TW201818960A - 使用低分子化ＰＲＰ之Ｈｉｂ接合型疫苗之製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供保存安定性優良之PRP接合物的調製方法及Hib接合型疫苗之製造方法。本發明之PRP接合物之調製方法之特徵為當進行PRP與載體蛋白質之結合反應時，藉由使用比天然PRP更低分子化之PRP，抑制PRP從調製後之PRP接合物的游離。以由本調製方法所得到之PRP接合物作為抗原的Hib接合型疫苗，亦同樣地保存安定性優良，且保持充分之免疫原性。

Description

使用低分子化PRP之Hib接合型疫苗之製造方法
本發明係關於藉由聚磷酸核糖基核糖醇(PRP)與載體蛋白質進行結合反應，調製PRP接合物之方法、以及流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)b型(Hib)接合型疫苗之製造方法。
流感嗜血桿菌為兼嫌氣性(facultative anaerobic)革蘭氏陰性桿菌，具有呈現絲狀或球菌狀之形態的「多形性」性質，無芽胞或鞭毛。依據有無莢膜分類為無莢膜株及有莢膜株，已知為有莢膜株之b型株(Hib)的病原性特別高。Hib感染為乳幼兒之髓膜炎的主要原因，附著於上呼吸道之Hib菌侵入血中，從菌血症擴及全身，引起髓膜炎、咽頭蓋炎、關節炎等全身感染症。
已知針對Hib之莢膜多糖體，即PRP，的抗體在Hib感染之防禦方面有效，然而由於只基於PRP成分之Hib疫苗為T細胞非依存性，對於免疫系統尚未成熟之出生後未滿18個月的乳幼兒效果不充分。因此，使PRP與載體蛋白質接合(conjugate)(結合)，開發T細胞依存性之 接合型疫苗，而使用於乳幼兒。
PRP等多糖類與載體蛋白質結合而成之接合型疫苗為周知。專利文獻1揭示有關Hib與糖蛋白質之接合物之製法及作為混合疫苗使用，專利文獻2揭示有關寡聚糖接合型疫苗之改良製造方法。
PRP之生產方法亦為周知。專利文獻3揭示以培養基培養Hib株後，將上清液精製，萃取PRP的方法。
破傷風類毒素，依照WHO規格，要求超過1,000Lf/mgPN之純度。據報導世界各國之製造業者34公司中有31公司符合此基準，其中有15公司達到超過1,500LF/mgPN之純度(非專利文獻1)。又，歐州藥局方(EP：European Pharmacopoeia)之Hib接合型疫苗的規格方面，為>1,500Lf/mgPN。就破傷風類毒素之精製方法而言，可使用硫酸銨沉澱或三氯乙酸沉澱、管柱層析(凝膠過濾層析、親和層析)、鹽析、透析等。
關於多糖類與載體蛋白質之結合比的檢討，於專利文獻4中報導。若依據專利文獻4，揭示關於一種複合疫苗，其特徵為多糖類對蛋白質之比為1：0.3至1：2。
就評價Hib接合型疫苗之免疫原性的方法而言，已知有使用大鼠之免疫原性試驗，關於抗體價，係依據ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay；酵素免疫測定法)等進行評價(非專利文獻2至4)。其他方面，已知有使用小鼠、天竺鼠(非專利文獻5)、或猴(非專利文獻6)之評價。
已知PRP從PRP接合物游離而得之游離PRP，與對抗PRP之抗體價，成為逆相關，又，已知游離PRP不易上升之疫苗，從安定性、有效性之觀點而言，甚為重要(非專利文獻7)。
有關使用長度不同之PRP，藉由還原胺化法調製Hib接合物，進行免疫原性評價之結果，於非專利文獻8中報導。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開昭62-30726
[專利文獻2]日本特開平6-340550
[專利文獻3]日本特表2015-522272
[專利文獻4]日本特表平11-507026
[專利文獻5]PCT公開第93/15760號
[專利文獻6]美國專利第4673574號
[專利文獻7]歐州公開第161188號
[專利文獻8]歐州公開第208375號
[專利文獻9]歐州公開第477508號
[專利文獻10]美國專利第4220717號
[專利文獻11]美國專利第4459286號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Vaccine 14 (4) (1996) 313-320
