CN107157933A - 一种蛋白自组装新型纳米疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛋白自组装新型纳米疫苗及其制备方法,基于抗原蛋白自组装制备而成,在疫苗制备过程中选择性引入分子佐剂,抗原含量≥85%,无需铝佐剂、弗氏佐剂等辅助即可引发高效免疫效应,利用物理调控暴露蛋白分子间的巯基,通过巯基/二硫键交换反应,形成以二硫键交联为主的稳定的蛋白纳米粒。本发明克服了传统纳米疫苗需引入外源载体或交联剂等缺陷,可同时提高疫苗的免疫效应及生物安全性。所得到的疫苗颗粒形貌规整,稳定性强,调控方式灵活,重复性好,可高效刺激树突细胞成熟。具有较强的通用性、普适性,在一系列的抗原蛋白上得到验证,在疫苗新方法及生物制药领域具有潜在重大应用价值。
Description
技术领域
本发明属于高分子纳米生物医药材料领域,尤其是涉及一种蛋白自组装新型纳米疫苗及其制备方法,基于大分子抗原蛋白分子调控,通过内部巯基交联、蛋白再折叠或自组装的方法将抗原肽或免疫佐剂载入蛋白,形成高密度纳米疫苗。
背景技术
疫苗保护人类免受诸多致命性疾病的侵袭,是人类历史上最成功的医疗措施,如在全世界范围内根除了天花并且有效地减少了其它一些烈性的传染病感染,例如:脊髓灰质炎、白喉、破伤风、百日咳、麻疹、腮腺炎以及风疹病毒的感染等,在改善了人类的生活质量的同时,更是大大延长了人类的平均寿命。根据美国国立卫生研究院2010年的统计数据显示,疫苗每年至少减少了250万例死亡与难以计数的其他病例。
传统的疫苗设计采用病原微生物及其代谢产物,经过人工减毒、脱毒、灭活等方法制成疫苗,其缺点在于如果病原体灭活不彻底,会导致生物安全风险。当前的传统疫苗主要是指灭活苗和弱毒苗,但也存在着很难解决的弊端。如,常规疫苗生产成本高,需要佐剂和多种免疫接种方式才能引起有效地免疫保护,并且容易受到母源抗体的干扰,而对新生幼畜具有很低或没有免疫保护作用。类毒素可以引起体液免疫应答但是不产生或产生很少的细胞免疫应答;灭活苗中不能引起免疫应答的部分不仅对预防传染没有作用,反而有可能减弱能引起免疫反应部分产生的免疫保护作用。灭活苗中还含有对机体有害的物质,例如,内毒素等。活疫苗存在致病力并且有污染的风险,一般说来,灭活苗安全但和活疫苗相比其产生免疫保护的时间短并且保护力弱。而活疫苗中存在致病毒株和其它病原体的风险非常高。弱毒疫苗既可以产生体液免疫又能产生细胞免疫,但是弱毒疫苗仅适用于少数病原和免疫力低下的动物。
亚单位疫苗是利用微生物表面的一种或多种保护性抗原诱发机体产生保护性免疫应答,但亚单位疫苗通常免疫原性较弱,需要添加佐剂来增强免疫原性,例如经FDA批准的铝佐剂及弗氏佐剂。但是,已有许多人对铝佐剂的安全及质量问题提出了质疑,如:铝佐剂不能冻干,制备的疫苗批与批之间差异大,质量难控制且对佐剂的效果很难做出准确的评价;主要刺激Th2相关抗体的产生,只能诱导产生体液免疫应答;增加发生超敏反应的危险。
核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防或治疗疾病目的。有案可查的动物用DNA疫苗包括:马西尼罗病毒疫苗、人用HIV DNA疫苗等。由于DNA疫苗可能存在与机体细胞基因组DNA发生整合的担忧,一些疫苗学家可能对其应用于人体持谨慎态度。
纳米疫苗作为一种新型纳米疫苗,是目前疫苗领域的一大热点。纳米颗粒作为抗原与佐剂的递送工具和免疫增强剂被广泛应用,不仅提高了抗原、佐剂的稳定性,增强抗原的递呈效率和免疫原性,促进抗原胞内加工,可与主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibility Complex,MHC)分子特异性结合;同时也能够靶向递呈抗原,具有缓释功能;重要的是,许多纳米颗粒自身具有免疫佐剂活性,可高效增强机体免疫应答。然而,纳米载体如纳米乳剂、脂质体、胶束、PLGA、硅纳米粒、金纳米棒等,也带来了很多问题,如抗原与佐剂负载效率低、载体在疫苗组分中占比过高;抗原与佐剂的颗粒内包封使得抗原的表面多展示近似于无;动物或人体内产生了针对纳米颗粒的抗体,例如PEG是获得公认的生物相容性良好的生物材料,但却被发现机体内产生了针对PEG的抗体;纳米载体的毒性与体内代谢问题也没有得到很好的解决。
重要的是,传统的疫苗偏重于疾病的预防,在转向至免疫治疗时往往效果不佳,而对已发病的个体则不能诱发免疫应答,也无法抵御疾病的发生。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于抗原内部二硫键自纳米化交联的、全抗原新型自纳米化纳米疫苗及其制备方法,该纳米粒子能有效解决现有疫苗技术合成成本高、合成过程复杂、涉及生物安全性等问题,也有效解决了现有纳米疫苗设计领域使用外源载体、化学交联剂及抗原密度低、无抗原表面展示等传统问题,并且结构稳定、易于储存、具有高度模拟病毒结构的特点,实现了载体即抗原,同时纳米颗粒又具有免疫佐剂的双重作用。该纳米疫苗可高效促进免疫细胞对抗原的吞噬,无细胞毒性,具有良好的生物相容性,可高效刺激树突细胞成熟、产生免疫反应。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
新型自纳米化纳米疫苗,仅包括抗原蛋白与免疫佐剂。所述的抗原包括,病毒抗原、细菌抗原以及肿瘤抗原,来自于病毒、细菌、其他微生物、肿瘤或基因工程蛋白产物,所述的免疫佐剂包括,所述免疫佐剂为Toll样受体激动剂、NOD样受体激动剂、细胞因子佐剂、DNA类免疫佐剂、皂苷类佐剂、多肽类佐剂及抗原肽、多糖类佐剂、无机纳米佐剂、有机纳米佐剂、化疗药或它们的组合。
本发明的技术方案为:一种制备具有抗原高密度的新型自纳米化纳米疫苗的方法,包括以下步骤:
(a)用一种溶剂溶解蛋白获得蛋白溶液;(b)在变性剂或者适合的变性条件中将免疫佐剂或其它物质加入步骤(a)中所述的蛋白溶液中,使蛋白去折叠以巯基暴露,通过二硫键交联以及蛋白再折叠或自组装,把免疫佐剂或多肽包入蛋白,形成蛋白纳米颗粒;(c)将合成的纳米疫苗快速冷却,以停止反应;(d)形成的纳米疫苗溶液可通过简单的物理方法去除体系无用的小分子成分,提纯或浓缩,得到新型自纳米化纳米疫苗。
所述的这些抗原是这样的抗原,已经被使用或者可用于治疗或预防易于影响动物界以及人的多种疾病,尤其为:白喉(diphtheria)、破伤风(tetanus)、脊髓灰质炎(polio)、狂犬病(rabies)、百日咳(whooping cough)、甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎(hepatitisA,B or C)、黄热病(yellow fever)、伤寒(typhoid fever)、水痘(chickenpox)、麻疫(measles)、腿腺炎(mumps)、德国麻疫(German measles)、乙型脑炎(Japaneseencephalitis)、流感(influenza)、脑膜炎(meningitis)、霍乱(cholera);由以下病毒介导的传染:轮状病毒(Rotavirus)、诺如病毒(Norovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)、单纯疱疫病毒(Herpes Simplex Virus)、乳头状瘤病毒(Papilloma Virus)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)、西尼罗河病毒(West NileVirus)、登革热病毒(Dengue Virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya Virus)、HIV(AIDS);由以下引起的细菌性疾病:链球菌(streptococci)、沙眼衣原体和肺炎衣原体(trachomatisand pneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌、粘膜炎莫拉氏菌、金黄色葡萄球菌或B型流感嗜血菌influenza type B),李斯特菌病(listeriosis)、志贺氏菌病(shigellosis)、沙门氏菌病(salmonellosis)、结核病(tuberculosis)、莱姆病(Lyme’sdisease)、寄生虫疾病(parasitic complaints)诸如痕疾(malaria)、利什曼病(leishmaniosis)等;肿瘤抗原、肿瘤裂解物、肿瘤模式抗原OVA等;也可来自于免疫原性较弱的蛋白,包括卵白蛋白、血清白蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麦白蛋白、豆白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、血管内皮抑素、血红蛋白、肌红蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤维连接蛋白、纤层蛋白、胶原蛋白、明胶、人造多肽与蛋白,或者它们的组合。
所述的这些抗原是这样的抗原:蛋白抗原内部之间应包含3个及三个以上巯基,已提供足够的交联位点,使之成为化学键交联为主的纳米颗粒。
所述的新型自纳米化纳米疫苗为具有还原敏感性的的纳米粒子。
所述的新型自纳米化纳米疫苗平均粒径为5~2000nm,优化的为20-800nm,最优的为30~500nm。
所述的新型自纳米化纳米疫苗体系中,抗原质量分数可≥80%,免疫佐剂≤20%,优化的为抗原质量分数可≥90%,免疫佐剂≤10%。
所述的新型自纳米化纳米疫苗体系中,Toll样受体激动剂包括TLR2识别的肽聚糖(PGs)、G+菌的酯磷壁酸(LTA)、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、细菌DNA,TLR3识别的RNA病毒的双链RNA(dsRNA),TLR4识别脂多糖(LPS)、热休克蛋白(HSP)60,TLR5识别的细菌的鞭毛,TLR6识别的支原体双酰基脂肽,TLR7、TLR8识别呼吸道合胞病毒和流感病毒的单链RNA,TLR7还可识别一些合成的免疫调节剂,TLR9识别细菌未甲基化的CpG DNA,TLR11识别尿道病原菌和刚地弓形虫的蛋白成分。优化的是TLR3受体识别的poly(I:C)和TLR9识别的CpG ODN寡链核苷酸。
所述的新型自纳米化纳米疫苗体系中,NOD样受体激动剂包括NOD1识别的配体γ-D-谷氨酸-meso-二氨基庚二酸(γ-D-glu-meso-DAP),及NOD2识别的配体胞壁酸二肽(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺,MDP)。
所述的新型自纳米化纳米疫苗体系中,细胞因子佐剂包括白细胞介素类(IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18)、干扰素类(IFN-γ)、肿瘤坏死因子类、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子;所述的趋化因子包括巨噬细胞炎症蛋白-1α,巨噬细胞炎症蛋白-2,巨噬细胞衍生趋化因子、RANTES等。优选的是白细胞介素-12,白细胞介素-18、干扰素-γ,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
