WO2018074296A1 - 低分子化ＰＲＰを用いたＨｉｂコンジュゲートワクチンの製造方法 - Google Patents

低分子化ＰＲＰを用いたＨｉｂコンジュゲートワクチンの製造方法 Download PDF

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真 森山
勝彦 深田
和彦 来海
由揮 三原
宏 米村
洋一郎 城野
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a PRP conjugate by a binding reaction between polyribosyl ribitol phosphate (PRP) and a carrier protein, and a method for producing a Haemophilus influenzae type b (Hib) conjugate vaccine.
  • PRP polyribosyl ribitol phosphate
  • Hib Haemophilus influenzae type b
  • Haemophilus influenzae is a facultative anaerobic gram-negative bacilli, has the property of “polymorphism” in the form of filaments and cocci, and has no spores or flagella. It is classified into a non-capsular strain and a capsular strain depending on the presence or absence of the capsule, and it is known that the b-type strain (Hib), which is a capsular strain, has particularly high pathogenicity. Hib infection is a major factor in meningitis in infants, Hib bacteria colonized in the upper respiratory tract invade into the blood, spread from bacteremia to the whole body, systemic infections such as meningitis, pharyngitis, arthritis Cause illness.
  • Patent Document 1 discloses a method for producing Hib and a glycoprotein conjugate and use as a combination vaccine
  • Patent Document 2 discloses an improved method for producing an oligosaccharide conjugate vaccine.
  • Patent Document 3 discloses a method in which a Hib strain is cultured in a medium, the supernatant is purified, and PRP is extracted.
  • Tetanus toxoid is required to have a purity exceeding 1,000Lf / mgPN according to WHO standards. 31 out of 34 manufacturers worldwide have met this standard, 15 of which have been reported to achieve a purity of over 1,500 LF / mgPN (Non-patent Document 1).
  • the European Pharmacopoeia (EP) standards for Hib conjugate vaccines are> 1,500Lf / mgPN.
  • Tetanus toxoid purification methods include ammonium sulfate precipitation, trichloroacetic acid precipitation, column chromatography (gel filtration chromatography, affinity chromatography), salting out, dialysis, and the like.
  • Patent Document 4 discloses a composite vaccine characterized in that the ratio of polysaccharide to protein is 1: 0.3 to 1: 2.
  • Non-Patent Documents 2 to 4 As a method for evaluating the immunogenicity of a Hib conjugate vaccine, an immunogenicity test using rats is known, and the antibody titer is evaluated by ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • Non-patent document 8 reports the results of preparing Hib conjugates by reductive amination method using different lengths of PRP and performing immunogenicity evaluation.
  • Vaccine 14 (4) (1996) 313-320 The Journal of Infectious Diseases, 190, 1177-1182, 2004 The Journal of Infectious Diseases, 191, 58-64, 2005 Vaccine 24 (2006) 3505-3512 Vaccine 16 (1998) 1842-1849 Vaccine 19 (2001) 902-907 Vaccine 25 (2007) 194-200 Vaccine 33 (2015) 2646-2654 Infection and Immunity, 40 (1) 1983, 245-256 Biologicals 35 (2007) 235-245 Vaccine 32 (2014) 5650-5656 Vaccine 12 (8) (1994) 700-706 Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 21 (6) (2000) 1087-1091 Journal of Microbiology and Biotechnology (2003), 13 (3), 469-472
  • Hib conjugate vaccines that use PRP conjugates as antigens are highly immunogenic for infants and are effective, but lower storage stability due to the release of PRP from the carrier protein during vaccine storage is an issue. . Although development of a more stable Hib conjugate vaccine is desired, an effective method for suppressing the increase in free PRP content has not been reported.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a method for preparing a PRP conjugate excellent in storage stability and a method for producing a Hib conjugate vaccine.
  • the present inventors have prepared a method for preparing a stable PRP conjugate in which an increase in free PRP content is suppressed by using PRP having a moderately lower molecular weight than native PRP. I found. Furthermore, the present inventors have energetically examined the weight ratio of the PRP and the carrier protein in the reaction, the purity of the carrier protein (especially tetanus toxoid), and the pH of the storage solution after preparation of the PRP conjugate. The present inventors have found a method for producing a more stable Hib conjugate vaccine.
  • the present invention includes the following.
  • [1] In a method for preparing a PRP conjugate by a coupling reaction between polyribosyl ribitol phosphate (PRP) and a carrier protein, a PRP conjugate having a molecular weight lower than that of native PRP is used. A preparation method characterized in that release of PRP from a gate is suppressed.
  • the method according to [1] which comprises storing the solution in a pH of 5.4 to 6.3 after the preparation of the PRP conjugate.
  • [3] The method according to [2], wherein a free PRP content is less than 50% in a severe test at 37 ° C. for 4 weeks in a solution having a pH of 5.4 to 6.3.
  • the prepared PRP conjugate can be stably stored for a long period of time. Furthermore, the Hib conjugate vaccine can be stably stored while maintaining sufficient immunogenicity.
  • 4 is a graph showing a relationship between an increase in free PRP content (%) and a PRP molecular weight when a PRP conjugate prepared according to an embodiment of the present invention is stored at 37 ° C. for 4 weeks.