[非專利文獻2]The Journal of Infectious Diseases, 190, 1177-1182, 2004
[非專利文獻3]The Journal of Infectious Diseases, 191, 58-64, 2005
[非專利文獻4]Vaccine 24 (2006) 3505-3512
[非專利文獻5]Vaccine 16 (1998) 1842-1849
[非專利文獻6]Vaccine 19 (2001) 902-907
[非專利文獻7]Vaccine 25 (2007) 194-200
[非專利文獻8]Vaccine 33 (2015) 2646-2654
[非專利文獻9]Infection and Immunity, 40(1)1983, 245-256
[非專利文獻10]Biologicals 35 (2007) 235-245
[非專利文獻11]Vaccine 32 (2014) 5650-5656
[非專利文獻12]Vaccine 12 (8) (1994) 700-706
[非專利文獻13]Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 21 (6) (2000) 1087-1091
[非專利文獻14]Journal of Microbiology and Biotechnology (2003), 13(3), 469-472
以PRP接合物作為抗原之Hib接合型疫苗，雖對乳幼兒之免疫原性亦高度有效，然而在疫苗保存中由於PRP從載體蛋白質游離，造成保存安定性降低之問題。雖然期望開發更安定的Hib接合型疫苗，然而未曾報導能 抑制游離PRP含量上升的有效方法。
本發明為鑑於上述情事而產生者，提供保存安定性優良之PRP接合物的調製方法及Hib接合型疫苗之製造方法。
本發明人等，為能解決上述課題而專心檢討之結果，發現藉由使用比天然PRP更適度低分子化之PRP，而調製游離PRP含量上升受到抑制之安定PRP接合物的方法。再者，本發明人等藉由努力檢討有關PRP及載體蛋白質付諸於反應時之重量比，載體蛋白質(尤其破傷風類毒素)之純度，PRP接合物調製後之保存溶液的pH，發現更安定之Hib接合型疫苗的製造方法。
亦即，本發明包含以下事項。
[1]一種調製方法，係藉由聚磷酸核糖基核糖醇(PRP)與載體蛋白質進行結合反應，而調製PRP接合物之方法，其特徵為藉由使用比天然PRP更低分子化之PRP，而抑制PRP從調製後之PRP接合物游離。
[2]如[1]記載之方法，包含PRP接合物於調製後，保存於pH5.4至6.3之溶液中。
[3]如[2]記載之方法，其中於pH5.4至6.3之溶液，37℃、4週之苛酷試驗中，游離PRP含量小於50%。
[4]如[1]至[3]中任一項記載之方法，其中PRP之低分子化的方法為物理性破碎。
[5]如[1]至[3]中任一項記載之方法，其中PRP之低分 子化的方法為藉由酸或鹼之水解。
[6]如[1]至[5]中任一項記載之方法，其中低分子化之PRP的分子量為80至150kDa。
[7]如[1]至[6]中任一項記載之方法，其中在調製PRP接合物之結合反應中，PRP及載體蛋白質係以重量比2：1至4：1付諸於反應。
[8]如[7]記載之方法，其中PRP及載體蛋白質係以重量比4：1付諸於反應。
[9]如[1]至[8]中任一項記載之方法，包含在調製PRP接合物之結合反應之前，使用1-氰基-4-(二甲基胺基)吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)，使低分子化PRP活化的步驟。
[10]如[1]至[9]中任一項記載之方法，其中載體蛋白質為破傷風類毒素。
[11]如[10]記載之方法，其中破傷風類毒素之純度為2,500至3,500LF/mgPN。
[12]如[11]記載之方法，其中破傷風類毒素之純度為2,900至3,300LF/mgPN。
[13]一種流感嗜血桿菌b型(Hib)接合型疫苗之製造方法，包含[1]至[11]中任一項記載之方法。