所述的新型自纳米化纳米疫苗体系中,DNA类免疫佐剂包括包含编码细胞因子(白细胞介素类、干扰素类、肿瘤坏死因子类、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)基因及趋化因子基因(巨噬细胞炎症蛋白,RANTES)的DNA质粒,优选编码白细胞介素-12,白细胞介素-18,干扰素-γ,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的DNA质粒。最优的为包含编码白细胞介素-12、干扰素-γ基因的DNA质粒。
所述的新型自纳米化纳米疫苗体系中,多糖类免疫佐剂为脂多糖、黄芪多糖、人参多糖、党参多糖、枸杞多糖、淫羊藿多糖、当归多糖、灵芝多糖、香菇多糖、牛膝多糖。
所述的化疗药是使用过程中低剂量化疗促免疫的化疗药,紫杉醇、多柔比星、多西他赛、顺铂、蒽环霉素、弗达拉滨、环磷酰胺。
所述的新型自纳米化纳米疫苗体系中,所述的多肽为经提纯的亚单位疫苗,免疫原性较弱,在使用过程中经常需和免疫佐剂(铝佐剂、弗氏佐剂)联用。优选的是包含巯基的多肽。为了更好的复合纳米疫苗,可在多肽上人工修饰巯基。
本发明技术方案所述的步骤(a)的溶剂是水,生理盐水,糖,冻干保护剂或蛋白稳定剂。其中,所述的冻干保护剂是磷酸盐,醋酸盐,3-吗啉丙磺酸(MOPS)、2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、柠檬酸、甘氨酸,三羟甲基氨基甲烷(Tris),4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)过氧化氢,谷胱甘肽,葡萄糖、或它们的组合。所述的蛋白稳定剂是海藻糖,甘露醇,蔗糖,乙酰色氨酸,辛酸钠或者它们的组合。其中,所述的溶剂优选水,3-吗啉丙磺酸(MOPS)、2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、柠檬酸、甘氨酸,三羟甲基氨基甲烷(Tris),辛酸钠或生理盐水。最优的是MES缓冲液、PBS缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或他们的组合。
本发明技术方案中所述的步骤(b)的变性剂或者适合的变性条件包括水、强酸、强碱、无机盐、有机溶剂、结构展开剂或表面活性剂。其中,所述的强酸强碱包括盐酸,硫酸,氢氧化钠等。所述的有机溶剂是甲醇,乙醇,异丙醇,福尔马林,氯仿,丙酮,硫化氢或它们的组合。所述的结构展开剂是水,氯化钠,磷酸盐,醋酸盐,甘氨酸,三羟甲基氨基甲烷,十六烷基三甲基溴化铵、过氧化氢,谷胱甘肽,2-巯基乙醇,二硫苏糖醇,盐酸胍,尿素,直链烷基苯磺酸钠、谷胱甘肽,十二烷基硫酸钠、高氯酸,三丁基膦,甲巯丙脯氨酸,过甲酸,青霉胺,甲硫咪唑,乙酰半胱氨酸以及它们的组合。所述的无机盐是水,氯化钠,磷酸盐,醋酸盐,甘氨酸,三羟甲基氨基甲烷,过氧化氢,谷胱甘肽,葡萄糖,蔗糖,甘露醇,海藻糖,乙酰色氨酸,辛酸钠或它们的组合。
其中,优选的变性剂或者适合的变性条件是水,醋酸盐,甘氨酸,氯化钠,葡萄糖,乙醇,丙酮,2-巯基乙醇,尿素、直链烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、或它们的组合。最优的是水、直链烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、尿素或它们的组合。
本发明技术方案中所述的步骤(a)的操作pH值为2~13;优选为pH 3~11;最优为pH 3.5-9.5。
本发明技术方案中所述的步骤(b)的操作温度为-20~120℃;优选为50~110℃;最优为60~100℃。
本发明技术方案中所述的步骤(b)的反应时间为30s~24h;优选为50s~12h;最优为60s~1h。
本发明技术方案中所述的步骤(b)中适合的变性条件还包括外力操作以辅助蛋白展开。其中,所述的外力包括变化压力或光照辐射。其中,光照辐射优选紫外光。所述紫外光波长为280-315nm、强度为每平方厘米450微瓦~50毫瓦。本发明技术方案中所述的步骤(c)步骤指的是将反应溶液从反应环境中取出,置于低于反应温度以下温度停止反应。该温度为-20℃-50℃,优选为-10℃-10℃,最优为-5℃-5℃(例:冰水浴)
本发明技术方案中所述的步骤(d)涉及到的物理方法,一般来说,这个步骤包括任意的能够将小分子从纳米粒中分离出去的方法。这些方法可包括盐沉淀,超滤、透析,层析以及它们的组合。
本发明可能还需要一个步骤(e)将提纯后的纳米粒经过脱水步骤制成干粉利于长期保存。本发明所涉及的保护的方法包括:离心,冷冻干燥。
本领域技术人员能够意识到本发明的范围和精髓是变动的。解折叠的物质是变化的,同时许多的免疫佐剂是可使用的,许多的天然抗原蛋白和抗原多肽是可以用来作为载体的。本发明将会在下面的实施例中得到更加明确和清晰地描述。
下面是对本发明技术方案的进一步描述:
除上面的总的技术方案之外,本发明进一步提出了一种全抗原蛋白的新型纳米疫苗的方法,所述方法包含以下几个步骤:(a)在60~100℃,pH3.5~9.5的条件下,用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液;(b)在变性剂或者适合的变性条件下从而引起蛋白结构展开、巯基暴露,蛋白大分子再折叠或自组装;(c)将合成的纳米疫苗快速冷却,以停止反应;(d)将纳米疫苗透析,以除去无用的的小分子物质或者进一步浓缩;(e)对所得溶液进行脱水作用,制得能够保存的疫苗干粉。这里制得的纳米疫苗抗原质量分数为100%,平均粒径为20~800nm,都分散系数PDI<0.4。
本实施方案的方法中的所用的抗原蛋白可来自于从白喉(diphtheria)、破伤风(tetanus)、脊髓灰质炎(polio)、狂犬病(rabies)、百日咳(whooping cough)、甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎(hepatitis A,B or C)、黄热病(yellow fever)、伤寒(typhoidfever)、水痘(chickenpox)、麻疫(measles)、腿腺炎(mumps)、德国麻疫(German measles)、乙型脑炎(Japanese encephalitis)、流感(influenza)、脑膜炎(meningitis)、霍乱(cholera);由以下病毒介导的传染:轮状病毒(Rotavirus)、诺如病毒(Norovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)、单纯疱疫病毒(HerpesSimplex Virus)、乳头状瘤病毒(Papilloma Virus)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)、西尼罗河病毒(West Nile Virus)、登革热病毒(Dengue Virus)、基孔肯雅病毒(ChikungunyaVirus)、HIV(AIDS);由以下引起的细菌性疾病:链球菌(streptococci)、沙眼衣原体和肺炎衣原体(trachomatis and pneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌、粘膜炎莫拉氏菌、金黄色葡萄球菌或B型流感嗜血菌influenza type B),李斯特菌病(listeriosis)、志贺氏菌病(shigellosis)、沙门氏菌病(salmonellosis)、结核病(tuberculosis)、莱姆病(Lyme’s disease)、寄生虫疾病(parasitic complaints)诸如痕疾(malaria)、利什曼病(leishmaniosis)等;肿瘤抗原、肿瘤裂解物、肿瘤模式抗原OVA等;也可来自于免疫原性较弱的蛋白,包括卵白蛋白、血清白蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麦白蛋白、豆白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、血管内皮抑素、血红蛋白、肌红蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤维连接蛋白、纤层蛋白、胶原蛋白、明胶、人造多肽与蛋白,或者它们的组合。
本发明技术方案所述的的溶剂是水,生理盐水,磷酸盐,醋酸盐,3-吗啉丙磺酸(MOPS)、2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液、柠檬酸缓冲液、甘氨酸缓冲液,三羟甲基氨基甲烷(Tris),4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、如甘氨酸缓冲液、邻苯二甲酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、巴比妥钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷(MOPS)缓冲液、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷(MOPSO)缓冲液、哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)缓冲液、三乙醇胺(TEA)缓冲液、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)缓冲液、2-(环已胺)-1-乙磺酸(CHES)缓冲液、3-(环已胺)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)缓冲液、3-(环已胺)-1-丙磺酸(CAPS)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)缓冲液、哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸(POPSO)缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸(EPPS)缓冲液、N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸(Tricine)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)缓冲液、3-[N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)]氨基-2-羟丙烷磺酸(AMPSO)缓冲液、N-(氨基甲酰基甲基)亚氨基二乙酸(ADA)缓冲液、6.8 6.1-7.5 182.2 N-氨基甲酰甲基乙磺酸(ACES)缓冲液、N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙璜酸(BES)缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液、N-3-(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)缓冲液、3-[N-N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)缓冲液、N-3-(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙烷磺酸(TAPSO)缓冲液过氧化氢,谷胱甘肽,葡萄糖、或它们的组合。