  • the immunogenicity when a rat is immunized with 1/25 SHD (Single Human Dose) and 1/50 SHD with a Hib conjugate vaccine using a PRP conjugate prepared by changing the PRP molecular weight as an antigen. It is the shown graph.
  • a rat When a rat is immunized with 1/25 SHD and 1/50 SHD with a Hib conjugate vaccine using a PRP conjugate prepared by changing the weight ratio of PRP and carrier protein subjected to the binding reaction according to an embodiment of the present invention as an antigen. It is the graph which showed the immunogenicity of.
  • rats were immunized with 1/100 SHD and 1/500 SHD with Hib conjugate mixed vaccine using PRP conjugate prepared by changing the weight ratio of PRP and carrier protein for the binding reaction as an antigen. It is the graph which showed the immunogenicity at the time.
  • FIG. 6 is a graph showing immunogenicity when a rat is immunized three times with different doses of a Hib conjugate mixed vaccine using a PRP conjugate prepared as an antigen according to an embodiment of the present invention.
  • Free PRP content when a Hib conjugate mixed vaccine containing PRP conjugate prepared by changing the weight ratio of PRP and carrier protein subjected to binding reaction according to one embodiment of the present invention as an antigen is stored at 37 ° C. for 4 weeks
  • 5 is a graph showing the relationship between the increase in (%) and the storage solution pH.
  • a free PRP when a Hib conjugate mixed vaccine having a PRP conjugate prepared by changing the weight ratio of PRP and carrier protein subjected to a binding reaction according to an embodiment of the present invention as an antigen is stored at 10 ° C. for 45 months It is the graph which showed the relationship between the raise of content (%), and preservation solution pH.
  • a PRP having a lower molecular weight than that of native PRP is used to perform a PRP conjugate from the prepared PRP conjugate in performing a binding reaction between PRP and a carrier protein. It is characterized in that release of is suppressed.
  • the Hib conjugate vaccine using the PRP conjugate obtained by this preparation method as an antigen is similarly excellent in storage stability and retains sufficient immunogenicity.
  • PRP conjugates can be prepared by known binding techniques.
  • PRP can be linked via a thioether bond.
  • PRP is activated with 1-cyano-4- (dimethylamino) pyridine tetrafluoroborate (CDAP) to form a cyanate ester.
  • CDAP 1-cyano-4- (dimethylamino) pyridine tetrafluoroborate
  • the PRP activated in this way can be linked to the amino group of the carrier protein directly or via a spacer group.
  • the cyanate ester is combined with hexanediamine, and the amino-derivatized polysaccharide and the carrier protein are conjugated by a heteroligation chemical reaction involving the formation of a thioether bond (Patent Document 5).
  • conjugates can also be prepared by a reductive amination method (Patent Documents 6 to 9).
  • Still another method is a method of binding cyanogen bromide (CNBr) activated polysaccharide derivatized with adipic acid dihydrazide (ADH) to a carrier protein by carbodiimide condensation (Non-patent Document 9).
  • Carrier proteins include tetanus toxoid, pertussis toxoid, diphtheria toxoid, CRM197 which is a gene variant of diphtheria toxoid, non-capsular hemophilus influenza D antigen, meningitis group B outer membrane protein (OMP), etc. Can be mentioned.
  • a typical carrier protein for PRP conjugates is tetanus toxoid.
  • tetanus toxoid When using tetanus toxoid as a carrier protein, its purity should be at least 1,000 Lf / mg PN, which is the WHO standard. In the method of the present invention, the purity of tetanus toxoid is better, and it is preferably 2,500 to 3,500 Lf / mgPN. More preferably, it is 2,900-3,300 Lf / mgPN.
  • crushing is performed at a pressure of 10,000 to 30,000 psi for 10 minutes to 2 hours.
  • the crushing is preferably performed at a pressure of 20,000 to 30,000 psi for 10 minutes to 2 hours, more preferably at a pressure of 25,000 to 30,000 psi for 10 minutes to 2 hours.
  • hydrolysis using an acid, an oxidizing agent or an alkali can also be used.
  • the acid and the oxidizing agent include hydrochloric acid, sulfuric acid, and sodium periodate
  • examples of the alkali include sodium hydroxide and sodium bicarbonate.
  • the molecular weight of native PRP that is not low molecular weight is about 250 to 400 kDa
  • the molecular weight of low molecular weight PRP is less than 250 kDa. In the present invention, it is preferably 80 to 150 kDa, more preferably 80 to 100 kDa.
  • the molecular weight is measured by a method using an HPLC (High Performance Liquid Chromatography) apparatus described in Non-Patent Document 10 or Non-Patent Document 11.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • the calibration curve is created using pullulan or the like, and the molecular weight of the peak top can be obtained as a converted value of pullulan or the like.
  • the absolute molecular weight can be determined by a method using MALS (Multi Angle Light Scattering). Any other method that can measure the molecular weight may be used.
  • PRP and carrier protein are used to avoid excessive antibody responses to the carrier protein and to increase the vaccine productivity per carrier protein by reducing the amount of carrier protein used. It is subjected to a binding reaction in a weight ratio range of 2: 1 to 4: 1. A more preferred weight ratio is 4: 1.
