KR20160062168A - 증진된 면역원성을 갖는 폴리사카라이드-단백질 접합체 및 이의 신속한 고생산 방법 - Google Patents

증진된 면역원성을 갖는 폴리사카라이드-단백질 접합체 및 이의 신속한 고생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 증진된 면역원성과 함께 상당히 높은 항체 역가를 나타내는 폴리사카라이드-단백질 접합체에 관한 것이다. 상기 캐리어 단백질은 그람 양성 세균 그룹으로부터 수득되고, 폴리사카라이드 단편은 그람 음성 세균 그룹으로부터, 바람직하게, 해모필러스 인플루엔자 혈청형(Hib), 나이세리아 메닌기티디스 혈청형 A 및 C(MenA 및 MenC)로부터 수득된다. 본 발명은 또한 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 신속하고 높은 생산 방법에 관한 것이고, 여기서, 유도체화된 캐리어 단백질은 환원적 아민화 화학을 사용하는 폴리사카라이드-단백질 접합체를 수득하기 위해 최적화된 길이를 갖는 절단되고 탈중합된 폴리사카라이드 단편과 반응한다. 본 발명은 추가로 폴리사카라이드를 접합에 사용하기 위한 최적 길이로 단편화시키는 화학적 방법에 관한 것이다.

Description

증진된 면역원성을 갖는 폴리사카라이드-단백질 접합체 및 이의 신속한 고생산 방법{Polysaccharide-Protein Conjugates With Enhanced Immunogenicity And Rapid High Yielding Process of Preparation Thereof}
본 발명은 증진된 면역원성을 갖는 폴리사카라이드-단백질 접합체 및 이를 수득하기 위한 신속한 고생산 접합 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 증진된 면역원성을 부여하기 위해 최적화된 폴리사카라이드 쇄 길이를 사용하여 개발된 폴리사카라이드 단백질 접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 개선된 수율 및 보다 높은 면역원성으로 폴리사카라이드를 캐리어 단백질 접합시키기 위한 환원적 아민화의 신속한 방법에 관한 것이다.
백신접종(면역화)은 면역 반응을 유발하기 위한 방법이다. 백신접종 방법은 생존 실체에 백신을 투여하고 이어서 신체의 천연 면역계를 활성화시킴을 포함한다. 백신은 투여시 병원체에 대한 항체 생산 또는 세포 면역을 자극하는 세균 또는 바이러스와 같은 약독화되거나 사멸된 병원체, 또는 상기 병원체 구조의 일부의 제제인 소량의 항원을 포함한다.
면역학적으로, 항원은 T-세포 의존성 (TD) 항원 또는 T-세포 독립적 (TI) 항원으로 분류될 수 있다. 단백질 및 펩타이드는 일반적으로 TD 항원이고 면역 반응을 유발하고 이에 의해 메모리 B 및 T 림프구의 형성으로 인해 오랫동안 지속적인 면역 반응을 유도하기 위해 헬퍼 T 림프구로부터의 자극을 요구한다. 대조적으로, TI 항원은 B 세포를 자극하여 T 세포의 도움 없이 그리고 메모리 B 및 T 림프구의 형성 없이 항체-분비 세포로 증식하고 분화시킨다. 이들 T-세포-독립적 항원 대부분은 저친화성 항체의 생산을 자극하는 미생물 폴리사카라이드이다.
그람 음성 세균에서, 세균 캡슐에 존재하는 폴리사카라이드는 불량한 면역원성을 보여주는 중요한 독성 인자이다. 접합체 백신은 미생물 폴리사카라이드 (PS) 항원이 캐리어 단백질(CP)과 커플링되어 T-세포 독립적 면역 반응을 T-세포 의존성 면역 반응으로 전환시키는 생성물이다. 상기 접합체 백신은 캡슐 폴리사카라이드를 함유하는 세균에 의해 유발된 공격적 질환에 대해 유아 및 어린이를 면역화시키기 위해 사용된다. 상기 항원성 캡슐 폴리사카라이드를 캐리어 단백질과 커플링시켜 고도의 면역원성 접합체를 수득한다.
탄수화물-단백질 접합체는 기본 연구에서 및 다양한 세균 백신에서 면역원으로서 광범위하게 활용되고 있다. 이들 접합체를 제조하기 위한 단순하고 신뢰할 수 있는 방법을 개발하기 위한 상당한 노력이 있어 왔다. 환원적 아민화를 통한 직접적인 커플링이 호소력 있는 방법이지만, 이들 방법은 많은 결점을 갖고 있다. 환원적 아민화를 통한 기존의 접합 방법은 시간 소모적이고 저수율의 방법이며 이와 같이 수득된 접합체는 적은 면역원성을 보여준다.
또한 폴리사카라이드-단백질 접합체의 면역학적 수행능이 길이-의존적이고 아마도 최적화를 위해서는 다수의 에피토프를 요구한다는 것은 널리 확립된 사실이다(문헌참조: Costantino et al., 1999). 또한, 선택적 말단 그룹 활성화를 갖는 보다 작은 폴리사카라이드 단편이 꾸준한 재현성과 함께 널리 한정된 접합체 백신을 생성시킨다는 것은 공지되어 있다. 보다 큰 크기의 폴리사카라이드 분자는 입체적으로 숨겨진 에피토프를 가질 수 있는 반면 보다 작은 단편은 접합 후 면역계에 노출된 최대 에피토프를 갖는다.
폴리사카라이드의 탈중합을 포함하는 여러 방법이 보다 작은 폴리사카라이드 단편을 제조하기 위해 개발되었다. 폴리사카라이드의 탈중합은 선행 기술 분야에 널리 보고되어 있다. 예를 들어, 문헌["Experimental design to optimize an Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine made with hydrazide-derivatized tetanus toxoid" by Laferriere et al, 2011]은 이를 상세하게 기재하고 있다. 주요 결점 중 하나는 상기 방법이 32시간 이상 범위의 오랜 시간이 걸리고 약 15 %의 접합체 수율을 갖는다는 것이다. 문헌[참조: Anderson et ah, 1986]은 또한 디프테리아 톡소이드와의 접합을 위해 보다 작은 크기의 폴리사카라이드의 용도를 기재하고 있고 20개 반복 단위의 Hib-PRP로부터 제조된 접합체가 8개 반복 단위로 제조된 것들 보다 더 면역원성임을 밝혀냈다. 이들의 방법은 또한 매우 오랜 시간, 즉 5일 초과의 시간이 걸린다.
본 발명은 개선된 수율 및 보다 높은 면역원성으로 폴리펩타이드를 캐리어 단백질에 접합시키기 위한 환원적 아민화의 신속한 방법을 제공함에 의해 선행 기술 분야의 결점을 극복한다. 본 발명의 방법은 보다 짧은 접합 시간을 요구한다. 본 발명은 또한 항원성 에피토프의 면역계로의 보다 우수한 노출을 통해 증진된 면역원성을 갖는 작은 크기의 폴리사카라이드를 제공한다.
발명의 목적
따라서, 본 발명의 주요 목적은 증진된 면역원성을 갖는 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 폴리사카라이드 단편화를 위한 화학적 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 증진된 면역원성을 갖는 해모필러스 인플루엔자 b형(Hib)에 대한 저분자량(LMW)의 폴리사카라이드 단백질 접합체 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 증진된 면역원성으로 나이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis) 혈청그룹 A 및 C (MenA 및 MenC)에 대해 고분자량(HMW)의 폴리사카라이드 단백질 접합체 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 보다 짧은 접합 시간 및 보다 우수한 접합체 수율로 폴리사카라이드-단백질 접합체를 수득하는 신속한 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
따라서, 본 발명은 증진된 면역원성을 갖는 폴리사카라이드-단백질 접합체 및 상기 폴리사카라이드-단백질 접합체 및 이들의 백신을 수득하기 위한 신속한 고생산 접합 방법을 제공한다.