此外,本实施方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以包括水,氯化钠,磷酸盐,醋酸盐,甘氨酸,三羟甲基氨基甲烷,过氧化氢,谷胱甘肽,甲醇,乙醇,异丙醇,福尔马林,氯仿,丙酮,硫化氢,2-巯基乙醇,二硫苏糖醇,盐酸胍,尿素,高氯酸,三丁基膦,甲硫丙脯氨酸,过甲酸,青霉胺,谷胱甘肽,甲硫咪唑,乙酰半胱氨酸以及它们的组合。
本合成方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以从本实施方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以包括水,氯化钠,磷酸盐,醋酸盐,甘氨酸,三羟甲基氨基甲烷,十六烷基三甲基溴化铵、过氧化氢,谷胱甘肽,甲醇,乙醇,异丙醇,丙酮,硫化氢,2-巯基乙醇,二硫苏糖醇,盐酸胍,尿素,十二烷基苯磺酸钠、直链烷基苯磺酸钠、谷胱甘肽,十二烷基硫酸钠、高氯酸,三丁基膦,甲巯丙脯氨酸,过甲酸,青霉胺,甲巯咪唑,乙酰半胱氨酸以及它们的组合。
本发明技术方案再进一步提出了一种将toll样受体激动剂包入抗原蛋白,合成新型纳米疫苗的方法,所述方法包含以下几个步骤:(a)在60~100℃,pH3.5~9.5的条件下,用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液;(b)在变性剂或者适合的变性条件下,将toll样受体激动剂加入步骤(a)中所述的蛋白溶液,从而引起蛋白展开与再折叠或自组装,将toll受体激动剂包在所述蛋白中;(c)合成的纳米粒快速冷却,以停止反应;(d)将纳米粒透析,以除去无用的的小分子物质或者进一步浓缩;(e)对所得溶液进行脱水作用,制得能够保存的疫苗干粉。这里制得的纳米粒平均粒径为20~300nm,抗原质量分数≥95%,toll受体激动剂小于等于5%。本合成方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以从本实施方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以包括水,氯化钠,磷酸盐,醋酸盐,甘氨酸,三羟甲基氨基甲烷,十六烷基三甲基溴化铵、过氧化氢,谷胱甘肽,甲醇,乙醇,异丙醇,丙酮,硫化氢,2-巯基乙醇,二硫苏糖醇,盐酸胍,尿素,十二烷基苯磺酸钠、直链烷基苯磺酸钠、谷胱甘肽,十二烷基硫酸钠、高氯酸,三丁基膦,甲巯丙脯氨酸,过甲酸,青霉胺,甲巯咪唑,乙酰半胱氨酸以及它们的组合。此外,本实施方案的方法中的所用的抗原蛋白可来自于从以上所属的病毒抗原蛋白、细菌抗原蛋白、其他微生物抗原蛋白、肿瘤抗原蛋白、肿瘤裂解物以及其它基因工程蛋白产物中选择。
本发明技术方案再进一步提出了一种将抗原多肽包入抗原蛋白,合成新型纳米疫苗的方法,所述方法包含以下几个步骤:(a)在60~100℃,pH3.5~9.5的条件下,用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液;(b)在变性剂或者适合的变性条件下,将toll样受体激动剂加入步骤(a)中所述的蛋白溶液,从而引起蛋白展开与再折叠或自组装,将toll受体激动剂包在所述蛋白中;(c)合成的纳米粒快速冷却,以停止反应;(d)将纳米粒透析,以除去无用的的小分子物质或者进一步浓缩;(e)对所得溶液进行脱水作用,制得能够保存的疫苗干粉。这里制得的纳米粒平均粒径为20~300nm,抗原质量分数≥97%,toll受体激动剂小于等于3%。本合成方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以从本实施方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以包括水,氯化钠,磷酸盐,醋酸盐,甘氨酸,三羟甲基氨基甲烷,十六烷基三甲基溴化铵、过氧化氢,谷胱甘肽,甲醇,乙醇,异丙醇,丙酮,硫化氢,2-巯基乙醇,二硫苏糖醇,盐酸胍,尿素,十二烷基苯磺酸钠、直链烷基苯磺酸钠、谷胱甘肽,十二烷基硫酸钠、高氯酸,三丁基膦,甲巯丙脯氨酸,过甲酸,青霉胺,甲巯咪唑,乙酰半胱氨酸以及它们的组合。此外,本实施方案的方法中的所用的抗原蛋白可来自于从以上所属的病毒抗原蛋白、细菌抗原蛋白、其他微生物抗原蛋白、肿瘤抗原蛋白、肿瘤裂解物以及其它基因工程蛋白产物中选择。
本发明技术方案再进一步提出了一种将巯基修饰的TLR9受体激动剂—CpG-SH及抗原多肽包入抗原蛋白,合成新型纳米疫苗的方法,所述方法包含以下几个步骤:(a)在60~100℃,pH3.5~9.5的条件下,用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液;(b)在变性剂或者适合的变性条件下,将toll样受体激动剂加入步骤(a)中所述的蛋白溶液,从而引起蛋白展开与再折叠或自组装,将toll受体激动剂包在所述蛋白中;(c)合成的纳米粒快速冷却,以停止反应;(d)将纳米粒透析,以除去无用的的小分子物质或者进一步浓缩;(e)对所得溶液进行脱水作用,制得能够保存的疫苗干粉。这里制得的纳米粒平均粒径为20~300nm,抗原质量分数≥97%,toll受体激动剂小于等于3%。本合成方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以从本实施方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以包括水,氯化钠,磷酸盐,醋酸盐,甘氨酸,三羟甲基氨基甲烷,十六烷基三甲基溴化铵、过氧化氢,谷胱甘肽,甲醇,乙醇,异丙醇,丙酮,硫化氢,2-巯基乙醇,二硫苏糖醇,盐酸胍,尿素,十二烷基苯磺酸钠、直链烷基苯磺酸钠、谷胱甘肽,十二烷基硫酸钠、高氯酸,三丁基膦,甲巯丙脯氨酸,过甲酸,青霉胺,甲巯咪唑,乙酰半胱氨酸以及它们的组合。此外,本实施方案的方法中的所用的抗原蛋白可来自于从以上所属的病毒抗原蛋白、细菌抗原蛋白、其他微生物抗原蛋白、肿瘤抗原蛋白、肿瘤裂解物以及其它基因工程蛋白产物中选择。
本发明技术方案再进一步提出了一种将NOD样受体激动剂包入抗原蛋白,合成新型纳米疫苗的方法,所述方法包含以下几个步骤:(a)在60~100℃,pH3.5~9.5的条件下,用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液;(b)在变性剂或者适合的变性条件下,将toll样受体激动剂加入步骤(a)中所述的蛋白溶液,从而引起蛋白展开与再折叠或自组装,将toll受体激动剂包在所述蛋白中;(c)合成的纳米粒快速冷却,以停止反应;(d)将纳米粒透析,以除去无用的的小分子物质或者进一步浓缩;(e)对所得溶液进行脱水作用,制得能够保存的疫苗干粉。这里制得的纳米粒平均粒径为20~500nm,抗原质量分数≥85%,toll受体激动剂小于等于15%。本合成方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以从本实施方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以包括水,氯化钠,磷酸盐,醋酸盐,甘氨酸,三羟甲基氨基甲烷,十六烷基三甲基溴化铵、过氧化氢,谷胱甘肽,甲醇,乙醇,异丙醇,丙酮,硫化氢,2-巯基乙醇,二硫苏糖醇,盐酸胍,尿素,十二烷基苯磺酸钠、直链烷基苯磺酸钠、谷胱甘肽,十二烷基硫酸钠、高氯酸,三丁基膦,甲巯丙脯氨酸,过甲酸,青霉胺,甲巯咪唑,乙酰半胱氨酸以及它们的组合。此外,本实施方案的方法中的所用的抗原蛋白可来自于从以上所属的病毒抗原蛋白、细菌抗原蛋白、其他微生物抗原蛋白、肿瘤抗原蛋白、肿瘤裂解物以及其它基因工程蛋白产物中选择。
本发明技术方案再进一步提出了一种将低浓度化疗药包入抗原蛋白,合成新型纳米疫苗的方法,所述方法包含以下几个步骤:(a)在60~100℃,pH3.5~9.5的条件下,用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液;(b)在变性剂或者适合的变性条件下,将toll样受体激动剂加入步骤(a)中所述的蛋白溶液,从而引起蛋白展开与再折叠或自组装,将toll受体激动剂包在所述蛋白中;(c)合成的纳米粒快速冷却,以停止反应;(d)将纳米粒透析,以除去无用的的小分子物质或者进一步浓缩;(e)对所得溶液进行脱水作用,制得能够保存的疫苗干粉。这里制得的纳米粒平均粒径为20~500nm,抗原质量分数≥85%,toll受体激动剂小于等于15%。本合成方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以从本实施方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以包括水,氯化钠,磷酸盐,醋酸盐,甘氨酸,三羟甲基氨基甲烷,十六烷基三甲基溴化铵、过氧化氢,谷胱甘肽,甲醇,乙醇,异丙醇,丙酮,硫化氢,2-巯基乙醇,二硫苏糖醇,盐酸胍,尿素,十二烷基苯磺酸钠、直链烷基苯磺酸钠、谷胱甘肽,十二烷基硫酸钠、高氯酸,三丁基膦,甲巯丙脯氨酸,过甲酸,青霉胺,甲巯咪唑,乙酰半胱氨酸以及它们的组合。此外,本实施方案的方法中的所用的抗原蛋白可来自于从以上所属的病毒抗原蛋白、细菌抗原蛋白、其他微生物抗原蛋白、肿瘤抗原蛋白、肿瘤裂解物以及其它基因工程蛋白产物中选择。
本发明技术方案再进一步提出了一种抗原蛋白包载免疫佐剂组分的用于免疫预防和治疗的新型纳米疫苗,制备这种纳米疫苗的方法包含以下几个步骤:(a)在50~110℃,PH3~11的条件下,用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液;(b)在变性剂或者适合的变性条件下从而引起蛋白结构展开、巯基暴露,蛋白大分子再折叠或自组装,将免疫佐剂包裹在所述蛋白中;(c)将合成的纳米疫苗快速冷却,以停止反应;(d)将纳米疫苗透析,以除去无用的的小分子物质或者进一步浓缩。
本发明技术方案再进一步提出了一种抗原蛋白包载Toll样受体激动剂组分用于免疫预防和治疗的新型纳米疫苗,制备这种纳米疫苗的方法包含以下几个步骤:(a)在50~110℃,PH3~11的条件下,用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液;(b)在变性剂或者适合的变性条件下从而引起蛋白结构展开、巯基暴露,蛋白大分子再折叠或自组装,将免疫佐剂包裹在所述蛋白中;(c)将合成的纳米疫苗快速冷却,以停止反应;(d)将纳米疫苗透析,以除去多余的的小分子物质或者进一步浓缩;(e)对所得溶液进行脱水作用,制得能够保存的疫苗干粉。
本发明技术方案再进一步提出了一种抗原蛋白包载NOD受体激动剂组分用于免疫预防和治疗的新型纳米疫苗,制备这种纳米疫苗的方法包含以下几个步骤:(a)在50~110℃,PH3~11的条件下,用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液;(b)在变性剂或者适合的变性条件下从而引起蛋白结构展开、巯基暴露,蛋白大分子再折叠或自组装,将免疫佐剂包裹在所述蛋白中;(c)将合成的纳米疫苗快速冷却,以停止反应;(d)除去纳米疫苗多余的的小分子物质或进一步浓缩;(e)对所得溶液进行脱水作用,制得能够保存的疫苗干粉。
本发明技术方案再进一步提出了一种抗原蛋白包载低浓度化疗药用于免疫预防和治疗的新型纳米疫苗,制备这种纳米疫苗的方法包含以下几个步骤:(a)在50~110℃,PH3~11的条件下,用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液;(b)在变性剂或者适合的变性条件下从而引起蛋白结构展开、巯基暴露,蛋白大分子再折叠或自组装,将免疫佐剂包裹在所述蛋白中;(c)将合成的纳米疫苗快速冷却,以停止反应;(d)将纳米疫苗透析,以除去多余的小分子物质或者进一步浓缩;(e)对所得溶液进行脱水作用,制得能够保存的疫苗干粉。