[14]一種以[13]記載之製造方法所製造之Hib接合型疫苗的用途，係作為混合疫苗使用。
[15]一種以[13]記載之製造方法所製造之Hib接合型疫苗的用途，係與沉降精製百日咳白喉破傷風不活化小兒麻痺混合疫苗合製成5種混合疫苗使用。
若依照本發明，可將調製後之PRP接合物長期安定地保存。再者，可使Hib接合型疫苗保有原來充分的免疫原性而安定地保存。
關於第1圖至第7圖係說明如下。
[第1圖]係展示藉由本發明之一實施態樣所調製的PRP接合物於37℃保存4週後，游離PRP含量(%)之上升與PRP分子量之關係圖。
[第2圖]係展示以藉由本發明之一實施態樣改變PRP分子量而調製之PRP接合物作為抗原的Hib接合型疫苗，以1/25SHD(Single Human Dose)及1/50SHD對大鼠進行免疫時之免疫原性圖。
[第3圖]係展示以藉由本發明之一實施態樣改變付諸於結合反應之PRP與載體蛋白質之重量比而調製之PRP接合物作為抗原的Hib接合型疫苗，以1/25SHD及1/50SHD對大鼠進行免疫時之免疫原性圖。
[第4圖]係展示以藉由本發明之一實施態樣改變付諸於結合反應之PRP與載體蛋白質之重量比而調製之PRP接合物作為抗原的Hib接合型混合疫苗，以1/100SHD及1/500SHD對大鼠進行免疫時之免疫原性圖。
[第5圖]係展示將以藉由本發明之一實施態樣調製之PRP接合物作為抗原的Hib接合型混合疫苗，在改變投與 量下，對大鼠進行3次免疫時之免疫原性圖。
[第6圖]係展示以藉由本發明之一實施態樣改變付諸於結合反應之PRP與載體蛋白質之重量比而調製之PRP接合物作為抗原的Hib接合型混合疫苗，於37℃保存4週時，游離PRP含量(%)之上升與保存溶液pH之關係圖。
[第7圖]係展示以藉由本發明之一實施態樣改變付諸於結合反應之PRP與載體蛋白質之重量比而調製之PRP接合物作為抗原的Hib接合型混合疫苗，於10℃保存45個月時，游離PRP含量(%)之上升與保存溶液pH之關係圖。
[用於實施發明之態樣]
以下，詳細說明本發明之較佳實施態樣。但是，本發明並未限定於以下之實施態樣。
根據本發明之實施態樣的PRP接合物之調製方法，其特徵為當進行PRP與載體蛋白質之結合反應時，藉由使用比天然PRP更低分子化之PRP，而抑制PRP從調製後之PRP接合物游離。關於以依照本調製方法所得到之PRP接合物作為抗原的Hib接合型疫苗，同樣地保存安定性優良，且保持充分之免疫原性。
PRP接合物可藉由周知之結合技術調製。例如可將PRP經由硫醚鍵結合。在此結合方法中，藉由將PRP以1-氰基-4-(二甲基胺基)吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)活化，形成氰酸酯。以此種方式活化之PRP，可直接或經由間隔基與載體蛋白質之胺基結合。較佳為將氰酸酯與己二胺結 合，藉由伴隨硫醚鍵之形成的異源接合化學反應，使胺基衍生物化多糖與載體蛋白質接合(專利文獻5)。
除上述之外，亦可藉由還原胺化方法調製接合物(專利文獻6至9)。再者，就其他方法而言，可列舉將以己二酸二醯肼(ADH)衍生物化之溴化氰(CNBr)活化多糖，藉由碳化二亞胺縮合而結合於載體蛋白質的方法(非專利文獻9)。
就載體蛋白質而言，可列舉破傷風類毒素、百日咳類毒素、白喉類毒素、為白喉類毒素之基因變異體的CRM197、非莢膜型嗜血流感桿菌D抗原、髓膜炎B群之外膜蛋白質(OMP)等。對PRP接合物而言，典型的載體蛋白質為破傷風類毒素。
在使用破傷風類毒素作為載體蛋白質之情況，其純度係以WHO規格的1,000Lf/mgPN以上使用。在本發明之方法中，破傷風類毒素之純度越高越好，以2,500至3,500Lf/mgPN為較佳。更佳為2,900至3,300Lf/mgPN。
就將PRP低分子化之方法而言，可列舉藉由高壓乳化機之物理性破碎。在此情況，藉由10,000至30,000psi之壓力，以10分鐘至2小時進行破碎。較佳為以20,000至30,000psi之壓力經10分鐘至2小時，更佳為以25,000至30,000psi之壓力經10分鐘至2小時進行破碎。
就將PRP低分子化之方法而言，亦可採取使用酸、氧化劑或鹼之水解。就酸、氧化劑而言，可列舉鹽酸、硫酸、過碘酸鈉等，就鹼而言，可列舉氫氧化鈉、碳 酸氫鈉等。