  • the pH of the PRP conjugate storage solution is preferably 5.0 to 6.6, more preferably pH 5.4 to 6.3.
  • the pH may be adjusted with an acid such as hydrochloric acid or acetic acid, an alkaline solution such as sodium hydroxide or sodium hydrogen carbonate, or a buffer solution may be used.
  • the storage solution may be a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, a MES buffer solution, or another buffer solution such as a succinate buffer solution, as long as it can maintain the above-mentioned pH range. .
  • the free PRP content can be measured by the method described in Non-Patent Documents 12-14.
  • the temperature condition for the long-term storage test when examining stability is 5 ⁇ 3 ° C or 10 ° C or less avoiding freezing. Alternatively, stability may be accelerated and evaluated under higher temperature conditions.
  • the immunogenicity of the Hib conjugate vaccine prepared by the method according to the present invention is determined by immunizing animals such as rats and monkeys and measuring the anti-PRP antibody titer.
  • the antibody titer is measured by ELISA or the like.
  • evaluation may be performed by a serum bactericidal antibody (SBA) test using complement and Hib bacteria as described in Non-Patent Document 11. Since it is known that the antibody titer and the SBA titre correlate to a certain extent as described in Non-Patent Document 11, evaluation may be performed by the antibody titer by ELISA.
  • SBA serum bactericidal antibody
  • the Hib conjugate vaccine produced by the method according to the present invention hardly causes immune interference, it may be a mixed vaccine with other antigens.
  • examples thereof include a mixed vaccine with a precipitated purified pertussis diphtheria tetanus inactivated polio mixed vaccine.
  • the Hib conjugate vaccine produced by the method according to the present invention may be used together with an adjuvant.
  • the dosage form may be a liquid formulation or a lyophilized formulation.
  • EDC which is a condensing agent, with activated PRP and a tetanus toxoid (TT) stock solution (produced by Chemo-Serum Therapy Laboratories) with a purity of 2,900-3,300 LF / mgPN at a weight ratio of 1: 1, 2: 1, 4: 1
  • TT tetanus toxoid
  • Hib conjugate vaccine 1 group of 5 SD rats (female, 5 weeks old) on the back with PRP conjugate (PRP molecular weight: Native, 155 kDa, 108 kDa, 88 kDa and those with different molecular weight of PRP, or 0.5 ml of the Hib conjugate vaccine using the antigen prepared in Example 2 by changing the weight ratio of PRP and carrier protein) was inoculated subcutaneously, and the second inoculation was performed 4 weeks later. Blood was collected 2 weeks after the second inoculation, and the antibody titer was measured by ELISA prepared in-house. The results are shown in FIGS. It was confirmed that an anti-PRP antibody titer equivalent to or higher than the existing Hib conjugate vaccine (“ActHIB (trade name)” manufactured by Sanofi Pasteur) was obtained.
  • DTP-IPV 4 kinds of mixed vaccine precipitation precipitated pertussis diphtheria tetanus inactivated polio (Sabin strain) mixed vaccine; Quattrovac) (trade name) ") or sedimentation purified pertussis diphtheria tetanus mixed vaccine (manufactured by Chemo-Serum Therapeutic Institute) with inactivated poliovirus (IPV; Salk strain) added to PRP conjugate
  • mixed vaccine precipitation precipitated pertussis diphtheria tetanus inactivated polio (Sabin strain) mixed vaccine; Quattrovac) (trade name)
  • sedimentation purified pertussis diphtheria tetanus mixed vaccine manufactured by Chemo-Serum Therapeutic Institute
  • IPV inactivated poliovirus
  • PRP conjugate PRP molecular weight: Native, 155, 108, 88 kDa and PRP molecular weight changed, or PRP and carrier protein weight ratio changed on the back of 5 SD rats per group (female, 5 weeks old)
  • 0.5 ml of a Hib conjugate vaccine having the antigen (prepared in Example 2) as an antigen was subcutaneously inoculated, and a second inoculation was performed 4 weeks later. Blood was collected 2 weeks after the second inoculation, and the antibody titer was measured by ELISA prepared in-house. The result is shown in FIG.
  • the immunogenicity of the prepared 5 kinds of mixed vaccine was subcutaneously administered 3 times at 3 week intervals to the back of 10 rats (Wister, female, 8 weeks old) per group, and blood was collected 3 weeks after inoculation.
  • the antibody titer was measured with the prepared ELISA.
  • FIG. When the dose of 5 types of mixed vaccine was changed and compared with the 5 types of mixed vaccine mixed with existing Hib conjugate vaccine ("ActHIB (trade name)" manufactured by Sanofi Pasteur) The value of 10 ⁇ g was the highest in the existing Hib conjugate vaccine, whereas the value of 2 ⁇ g was the highest in the Hib conjugate vaccine of the present invention, and it was estimated that the equivalent immunogenicity could be obtained with a smaller dose. .
  • the preparation method according to the present invention can be used in the manufacture of a Hib conjugate vaccine and a mixed vaccine containing a Hib conjugate vaccine.