对本发明所述技术方案的说明:
本发明所述的"纳米粒",指的处于微观体和宏观体系之间,尺度在1-1000nm之间的超微粒子。本发明所制备的新型纳米疫苗平均粒径分布于5nm到1000nm之间,最优的区间是30nm到400nm。而且,本发明所制备的新型纳米疫苗抗原组分≥80%以上,具有超高的抗原密度。
本发明中所述的将免疫佐剂包入蛋白,指的是免疫佐剂可以通抗原蛋白的结构展开、巯基暴露及去折叠,进入蛋白的中心区域。本发明中所述的免疫佐剂指代的是给人或动物服用或注射时,可引起机体免疫应答的蛋白、核苷酸、细胞因子、化合物以及混合物,该免疫应答包括免疫激活与免疫抑制。该免疫佐剂包括亲水性免疫佐剂及疏水型免疫佐剂。本领域技术人员清楚疏水性免疫佐剂的水溶性不好,亲水性药理活性物质能够优化的溶解在水中,可通过修饰巯基或其它基团,增加抗原蛋白对亲水性佐剂的负载率。疏水性的免疫佐剂可与抗原蛋白的疏水区结合,故抗原蛋白对其负载率较高。
本领域技术人员能够理解本发明中使用的免疫佐剂的量会根据抗原蛋白的量的变化而变化,同时根据纳米疫苗的量的变化而变化。同时,有经验的人能够意识到本发明中使用的免疫佐剂,可以是纯的物质,或者是它们的混合物,这些都没有背离本发明的范围。
本发明中,可以选择不同的蛋白去形成本领域技术人员所感兴趣的纳米疫苗,该蛋白即可指代免疫原性较强的抗原蛋白,又可指代免疫原性较弱,主要发挥载体及保护作用的载体蛋白。本发明中所涉及的蛋白包括所有的能够在变性剂作用下结构展开、巯基暴露可结合免疫佐剂的的蛋白或者多肽。合适的抗原蛋白的例子包括如下,但是不仅仅局限于此:来自于白喉(diphtheria)、破伤风(tetanus)、脊髓灰质炎(polio)、狂犬病(rabies)、百日咳(whooping cough)、甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎(hepatitis A,B or C)、黄热病(yellow fever)、伤寒(typhoid fever)、水痘(chickenpox)、麻疫(measles)、腿腺炎(mumps)、德国麻疫(German measles)、乙型脑炎(Japanese encephalitis)、流感(influenza)、脑膜炎(meningitis)、霍乱(cholera);由以下病毒介导的传染:轮状病毒(Rotavirus)、诺如病毒(Norovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytial Virus)、单纯疱疫病毒(Herpes Simplex Virus)、乳头状瘤病毒(PapillomaVirus)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)、西尼罗河病毒(West Nile Virus)、登革热病毒(Dengue Virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya Virus)、HIV(AIDS);由以下引起的细菌性疾病:链球菌(streptococci)、沙眼衣原体和肺炎衣原体(trachomatis and pneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌、粘膜炎莫拉氏菌、金黄色葡萄球菌或B型流感嗜血菌influenza type B),李斯特菌病(listeriosis)、志贺氏菌病(shigellosis)、沙门氏菌病(salmonellosis)、结核病(tuberculosis)、莱姆病(Lyme’s disease)、寄生虫疾病(parasitic complaints)诸如痕疾(malaria)、利什曼病(leishmaniosis)等;肿瘤抗原、肿瘤裂解物、肿瘤模式抗原OVA等;也可来自于免疫原性较弱的蛋白,包括卵白蛋白、血清白蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麦白蛋白、豆白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、血管内皮抑素、血红蛋白、肌红蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤维连接蛋白、纤层蛋白、胶原蛋白、明胶、人造多肽与蛋白,或者它们的组合。
在一个更优化的范围,适合于本发明的蛋白可随着目标疾病不同而选取不同的抗原蛋白,但优化后的抗原蛋白应符合以下特点:含有3个以上巯基,可在变性剂去折叠后通过化学键及次级键自组装形成纳米颗粒。本发明在此举例说明,包括如下:乙型肝炎或丙型肝炎(hepatitis A,B or C)、乳头状瘤病毒(Papilloma Virus)、肿瘤模式抗原OVA、肿瘤裂解物、白蛋白,血红蛋白以及它们的组合物。本领域技术人员会清楚本发明方法中,所述的抗原蛋白的量随着免疫佐剂的质量及纳米疫苗的质量的变化而变化
本发明方法中的步骤(a)为用第一种溶剂为溶解或上述抗原蛋白获得的抗原蛋白溶液。这里的抗原蛋白溶液指代两部分,包括抗原蛋白与能将抗原蛋白溶解的溶剂,该溶剂对抗原蛋白的溶解度良好,不会出现蛋白絮凝、沉淀等变性现象。在蛋白溶液中使用的第一种溶液举例如下,但不仅仅局限于此:水,生理盐水,糖,冻干保护剂和蛋白稳定剂,在更精确的范围,溶剂包括水,磷酸盐溶液,葡萄糖溶液,海藻糖溶液,3-吗啉丙磺酸(MOPS)、醋酸溶液,2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、柠檬酸、甘氨酸,三羟甲基氨基甲烷(Tris),辛酸钠或生理盐水。
在一个更加精确的范围,第一种溶剂包括水、醋酸缓冲液、MES缓冲液、PBS缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或他们的组合。本发明中所使用的抗原蛋白溶液中的溶剂的浓度只要适合溶解抗原蛋白、利于抗原蛋白再折叠及疫苗后处理,都是可行的。一般而言,蛋白溶液中溶剂的含量范围从0.001M到2M。优化的范围,从0.01M到1M。再优化的范围,从0.02M到0.2M。一个更加优化的范围,从0.05M到0.1M。本领域技术人员能够明白用来溶解蛋白的溶剂的浓度与体积量会根据抗原蛋白的性质及溶液浓度的变化而变化。
实验表明,本发明中的步骤(a)中的反应参数对于形成高质量的纳米疫苗来说,是非常重要的。一般来说,要获得一个理想的结果,本发明中的步骤(a)须在-20℃到120℃范围之间反应。优选为一个较为精确的范围是从50℃到110℃,最优的的范围是从60℃到100℃。合成过程已经证明,要获得一个高质量的纳米疫苗来说,其实验过程必须优化。该本发明中步骤(a)的pH须在3到9之间,一个比较精确的范围是从5到8.5,在一个更加精确的范围是从6到8。本领域技术人员能够清楚步骤(a)需要一段时间以使得蛋白充分的溶解,溶解时间的多少与溶解手段的复杂程度取决于于所使用的蛋白的种类,蛋白的浓度及使用溶剂的种类,溶剂的浓度和温度等其他因素。一般来说,本领域技术人员能够充分意识到,反应过程和反应过程的每一个步骤都需要充足的时间,同时,反应时间过长将导致抗原蛋白的聚集体过大导致溶液絮凝。在此举例说明,本方案反应时间需5min到12h不等。
本发明的第二个步骤即步骤(b)包括在变性剂或者合适的变性条件下,将免疫佐剂加入到经过步骤(a)所述形成的蛋白溶液中,使蛋白展开、巯基暴露,而后结构再折叠或者自纳米化形成纳米疫苗。这里使用的变性剂及合适的适合的变性条件指的是,该溶液及条件不仅能使抗原蛋白或者多肽三维结构发生改变,其二维结构也发生改变。一般而言,该步骤发生蛋白结构的不可逆变性。一般来说,在该步骤提到的变性剂或者适合的变性条件下诱导的变性,为温和的蛋白变性。本领域技术人员能够充分意识到蛋白的温和变性指的是在蛋白解折叠/变性之后,能够在某些条件下再折叠成合适的结构。变性剂或者适合的变性条件可以提供一个缓冲环境来破坏蛋白的二硫键、氢键,以及干扰蛋白内部的疏水作用。本步骤发生自纳米化指的是抗原蛋白分子与免疫佐剂发生的巯基/二硫键交换反应或其它化学反应,发生化学交联,并在疏水作用力及氢键的的共同作用下,产生稳定的纳米疫苗的过程。
本领域技术人员能够充分意识到许多试剂及溶液能够充当变性剂或者适合的变性条件。这里所述的变性剂或者适合的变性条件括水,强酸,强碱,无机盐,有机溶剂,结构展开剂和表面活性剂。合适的变性剂或者适变性条件举例如下,但是不仅仅局限于此:水、盐酸,硫酸,氢氧化钠甲醇,乙醇,异丙醇,福尔马林,氯仿,丙酮,硫化氢、十六烷基三甲基溴化铵、过氧化氢,谷胱甘肽,2-巯基乙醇,二硫苏糖醇,盐酸胍,尿素,十二烷基苯磺酸钠、直链烷基苯磺酸钠、谷胱甘肽,十二烷基硫酸钠、高氯酸,三丁基膦,甲巯丙脯氨酸,过甲酸,青霉胺,甲硫咪唑,乙酰半胱氨酸、氯化钠,磷酸盐,醋酸盐,甘氨酸,三羟甲基氨基甲烷,过氧化氢,谷胱甘肽,葡萄糖,蔗糖,甘露醇,海藻糖,乙酰色氨酸,辛酸钠或它们的组合。其中,一个更精确的变性剂剂变性条件范围是是水,醋酸盐,甘氨酸,氯化钠,葡萄糖,乙醇,丙酮,2-巯基乙醇,尿素、直链烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、或它们的组合。最优的是水、直链烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、尿素或它们的组合。实验证明,当变性剂或者适合的变性条件的pH在3-11之间。一个更加精确的pH范围是从3.5到9.5。
此外,所述的步骤(b)中适合的变性条件还包括外力操作以辅助蛋白展开,包括变化压力或光照辐射。一般来说,外加压力能使蛋白发生去折叠的力量。光照辐射致蛋白去折叠优选紫外光。所述紫外光波长为280-315nm、强度为每平方厘米450微瓦~50毫瓦。
所述的(c)步骤指的是将反应溶液从反应环境中取出,置于反应温度以下环境,快速停止反应。该反应温度优选为-10℃-10℃,最优为-5℃-5℃,较经济的为冰水浴。
本发明步骤(d))除去纳米疫苗多余的的小分子物质,或进一步浓缩。一般来说,这个步骤包括任意的能够将小分子从溶液中分离出去的方法,本领域技术人员能够充分意识到分离的方法包括任意的能够纯化蛋白或者多肽的方法。这些方法可包括这些方法可包括盐沉淀,超滤、透析,层析以及它们的组合。这些方法应做适当的选择。一个更加精细的范围,透析和超滤是可行的。最精细的范围,选择好合适的分子量,超滤操作。
本发明可能还需要一个步骤(e),将提纯或浓缩后的纳米粒经过脱水步骤制备成药物干粉,以方便储存和运输。本发明所涉及的保护的方法包括:减压干燥,冻干,喷雾干燥。
本领域技术人员能够意识到本发明的范围和精髓是变动的。去折叠的蛋白是变化的,同时许多的免疫佐剂是可使用的,许多的抗原蛋白和抗原多肽是可以用来作为载体的。本发明将会在下面的实施例中得到更加明确和清晰地描述。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
(1)首先,经本发明提供的方法形成的纳米疫苗组分简单,即仅含对免疫发挥作用抗原和免疫佐剂。由于本方法没有使用传统的纳米材料作为载体,这就避免了传统纳米载体的代谢及带来的生物安全性问题。其次,本发明方法在合成蛋白纳米颗粒时,没有采用一般蛋白纳米颗粒的合成方法使用化学交联剂,这就避免了化学交联剂如戊二醛带来的毒性问题;第三,该蛋白疫苗的质量较高,可包裹核苷酸、多肽、细胞因子及具有免疫功能的化疗药、其它化合物等平台型作用,尺寸可控性良好;第三,本方法创造性的利用抗原分子间的巯基及其它次级键,合成了稳定性较好的的纳米颗粒,合成方法简单、快捷,过程绿色环保,对环境无害。通过本技术方案合成的纳米疫苗,其抗原组分含量可搞到85%以上,远超过现有纳米疫苗与传统疫苗的抗原含量,抗原密度高。由于抗原密度高,在疾病的预防与治疗时,可以通过更少的接种频次与接种量,对病人更加方便,而且提高了疫苗的成本效率。
