-7天内对猪进行肌肉注射本发明的疫苗用中药免疫增强剂，用于修复或激活机体免疫系统，提高猪机体的免疫水平或免疫应答；其用量为：每头猪肌肉注射1-2ml本发明疫苗用中药免疫增强剂。
本发明疫苗用中药免疫增强剂中牛膝多糖和胸腺五肽的功效：
牛膝多糖是从牛膝中分离、提取得到的一种小分子多糖化合物，具有分子量小，无抗原性，水溶性好，人体易吸收，化学提取质量稳定等优势，药理试验表明牛膝多糖能增强机体免疫力，升高血清溶血素和脾脏内抗体形成的细胞数，提高血清免疫球蛋白，激发网状内皮系统的吞噬功能，促进淋巴细胞增殖，增强NK细胞和CTL细胞的活性。能抑制肿瘤患者因化疗引起的白细胞下降，使白血球升高的有效率达97％。同时还能恢复免疫系统的创伤，起到恢复肝功能、增强人体骨髓造血功能、抑制肿瘤生长的作用，并无毒副性。
胸腺五肽是胸腺生成素Ⅱ的有效部分，由精氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸、缬氨酸、酪氨酸五种氨基酸组成，具有胸腺生成素II相同的全部生理功能。胸腺五肽的生理功能主要包括：①诱导T细胞分化，选择性地诱导Thy-1-的前胸腺细胞转化为Thy-1+的T细胞；②与成熟外周血T细胞的特异受体结合，使胞内cAMP水平上升，从而诱发一系列胞内反应，这也是它免疫调节功能的基础；③显著增高脾淋巴细胞的E玫瑰花结形成率及转化率，对免疫应答的初次或再次反应的不同阶段都有增强作用，能增多IgM类型和IgG或IgA类型的抗体形成细胞；④增强巨噬细胞的吞噬功能，增加多形核嗜中性白细胞的酶和吞噬功能，升高循环抗体含量，增强红细胞免疫功能；⑤提高自然杀伤细胞的活力。⑥提高白介素-2的产生水平与受体表达水平；增强外周血单核细胞γ干扰素的产生；⑦增强血清中SOD活性。
本发明取得的积极有益效果：
(1)本发明疫苗用中药免疫增强剂能有效调节免疫动物机体的免疫系统，修复动物机体受损的免疫功能，显著提高免疫动物的免疫应答，提升机体免疫力。
(2)本发明的疫苗用中药免疫增强剂与猪瘟活疫苗配合使用，能够增强疫苗复苏过程中对猪瘟抗原的保护，减少抗原损失，有效激活免疫应答，缩短免疫窗口期，使得免疫动物至少提早一周产生有效的保护力；提高疫苗的体液免疫及细胞免疫水平，延长抗体的保护期，增强猪瘟活疫苗的免疫效果。
(3)本发明疫苗用中药免疫增强剂，制备方法简单，具有大规模推广应用价值。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。
实施例1：
一种疫苗用中药免疫增强剂，该疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖25g、MEM干粉13.4g、胸腺五肽5g、HEPES 2.38g，余量为水；其中，所述水为注射用水。
上述疫苗用中药免疫增强剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)按上述的疫苗用中药免疫增强剂的原料组成称取各原料组分，备用；
(2)取总用量85％的水，向其中加入将牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽和HEPES，搅拌溶解均匀，得到混合溶液，用0.01mol/L HCL或NaOH调节混合溶液的PH为7.3；用0.45μm滤膜对混合溶液进行粗滤除杂，然后用余量的水将混合溶液的体积补足至1000ml，再用0.22μm滤膜进行过滤除菌，即得疫苗用中药免疫增强剂。
实施例2：本发明疫苗用中药免疫增强剂的应用
1.本发明疫苗用中药免疫增强剂作为疫苗稀释剂的应用
以本发明实施例1制备的疫苗用中药免疫增强剂作为猪瘟活疫苗的稀释剂进行应用实验。具体操作为：每头份猪瘟活疫苗用1ml本发明实施例1制备的疫苗用中药免疫增强剂进行稀释，稀释后对实验猪进行颈部肌肉注射。
(1)安全性考察：
选取15-20kg左右保育猪30头，随机分为A、B、C三组，每组10头；其中，A组颈部肌肉注射5ml本发明实施例1制备的疫苗用中药免疫增强剂，B组颈部肌肉注射5ml猪瘟活疫苗(商丘美兰生物工程有限公司，批号170901)(每头份猪瘟活疫苗用1ml本发明实施例1制备的疫苗用中药免疫增强剂进行稀释)，C组颈部肌肉注射5ml生理盐水。免疫后进行跟踪观察记录猪的存活、采食、精神状况及生长发育情况。注射一周后，A、B、C三组所有实验猪均存活，免疫部位未见异常反应，采食、精神状况及生长发育情况均正常。因此，证实本发明的疫苗用中药免疫增强剂是安全的，而且本发明的疫苗用中药免疫增强剂应用于猪瘟疫苗也是安全的。
(2)免疫效果考察
选取8-12kg左右实验猪30头(IDEXX猪瘟抗原检测试剂盒检测血清阴性)，随机分为A、B两组，每组15头，其中，A组免疫猪瘟活疫苗(兔源)(商丘美兰生物工程有限公司，批号170901)，每头份疫苗用1ml生理盐水稀释；B组免疫猪瘟活疫苗(兔源)(商丘美兰生物工程有限公司，批号170901)，每头份疫苗用1ml本发明疫苗用中药免疫增强剂进行稀释；A、B两组均分别在35日龄、70日龄免疫猪瘟疫苗1头份。第二次免疫7天后，每周对实验小猪采集血液分离血清，检测血清中猪瘟抗体水平(IDEXX猪瘟病毒抗体阻断ELISA试剂盒)，连续检测8周，依据免疫合格率(阻断率大于40％为合格)、抗体水平高低(阻断率越高效果越好)、阻断率大于40％最早出现时间等指标，评估免疫效果。
表1猪瘟免疫效果检测结果
免疫检测结果显示，第二次免疫后抗体水平呈不断上升趋势，A组的阻断率在第二次免疫后第二周(48％)达到合格，B组的阻断率在第二次免疫后第一周(47％)达到合格；且在检测期内，B组阻断率优于A组。实验结果证明，采用本发明疫苗用中药免疫增强剂作为猪瘟疫苗的稀释剂可使机体提前一周产生有效保护力，且抗体水平明显优于用生理盐水作为猪瘟疫苗稀释剂。
2.本发明疫苗用中药免疫增强剂作为日常提高猪抵抗力和免疫力的注射针剂的应用