Abstract

保存安定性に優れるPRPコンジュゲートの調製方法とHibコンジュゲートワクチンの製造方法が提供される。本発明のPRPコンジュゲートの調製方法は、PRPとキャリアたん白質の結合反応を行うにあたって、ネイティブPRPよりも低分子化されたPRPを用いることにより、調製後のPRPコンジュゲートからPRPの遊離が抑制されることを特徴とする。本調製方法により得たPRPコンジュゲートを抗原とするHibコンジュゲートワクチンについても同様に保存安定性に優れており、かつ十分な免疫原性を保持している。

Description

低分子化ＰＲＰを用いたＨｉｂコンジュゲートワクチンの製造方法
　本発明は、ポリリボシルリビトールリン酸（PRP）とキャリアたん白質とを結合反応によりPRPコンジュゲートを調製する方法、並びにヘモフィルス・インフルエンザ菌ｂ型（Hib）コンジュゲートワクチンの製造方法に関する。
　ヘモフィルス・インフルエンザ菌は通性嫌気性グラム陰性桿菌であり、フィラメント状や球菌状の形態を呈する「多形性」という性質をもち、芽胞や鞭毛をもたない。莢膜の有無によって無莢膜株と有莢膜株に分類され、有莢膜株であるｂ型株（Hib）の病原性が特に高いことで知られる。Hib感染は乳幼児における髄膜炎の主要な要因であり、上気道に定着したHib菌が血中に侵入し、菌血症から全身に広がり、髄膜炎、咽頭蓋炎、関節炎などの全身感染症を惹起する。
　Hib感染の防御にはHibの莢膜多糖体であるPRPに対する抗体が有効であることが知られているが、PRP成分のみに基づくHibワクチンはT細胞非依存性のため、免疫系の未熟な生後18ヶ月未満の乳幼児に対しては効果不十分である。そこで、PRPにキャリアたん白質をコンジュゲート（結合）させてT細胞依存性にしたコンジュゲートワクチンが開発され、乳幼児に対して使用されている。
　PRPなどの多糖類をキャリアたん白質と結合したコンジュゲートワクチンは公知である。特許文献１は、Hibと糖たん白質コンジュゲートの製法及び混合ワクチンとしての使用について開示しており、特許文献２はオリゴ糖コンジュゲートワクチンの改良された製造方法について開示している。
　PRPの生産方法も公知である。特許文献３は、Hib株を培地で培養後、上清を精製し、PRPを抽出する方法を開示している。
　破傷風トキソイドは、WHO規格により1,000Lf/mgPNを超える純度が要求されている。世界各国の製造業者34社中31社はこの基準を満たしており、そのうち15社は1,500LF/mgPNを超える純度を達成しているとの報告がある（非特許文献１）。また欧州薬局方（EP：European Pharmacopoeia）のHibコンジュゲートワクチンの規格では、＞1,500Lf/mgPNとなっている。破傷風トキソイドの精製方法としては、硫安沈殿やトリクロロ酢酸沈殿、カラムクロマトグラフィー（ゲルろ過クロマト、アフィニティークロマト）、塩析、透析などが用いられている。
　多糖類とキャリアたん白質の結合比に関する検討は、特許文献４にて報告されている。特許文献４によれば、多糖類のたん白質に対する比が１：０．３ないし１：２であることを特徴とする複合ワクチンについて開示されている。
　Hibコンジュゲートワクチンの免疫原性を評価する方法としては、ラットを用いた免疫原性試験が知られており、抗体価についてはELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay；酵素免疫測定法）等にて評価される（非特許文献２～４）。他には、マウスやモルモット（非特許文献５）、サル（非特許文献６）を用いた評価が知られている。
　PRPコンジュゲートからPRPが遊離した遊離PRPと、PRPに対する抗体価については、逆相関することが知られており、遊離PRPが上昇しにくいワクチンは安定性、有効性の観点から重要であることが知られている（非特許文献７）
　長さの異なるPRPを用いて、還元アミノ化法によりHibコンジュゲートを調製し、免疫原性評価を行った結果については、非特許文献８に報告されている。
特開昭62-30726 特開平6-340550 特表2015-522272 特表平11-507026 PCT公開第93/15760号 米国特許第4673574号 欧州公開第161188号 欧州公開第208375号 欧州公開第477508号 米国特許第4220717号 米国特許第4459286号
Vaccine 14 (4) (1996) 313-320 The Journal of Infectious Diseases, 190, 1177-1182, 2004 The Journal of Infectious Diseases, 191, 58-64, 2005 Vaccine 24 (2006) 3505-3512 Vaccine 16 (1998) 1842-1849 Vaccine 19 (2001) 902-907 Vaccine 25 (2007) 194-200 Vaccine 33 (2015) 2646-2654 Infection and Immunity, 40（1）1983, 245-256 Biologicals 35 (2007) 235-245 Vaccine 32 (2014) 5650-5656 Vaccine 12 (8) (1994) 700-706 Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 21 (6) (2000) 1087-1091 Journal of Microbiology and Biotechnology (2003), 13(3), 469-472