由於未進行低分子化之天然PRP的分子量為約250至400kDa，經低分子化之PRP的分子量成為小於250kDa。在本發明中，以80至150kDa為較佳，更佳為80至100kDa。
分子量之測定係藉由使用非專利文獻10或非專利文獻11所記載之HPLC(High Performance Liquid Chromatography；高效液體層析)裝置之方法進行。在此情況，校正曲線係使用普魯蘭多糖等製成，可求得為普魯蘭多糖等之換算值的峰頂之分子量。或者，亦可藉由使用MALS(Multi Angle Light Scattering；多角度光散射檢測器)之方法，求取絶對分子量。此外，只要為能進行分子量之測定的方法，任何方法均可使用。
藉由使用低分子化之PRP，提高PRP接合物之保存安定性的作用機構，推測有以下2點：(1)於低分子化PRP接合物之情況，由於與載體蛋白質結合之PRP的長度短，即使藉由水解而PRP被切斷，游離之PRP的總量變少，(2)藉由PRP低分子化，接合物之間所存在的PRP不易切斷。但是，立體構造上亦有限制，只是單純地過於低分子化，安定性亦無法改善，並非所謂越短越好。
在本發明之一實施態樣中，為了避免對載體蛋白質產生過度的抗體回應，又為了減少載體蛋白質之使用量而提高每單位載體蛋白質之疫苗生產性，PRP與載體蛋白質係以重量比2：1至4：1之範圍付諸於結合反應。 更佳之重量比為4：1。
PRP接合物保存溶液之pH以5.0至6.6為較佳，更佳為pH5.4至6.3。pH調整可藉由鹽酸或乙酸等酸，氫氧化鈉、碳酸氫鈉等鹼液進行調整，亦可使用緩衝液。保存溶液只要能維持前述之pH之範圍的組成即可，可為磷酸緩衝溶液、乙酸緩衝溶液、MES緩衝溶液，亦可為琥珀酸緩衝溶液等其他緩衝溶液。
游離PRP含量之測定可依照非專利文獻12至14等所記載之方法進行。檢討安定性時之長期保存試驗的溫度條件，係於5±3℃或在避免凍結下於10℃以下進行。或者，亦可於更高溫條件下加速地評價安定性。
依照本發明之方法所製作的Hib接合型疫苗之免疫原性，可藉由對大鼠或猴等動物施予免疫，測定抗PRP抗體價而求得。抗體價係藉由ELISA等測定。或者，亦可藉由使用如非專利文獻11之補充物及Hib菌的血清殺菌抗體(SBA；Serum Bactericidal antibody)試驗而進行評價。由於如非專利文獻11所記載，已知抗體價與SBA價有一定程度相關，亦可藉由採用ELISA對抗體價進行評價。
依照本發明之方法所製造的Hib接合型疫苗，由於不易引起免疫干擾，亦可作成與其他抗原之混合疫苗。例如，可列舉與沉降精製百日咳白喉破傷風不活化小兒麻痺混合疫苗合製之混合疫苗等。
採用本發明之方法所製造的Hib接合型疫苗，亦可與佐劑一起使用。劑型可為液狀製劑，亦可為凍 結乾燥製劑。
以下，藉由實施例詳細地說明本發明，然而本發明不受此等實施例任何限定。
[實施例1]
低分子化PRP之製作
依據專利文獻10或11等所記載之固定方法，藉由在添加NAD(菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide))之BHI(腦心湯(Brain Heart Broth))培養基中，將Hib於37℃培養8至14小時，並將上清液以乙醇沉澱而精製，得到峰頂分子量(為普魯蘭多糖換算量)為250至400kDa的精製PRP。將含精製PRP之製成液藉由高壓乳化機(Microfluidics公司製)，以10,000psi、20,000psi、30,000psi等各種壓力處理15至20次，藉由物理方式將PRP破碎，進行低分子化。將所得到之低分子化PRP進行分子大小分析，確認峰頂分子量分別為155kDa、108kDa、81kDa。
[實施例2]
PRP接合物之調製
使2至12mg/mL之所得到的各低分子化PRP，於100mg/mL濃度之CDAP中，以對PRP之重量比成為0.2至2.0之條件反應，並進一步與0.5M之ADH反應2小時。然後，進行透析除去未反應物，得到活化PRP。使活化PRP與2,900至3,300LF/mgPN純度之破傷風類毒素(TT)原液(化學及血清療法研究所製)及為縮合劑之EDC(1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺)一起反應，其中PRP與TT原液 之重量比分別為1：1、2：1、4：1。視濃度反應40分鐘至4小時，然後進行透析，得到PRP/TT比為0.48、0.77、1.0之PRP接合物。