(2)通过本发明制备的新型纳米疫苗的另一个意义是,该纳米疫苗基本由抗原组成,其抗原密度高(一个50nm尺寸的纳米颗粒含有500个抗原分子);纳米颗粒表面由高度重复的抗原组分组成,可高度模拟病毒的衣壳结构。这种结构具有类似病毒的功能,可高效刺激机体产生高水平的免疫应答。此外,该疫苗除了传统疫苗的预防功能以外,还具有疾病的治疗功能。该新型纳米疫苗因亲水区暴露在外,其表面具有丰富的表面位点,可方便进行其他修饰,来靶向或输送抗原、佐剂细胞因子到免疫器官发挥更有效的作用。本发明可依据季报哪个的不同选取不同的抗原蛋白模型及佐剂药物来实现疾病的精准治疗,例如,我们可以将乙肝的的膜抗原提取出来,用本发明制备出具有超高抗原密度的乙肝疫苗,用于后续的治疗与预防实验。
附图说明
图1为不同反应时间对本发明中纳米疫苗粒径大小的影响图;
图2为同一反应时间,不同pH对本发明中纳米疫苗粒径大小的影响图;
图3为本发明中的肿瘤模式蛋白OVA负载免疫多肽纳米疫苗粒径-反应时间的尺寸可控图;
图4为本发明中不同水合粒径大小的肿瘤模式蛋白OVA@CpG纳米疫苗的凝胶电泳示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1:肿瘤模式抗原的纳米疫苗制备
6mg OVA粉末溶于2mL pH3.5的0.05M MES缓冲液中,过滤或离心出去絮状不溶物。向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的十二烷基硫酸钠水溶液50微升,搅拌2分钟,混合均匀。将反应溶液注入螺口玻璃瓶中拧紧,置于90℃油浴中加热,在磁力搅拌器上以750转/分钟的速度搅拌,反应时间为4-30分钟。随反应时间不同,可得到乳光程度不同的、粒径均匀的纳米粒子(如图1所示,随着反应时间的不同,得到质量良好、可控性较强的,具有不同粒径的纳米疫苗)。反应完毕后,将反应溶液置于冰水浴中1-2min,使反应快速终止。最后使用3000分子量的超滤管离心,或用3000分子量透析袋透析48h,除去体系内的杂质及未反应的组分,得到提纯浓缩的纳米疫苗。随着反应时间的不同,得到质量良好(PDI<0.2)、可控性较强的,具有不同粒径(20-500nm)的纳米疫苗。该纳米疫苗进行冷冻干燥36h,得到白色絮状固体。该纳米疫苗抗原质量分数为100%。该白色固体复溶后易被生理盐水、磷酸盐缓冲液、水等溶解为原溶液,且纳米粒粒径及多分散系数基本保持不变改变。复溶后的纳米疫苗粒径主要分布在30-500nm。
实验中,十二烷基硫酸钠还可用其它变性剂代替,比如水,直链烷基苯磺酸钠、强酸(硫酸、盐酸、高氯酸),强碱(氢氧化钠),十六烷基三甲基溴化铵、过氧化氢,谷胱甘肽,硫化氢,2-巯基乙醇,二硫苏糖醇,盐酸胍,尿素谷胱甘肽,三丁基膦,甲巯丙脯氨酸,过甲酸,青霉胺,甲巯咪唑,乙酰半胱氨酸以及它们的组合。结果发现,较温和的而变性剂有利于形成质量较高的纳米疫苗,实践证明,微量的十二烷基烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、尿素、还原剂和氧化剂对可以达到较好的粒径分布(PDI较小)。
实施例2:肿瘤模式抗原的纳米疫苗制备
6mg OVA粉末溶于2mL pH为3.0、4.0、5.0、6.0的缓冲液中,过滤或离心出去絮状不溶物。向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的十二烷基硫酸钠水溶液50微升,搅拌2分钟,混合均匀。将反应溶液注入螺口玻璃瓶中拧紧,置于90℃油浴中加热,在磁力搅拌器上以750转/分钟的速度搅拌,反应时间为25分钟。随反应时间不同,可得到乳光程度不同的、粒径均匀的纳米粒子(如图1所示)。反应完毕后,将反应溶液置于冰水浴中1-2min,使反应快速终止。最后使用3000分子量的超滤管离心,或用3000分子量透析袋透析48h,除去体系内的杂质及未反应的组分,得到提纯浓缩的纳米疫苗。冷冻干燥后的样品能够复融。如图2所示,随着溶液pH的不同,在同一反应时间内得到纳米疫苗粒径也不同。该纳米疫苗抗原质量分数为100%。
附加实验表明甘氨酸、蔗糖、乳糖和海藻糖均能作为冻干保护剂,且用乳糖做动感保护剂得到的纳米疫苗干粉质量最好。
实验中,抗原蛋白的缓冲体系替代MES缓冲液、甘氨酸缓冲液、邻苯二甲酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、巴比妥钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷(MOPS)缓冲液、哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)缓冲液、三乙醇胺(TEA)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)缓冲液、3-[N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)]氨基-2-羟丙烷磺酸(AMPSO)缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液、N-3-(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)缓冲液、N-3-(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙烷磺酸(TAPSO)缓冲液以及它们的组合。结果发现,浓度在0.01M-0.2M之间的缓冲液有利于形成质量较高的纳米疫苗,实践证明,对同一种蛋白而言,适宜的缓冲液浓度(0.05M)及pH(4.0)可利于形成分布较窄、质量较高(PDI<0.15)的纳米颗粒。
本实验考察了不同缓冲液pH对纳米疫苗的粒径及反应时间的影响。对OVA蛋白而言,pH越低,形成的纳米疫苗质量越高。
实施例3肿瘤模式抗原的纳米疫苗制备
6mg OVA粉末溶于2mL pH为3.5的0.05M MES缓冲液中,过滤或离心出去絮状不溶物。向抗原蛋白体系中加入变性剂,搅拌2分钟,混合均匀。将反应溶液注入螺口玻璃瓶中拧紧,置于50℃-120℃温度梯度下油浴中加热,在磁力搅拌器上以750转/分钟的速度搅拌,反应时间为10分钟。随反应时间不同,可得到乳光程度不同的、粒径均匀的纳米粒子(如图1所示)。反应完毕后,将反应溶液置于冰水浴中1-2min,使反应快速终止。最后使用3000分子量的超滤管离心,或用3000分子量透析袋透析48h,除去体系内的杂质及未反应的组分,得到提纯浓缩的纳米疫苗。结果显示,随着反应温度的不同,在同一反应时间内得到纳米疫苗粒径也不同,95℃环境下形成150nm大小的纳米疫苗,而80℃环境下反应形成的纳米疫苗为20nm。该纳米疫苗抗原质量分数为100%。
本实验考察了不同温度对纳米疫苗的粒径及反应时间的影响。温度越低,在相同时间内形成的纳米疫苗的粒径也越小。结果表明,温度在50℃-120℃均可形成纳米粒,在80-100℃形成的纳米疫苗质量更好。
实施例4:肿瘤模式抗原的纳米疫苗制备
6mg OVA粉末溶于2mL pH为6.0的0.05M MES缓冲液中,过滤或离心出去絮状不溶物混合均匀。将反应溶液注入螺口玻璃瓶中拧紧,置于70℃油浴中加热,在磁力搅拌器上以750转/分钟的速度搅拌,反应时间为1-10分钟。随反应时间不同,可得到乳光程度不同的、粒径均匀的纳米粒子(如图1所示)。反应完毕后,将反应溶液置于冰水浴中1-2分钟,使反应快速终止。最后使用3000分子量的超滤管离心,或用3000分子量透析袋透析48h,除去体系内的杂质,得到提纯浓缩的纳米疫苗。结果显示,在不加变性剂的情况下,本方法可在较短时间内形成粒径分布较窄的纳米疫苗。但因无变性剂的调剂作用,蛋白聚集过快,导致此类纳米疫苗不稳定。
实施例5:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg OVA粉末溶于2mL pH3.5的0.05M MES缓冲液中,过滤或离心出去絮状不溶物。向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的十二烷基硫酸钠水溶液50微升,搅拌均匀后,向将无酶水溶解的一定浓度的CpG,按照抗原:佐剂质量比(10:1,20:1,30:1)滴加到反应溶液里面,搅拌2分钟,混合均匀。将反应溶液注入螺口玻璃瓶中拧紧,置于90℃水浴中加热,在磁力搅拌器上以750转/分钟的速度搅拌,反应时间为4-30分钟。随反应时间不同,可得到乳光程度不同的、粒径均匀的纳米粒子(如图1所示)。反应完毕后,将反应溶液置于冰水浴中1-2min,使反应快速终止。最后使用3000分子量的超滤管离心,或用3000分子量透析袋透析48h,除去体系内的杂质及未反应的组分,得到提纯浓缩的纳米疫苗。如图3所示,随着反应时间的不同,得到质量良好、可控性较强的,具有粒径在20-450nm、多分散系数(PDI)小于0.15的的纳米疫苗。图4为不同水合粒径大小的肿瘤模式蛋白OVA@CpG纳米疫苗的凝胶电泳示意图,图中依次为抗原佐剂质量比为10:1,20:1,30:1时纳米疫苗的琼脂糖凝胶电泳图,从图中可以看出,该纳米疫苗可成功负载免疫佐剂CpG,具体来说,纳米疫苗抗原质量分数为97%,免疫组分为3%。
实施例6:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg OVA粉末溶于2mL pH3.5的0.05M MES缓冲液中,过滤或离心出去絮状不溶物。向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的十二烷基硫酸钠水溶液50微升,搅拌均匀后,将无酶水溶解的一定浓度的巯基修饰的寡核苷酸(SH-CpG),按照抗原:佐剂质量比(10:1)滴加到反应溶液里面,搅拌2分钟,混合均匀。将反应溶液注入螺口玻璃瓶中拧紧,置于90℃水浴中加热,在磁力搅拌器上以750转/分钟的速度搅拌。反应完毕后,将反应溶液置于冰水浴中1-2min,使反应快速终止。最后使用3000分子量的超滤管离心,得到提纯浓缩的纳米疫苗。得粒径分布在30-400nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为93%,佐剂成分为7%。该疫苗可高效刺激未成熟的骨髓来源的树突状细胞(BMDC)的表面标志物CD83、CD86上调,促进树突细胞成熟。
实施例7:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg OVA粉末溶于2mL pH 5的MES缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液30微升,搅拌均匀后,按照抗原:佐剂质量比(20:1)将无酶水溶解的聚肌苷酸胞苷酸poly(I:C)滴加到反应溶液里面,60℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-400nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例8:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg OVA粉末溶于2mL pH 5的MES缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液30微升,搅拌均匀后,按照抗原:佐剂质量比(10:1)将Pam3Cys滴加到反应溶液里面,60℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-400nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为91%,佐剂成分为9%。