　PRPコンジュゲートを抗原としたHibコンジュゲートワクチンは、乳幼児に対する免疫原性も高く有効であるが、ワクチン保存中にキャリアたん白質からPRPが遊離することによる保存安定性の低下が課題となっている。より安定なHibコンジュゲートワクチンの開発が望まれているものの、遊離PRP含量の上昇を抑える有効な方法は報告されていない。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、保存安定性に優れるPRPコンジュゲートの調製方法とHibコンジュゲートワクチンの製造方法を提供するものである。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ネイティブPRPよりも適度に低分子化したPRPを用いることにより、遊離PRP含量の上昇が抑制された安定なPRPコンジュゲートの調製方法を見出した。さらに本発明者らは、PRPとキャリアたん白質を反応に供する際の重量比、キャリアたん白質（特に破傷風トキソイド）の純度、PRPコンジュゲート調製後の保存溶液のpHについて精力的に検討することにより、より安定なHibコンジュゲートワクチンの製造方法を見出した。
　したがって、本発明は以下を含む。
[１]ポリリボシルリビトールリン酸（PRP）とキャリアたん白質とを結合反応によりPRPコンジュゲートを調製する方法において、ネイティブPRPよりも低分子化されたPRPを用いることにより、調製後のPRPコンジュゲートからPRPの遊離が抑制されることを特徴とする調製方法。
[２]PRPコンジュゲートの調製後、pH5.4～6.3の溶液で保存することを含む、[１]に記載の方法。
[３]pH5.4～6.3の溶液で37℃、4週間の苛酷試験における遊離PRP含量が50％未満である、[２]に記載の方法。
[４]PRPの低分子化の方法が物理的破砕である、[１]～[３]のいずれか一項に記載の方法。
[５]PRPの低分子化の方法が酸又はアルカリによる加水分解である、[１]～[３]のいずれか一項に記載の方法。
[６]低分子化したPRPの分子量が80～150kDaである、[１]～[５]のいずれか一項に記載の方法。
[７]PRPコンジュゲートを調製する結合反応において、PRPとキャリアたん白質が重量比２：１から４：１で反応に供される、[１]～[６]のいずれか一項に記載の方法。
[８]PRPとキャリアたん白質が重量比４：１で反応に供される、[７]に記載の方法。
[９]PRPコンジュゲートを調製する結合反応の前に、1－シアノ－4－（ジメチルアミノ）ピリジンテトラフルオロボレート（CDAP）を用いて、低分子化したPRPを活性化させる工程を含む、[１]～[８]のいずれか一項に記載の方法。
[１０]キャリアたん白質が破傷風トキソイドである、[１]～[９]のいずれか一項に記載の方法。
[１１]破傷風トキソイドの純度が2,500～3,500LF/mgPNである、[１０]に記載の方法。
[１２]破傷風トキソイドの純度が2,900～3,300LF/mgPNである、[１１]に記載の方法。
[１３][１]～[１１]のいずれか一項に記載の方法を含む、ヘモフィルス・インフルエンザ菌ｂ型菌（Hib）コンジュゲートワクチンの製造方法。
[１４][１３]に記載の製造方法で製造したHibコンジュゲートワクチンの、混合ワクチンとしての使用。
[１５][１３]に記載の製造方法で製造したHibコンジュゲートワクチンの、沈降精製百日せきジフテリア破傷風不活化ポリオ混合ワクチンとの5種混合ワクチンとしての使用。
　本発明によれば、調製後のPRPコンジュゲートを長期間安定に保存することが可能となる。さらには、Hibコンジュゲートワクチンを十分な免疫原性を保ったまま、安定に保存することが可能となる。
　図１～図７について以下に説明する。
本発明の一実施形態により調製したPRPコンジュゲートを、37℃で4週間保存した際の遊離PRP含量（%）の上昇とPRP分子量の関係を示したグラフである。 本発明の一実施形態によりPRP分子量を変えて調製したPRPコンジュゲートを抗原とするHibコンジュゲートワクチンを、ラットに1/25SHD（Single Human Dose）と1/50SHDで免疫した際の免疫原性を示したグラフである。 本発明の一実施形態により結合反応に供するPRPとキャリアたん白質の重量比を変えて調製したPRPコンジュゲートを抗原とするHibコンジュゲートワクチンを、ラットに1/25SHDと1/50SHDで免疫した際の免疫原性を示したグラフである。 本発明の一実施形態により結合反応に供するPRPとキャリアたん白質の重量比を変えて調製したPRPコンジュゲートを抗原とするHibコンジュゲート混合ワクチンを、ラットに1/100SHDと1/500SHDで免疫した際の免疫原性を示したグラフである。 本発明の一実施形態により調製したPRPコンジュゲートを抗原とするHibコンジュゲート混合ワクチンを、投与量を変えてラットに3回免疫した際の免疫原性を示したグラフである。 本発明の一実施形態により結合反応に供するPRPとキャリアたん白質の重量比を変えて調製したPRPコンジュゲートを抗原とするHibコンジュゲート混合ワクチンを、37℃で4週間保存した際の遊離PRP含量（%）の上昇と保存溶液pHの関係を示したグラフである。 本発明の一実施形態により結合反応に供するPRPとキャリアたん白質の重量比を変えて調製したPRPコンジュゲートを抗原とするHibコンジュゲート混合ワクチンを、10℃で45ヶ月間保存した際の遊離PRP含量（%）の上昇と保存溶液pHの関係を示したグラフである。
　以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本発明の実施形態に係るPRPコンジュゲートの調製方法は、PRPとキャリアたん白質の結合反応を行うにあたって、ネイティブPRPよりも低分子化されたPRPを用いることにより、調製後のPRPコンジュゲートからPRPの遊離が抑制されることを特徴とする。本調製方法により得たPRPコンジュゲートを抗原とするHibコンジュゲートワクチンについても同様に保存安定性に優れており、かつ十分な免疫原性を保持している。