본 발명은 폴리사카라이드가 100 ± 40 kD 범위의 분자량으로 단편화된, 보다 바람직하게는 대략 100kD의 평균 분자량을 갖는 최적화된 분자량 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한 폴리사카라이드 단편이 12 ± 6 kD 범위의 분자량으로 단편화된, 보다 바람직하게는 대략 10 kD의 평균 분자량을 갖는 Hib 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하기 위해 최적화된 저분자량 폴리사카라이드를 제공한다.
본 발명은 또한 Hib 캡슐 폴리사카라이드, 즉, PRP (폴리리보실-리비톨-포스페이트)를 덜한 다중분산성 및 재현성 결과를 갖는 12 ± 6 kD의 크기로 화학적 분해시키기 위한 방법을 기재하고 있다.
본 발명은 또한 천연 캡슐 폴리사카라이드, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 MenA 및 MenC를 재현성 결과와 함께 덜한 다중분산성을 보여주는 100 ± 40 kD의 크기로 화학적 분해시키기 위한 방법을 기재하고 있다.
바람직한 양태 중 하나에서, 본 발명은 폴리사카라이드의 화학적 분해를 제공하고, 여기서, 상기 폴리사카라이드 샘플은 예비결정된 기간 동안 나트륨-메타페리오데이트로 유지되고 겔 여과 칼럼 상에서 직접 탈염된다.
상기 폴리사카라이드 샘플은 정제되고 정제된 폴리사카라이드의 분석학적 검정은 PS 함량, 시알산 함량, 인 함량, 단백질 불순물, 핵산 불순물, 내독소, 동일성 및 수분 함량을 포함하는 물리화학적 성질을 평가하기 위해 수행된다. 상기 정제된 폴리사카라이드는 총 함량에 대해 분석되고 알데하이드 그룹을 생성시킴에 의해 유도체화된다.
본 발명은 추가로 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제공하고, 여기서, 선택적 말단-그룹 활성화는 보다 작은 폴리사카라이드 단편에 대해 가능하다. 전형적인 폴리사카라이드는 메타페리오데이트와 같은 산화제에 의해 각각 Hib 폴리사카라이드 및 메닌고코칼 혈청그룹에 대해 대략 10 및 100kD로 보다 작은 질량으로 단편화되고 환원적 아민화 화학을 사용하여 유도체화된 캐리어 단백질에 접합된다.
캐리어 단백질은 활성화되는 파상풍 톡소이드, CRM197 또는 다른 적합한 캐리어 단백질이고 단백질 함량 및 활성화 정도에 대해 분석된다. 하이드라진 1수화물은 하이드라진 그룹을 촉매 시약의 존재하에 링커로서 캐리어 단백질에 부착시키기 위해 사용된다. 상기 촉매 시약의 비제한적인 예는 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드)이다.
접합 단계는 유도체화된 폴리사카라이드와, 파상풍 톡소이드와 같은 유도체화된 캐리어 단백질의 접합을 포함한다. 상기 폴리사카라이드-단백질 접합체는 추가로 정제되고 단백질 함량 및 폴리사카라이드 함량, 유리 폴리사카라이드, 크기 분포 및 효능의 비율에 대해 분석된다.
본 발명은 또한 폴리사카라이드-단백질 접합체의 물리화학적 분석을 위한 분석법을 수행한다. 상기 분석법은 모든 실험 단계에서, 즉 초기 폴리사카라이드 샘플, 활성화된 사카라이드, 캐리어 단백질, 벌크 접합체 및 최종 백신을 위해 수행된다.
생산된 접합체는 Hib에 대해 래트로 면역화되고 MenA/MenC에 대해 마우스로 면역화되고 혈청 항체에 대해 적정하여 면역학적 잠재력을 평가한다. Hib 및 MenA/MenC에 대해 간접적인 IgG-ELISA 및 MenA 및 MenC 접합체에 대한 혈청 살균 검정에 의한 측정시 항체 역가는 표준 백신을 사용하여 수득된 것들과 균등하거나 높다. 따라서, 상기 방법은 저렴하고 덜 시간 소모적이다.
본 발명의 가장 중요한 결과는 보다 짧은 시간 및 보다 양호한 접합 수율에서 각각의 폴리펩타이드의 최적화된 분자량을 사용하여 생산된 접합체로 보다 우수한 면역원성을 수득하는 것이다.
도 1은 환원적 아민화 방법의 다이아그램을 도시한다.
도 2는 RI 검출기에 의한 모니터링시 TSK 4000-5000 PWXL 칼럼 상에서 수득된 탈중합되고 활성화된 Hib PRP의 고성능 액체 크로마토그래피 시스템(SEC-HPLC) 프로필을 사용하는 크기 배척 크로마토그래피를 도시한다.
도 3a 및 3b는 RI 검출기에 의한 모니터링시 TSK 4000-5000 PWXL 칼럼 상에서 활성화된 MenA 및 MenC 폴리사카라이드의 SEC-HPLC 용출 프로필을 도시한다.
도 4는 UV 검출기에 의한 모니터링시 TSK 4000-5000 PWXL 칼럼 상에 Hib PRP-TT 접합체의 SEC-HPLC 프로필에서 쉬프트를 도시한다.
도 5는 PRP-TT 접합체의 SDS-PAGE 분석을 도시한다. 샘플 레인은 하기를 포함했다. 레인 1 - 분자량에 대한 단백질 표준물, 레인 2 - 저분자량의 PRP-TT 접합체, 레인 3 - 고분자량의 PRP-TT 접합체, 및 레인 4 - 천연 TT.
도 6은 UV 검출기에 의한 모니터링시 TSK 4000-5000 PWXL 칼럼 상의 유리된 파상풍 톡소이드와 비교하여 Men A-TT 접합체 및 Men C-TT 접합체의 SEC-HPLC 프로필에서 쉬프트를 도시한다.
도 7은 억제 ELISA에서 Men C-TT 접합체와 함께 항체 억제 %의 그래프를 도시한다.
도 8은 0일, 28일 및 42일째에 3회 투여 후 혈청 IgG 역가를 측정하기 위한 ELISA에 의해 래트에서 Hib 접합체 면역원성을 도시한다. 상기 항체 역가는 상이한 Hib PS 크기와 함께 상이한 용량 수준에서 0일, 28일, 42일, 49일 및 70일째에 평가하였다.
도 9는 혈청 항-MenA IgG 역가를 측정하기 위한 ELISA에 의해 마우스에서 메닌고코컬 혈청 그룹 A 접합체 면역원성을 도시한다.
도 10은 혈청 항-MenC IgG 역가를 결정하기 위한 ELISA에 의해 마우스에서 메닌고코칼 혈청 그룹 C 접합체 면역원성을 도시한다.
도 11은 항-MenC 혈청 기능성 항체 역가를 결정하기 위한 혈청 살균 분석에 의해 마우스에서 메닌고코칼 혈청그룹 C 접합체 면역원성을 도시한다.
대부분의 단백질은 C-말단 작용기 및 아스파르트산 및 글루탐산 측쇄로부터 기원하는 풍부한 카복실산 그룹을 함유한다. 이들 그룹은 안정한 이미드 생성물을 생산하기 위해 친핵성 화합물로 용이하게 변형된다. 친핵성 작용기는 알데하이드 그룹과 용이하게 반응하지만 이들은 카복실레이트 또는 카복실산 그룹과 자발적으로 반응하지 않는다. 상기 카복실산 그룹은 먼저 이것이 친핵체쪽으로 반응성이게 하는 또 다른 화합물로 활성화되어야만 한다. 본 발명에서, 상기 단백질은 카복실 대 아민 접합을 위해 수용액 중에서 수용성 가교결합제로 처리한다. 상기 가교결합제의 비제한적인 예 중 하나는 카보디이미드 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드)이다. 상기 가교결합제는 가용성 카복실레이트 그룹과 반응하여 고도로 반응성인 중간체 에스테르를 형성한다. 상기 활성 에스테르 종은 하이드라지드와 같은 친핵체와 추가로 반응하여 연장 말단 하이드라지드 그룹과의 결합을 갖는 안정한 이미드 생성물을 생산한다(도 1).