实施例9:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg OVA粉末溶于2mL pH 4的MES缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液30微升,搅拌均匀后,将NOD样受体激动剂滴加到反应溶液里面,80℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为85%,佐剂成分为15%。
实施例10:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg肿瘤裂解物溶于2mL pH 5的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,将CpG滴加到反应溶液里面,75℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例11:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg肿瘤裂解物溶于2mL pH 5的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为3%的十二烷基磺酸钠水溶液20微升,搅拌均匀后,将CpG滴加到反应溶液里面,75℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例12:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg肿瘤裂解物溶于2mL pH 5的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为3%的尿素水溶液30微升,搅拌均匀后,将CpG滴加到反应溶液里面,80℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为93%,佐剂成分为7%。
实施例13:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg肿瘤裂解物溶于2mL pH 5的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为3%的尿素水溶液30微升,搅拌均匀后,将SH-CpG滴加到反应溶液里面,85℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为92%,佐剂成分为8%。
实施例14:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg肿瘤裂解物溶于2mL pH 5的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,将Poly(I:C)滴加到反应溶液里面,70℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例15:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg肿瘤裂解物溶于2mL pH 5的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,80℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为100%。
实施例16:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg肿瘤裂解物溶于2mL pH 5的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,将NOD样受体激动剂滴加到反应溶液里面,85℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为86%,佐剂成分为14%。
实施例17:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg肿瘤裂解物溶于2mL pH 5的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,将Pam3Cys滴加到反应溶液里面,85℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例18:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg肿瘤裂解物溶于2mL pH 5的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,将咪唑喹啉滴加到反应溶液里面,85℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例19:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg肿瘤裂解物溶于2mL pH 5的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,将胞壁酰二肽滴加到反应溶液里面,85℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为87%,佐剂成分为13%。
实施例20:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg肿瘤裂解物溶于2mL pH 5的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,将多糖滴加到反应溶液里面,85℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为87%,佐剂成分为13%。
实施例21:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg肿瘤裂解物溶于2mL pH 5的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,将细胞因子溶液滴加到反应溶液里面,85℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为87%,佐剂成分为13%。
实施例22:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
肿瘤模式抗原OVA 6mg溶于2mL pH 4的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,将多糖滴加到反应溶液里面,85℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例23:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
肿瘤模式抗原OVA 6mg溶于2mL pH 3的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液10微升,搅拌均匀后,将细胞因子滴加到反应溶液里面,60℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例24:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
肿瘤模式抗原OVA 6mg溶于2mL pH 3的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液10微升,搅拌均匀后,将具有免疫佐剂功能的质粒滴加到反应溶液里面,60℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例25:肿瘤模式抗原负载免疫佐剂纳米疫苗的制备
6mg肿瘤裂解物溶于2mL pH 4的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,将免疫佐剂功能的质粒滴加到反应溶液里面,85℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例26:白喉病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
6mg白喉病毒抗原溶于2mL pH 4的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,将CpG滴加到反应溶液里面,85℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例27:乙肝病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
6mg乙肝病毒表面抗原溶于2mL pH 4的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,将CpG滴加到反应溶液里面,85℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例28:乙肝病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
6mg乙肝病毒核心抗原溶于2mL pH 4的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,将CpG滴加到反应溶液里面,85℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例29:乙肝病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
6mg乙肝病毒e抗原溶于2mL pH 4的Tris缓冲液中,向抗原蛋白体系中加入质量分数为6%的SDS水溶液20微升,搅拌均匀后,将CpG滴加到反应溶液里面,85℃水浴反应,750rpm磁力搅拌。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为93%,佐剂成分为7%。
实施例30:破伤风病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为破伤风病毒抗原,不加任何佐剂。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为100%。
实施例31:破伤风病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为破伤风病毒抗原,佐剂CpG变为巯基CpG。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例32:破伤风病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为破伤风病毒抗原,佐剂CpG变为NOD免疫佐剂。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例33:脊髓灰质炎病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为脊髓灰质炎病毒抗原,不加任何佐剂。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为100%。