　PRPコンジュゲートは公知の結合技術によって調製することができる。例えばPRPをチオエーテル結合を介して結合することができる。この結合方法では、PRPを1－シアノ－4－（ジメチルアミノ）ピリジンテトラフルオロボレート（CDAP）で活性化することにより、シアン酸エステルを形成する。このようにして活性化されたPRPは、直接又はスペーサー基を介してキャリアたん白質のアミノ基と結合できる。好ましくは、シアン酸エステルをヘキサンジアミンと結合し、チオエーテル結合の形成を伴うヘテロライゲーション化学反応によりアミノ誘導体化多糖とキャリアたん白質をコンジュゲートさせる（特許文献５）。
　上記の他、還元アミノ化方法によりコンジュゲートを調製することもできる（特許文献６～９）。さらに別の方法として、アジピン酸ジヒドラジド（ADH）で誘導体化した臭化シアン（CNBr）活性化多糖を、カルボジイミド縮合でキャリアたん白質に結合する方法が挙げられる（非特許文献９）。
　キャリアたん白質としては、破傷風トキソイドや百日咳トキソイド、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキソイドの遺伝子変異体であるCRM197、非莢膜型ヘモフィルス・インフルエンザD抗原、髄膜炎グループBの外膜たん白質（OMP）などが挙げられる。PRPコンジュゲートに典型的なキャリアたん白質は、破傷風トキソイドである。
　破傷風トキソイドをキャリアたん白質として用いる場合、その純度は、WHO規格である1,000Lf/mgPN以上で使用する。本発明の方法では、破傷風トキソイドの純度はより高い方が良く、2,500～3,500Lf/mgPNであることが好ましい。より好ましくは2,900～3,300Lf/mgPNである。
　PRPを低分子化する方法としては、高圧乳化機による物理的破砕が挙げられる。この場合、10,000～30,000psiの圧力にて、10分～2時間をかけて破砕を行う。好ましくは20,000～30,000psiの圧力で10分～2時間、さらに好ましくは、25,000～30,000psiの圧力で10分～2時間で破砕を行う。
　PRPを低分子化する方法としては、酸、酸化剤やアルカリを用いた加水分解を用いることもできる。酸、酸化剤としては塩酸、硫酸、過ヨウ素酸ナトリウムなどが挙げられ、アルカリとしては水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられる。
　低分子化していないネイティブPRPの分子量は250～400kDa程度であるため、低分子化されたPRPの分子量は250kDa未満となる。本発明においては、80～150kDaであることが好ましく、より好ましくは80～100kDaである。
　分子量の測定は非特許文献１０や非特許文献１１に記載されているHPLC（High Performance Liquid Chromatography；高速液体クロマトグラフィー）装置を用いた方法にて行う。この場合、校正曲線はプルラン等を用いて作成し、ピークトップの分子量をプルラン等の換算値として求めることができる。あるいはMALS（Multi Angle Light Scattering；多角度光散乱検出器）を用いた方法にて絶対分子量を求めることもできる。その他、分子量の測定が可能な方法であればどのような方法を用いても良い。
　低分子化したPRPを用いることで、PRPコンジュゲートの保存安定性が向上する作用メカニズムについては、（１）低分子化PRPコンジュゲートの場合、キャリアたん白質と結合しているPRPの長さが短いため、加水分解によりPRPが切断されても、遊離するPRPの総量が少なくなること、（２）PRPが低分子化していることで、コンジュゲートの間に存在しているPRPは切断されにくいこと、の２点が推察される。ただし、立体構造上の制約もあり、単純に低分子化しすぎても安定性は改善せず、短ければ良いというわけではない。
　本発明における一実施形態において、キャリアたん白質に対する過剰な抗体応答を回避するため、またキャリアたん白質の使用量を減らしてキャリアたん白質あたりのワクチン生産性を高めるために、PRPとキャリアたん白質は重量比２：１から４：１の範囲で結合反応に供される。より好ましい重量比は４：１である。
　PRPコンジュゲート保存溶液のpHは5.0～6.6が好ましく、より好ましくはpH5.4～6.3である。pH調整は、塩酸や酢酸などの酸、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどのアルカリ液にて調整しても良いし、緩衝液を使用することも可能である。保存溶液は前述のpHの範囲を維持できる組成であれば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、MES緩衝溶液であっても良く、コハク酸緩衝溶液等の他の緩衝溶液であっても構わない。
　遊離PRP含量の測定は非特許文献１２～１４などに記載の方法で行うことができる。安定性を検討する際の長期保存試験の温度条件は、５±３℃もしくは凍結を避けて10℃以下にて行う。あるいは、より高温条件下で安定性を加速的に評価しても構わない。
　本発明による方法にて作製したHibコンジュゲートワクチンの免疫原性は、ラットやサルなどの動物に免疫し、抗PRP抗体価を測定することによって求める。抗体価は、ELISAなどにより測定する。あるいは、非特許文献１１にあるような補体とHib菌を用いる血清殺菌抗体（SBA；Serum Bactericidal antibody）試験にて評価を行っても良い。抗体価とSBA価は一定程度相関することが非特許文献１１に記載のように知られているため、ELISAによる抗体価にて評価を行っても良い。