여러 실험을 수행하여 하이드라지드 분자를 사용한 TT의 충분한 표지화를 얻기 위해, 즉, 유도체화된 캐리어 단백질, 예를 들어, 파상풍 톡소이드의 목적하는 활성화 정도를 성취하기 위해 수행된다. 이와 관련하여, 다양한 농도의 가교결합제가 활성화 반응 동안에 적용된다. 추가로, 고도로 하이드라지드 활성화된 TT (TT-H)는 보다 낮은 수율의 활성화된 TT를 유도하는 반응 혼합물에서 침전하는 경향이 있다. 이에 대응하기 위해, 반응 혼합물은 항온처리 동안에 관찰하고 반응은 침전이 관찰되는 경우 켄칭된다. 이는 정상적으로 6.2-6.5인 TT의 등전점에서의 변화 때문이다. 등전점은 보다 낮은 pH에서 궁극적으로 단백질의 침전을 유도하는 TT 분자 상에 하이드라지드의 로딩 때문에 알칼린 측쇄로 증가한다.
활성화된 TT는 SEC-HPLC 상에서 조사하여 미반응된 하이드라진의 제거를 확신하고 변형된 TT의 프로필을 동정한다. 40 초과의 활성화 정도(TT 분자 당 하이드라지드의 수)는 TT 분자 상에 활성화된 폴리사카라이드의 충분한 로딩을 위해 적당한 상기 공정으로 성취한다.
탄수화물 및 당단백질과 같은 폴리사카라이드를 함유하는 다른 생물학적 분자는 이들의 당 잔기에서 특이적으로 변형되어 반응성 포밀 작용기를 생성한다. 상기 포밀 작용기는 비교적 비반응성이고 산화되어 아민 반응성 알데하이드로 전환한다. 페리오데이트 산화는 당 잔기의 하이드록실을 아민-반응성 알데하이드로 전환시키기 위해 바람직한 경로이다. 인접한 하이드록실을 소유하는 페리오데이트는 탄소-탄소 결합을 절단하여 -OH 그룹을 산화시켜 고도의 반응성 알데하이드를 형성한다. 말단 시스-글리콜은 포름알데하이드로서 하나의 탄소 원자를 상실시키고 이전 2번 탄소 원자 상에 알데하이드 그룹을 생성시킨다(도 1). 상기 페리오데이트 산화는 페리오데이트에 의해 수행된다. 페리오데이트의 하나의 비제한적인 예는 나트륨 메타페리오데이트이다. 산화 반응 동안에 페리오데이트의 농도를 다양하게 하여 어떠한 당 잔기가 변형되는지와 관련하여 일부 특이성을 부여한다. 보다 큰 농도의 페리오데이트를 사용한 폴리사카라이드의 산화는 인접한 하이드록실-함유 탄소-탄소 결합을 절단하고 이는 당을 개환시키고 작은 크기의 폴리사카라이드 단편을 생성시킨다.
반응 파라미터는 바람직한 크기의 폴리사카라이드 단편 및 바람직한 정도의 활성화를 수득하기 위해 탈중합/활성화 반응 동안에 다양하다. 다양한 반응 파라미터는 페리오데이트의 농도, 페리오데이트의 폴리사카라이드로의 상이한 노출 시기를 포함한다. 페리오데이트의 농도는 Hib에 대해 실시예 3에서 및 MenA 및 MenC에 대해 실시예 4에서 설명된 바와 같은 반응 혼합물에서 폴리사카라이드 대 페리오데이트의 몰비에 영향을 미친다.
에이취. 인플루엔자(H. influenzae) b (Hib), 엔. 메닌기티디스 혈청그룹 A 및 C(MenA 및 MenC)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그람 음성 세균 그룹으로부터 기원하는 폴리사카라이드는 보다 낮은 분자량의 폴리사카라이드 단편을 수득하기 위해 절단한다. 저분자량의 폴리사카라이드 단편은 Men A 및 Men C에 대해 100 ± 40 kD의 범위로 수득되고 100kD의 평균 분자량을 갖고, Hib의 경우에, 상기 폴리사카라이드 단편은 12 ± 6 kD 범위의 분자량으로 절단되고 10kD의 평균 분자량을 갖는다.
접합 단계 동안에, 알데하이드 함유 폴리사카라이드 단편은 하이드라진 표지된 단백질과 반응하여 쉬프 염기(Schiff base)를 형성한다. 쉬프 염기는 수용액 중에서 가수분해에 의해 용이하게 역전되는 비교적 불안정한 결합이다. 쉬프 염기의 형성은 알칼린 pH 값에서 증진되지만 이들은 2급 또는 3급 아민 연결로 환원되지 않는 경우 여전히 완전하게 안정하지 않다. 다수의 환원제를 사용하여 쉬프 염기를 알킬아민 연결로 전환시킬 수 있다. 일단 환원되면, 상기 결합은 고도로 안정하다. 환원적 아민화는 쉬프 염기 구조에 대해 특이성을 갖고 본래의 알데하이드 그룹에 영향을 주지 않는 환원제로서 사용하여 최상으로 촉진된다. 상기 환원제의 비제한적인 예는 미반응된 알데하이드를 비-반응성 하이드록실로 신속하게 전환시키는 강한 환원력을 갖는 붕소수소화나트륨 또는 시아노붕소수소화나트륨을 포함하고 접합 공정에서 이들을 추가의 침전물로부터 효과적으로 제거한다(도 1). 접합 과정은 접합체에 비교하여 활성화된 TT 또는 폴리사카라이드의 체류 시간의 변화와 함께 SEC-HPLC 분석에 의해 모니터링된다.
정제된 PS-TT 접합체는 폴리사카라이드 함량, 단백질 함량 및 비접합된 유리 폴리사카라이드를 특징으로 한다. 이와 같이 수득된 폴리사카라이드-TT 접합체의 항원성 및 면역원성을 시험하기 위한 연구를 수행한다.
실시예 1. Hib-TT 접합체에 대해 히드라진을 사용한 캐리어 단백질(TT)의 유도체화
100 mg의 벌크 TT를 50 kD MWCO 아미콘 필터를 사용하여 0.2M NaCl을 함유하는 0.1M MES 완충액(pH 6.5)에 대해 희석여과한다. 밀리 Q 워터(MQW) 중에서 5M 하이드라진의 스톡으로부터 0.4M 농도의 2.0 ml의 하이드라진 용액을 13.6 ml의 MES 완충액과 혼합한다. 용액의 pH는 5N HQ를 사용하여 약 6.5로 조정하였다. 여기에 0.48 ml의 EDC 용액을 첨가하여 EDC의 최종 농도가 30 mM(MQW 중에서 1.5M EDC의 스톡으로부터)이 되게 한다. 상기 용액에 2.0 ml의 희석여과된 TT를 첨가하고 반응 혼합물의 최종 용적은 24.08 ml로 조정한다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한다. 항온처리 후, 상기 반응은 용액의 pH를 5N NaOH에 의해 약 9.0으로 증가시킴에 의해 켄칭한다. 상기 용액은 50 kD MWCO 아미콘 필터를 사용하여 30 mM NaCl, 3 mM Na2C03, pH ~ 10.5에 대해 희석여과한다. 완충액의 적어도 6회 세척은 미반응된 하이드라진의 완전한 제거를 보장하기 위해 주어진다. 희석여과된 활성화된 TT 용액은 1.5 ml로 농축시킨다. 상기 활성화된 TT는 SEC-HPLC상에서 분석하여 미반응된 하이드라진의 제거를 확신한다. 활성화된 TT는 TNBS 검정에 의한 하이드라지드 표지화를 위해 분석하였다. 활성화된 TT의 단백질 함량은 로우리 검정에 의해 결정하였다. 하이드라지드를 사용한 TT의 표지화는 하이드라지드의 몰을 존재하는 단백질의 몰로 나누어 계산된 활성화도로 나타낸다(표 1).