实施例34:脊髓灰质炎病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为脊髓灰质炎病毒抗原,佐剂CpG变为巯基CpG。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例35:脊髓灰质炎病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为脊髓灰质炎病毒抗原,佐剂CpG变为NOD免疫佐剂。反应完毕后,冷却终止反应。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例36:狂犬病病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为狂犬病病毒抗原,不加任何佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为100%。
实施例37:狂犬病病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为狂犬病病毒抗原,佐剂CpG变为巯基CpG。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例38:狂犬病病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为狂犬病病毒抗原,佐剂CpG变为NOD免疫佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例39:甲型肝炎病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为甲型肝炎病毒抗原,不加任何佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为100%。
实施例40:甲型肝炎病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为甲型肝炎病毒抗原,佐剂CpG变为巯基CpG。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例41:甲型肝炎病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为甲型肝炎病毒抗原,佐剂CpG变为NOD免疫佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例42:丙型肝炎病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为丙型肝炎病毒抗原,不加任何佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为100%。
实施例43:丙型肝炎病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为丙型肝炎病毒抗原,佐剂CpG变为巯基CpG。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例44:丙型肝炎病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为丙型肝炎病毒抗原,佐剂CpG变为NOD免疫佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例45:伤寒病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为伤寒病毒抗原,不加任何佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为100%。
实施例46:伤寒病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为伤寒病毒抗原,佐剂CpG变为巯基CpG。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例47:伤寒病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为伤寒病毒抗原,佐剂CpG变为NOD免疫佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例48:水痘病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为水痘病毒抗原,不加任何佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为100%。
实施例49:水痘病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为水痘病毒抗原,佐剂CpG变为巯基CpG。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例50:水痘病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为水痘病毒抗原,佐剂CpG变为NOD免疫佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例51:麻疫病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为麻疫病毒抗原,不加任何佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为100%。
实施例52:麻疫病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为麻疫病毒抗原,佐剂CpG变为巯基CpG。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例53:麻疫病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为麻疫病毒抗原,佐剂CpG变为NOD免疫佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例54:乳头瘤病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为乳头瘤病毒抗原,不加任何佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为100%。
实施例55:乳头瘤病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为乳头瘤病毒抗原,佐剂CpG变为巯基CpG。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例56:乳头瘤病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为乳头瘤病毒抗原,佐剂CpG变为NOD免疫佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例57:HIV病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为HIV病毒抗原,不加任何佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为100%。
实施例58:HIV病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为HIV病毒抗原,佐剂CpG变为巯基CpG。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例59:HIV病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为HIV病毒抗原,佐剂CpG变为NOD免疫佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例60:结核病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为结核病毒抗原,不加任何佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为100%。
实施例61:结核病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为结核病毒抗原,佐剂CpG变为巯基CpG。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为95%,佐剂成分为5%。
实施例62:结核病毒抗原负载免疫佐剂纳米病毒疫苗的制备
本实施例与实施例6相同,仅改变卵清蛋白为结核病毒抗原,佐剂CpG变为NOD免疫佐剂。可得粒径分布在30-500nm,PDI小于0.2的纳米疫苗。该纳米疫苗抗原组分为90%,佐剂成分为10%。
实施例63
一种蛋白自组装新型纳米疫苗,该疫苗仅包含抗原蛋白和免疫佐剂,由自体内部的巯基通过巯基/二硫键反应形成以二硫键为主,以疏水作用力、氢键、静电作用力弱相互作用力为辅,将免疫佐剂及抗原肽包封在形成的纳米颗粒中,其中抗原蛋白质量占比为85%,免疫佐剂占比为15%,不需要使用任何化学交联剂和纳米载体,其平均粒径在20nm,并且具有还原敏感性。
使用的抗原蛋白为含有半胱氨酸和/或二硫键的蛋白质。本实施例中的抗原蛋白为白喉(diphtheria),免疫佐为剂Toll样受体激动剂,本实施例选用CpG ODN。
蛋白自组装新型纳米疫苗的制备方法采用以下步骤:
(a)在-10℃,pH为3的缓冲液条件下,用生理盐水作为溶剂溶解抗原蛋白获得蛋白溶液;
(b)在变性剂2-巯基乙醇的作用下,将免疫佐剂加入步骤(a)得到的蛋白溶液中,快速升温至60℃,使蛋白去折叠以巯基暴露,通过二硫键交联以及蛋白再折叠或自组装,把免疫佐剂或多肽包入蛋白,自纳米化形成蛋白纳米颗粒,即制备得到纳米疫苗。
制备得到的蛋白纳米颗粒通过超滤或透析,去除体系内的杂质,得到提纯或浓缩的纳米疫苗,还可以经过冻干脱水制备成疫苗制剂。
实施例64
一种蛋白自组装新型纳米疫苗,该疫苗仅包含抗原蛋白和抗原肽,由自体内部的巯基通过巯基/二硫键反应形成以二硫键为主,以疏水作用力、氢键、静电作用力弱相互作用力为辅,将免疫佐剂及抗原肽包封在形成的纳米颗粒中。该疫苗的抗原蛋白质量占比为95%,抗原肽占比5%。不需要使用任何化学交联剂和纳米载体,其平均粒径在500nm,并且具有还原敏感性。
抗原蛋白为含有半胱氨酸和/或含≥3个二硫键的抗原蛋白,本实施例选用诺如病毒(Norovirus),抗原肽为具有抗原活性的寡肽或其衍生物,本实施例选用EGFR237-267。
蛋白自组装新型纳米疫苗的制备方法采用以下步骤:
(a)在110℃,pH为11的缓冲液条件下,用邻苯二甲酸缓冲液作为溶剂溶解抗原蛋白获得蛋白溶液;