　本発明による方法にて製造したHibコンジュゲートワクチンは、免疫干渉を起こしにくいため、他の抗原との混合ワクチンとしても良い。例えば、沈降精製百日せきジフテリア破傷風不活化ポリオ混合ワクチンとの混合ワクチンなどが挙げられる。
　本発明による方法で製造したHibコンジュゲートワクチンはアジュバントと共に用いても良い。剤型は液状製剤であっても良く、凍結乾燥製剤であっても良い。
　以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
低分子化PRPの作製
　特許文献１０や１１などに記載の定法に従って、NAD（Nicotinamide Adenine Dinucleotide）を加えたBHI（Brain Heart Broth）培地にて、Hibを8～14時間、37℃で培養し、上清をエタノール沈殿で精製することによりプルラン換算量でピークトップ分子量が250～400kDaの精製PRPを得た。精製PRPを含むプロセス液を高圧乳化機（Microfluidics社製）にて10,000psi、20,000psi、30,000psiの各圧力にて15～20回処理し、PRPを物理的に破砕することにより低分子化した。得られた低分子化PRPを分子サイズ分析し、ピークトップ分子量がそれぞれ155kDa、108kDa、81kDaであることを確認した。
PRPコンジュゲートの調製
　得られた各低分子化PRPの2～12mg/mLを、100mg/mL濃度のCDAPにてPRPに対する重量比が0.2～2.0となる条件にて反応させ、さらに0.5MのADHと２時間反応させた。その後、透析を行って未反応物を除去することで活性化PRPを得た。活性化PRPと2,900～3,300LF/mgPNの純度の破傷風トキソイド（TT）原液（化学及血清療法研究所製）を、１：１、２：１、４：１の重量比で縮合剤であるEDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）と共にそれぞれ反応させた。濃度に応じて40分から４時間反応し、その後透析することで、PRP/TT比が0.48、0.77、1.0のPRPコンジュゲートを得た。
PRPコンジュゲートの保存安定性評価
　作製したPRPコンジュゲート（リン酸緩衝溶液、pH6.8）の保存安定性を、37℃の苛酷試験にて評価した。保存開始時、２週間後及び4週間後における遊離PRP含量（%）を非特許文献１３に記載のDOC処理後、非特許文献１０に記載のリボース試験を用いて測定した。その結果を図１に示す。低分子化していないネイティブPRPや155kDaのPRPに比べて、より低分子化した108kDaや81kDaのPRPの方が、遊離PRP含量の上昇を抑制できることが分かった。
PRPコンジュゲート保存溶液のpH検討
　pHが6.0、6.3、6.6、7.0であるリン酸緩衝液を調製し、PRPコンジュゲート（低分子化後PRP分子量142kDa）の保存溶液のpHによる影響を37℃の苛酷条件にて評価した。保存開始時、２週間後及び４週間後における遊離PRP含量（%）を実施例３と同様の方法を用いて測定した結果、pH6～7の範囲においてpHが低いほど、遊離PRP含量の上昇を抑えられることが分かった（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Hibコンジュゲートワクチンの免疫原性評価
　１群５匹のSDラット（メス、5週齢）の背部にPRPコンジュゲート（PRP分子量：Native、155kDa、108kDa、88kDaとPRPの分子量を変えたもの、又は、PRPとキャリアたん白質の重量比を変えて実施例２で調製したもの）を抗原とするHibコンジュゲートワクチンを、0.5mL皮下接種し、４週間後に２回目の接種を行った。２回目の接種から２週後に採血を行い、自家調製したELISAにて抗体価を測定した。その結果を図２及び図３に示す。既存のHibコンジュゲートワクチン（サノフィパスツール社製「アクトヒブ（ActHIB）（商標名）」）に比べて同等以上の抗PRP抗体価が得られていることを確認した。
PRPコンジュゲートを含む混合ワクチンの調製、及び免疫原性評価
　DTP-IPV４種混合ワクチン（沈降精製百日せきジフテリア破傷風不活化ポリオ（セービン株）混合ワクチン；化学及血清療法研究所製「クワトロバック（Quattrovac）（商標名）」）又は沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン（化学及血清療法所製）に不活化ポリオウイルス（IPV；Salk株）を加えたものに、PRPコンジュゲートを加えることで５種混合ワクチンを調製した。
　１群５匹のSDラット（メス、5週齢）の背部にPRPコンジュゲート（PRP分子量：Native, 155、108、88kDaとPRP分子量を変えたもの、又はPRPとキャリアたん白質の重量比を変えて実施例２で調製したもの）を抗原とするHibコンジュゲートワクチンを0.5mL皮下接種し、４週間後に２回目の接種を行った。２回目の接種から２週後に採血を行い、自家調製したELISAにて抗体価を測定した。その結果を図４に示す。PRPとキャリアたん白の重量比を４：１で反応させたPRPコンジュゲートを用いた５種混合ワクチンの100分の1シングルヒューマンドーズ（1/100SHD）のみ低めの抗PRP抗体価を示したが、それ以外は既存のHibコンジュゲートワクチン（サノフィパスツール社製「アクトヒブ（ActHIB）（商標名）」）を用いた５種混合ワクチンと同等以上の抗PRP抗体価を示した。重量比４：１の反応条件は、1/500SHD条件でアクトヒブ（ActHIB）（商標名）よりも高い抗体価を示した。