실시예 2: 메닌-TT(MenA-TT 및 MenC-TT) 접합체에 대해 하이드라진을 사용한 캐리어 단백질(TT)의 유도체화
파상풍 톡소이드는 실시예 1에서 Hib-TT 접합체 제제에 대한 것과 동일한 방식으로 활성화된다. 활성화된 TT는 SEC-HPLC 상에서 조사하여 미반응된 하이드라진의 제거를 확신하고 변형된 TT의 프로필을 인지한다. 50 ± 5의 활성화도(TT 분자당 하이드라지드의 수) (표 1)는 TT 분자 상의 활성화된 폴리사카라이드의 충분한 로딩을 위해 적합한 상기 방법으로 성취된다. 하이드라지드 활성화된 TT (TT-H)는 추가의 사용때까지 - 20 ℃에서 pH 약 10.5에서 저장한다.
활성 하이드라지드 그룹을 생성하기 위한 TT의 상이한 배치의 유도체화
배치 번호 Expt의 스케일
(단백질의 양)		 활성화 정도 방법 회수율
TTH-01 25mg 50.7 82 %
TTH-02 50mg 53.4 85 %
TTH-03 50mg 51.7 76 %
TTH-04 100mg 53.6 80 %
TTH-05 100mg 54.2 82 %
실시예 3: 산화에 의한 Hib PRP의 탈중합 및 활성화
100 mg의 Hib PRP를 1000 ㎕의 MQW에 용해시킨다. PRP 단량체 몰은 2000 ㎕의 반응 혼합물의 용적 및 PRP 단량체의 분자량으로서 368.2 돌턴을 고려하여 436 mM로서 계산한다. MQW 중에 나트륨 페리오데이트 200 mM 스톡을 제조한다. 1몰의 PRP는 0.5몰의 나트륨 페리오데이트와 반응시킨다. 상기 반응 혼합물은 이어서 7 내지 15분 동안 암실에서 유지시킴에 의해 2 내지 8 ℃에서 항온처리한다. 항온처리 후, 반응 혼합물은 세파덱스 G-25 칼럼에 의해 정제한다. 이전에 상기 칼럼을 1/5 x의 0.15 M MES, 0.2 M NaCl, pH 6.5로 평형화시킨다. 여기에, 2.5 ml의 샘플은 탈염을 위해 첨가하고 1/5 x의 0.15 M NaCl, 0.2 M NaCl, pH 6.5로 용출시킨다. 또는 그밖에 PS는 PD10 칼럼 상에서 직접 정제할 수 있다. 활성화된 폴리사카라이드의 용출 분획물은 회전증발기를 사용하여 500 ㎕로 농축시킨다. 활성화된 폴리사카라이드의 농축 용액은 오르시놀 검정(orcinol assay)에 의한 PRP 함량 및 BCA 검정에 의한 알데하이드 몰에 대해 SEC-HPLC에 의해 크기에 대해 분석한다(도 2). 폴리사카라이드의 활성화는 폴리사카라이드에 존재하는 단량체의 몰을 나트륨 메타페리오데이트로의 산화 후 생성된 알데하이드 몰로 나누어 계산된 활성화 정도로서 나타낸다(표 2). 고유 및 활성화된 Hib PRP의 SEC-HPLC 프로필은 활성화시 폴리사카라이드 단편(¾10 kD)이 고유 PRP 보다 저분자량을 가짐을 지적하고 이는 PRP의 분해를 시사한다. 도 2에서 오른 방향의 피크에서의 쉬프트는 고유 폴리사카라이드의 탈중합을 시사한다.
보다 높은 KD의 고유 폴리사카라이드의 크기는 일련의 GPC 칼럼을 사용한 HPLC-SEC 분석에 의해 보다 낮은 kD 활성화된 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 단편과는 상이해진다(도 2). 알데하이드 그룹 당 활성화 약 4-6의 사카라이드 반복 단위의 평균 활성화도를 갖는 6 내지 18kD 분자 크기의 활성화된 폴리사카라이드 단편이 생성된다. 활성화된 폴리사카라이드는 -20 ℃에서 저장한다.
Hib PRP 활성화
배치 번호 expt의 스케일 폴리사카라이드의 크기 활성화 정도 방법 회수율
PRP-01 25 mg
Figure pct00001
10 kD		 4.6 69.7%
PRP-02 25 mg
Figure pct00002
10 kD		 7.4 66 %
PRP-03 100mg
Figure pct00003
10 kD		 4.8 48.6 %
PRP-04 10 mg
Figure pct00004
100 kD		 80.2 71 %
PRP-05 25 mg
Figure pct00005
100 kD		 88.5 55 %
실시예 4: 산화에 의한 MenA 및 MenC 폴리사카라이드의 탈중합 및 활성화
MenA에 대해, 고유 폴리사카라이드는 25 ℃에서 4시간 동안 0.2몰 과량의 나트륨 메타페리오데이트 (NaIO4)에서 반응시킨다. MenC에 대해, 고유 폴리사카라이드는 대략 15분 동안 25 ℃에서 0.2몰 과량의 NaIO4에서 반응시킨다. 폴리사카라이드의 초기 크기에 의존하여, 시간 또는 몰비는 샘플 마다 변화할 수 있다. 과량의 염은 PD10 칼럼(GB Amersham)에 의해 직접 탈염되거나 Sephadex G-25 칼럼 상에서 탈염시키고, 0.2 M NaCl, pH 6.5를 함유하는 0.15 MES 완충액으로 평형화시킨다. 샘플이 상기 과정에서 희석됨에 따라, 회전증발기 상에서 대략 10mg/ml의 목적하는 최종 농도로 농축시킨다. 수득한 활성화된 폴리사카라이드의 농도는 MenA PS에 대한 인 검정 및 MenC PS에 대한 레소르시놀-염산 방법에 의해 결정한다. 수득한 폴리사카라이드의 알데하이드 함량은 표준물로서 글루코스를 사용하는 BAC 검정에 의해 결정한다. 폴리사카라이드의 유도체화는 활성화도로서, 즉, 폴리사카라이드에 존재하는 단량체의 몰을 나트륨 메타페리오데이트로 산화시킨 후 생성된 알데하이드 몰로 나누어 계산되는 알데하이드 당 사카라이드 반복체의 수로서 나타낸다. 활성화된 폴리사카라이드는 이에 제한되지 않는 회전 증발기 또는 동결건조기로부터 선택되는 증발 기술을 사용하여 물을 제거한 후 무수 분말로서 저장한다. 회전 증발은 임의의 생성물 붕괴 없이 생성물을 농축하고 건조시키기 위한 신속한 공정 때문에 동결 건조 보다 바람직하다.
알데하이드 그룹 당 약 70-90 사카라이드 반복 단위의 평균 활성화 정도 (DOA)는 MenA 폴리사카라이드에 대해서 밝혀졌고(표 3, 도 3a), 30-40의 평균 활성화도는 활성화된 MenC 폴리사카라이드에 대해 밝혀졌다(표 4, 도 3b). 도 3a 및 3b는 각각 샘플이 TSK 겔 G5000 PWXL + G4000 PWXL 칼럼 시리즈 상에서 pH 7.2에서 0.1 M NaNO3에서 및 1.0 ml/분의 유속에서 용출되는 경우 활성화된 MenA 및 MenC 폴리사카라이드의 HPLC-SEC 용출 프로필을 나타낸다. 페리오데이트 산화된 MenA 및 MenC 폴리사카라이드의 SEC-HPLC 용출 프로필은 고유 폴리사카라이드의 탈중합을 시사하는 오른 방향의 피크에서의 쉬프트를 보여준다.