本发明的疫苗用中药免疫增强剂可作为日常养猪过程提高猪抵抗力和免疫力的注射针剂的使用，以提高猪的对疫病的抵抗力；具体的用量为：每头猪肌肉注射1ml本发明实施例1制备的疫苗用中药免疫增强剂，每月使用一次。
实施例3：
一种疫苗用中药免疫增强剂，该疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖15g、MEM干粉10g、胸腺五肽10g、HEPES 2g，余量为注射用水。
所述疫苗用中药免疫增强剂的制备方法同实施例1。
实施例4：
一种疫苗用中药免疫增强剂，该疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖20g、MEM干粉15g、胸腺五肽6g、HEPES 2.5g，余量为注射用水。
所述疫苗用中药免疫增强剂的制备方法同实施例1。
实施例5：
一种疫苗用中药免疫增强剂，该疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖30g、MEM干粉18g、胸腺五肽10g、HEPES 3g，余量为注射用水。
所述疫苗用中药免疫增强剂的制备方法同实施例1。
实施例6：
一种疫苗用中药免疫增强剂，该疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖25g、MEM干粉15g、胸腺五肽8g、HEPES 2.2g，余量为注射用水。
所述疫苗用中药免疫增强剂的制备方法同实施例1。
实施例7：
一种疫苗用中药免疫增强剂，该疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖28g、MEM干粉8g、胸腺五肽2g、HEPES 2g，余量为注射用水。
所述疫苗用中药免疫增强剂的制备方法同实施例1。
实施例8：
一种疫苗用中药免疫增强剂，该疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖16g、MEM干粉8g、胸腺五肽4g、HEPES 2.8g，余量为注射用水。
所述疫苗用中药免疫增强剂的制备方法同实施例1。
实施例9：
一种疫苗用中药免疫增强剂，该疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖22g、MEM干粉12g、胸腺五肽9g、HEPES 2.6g，余量为注射用水。
所述疫苗用中药免疫增强剂的制备方法同实施例1。
实施例10：
一种疫苗用中药免疫增强剂，该疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖18g、MEM干粉16.5g、胸腺五肽10g、HEPES2.3g，余量为注射用水。
所述疫苗用中药免疫增强剂的制备方法同实施例1。
实施例11：
一种疫苗用中药免疫增强剂，该疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖25g、MEM干粉16g、胸腺五肽6g、HEPES 3g，余量为注射用水。
所述疫苗用中药免疫增强剂的制备方法同实施例1。
实施例12：
一种疫苗用中药免疫增强剂，该疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖26g、MEM干粉14g、胸腺五肽7g、HEPES 2.5g，余量为注射用水。
所述疫苗用中药免疫增强剂的制备方法同实施例1。
以上实施例仅用以说明本发明的技术实施方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，但是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种疫苗用中药免疫增强剂，其特征在于，所述疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖15-30g、MEM干粉8-18g、胸腺五肽2-10g、HEPES 2-3g，余量为水。
2.根据权利要求1所述的疫苗用中药免疫增强剂，其特征在于，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖25g、MEM干粉13.4g、胸腺五肽5g、HEPES 2.38g，余量为水。
3.根据权利要求1所述的疫苗用中药免疫增强剂，其特征在于，所述水为注射用水。
4.一种疫苗用中药免疫增强剂的制备方法，其特征在于，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂的制备方法包括以下步骤：
(1)按权利要求1-3任一所述的疫苗用中药免疫增强剂的原料组成称取各原料组分，备用；
(2)取总用量85％的水，向其中加入将牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽和HEPES，搅拌溶解均匀，得到混合溶液，调节其PH为7.2-7.4；对混合溶液进行过滤除杂，然后用余量的水将混合溶液的体积补足至1000ml，过滤除菌，即得疫苗用中药免疫增强剂。
5.权利要求1所述的疫苗用中药免疫增强剂作为疫苗稀释剂的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述疫苗为猪瘟活疫苗。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述疫苗用中药免疫增强剂的用量为：每头份猪瘟活疫苗用1-2ml疫苗用中药免疫增强剂进行稀释。
8.权利要求1所述的疫苗用中药免疫增强剂作为日常提高猪抵抗力和免疫力的注射针剂的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疫苗用中药免疫增强剂的用量为：每头猪肌肉注射1-2ml疫苗用中药免疫增强剂。
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