　調製した５種混合ワクチンの免疫原性を、１群１０匹のラット（Wister、メス、８週齢）の背部に３週間隔で３回皮下投与して、接種３週間後に採血を行い、自家調製したELISAにて抗体価を測定した。結果を図５に示す。５種混合ワクチンの用量を変えて、既存のHibコンジュゲートワクチン（サノフィパスツール社製「アクトヒブ（ActHIB）（商標名）」）と混合した５種混合ワクチンと比較したところ、３回接種後では、既存のHibコンジュゲートワクチンでは10μgの値が最も高かったのに対し、本発明のHibコンジュゲートワクチンでは２μgの値が最も高く、より少ない用量で同等の免疫原性を得られると推察された。
PRPコンジュゲート原液の安定性評価
　Hib原液の濃度とpHを変えて37℃に1週間加温して、PRPコンジュゲート原液の安定性の評価を行った。結果を表２に示す。原液の保管条件としては、高濃度の方がより安定であった。高濃度条件下でもpHは6.8よりも6.0の方が安定であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
PRPコンジュゲートを含む混合ワクチンのpHの安定性への影響評価
　混合ワクチンのpHが5.0、5.4、5.7、6.0となるように緩衝液を加え、対象検体を37℃の苛酷条件で４週間加温した後、遊離PRPを測定した。結果を表３に示す。混合ワクチンのpHは6.0、5.7、5.4の方が良く、pH5.0は不安定となる結果であった。なお、混合ワクチン中のHib以外の抗原の免疫原性への影響も確認したが、pHの影響は見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　混合ワクチンのpHを6.0又は6.8とし、37℃４週間加温した場合、10℃で45ヶ月間保存した後、遊離PRPを測定した。結果を図６、図７に示した。本発明の一実施形態により調製したPRPコンジュゲートを抗原とするHibコンジュゲート混合ワクチンにおいてpH6.8よりもpH6.0に合わせた方がより安定であった。37℃で２週間加温した結果は10℃で12ヶ月間保存した遊離PRPの値に近く、37℃で４週間加温した結果は10℃で45ヶ月間保存した遊離PRPの値に近かった。図６、図７より37℃で加温した場合と10℃で保存した場合のいずれでも、同様の傾向が確認された。
　本発明による調製方法は、Hibコンジュゲートワクチンの製造及びHibコンジュゲートワクチンを含む混合ワクチンの製造において利用可能である。

Claims (15)

  1. ポリリボシルリビトールリン酸（PRP）とキャリアたん白質とを結合反応によりPRPコンジュゲートを調製する方法において、ネイティブPRPよりも低分子化されたPRPを用いることにより、調製後のPRPコンジュゲートからPRPの遊離が抑制されることを特徴とする方法。
  2. PRPコンジュゲートの調製後、pH5.4～6.3の溶液で保存することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. pH5.4～6.3の溶液で37℃、4週間の苛酷試験における遊離PRP含量が50％未満である、請求項２に記載の方法。
  4. PRPの低分子化の方法が物理的破砕である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. PRPの低分子化の方法が酸又はアルカリによる加水分解である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 低分子化したPRPの分子量が80～150kDaである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. PRPコンジュゲートを調製する結合反応において、PRPとキャリアたん白質が重量比２：１から４：１で反応に供される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. PRPとキャリアたん白質が重量比４：１で反応に供される、請求項７に記載の方法。
  9. PRPコンジュゲートを調製する結合反応の前に、1－シアノ－4－（ジメチルアミノ）ピリジンテトラフルオロボレート（CDAP）を用いて、低分子化したPRPを活性化させる工程を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. キャリアたん白質が破傷風トキソイドである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 破傷風トキソイドの純度が2,500～3,500LF/mgPNである、請求項１０に記載の方法。
  12. 破傷風トキソイドの純度が2,900～3,300LF/mgPNである、請求項１１に記載の方法。
  13. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法を含む、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌（Hib）コンジュゲートワクチンの製造方法。
  14. 請求項１３に記載の製造方法で製造したHibコンジュゲートワクチンの、混合ワクチンとしての使用。
  15. 請求項１３に記載の製造方法で製造したHibコンジュゲートワクチンの、沈降精製百日せきジフテリア破傷風不活化ポリオ混合ワクチンとの5種混合ワクチンとしての使用。
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