알데하이드 기능성 그룹을 생성하기 위한 MenA 폴리사카라이드의 유도체화
번호 실온에서 NaIC-4와 함께 반응 시간 활성화된 PS의
함량		 CHO 몰 활성화 정도(DOA)
로트 1 4시간 3.8mg 0.259mM -88
로트 2 4시간 3.5mg 0.438mM -71
로트 3 4시간 3.5mg 0.293mM -90
로트 4 4시간 4mg 0.387mM -70
알데하이드 기능성 그룹을 생성하기 위한 MenC PS의 유도체화
번호 실온에서 NaIO4와 함께 반응 시간 활성화된 PS의
함량		 CHO 몰 활성화 정도(DOA)
로트 1 15분 3.65mg 0.89mM 32.9
로트 2 12분 3.4mg 0.74mM 37.45
로트 3 15분 4.16mg 0.92mM 36.65
로트 4 11분 7.0mg 1.73mM 26.18
로트 5 7분 10mg 1.47mM 44.44
실시예 5: 활성화된 Hib PRP 및 유도체화된 TT의 접합 반응
활성화된 하이드라지드-함유 TT는 0.2 M NaCl을 함유하는 0.15M MES 완충액(pH 6.5)에 대해 희석여과한다. 활성화된 알데하이드-함유 Hib PRP는 0.2 M NaCl을 함유하는 0.15M MES 완충액(pH 6.5) 중에 용해시키고; 활성화된 PRP 및 활성화된 TT는 폴리사카라이드의 접합을 위해 1:0.5 w/w 내지 1:0.75 w/w 비율로 혼합한다. TT 양에 대해 1 내지 1.5당량의 수소화시아노붕소나트륨은 반응 혼합물에 첨가한다. 상기 반응 혼합물은 3 내지 14시간 동안 22 + 2 ℃에서 항온처리하고 1 내지 2시간 동안 수소화붕소나트륨으로 처리한다. 수소화붕소나트륨은 활성화된 PS에서 초기 알데하이드 함량에 적어도 10배 몰 등가물의 비율로 취한다. ≪10 kD의 분자량을 갖는 PS-TT 접합체는 0.2 M NaCl을 함유하는 0.15M MES 완충액(pH 6.5 )(50 - 60 용적)에 대해 50 kD MWCO Amicon 필터를 통해 희석여과시킴에 의해 정제한다.
접합 과정은 접합체와 비교하여 활성화된 TT 또는 PS의 체류 시간을 변화시키면서 SEC-HPLC 분석에 의해 모니터링한다. 접합체의 HPLC-SEC 프로필은 접합 반응이 3시간 이내에 최대로 완성되는 것을 도시한다. 따라서, 활성화 단계로부터 최종 정제된 접합체까지의 총 접합 시간은 14 내지 22시간에 성취될 수 있다. 고유 및 활성화된 TT 및 PRP-TT 접합체의 SEC-HPLC 프로필(도 4)은 활성화시 활성화된 TT의 크기가 고유 TT로부터 변화지 않은 채로 유지됨을 지적하고 이는 거의 응집이 일어나지 않음을 시사한다. 한편, 90 내지 100 kD의 페리오데이트 활성화된 Hib 폴리사카라이드 및 ¾10 kD의 폴리사카라이드 단편은 고유 PS보다 저분자량을 갖고 이는 폴리사카라이드의 분해를 시사한다. 접합 후, 고분자량의 피크가 나타나고, 이는 Hib PRP-TT 접합체의 형성을 지적한다(도 4).
PRP-TT 접합체의 SDS-PAGE 분석은 또한 활성화된 TT가 활성화된 고분자량 및 저분자량 PRP에 성공적으로 커플링되어 있음을 시사한다. 접합체에 대한 SDS-PAGE는 불연속 겔/라엠리(Laemmli)의 완충계를 사용하여 수행된다. 상기 스택킹 층은 4 %의 폴리아크릴아미드를 함유하고 분리 층은 6 %의 폴리아크릴아미드를 함유한다. 전기영동 전개는 200 V의 전압과 함께 전기영동 챔버를 사용하여 5 μg의 각각 단백질 샘플을 로딩하는 트리스-글리신-SDS 전개 완충액 중에서 수행한다. 전기영동 전개 후, 상기 겔은 코마시 브릴리언트 블루 염료로 염색시킨다(도 5).
실시예 6: 활성화된 MenA 또는 MenC 및 유도체화된 TT의 접합 반응
활성화된 하이드라지드-함유 TT는 0.2 M NaCl을 함유하는 0.15M MES 완충액(pH 6.5)에 대해 희석여과한다. MenA 및 MenC 둘 다에 대한 활성화된 PS는 0.2 M NaCl을 함유하는 0.15M MES(pH 6.5) 중에 용해시킨다. MenA PS의 접합을 위해, 활성화된 MenA 폴리사카라이드 및 유도체화된 TT는 1:1.5 몰 비율로 혼합하고, 반면에 MenC PS의 접합을 위해, 활성화된 MenC 폴리사카라이드 및 유도체화된 TT는 1:2의 몰 비율로 혼합한다. TT의 양에 대한 수소화시아노붕소나트륨의 1.5w/w 당량을 반응 혼합물에 첨가한다. 상기 반응 혼합물은 25 ℃에서 3시간에서 밤새 항온처리하고, 이후 반응은 알데하이드 몰에 대해 10몰 과량의 수소화붕소나트륨을 첨가하여 켄칭하고 반응은 1 내지 2시간 동안 25 ℃에서 항온처리하였다. 접합체의 HPLC-SEC 프로필은 접합 반응이 3시간 이내에 최대로 완성됨을 도시한다. 활성화 단계에서 최종 정제된 접합체까지의 총 접합 시간은 14 내지 22시간 내에 성취될 수 있다. MenA PS-TT 및 MenC PS-TT 접합체는 비접합된 PS를 제거하기 위해 40 내지 60 %의 황산암모늄 침전시켜 정제하고 추가로 희석여과하고 0.15 M MES, 0.2 M NaCl, pH 6.5 중에 저장한다. MenA-TT 및 MenC-TT 접합체 프로필은 SEC-HPLC에 의해 TT와 비교한다. 활성화된 PRP 대 활성화된 TT의 혼합 비는 PRP의 캐리어 단백질로의 바람직한 로딩을 수득하기 위해 최적화한다. 접합체는 반응 과정 동안에 SEC-HPLC 상에서 조사한다. 접합체는 고유 TT와 비교되는 바와 같이, TT 분자 상의 폴리사카라이드의 로딩을 시사하는 피크에서의 쉬프트를 보여주기 위해 관찰한다. (도 6).
실시예 7: Hib PRP-TT 접합체의 특징 분석:
정제된 접합체는 단백질 함량에 대한 로우리 검정(Lowry assay) 및 PRP 함량에 대한 오르시놀 검정에 의해 분석한다. 나트륨 데옥시콜레이트 침전은 접합체에서 유리된 폴리사카라이드의 평가를 위해 사용한다. 1 % w/v 나트륨 데옥시콜레이트 용액은 MQW중에서 제조한다. 용액의 pH는 1N의 HCl로 약 6.8로 조정한다. 80 ㎕의 1 % w/v 나트륨 데옥시콜레이트 용액을 900 ㎕의 접합체 샘플에 첨가한다. 반응 혼합물은 30분 동안 2 내지 8 ℃에서 유지시킨다. 50 ㎕의 1N HCl을 상기에 첨가하고 샘플은 15분 동안 6000 x g에서 원심분리한다. 상등액을 수거하고 유리 폴리사카라이드 함량에 대한 오르시놀 검정에 의해 평가한다.
본 발명의 방법은 재현성 결과 및 최적의 수율을 나타낸다. 정제 후, 이들 접합체는 단백질 함량 뿐만 아니라 전체 및 유리 PRP 함량에 대해 분석한다. PRP 대 단백질 비율은 0.26 내지 0.36의 범위로 수득한다. 유리 폴리사카라이드의 %는 또한 10 % 미만인 것으로 밝혀졌다(표 5).