(b)在100℃、加入盐酸,其与与抗原蛋白之间的摩尔比在30:1,将免疫佐剂加入步骤(a)得到的蛋白溶液中,快速升温至120℃,使蛋白去折叠以巯基暴露,通过二硫键交联以及蛋白再折叠或自组装,把免疫佐剂或多肽包入蛋白,自纳米化形成蛋白纳米颗粒,即制备得到纳米疫苗。
制备得到的蛋白纳米颗粒通过超滤或透析,去除体系内的杂质,得到提纯或浓缩的纳米疫苗,还可以经过减压蒸馏脱水制备成疫苗制剂。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
Claims (20)
1.一种蛋白自组装新型纳米疫苗,其特征在于,该疫苗仅包含抗原蛋白和免疫佐剂或抗原肽,由自体内部的巯基通过巯基/二硫键反应形成以二硫键为主,以疏水作用力、氢键、静电作用力弱相互作用力为辅,将免疫佐剂及抗原肽包封在形成的纳米颗粒中。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗,其特征在于,该疫苗的抗原蛋白质量占比≥85%,免疫佐剂或抗原肽占比≤15%。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗,其特征在于,该疫苗不使用化学交联剂和纳米载体。
4.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗,其特征在于,该疫苗的平均粒径在20-500nm。
5.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗,其特征在于,该疫苗具有还原敏感性。
6.根据权利要求1或2所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗,其特征在于,所述的抗原蛋白为含有半胱氨酸和/或二硫键的蛋白质,优选含有半胱氨酸和/或含≥3个二硫键的抗原蛋白。
7.根据权利要求6所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗,其特征在于,所述的抗原蛋白包含如下结构中的一种:
白喉(diphtheria)、破伤风(tetanus)、脊髓灰质炎(polio)、狂犬病(rabies)、百日咳(whooping cough)、甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎(hepatitis A,B or C)、黄热病(yellow fever)、伤寒(typhoid fever)、水痘(chickenpox)、麻疫(measles)、腿腺炎(mumps)、德国麻疫(German measles)、乙型脑炎(Japanese encephalitis)、流感(influenza)、脑膜炎(meningitis)或霍乱(cholera);
由以下病毒介导的传染:轮状病毒(Rotavirus)、诺如病毒(Norovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)、单纯疱疫病毒(HerpesSimplex Virus)、乳头状瘤病毒(Papilloma Virus)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)、西尼罗河病毒(West Nile Virus)、登革热病毒(Dengue Virus)、基孔肯雅病毒(ChikungunyaVirus)或HIV(AIDS);
由以下引起的细菌性疾病:链球菌(streptococci)、沙眼衣原体和肺炎衣原体(trachomatis and pneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌、粘膜炎莫拉氏菌、金黄色葡萄球菌或B型流感嗜血菌influenza type B),李斯特菌病(listeriosis)、志贺氏菌病(shigellosis)、沙门氏菌病(salmonellosis)、结核病(tuberculosis)、莱姆病(Lyme’s disease)、寄生虫疾病(parasitic complaints)诸如痕疾(malaria)或利什曼病(leishmaniosis);
各种肿瘤抗原、肿瘤裂解物或肿瘤模式抗原OVA;
或者来自于免疫原性较弱的蛋白,包括血清白蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麦白蛋白、豆白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、血管内皮抑素、血红蛋白、肌红蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤维连接蛋白、纤层蛋白、胶原蛋白、明胶、人造多肽与蛋白,或者它们的组合。
8.根据权利要求1或2所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗,其特征在于,所述的免疫佐为剂Toll样受体激动剂、NOD样受体激动剂、细胞因子佐剂、DNA类免疫佐剂、皂苷类佐剂、多肽类佐剂及抗原肽、多糖类佐剂、无机纳米佐剂、有机纳米佐剂、化疗药或它们的组合。
9.根据权利要求8所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗,其特征在于,
所述的Toll样受体激动剂为CpG ODN、poly(I:C)或肽聚糖;
所述的NOD样受体激动剂为γ-D-谷氨酸-meso-二氨基庚二酸(γ-D-glu-meso-DAP),或NOD2识别的配体胞壁酸二肽(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺,MDP);
所述的细胞因子佐剂为白细胞介素-12、干扰素-γ或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子;
所述的DNA类免疫佐剂是编码细胞因子(白细胞介素类、干扰素类、肿瘤坏死因子类或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的质粒;
所述的多肽类佐剂及抗原肽为亚单位疫苗以及提纯的抗原肽;
所述的多糖类佐剂为脂多糖、黄芪多糖、人参多糖、党参多糖、枸杞多糖、淫羊藿多糖、当归多糖、灵芝多糖、香菇多糖或牛膝多糖;
所述的无机纳米佐剂为采用无机材料形成的纳米粒子,包括纳米氢氧化铝、纳米二氧化硅、纳米磷酸钙、纳米石墨烯、纳米炭管、纳米四氧化三铁或纳米金;
所述的有机纳米佐剂为采用有机材料形成的纳米粒子,包括高分子纳米粒/囊泡、生物大分子基纳米粒以及有机小分子组装形成的纳米粒,所述的高分子纳米粒/囊泡包括PLGA纳米粒或脂质体,所述的生物大分子基纳米粒包括壳聚糖类纳米粒或灭活病毒纳米颗粒;
所述的化疗药是使用过程中低剂量化疗可促免疫的化疗药,包括紫杉醇、多柔比星、顺铂或恩比霉素。
10.根据权利要求1或2所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗,其特征在于,所述的抗原肽为具有抗原活性的寡肽或其衍生物,包括EGFR237-267,OVA323-339,CETP461-476以及MHC-I键合肽或MHC-II键合肽。
11.一种蛋白自组装新型纳米疫苗的制备方法,其特征在于,该方法采用以下步骤:
(a)用溶剂溶解抗原蛋白获得蛋白溶液;
(b)在变性剂或者适合的变性条件下,将免疫佐剂或抗原肽加入步骤(a)得到的蛋白溶液中,使蛋白去折叠以巯基暴露,通过二硫键交联以及蛋白再折叠或自组装,把免疫佐剂或多肽包入蛋白,自纳米化形成蛋白纳米颗粒,即制备得到纳米疫苗。
12.根据权利要求11所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗的制备方法,其特征在于,步骤(a)在-10℃~110℃,pH为3-11.0的缓冲液条件下,用溶剂完全溶解抗原蛋白。
13.根据权利要求11或12所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗的制备方法,其特征在于,所述的溶剂为水,生理盐水,磷酸盐,醋酸盐,3-吗啉丙磺酸(MOPS)、2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液、柠檬酸缓冲液、甘氨酸缓冲液,4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、如甘氨酸缓冲液、邻苯二甲酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、巴比妥钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、过氧化氢,谷胱甘肽,葡萄糖或它们的组合。
14.根据权利要求11所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗的制备方法,其特征在于,步骤(b)所述的变性剂为2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、吐温80、十六烷基三甲基溴化铵、盐酸胍、直链烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、尿素、高氯酸、三丁基膦、甲巯丙脯氨酸、过甲酸、青霉胺、谷胱甘肽、甲硫咪唑、乙酰半胱氨酸、三氯乙酸、或它们的组合,变性剂的加入量依据变性剂本身的物理性质及变性响应速度来确定。
15.根据权利要求11所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗的制备方法,其特征在于,步骤(b)所述的适合的变性条件是控制温度60-100℃、加入适量强酸或强碱或有机溶剂或结构展开剂,上述组分与抗原蛋白之间的摩尔比在30:1~1000:1。
16.根据权利要求15所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗的制备方法,其特征在于,
所述的强酸为盐酸或硫酸,
所述的强碱为氢氧化钠,
所述的有机溶剂为甲醇,乙醇,异丙醇,福尔马林,氯仿,丙酮,硫化氢或它们的组合,
所述的结构展开剂为水,氯化钠,磷酸盐,醋酸盐,甘氨酸,三羟甲基氨基甲烷,十六烷基三甲基溴化铵、过氧化氢,谷胱甘肽,2-巯基乙醇,二硫苏糖醇,盐酸胍,尿素,直链烷基苯磺酸钠、谷胱甘肽,十二烷基硫酸钠、高氯酸,三丁基膦,甲巯丙脯氨酸,过甲酸,青霉胺,甲硫咪唑,乙酰半胱氨酸或它们的组合。
17.根据权利要求11所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗的制备方法,其特征在于,步骤(b)中加入免疫佐剂或抗原肽后,快速升温至60-120℃,制备得到蛋白纳米颗粒。
18.根据权利要求11所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗的制备方法,其特征在于,制备得到的蛋白纳米颗粒通过超滤或透析,去除体系内的杂质,得到提纯或浓缩的纳米疫苗。
19.根据权利要求18所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗的制备方法,其特征在于,提纯或浓缩的纳米疫苗经脱水制备成疫苗制剂。
20.根据权利要求19所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗的制备方法,其特征在于,脱水采用冻干、减压蒸馏或喷雾干燥。
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