[實施例3]
PRP接合物之保存安定性評價
藉由37℃之苛酷試驗評價所製作之PRP接合物(磷酸緩衝溶液，pH6.8)的保存安定性。於非專利文獻13所記載之DOC處理後，使用非專利文獻10所記載之核糖試驗測定保存開始時、2週後及4週後的游離PRP含量(%)。將其結果示於第1圖。由此可知與未低分子化之天然PRP或155kDa之PRP相比，更低分子化的108kDa或81kDa之PRP較能抑制游離PRP含量之上升。
[實施例4]
PRP接合物保存溶液之pH檢討
調製pH為6.0、6.3、6.6、7.0之磷酸緩衝液，以37℃之苛酷條件，評價pH對於PRP接合物(低分子化後PRP分子量為142kDa)之保存溶液的影響。使用與實施例3同樣之方法測定保存開始時、2週間後及4週間後之游離PRP含量(%)的結果，可知在pH6至7之範圍內，pH越低，越能抑制游離PRP含量之上升(表1)。
[實施例5]
Hib接合型疫苗之免疫原性評價
將以PRP接合物(PRP分子量：天然、或改變PRP之分子量為155kDa、108kDa、88kDa者，或改變PRP與載體蛋白質之重量比，於實施例2調製者)作為抗原之Hib接合型疫苗，以0.5mL之量皮下接種於1群(5隻)SD大鼠(雌性，5週齡)之背部，並於4週後進行第2次之接種。從第2次接種2週後進行採血，藉由自行調製之ELISA測定抗體價。將其結果示於第2圖及第3圖。確認與已有之Hib接合型疫苗(Sanofi Pasteur公司製「ActHIB(商標名)」)相比，得到同等以上之抗PRP抗體價。
[實施例6]
含PRP接合物之混合疫苗之調製，及免疫原性評價
在DTP-IPV4種混合疫苗(沉降精製百日咳白喉破傷風不活化小兒麻痺(沙賓株)混合疫苗；化學及血清療法研究所製「Quattrovac(商標名)」)或添加有不活化小兒麻痺病毒(IPV；Salk株)之沉降精製百日咳白喉破傷風混合疫苗(化學及血清療法所製)中，加入PRP接合物而調製5種混合疫苗。
將以PRP接合物(PRP分子量：天然、或改變PRP分子量為155、108、88kDa者，或改變PRP與載體蛋白質之重量比，於實施例2調製者)作為抗原之Hib接合型疫苗，以0.5mL之量皮下接種於1群(5隻)SD大鼠(雌性，5週齡)之背部，於4週後進行第2次之接種。第2次接種後2週後進行採血，以自行調製之ELISA測定抗體價。將其結果示於第4圖。只有使用PRP與載體蛋白以重量比4：1反應而得之PRP接合物之5種混合疫苗於1/100單次人類劑量(1/100SHD)下顯示低抗PRP抗體價，除此以外，均顯示與現有之Hib接合型疫苗(Sanofi Pasteur公司製「ActHIB(商標名)」)的5種混合疫苗同等以上之抗PRP抗體價。重量比4：1之反應條件，於劑量為1/500SHD之條件下，亦顯示比ActHIB(商標名)更高之抗體價。
關於所調製之5種混合疫苗之免疫原性，將5種混合疫苗以3週間隔皮下投與至1群(10隻)大鼠(Wister，雌性，8週齡)之背部，共計3次，於接種3週後 進行採血，藉由自行調製之ELISA測定抗體價。將結果示於第5圖。改變5種混合疫苗之用量，並與混合有現有之Hib接合型疫苗(Sanofi Pasteur公司製「ActHIB(商標名)」)的5種混合疫苗比較，3次接種後，現有之Hib接合型疫苗以用量為10μg時之值最高，相對地，本發明之Hib接合型疫苗以用量為2μg時之值為最高，推測能以較少用量得到同等之免疫原性。
[實施例7]
PRP接合物原液之安定性評價
改變Hib原液之濃度及pH，於37℃加溫1週，進行PRP接合物原液之安定性的評價。將結果示於表2。就原液之保管條件而言，高濃度者較為安定。即使於高濃度條件下，pH6.0者仍比6.8者安定。
[實施例8]
含PRP接合物之混合疫苗之pH對安定性的影響評價