PRP 대 단백질 비율 및 다양한 로트의 PRP-TT 접합체의 % 접합 수율
PRP-TT
접합체
로트 번호		 활성화된 PRP의 크기 PRP:단백질 비율 유리 PRP 방법의 % 수율
CB01
Figure pct00006
8 kD		 0.31 1.3 % 15 %
CB02
Figure pct00007
8 kD		 0.26 1.0 % 16 %
CB03
Figure pct00008
10 kD		 0.36 1.1 % 16 %
CB04
Figure pct00009
8 kD		 0.29 2.6 % 19 %
실시예 8: MenA/MenC-TT 접합체의 특징 분석
정제된 MenA PS-TT 및 MenC-TT 접합체는 이들의 폴리사카라이드 함량, 단백질 함량 및 비접합된 유리 폴리사카라이드에 대해 특징 분석한다. 정제된 접합체에서 비접합된 폴리사카라이드는 나트륨 데옥시콜레이트 침전 방법에 의해 결정한다. pH 6.8의 80 ㎕의 1 % w/v 나트륨 데옥시콜레이트는 900 ㎕의 접합체 샘플과 함께 첨가하고 반응 혼합물은 30분 동안 2 내지 8 ℃에서 유지한다. 50 ㎕의 1N HCl은 반응 혼합물에 첨가하고 이어서 15분 동안 6000g에서 원심분리한다. 상등액을 수거하고 MenA-TT 접합체에 대한 인 검정에 의해 그리고 MenC-TT 접합체에 대해 레조르시놀-염산 방법에 의해 총 폴리사카라이드 함량에 대해 분석한다. 비접합된 폴리사카라이드의 %는 데옥시콜레이트 침전에 의해 검출된 유리 폴리사카라이드의 양을 접합체에서 정량된 폴리사카라이드의 총량으로 나누어 계산한다. 접합체의 단백질 함량은 로우리 검정에 의해 결정하고 사카라이드 대 단백질의 비율은 수학적으로 계산한다.
표 6은 정제된 접합체의 특징 분석 데이타를 요약한다. 이들 접합체의 PS 대 단백질 비율은 0.34에서 0.51 (wt/wt)로 다양하고, 최고의 유리 PS는 10 %(wt/wt)에 가깝게 유지된다.
폴리사카라이드 대 단백질 비율 및 다양한 로트의 MenA-TT 및 MenC-TT 접합체의 % 접합 수율
접합체 PS/단백질
비율(wt/wt)		 비접합된 유리 PS 접합 % 수율
MenA PS-TT MAC01 0.37 10 % 28 %
MAC02 0.51 10 % 21 %
MAC03 0.50 4 % 30 %
MenC PS-TT

 MCC01 0.40 7 % 48 %
MCC02 0.34 검출가능하지 않음 33 %
MCC03 0.35 검출가능하지 않음 36 %
접합 수율은 접합을 위해 취한 총 활성 폴리사카라이드로부터 정제된 접합체에서 폴리사카라이드의 최종 함량으로 계산된다. 매우 높은 수율은 접합체, 즉 MenA 및 MenC 접합체 둘 다의 유형에서 성취된다. MenA에 대한 접합 수율은 25 % 이상의 범위에서 성취되고 MenC에 대한 접합 수율은 30 % 이상의 범위에서 성취된다.
실시예 9: Hib PRP-TT 접합체의 면역원성
동물 그룹은 상이한 용량 수준에서 모든 시험 샘플로 면역화시켜 음성 대조군과 비교하여 상당한 면역 반응을 유도한다. 최대 IgG 반응은 28일째 및 42일째에 주어진 2회 부스터 후 49일째에 나타난다.
제조된 Hib PRP-TT 접합체를 1㎍ 용량 수준에서 시판되는 등록된 Hib 접합체 백신과 함께 상이한 용량 수준(1 및 0.5㎍)에서 스프라그 돌리 래트(5 내지 8주령)를 면역화시킨다. 각각 10마리 동물 그룹은 이들의 체중을 기준으로 무작위화하였다. 200 ㎕의 각각의 Hib-PRP 접합체는 실험 0일, 28일 및 42일째에 동물 당 단일 주사로 피하 투여한다. 각각의 동물로부터 대략적으로 300 내지 800 ㎕의 혈액을 0일(채혈 전), 28일 및 42일째에 시험 용량의 투여 전에 레트로-오비탈 망상조직(plexus)으로부터 채혈하고 최종 수거일(49일)에 최대 가능한 혈액을 채혈한다. 혈액 혈청을 수거하고 샘플이 ELISA에 의해 분석될 때까지 -20 ℃ 이하에서 저장한다. 모든 동물은 최종 혈액 수거 후 희생시킨다.
혈청을 모아서 제조된 품질 관리된 혈청은 등록된 Hib 접합체 백신 및 인-하우스 접합체로 면역화된 래트로부터 수득한다. 품질 관리된 혈청은 시험 동물 혈청에서 IgG(EU/ml)의 값을 외삽하기 위해 표준 ELISA 곡선을 생성하기 위해 사용되는 5000EU/ml의 임의의 항-Hib IgG 농도를 함유하는 것으로 지정한다. 표준물에 대비되는 각각의 동물에 대한 IgG 역가는 Combistat 소프트웨어를 사용하여 계산한다. 이어서, 기하학적 평균 IgG 역가는 제형 각각에 대해 계산한다(표 7). 연구 중 하나에서, IgG 역가는 70일까지 Hib PS의 상이한 용량 수준에서 및 상이한 크기를 사용하여 평가하였다(도 8).
49일째에 IgG 역가에 대한 기하학적 평균(+,- 95 % 신뢰 간격)

49일째 IgG 역가에 대한 기하학적 평균
비히클 대조군 등록된 백신 1ug 시험 백신 1ug 시험 백신 051ug
연구 1 28(52,25) 233(363,150) 451(594,343) 649(772,545)
연구 2 39(46,33) 1200(2489,579) 2007(5120,787) 1956(4472,856)
연구 3 230(362,146) 661(1077,406) 2607(6029,1128) 702(1437,343)
연구 4 59(134,126) 2385(3851,1477) 3546(6020,2088) 989(1840,531)
ELISA에 의한 면역원성 연구는 시험 중에 상기 Hib PRP-TT 접합체가 비히클 대조군과 비교하여 항체 역가에서 상당한 배수 증가를 보여줌을 밝힌다. 또한, PS-TT 접합체는 보다 높은 분자량 표준 백신과 비교하여 균등하거나 보다 양호한 항체 역가를 유도한다. 또한, 4개의 연구 중 3개에서, 등록된 백신과 비교하여 0.5㎍의 보다 낮은 용량 수준에서 균등하거나 보다 우수한 반응이 있다(표 7). 따라서, 본 발명의 보다 낮은 kD Hib 접합체 백신은 등록된 비교체와 동일하거나 보다 큰 면역원성이다.
실시예 10: MenC-TT 접합체의 항원성
MenC 폴리사카라이드-TT 접합체의 항원성은 표준 공급원으로부터 각각의 유형에 대한 혈청과 함께, MenC 항원을 중화시킴에 의해 시험관내 분석에 의해 확인한다. 표준 항혈청만을 함유하고 항원을 함유하지 않는 대조군은 시험 샘플과 비교한다. 각각의 항원에 의한 혈청의 억제 정도는 ELISA에 의해 항원 부재 대조군과 비교한다.
나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 혈청 그룹 C(Bacton Dickinson; 222281)에 대해 8000배 희석된 토끼 항혈청은 96웰 미세 역가 플레이트(플레이트 A)에서 0.1 % v/v Brij 35 및 5 % FBS를 함유하는 인산-완충 식염수로 희석된 10㎍/ml에서 상이한 항원(비접합된 MenC 폴리사카라이드 및 MenC 폴리사카라이드-TT 접합체)과 37 ℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 별도의 플레이트(플레이트 B)는 MenC 폴리사카라이드 및 메틸화된 인간 혈청 알부민(m-HSA)의 혼합물로 피복하고 이어서 2 내지 8 ℃에서 밤새 항온처리 후 5 % FBS로 차단한다. 상기 플레이트 B에, 플레이트 A로부터의 연속으로 희석된 항혈청-항원 혼합물을 첨가하고 37 ℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 상기 플레이트는 0.1 % Brij 35를 함유하는 인산-완충 식염수 (pH 7.4)로 세척한다. 이어서 상기 플레이트는 PBS, 0.1 % Brij 35 및 5 % FBS에서 퍼옥시다제 표지된 항-토끼 IgG 항체와 25 ℃에서 60분 동안 항원처리한다. 상기 플레이트는 다시 세척하고 나트륨 아세테이트 완충액 중에서 100 ㎕의 퍼옥시다제 기질, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘-H202와 25 ℃에서 10분 동안 항원처리한다. 상기 반응은 50 ㎕의 2M H2S04를 첨가함에 의해 종료시킨다. A450은 Tecan 마이크로 플레이트 판독기상에서 기록한다. MenC PS-TT 접합체는 항-PS 항체를 상당히 중화시켰다(도 7). 비접합된 유리 MenC PS는 접합된 PS와 비교하여 보다 낮은 억제를 나타낸다.
Hib 및 MenA 폴리사카라이드-TT 접합체의 혈청 억제 ELISA에 대해 유사한 과정은 항원으로서 해모필러스 인플루엔자 b형 및 나이세리아 메닌기티디스 혈청그룹 A(BD; 222301) 및 비접합된 PS 및 PS-TT 접합체에 대한 토끼 항혈청과 함께 사용한다.
실시예 11: MenA 및 MenC 접합체의 면역원성
5 내지 9주의 6마리의 암컷 BALB/c 마우스 그룹은 개별적으로 및 조합적으로 정상 식염수에 제형화된 1㎍의 MenA 및 MenC 접합된 PS 항원으로 0일, 14일 및 28일째에 면역화시킨다(표 9). 모든 면역화는 피하 경로를 통해 200 ㎕의 백신 희석물을 투여함에 의해 수행한다. 단독의 정상 식염수는 음성 대조군 그룹을 위해 사용되고 등록된 백신은 양성 대조군 그룹을 위해 사용된다. 혈청은 14일, 28일 및 35일째에 수거한다. 특정 항-PS IgG 항체 역가는 ELISA로 평가한다.
96웰-플레이트 (Nunc Maxisorp)는 PBS 완충액(pH 7.4) 중에서 5 μg/ml PS 및 m-HSA의 혼합물을 웰당 100 ㎕로 첨가함에 의해 MenA PS(MenA 접합체의 시험을 위해) 또는 MenC PS(MenC 접합체의 시험을 위해)로 코팅한다. 플레이트는 4 ℃에서 밤새 항온처리하고 이어서 PBS 완충액(PBS 중 0.1 % Brij 35, pH 7.4)으로 3회 세척하고 37 ℃에서 1시간 동안 PBS 완충액(PBS 중 0.1 % Brij 35, pH 7.4) 중에서 웰당 200 ㎕의 5% FBS 용액으로 차단하였다. 각각의 항온처리 단계에 이어서 3회 PBS 완충액 세척한다. 표준 및 시험 혈청 샘플은 PBS 완충액(PBS 중 0.1 % Brij 35, 5 % FBS, pH 7.4) 중에서 희석하고 코팅된-블록킹된 플레이트로 이전(200 ㎕)시키고 연속 2배 희석함에 이어서 4 ℃에서 밤새 항온처리한다. 이어서, 웰당 100 ㎕로 1:1000 희석된 퍼옥시다제 접합된 항-마우스 IgG를 첨가하고 25℃에서 1시간 동안 방치한다. 웰당 100 ㎕로 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘-H202는 발색을 위해 첨가한다. 25 ℃에서 발색 10분 후, 반응은 50 ㎕의 2M H2SO4를 첨가함에 의해 중단시키고 광학 밀도는 Tecan 마이크로 플레이트 판독기상에서 450 nm에서 측정한다.
MenA 접합체에 대한 최대 IgG 역가는 2개의 부스터 후 35일째에 성취한다. MenA에 대해 음성 대조군과 비교하여 역가 값의 증가는 등록된 Men ACYW-DT 접합체 백신에서 대략 120배이고, MenA-TT 접합체에서는 330배이고 조합된 MenA-TT 접합체에 대해서는 220배이다. (표 8)
0일, 14일 및 28일째에 투여시 마우스 모델에서 MenA 제형에 대한 ELISA에 의한 IgG 역가에 대한 기하학적 평균(+,- 95 % 신뢰 간격) (도 9).
비히클 대조군 1㎍ 등록된 백신 1㎍ MenA-TT
접합체		 (1+1)㎍(MenA-TT)+(MenC-TT) 접합체
14일 1(1,1) 3(4,2) 498(329,198) 229(242,118)
28일 1(1,1) 430(2247,361) 11717(4485,3243) 6392(6306,3174)
35일 37(53,22) 4444(9937,3071) 12302(3913,2969) 8088(5760,3364)
MenC 접합체에 대한 최대 IgG 역가는 2개의 부스터 후 35일째에 성취한다. MenC에 대해 비히클 대조군과 비교하여 역가에서의 증가는 등록된 백신에서 대략 10배, MenC-TT 접합체에 대해서는 322배이고 조합된 MenC-TT 접합체에 대해서는 250배인 것으로 관찰된다(표 9).
0일, 14일 및 28일째에 투여시 마우스 모델에서 MenC 제형에 대한 ELISA에 의한 IgG 역가에 대한 기하학적 평균(+,- 95 % 신뢰 간격)(도 10)
비히클 대조군 1㎍ 등록된 백신 1㎍ MenC-TT
접합체		 (1+1)㎍(MenA-TT)+(MenC-TT) 접합체
14일 18(15,08) 30(18,11) 605(329,213) 637(519,286)
28일 15(7,5) 78(220,58) 6327(8701,3663) 6063(4354,2534)
35일 28(44,17) 305(595,202) 9039(8059,4261) 7046(3602,2384)
MenA 및 MenC 접합체 둘 다에 대한 14일 및 28일째에 IgG 역가 값에 대한 전체 경향은 ELISA에 의한 측정시 35일째 반응과 유사한 경향인 것으로 관찰된다.
실시예 12: MenC 접합체에 대한 혈청 살균 검정
마우스 그룹에 속하는 혈청 샘플 각각으로부터의 동일 용적은 함께 모아서 혈청 살균 검정에 의한 시험을 위해 그룹 혈청 풀을 제조한다. 상기 검정은 하기와 같이 수행한다:
단일 콜로니 분리를 위해 엔. 메닌기티디스 혈청그룹 C 표적 균주를 스트리킹하고 양 혈액 한천 플레이트 상에 5 % CO2와 37 ℃에서 밤새 (16 내지 24시간) 항온처리한다. 상기 균주는 또 다른 양 혈액 한천 플레이트의 전체 표면에 걸쳐 세포를 분주(약 50 CFU)함에 의해 계대배양하고 이어서 5 % CO2와 37 ℃에서 4시간 동안 항온처리한다. 세균을 약 5 ml의 살균 완충액 중에 재현탁시킨다. 1 mL의 현탁액을 제거하고 650 nm의 파장 길이에서 측정한다. 현탁액 OD650은 0.1로 조정하고 희석은 1:2500 희석으로 완료한다. 혈청은 연속으로 2배 희석하고 검정 완충액은 대조군 웰에서 첨가한다. 10 ㎕의 세균 후처리 용액을 모든 웰에 첨가한다. 10 ㎕의 열 불활성화된(30분 동안 56 ℃에서 유지시킴) 보체를 모든 불활성 보체 대조군 웰에 첨가하고 10 ㎕의 상기 불활성화된 보체를 혈청 함유 웰 및 활성 보체 대조군 웰에 첨가한다. 플레이트를 진탕하고 상기 플레이트를 CO2 없이 37 ℃에서 1시간 동안 항온처리한다.