以使混合疫苗之pH成為5.0、5.4、5.7、6.0的方式添加緩衝液，將對象檢體於37℃之苛酷條件加溫4週後，測定游離PRP。將結果示於表3。結果混合疫苗之pH為6.0、5.7、5.4者良好，pH為5.0時變成不安定。再者，雖然確認混合疫苗中Hib以外之抗原對免疫原性的影響，但未見到pH之影響。
在將混合疫苗之pH調成6.0或6.8，於37℃加溫4週之情況，於10℃保存45個月後，測定游離PRP。 將結果示於第6圖、第7圖。在以藉由本發明之一實施態樣所調製之PRP接合物作為抗原的Hib接合型混合疫苗中，pH6.0者比pH6.8者更為安定。於37℃加溫2週之結果，接近於10℃保存12個月的游離PRP之值，於37℃加溫4週之結果，與於10℃保存45個月的游離PRP之值接近。從第6圖、第7圖可確認於37℃加溫之情況及於10℃保存之情況，任一種均有同樣之傾向。
[產業上之可利用性]
依照本發明之調製方法，可利用於Hib接合型疫苗之製造，及含Hib接合型疫苗的混合疫苗之製造。

Claims (15)

  1. 一種藉由聚磷酸核糖基核糖醇(PRP)與載體蛋白質進行結合反應而調製PRP接合物之方法，係藉由使用比天然PRP更低分子化之PRP，而抑制PRP從調製後之PRP接合物游離。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，包含PRP接合物於調製後，保存在pH5.4至6.3之溶液中。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中於pH5.4至6.3之溶液，37℃、4週之苛酷試驗中，游離PRP含量小於50%。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之方法，其中PRP之低分子化的方法為物理性破碎。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之方法，其中PRP之低分子化的方法為藉由酸或鹼水解。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之方法，其中低分子化之PRP的分子量為80至150kDa。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之方法，其中在調製PRP接合物之結合反應中，PRP及載體蛋白質係以重量比2：1至4：1付諸於反應。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中PRP及載體蛋白質係以重量比4：1付諸於反應。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之方法，包含在調製PRP接合物之結合反應前，使用1-氰基-4-(二甲基胺基)吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)使低分子化之PRP活化 的步驟。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述之方法，其中載體蛋白質係破傷風類毒素。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中破傷風類毒素之純度為2,500至3,500LF/mgPN。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中破傷風類毒素之純度為2,900至3,300LF/mgPN。
  13. 一種嗜血流感桿菌b型菌(Hib)接合型疫苗之製造方法，包含如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之方法。
  14. 一種以如申請專利範圍第13項所述之製造方法所製造之Hib接合型疫苗的用途，係作為混合疫苗使用。
  15. 一種以如申請專利範圍第13項所述之製造方法所製造之Hib接合型疫苗的用途，係與沉降精製百日咳白喉破傷風不活化小兒麻痺混合疫苗合製成5種混合疫苗使用。
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