항온처리 후, 각각의 웰로부터 10 ㎕를 경사진 혈액 한천 플레이트 상에 스팟팅한다. 5 % CO2와 함께 37 ℃에서 밤새 모든 한천 플레이트를 항온처리한다. 플레이트의 각각 스팟 상에 콜로니의 수를 계수한다. 보체 대조군과 비교하여 세균의 > 50 % 사멸을 보여주는 최고의 혈청 희석은 혈청 샘플의 SBA 역가로서 고려된다.
상기 SBA 데이타는 2주 간격으로 3회 투여 후 비히클 면역화로부터 음성 반응을 보여주는 반면, 등록된 접합체 백신은 기능성 항체 역가의 증가를 보여주었다(도 11). 시험 중에 있는 백신 제형은 등록된 백신 대조군과 비교하여 상당히 높은 SBA 역가를 보여주었고 이는 백신이 마우스 모델의 생체내에서 효과적임을 지적한다.
유사한 종류의 프로토콜은 엔. 메닌기티디스 혈청그룹 A를 스트리킹함에 의해 MenA의 SBA 시험을 위해 사용한다.

Claims (19)

  1. 캐리어 단백질, 폴리사카라이드 단편으로 구성된 증진된 면역원성을 갖는 폴리사카라이드-단백질 접합체로서, 여기서,
    - 상기 캐리어 단백질이 그람 양성 세균으로부터 수득된 바람직하게는 이에 제한되지 않는 파상풍 톡소이드(TT) CRM197이고,
    - 상기 폴리펩타이드 단편이 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 혈청형 b(Hib), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 혈청그룹 A 및 C(MenA 및 MenC)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그람 음성 세균 그룹으로부터 수득되는,
    폴리사카라이드-단백질 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리사카라이드가 Hib, MenA 또는 MenC 캡슐 폴리사카라이드인, 폴리사카라이드-단백질 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 유리 폴리사카라이드 %가 10 % 미만이고 활성화된 TT에 대한 활성화된 폴리사카라이드의 비율이,
    - Hib PRP-TT 접합체에 대해 0.2 내지 0.5 (wt/wt)의 범위, 보다 바람직하게는 0.25 내지 0.35 (wt/wt)의 범위이고,
    - MenA-TT 접합체 및 MenC-TT 접합체에 대해 0.2 내지 0.8(wt/wt) 범위, 보다 바람직하게는 0.3 내지 0.7(wt/wt) 범위인,
    폴리사카라이드-단백질 접합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드-단백질 접합체가 0.5 μg 내지 1 μg의 용량에서 상당히 높은 항체 역가를 나타내는, 폴리사카라이드-단백질 접합체.
  5. 제1항에 따른 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) 가교결합제의 존재하에 캐리어 단백질을 적어도 하나의 친핵체와 반응시킴에 의한 적어도 하나의 캐리어 단백질의 유도체화 단계(여기서, 상기 캐리어 단백질은 그람 양성 세균으로부터 수득되고 바람직하게 파상풍 톡소이드 및 CRM 197로부터 선택된다);
    (b) 상기 폴리사카리아드를, 절단되고 활성화된 보다 작은 크기의 폴리사카라이드 단편으로 유도하는 적어도 하나의 산화제와 반응시킴에 의해 적어도 하나의 고분자량의 폴리사카라이드의 절단 및 탈중합 단계(여기서, 상기 고분자량의 폴리사카라이드가 에이취. 인플루엔자(H. influenzae) b형 (Hib PRP), 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis) 혈청그룹 A (MenA) 및 엔. 메닌기티디스 혈청그룹 C(MenC)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그람 음성 세균 그룹으로부터 수득된다);
    (c) 환원적 아민화 화학을 사용하는 폴리사카라이드-단백질 접합체를 수득하기 위해 단계 (a)의 상기 유도체화된 캐리어 단백질과 단계 (b)의 상기 활성화된 폴리사카라이드 단편의 접합 반응 단계
    를 포함하고,
    상기 접합 반응이 접합체의 최종 정제 때까지 폴리사카라이드의 활성화 단계로부터 14 내지 22시간의 짧은 접합 시간을 소요하고,
    - 상기 반응이 폴리사카라이드-단백질 접합체의 보다 높은 수율로 유도하고,
    - 상기 폴리사카라이드-단백질 접합체가 기능성 항체를 포함하는 상당히 높은 항체 역가를 나타내는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 가교결합제가 카복실에서 아민으로의 가교결합을 촉진시키기 위한 화학적 가교결합제이고, 상기 가교결합제가 바람직하게 EDC의 존재하에 하이드라진 1수화물인, 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 친핵체가 바람직하게 하이드라진인 환원제 그룹으로부터 선택되는, 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 유도체화된 파상풍 톡소이드의 활성화도가 50 ± 5인, 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 산화제가 바람직하게는 나트륨 페리오데이트 또는 나트륨 메타페리오데이트인 페리오데이트 그룹으로부터 선택되는, 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법.
  10. 제5항에 있어서,
    - 상기 절단되고 활성화된 Hib PRP 단편이 3 내지 15개 사카라이드 반복 단위당 하나의 알데하이드 그룹을 갖는 평균 활성화도와 함께 12 ± 6 kD 범위의 분자량을 갖고,
    - 상기 절단되고 활성화된 MenA 폴리사카라이드가 40 내지 120개 사카라이드 반복 단위 당 하나의 알데하이드 그룹을 갖는 평균 활성화 정도와 함께 100 ± 40 kD의 분자량을 갖고,
    - 상기 절단되고 활성화된 MenC 폴리사카라이드가 20 내지 80개 사카라이드 반복 단위 당 하나의 알데하이드 그룹을 갖는 평균 활성화 정도와 함께 100 ± 40 kD 범위의 분자량을 갖는, 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법.
  11. 제5항에 있어서, 상기 유도체화된 캐리어 단백질 및 상기 활성화된 폴리사카라이드 단편이 고도로 한정한 저분자량의 PS-TT 접합체를 수득하기 위해 적어도 하나의 환원제의 존재하에 접합되는, 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 환원제가 수소화붕소나트륨 또는 수소화시아노붕소나트륨과 같은 쉬프 염기(Schiff base) 구조에 대해 특이성을 갖는 그룹으로부터 선택되는, 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법..
  13. 제5항에 있어서, 정제된 접합체에서 유도체화된 TT에 대한 활성화된 폴리사카라이드의 비율이,
    - Hib PRP-TT 접합체에 대해 0.2 내지 0.5 (wt/wt)의 범위, 보다 바람직하게는 0.25 내지 0.35 (wt/wt)의 범위이고,
    - MenA-TT 접합체 및 MenC-TT 접합체에 대해 0.2 내지 0.8(wt/wt) 범위, 보다 바람직하게는 0.3 내지 0.7(wt/wt) 범위인,
    폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법.
  14. 제5항에 있어서, 환원적 아민화 화학을 사용하는 상기 접합 % 수율이,
    - Hib PRP-TT 접합체에 대해 16 % 내지 25 %,
    - MenC-TT 접합체에 대해 30 % 내지 50 %, 및
    - MenA-TT 접합체에 대해 20 % 내지 30 %인,
    폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, Hib PRP-TT 접합체의 용량이 래트 모델에서 0.5 μg 내지 1 μg 범위에 있는, 폴리사카라이드-단백질 접합체.
  16. 제1항에 있어서, MenA 및 MenC PS-TT 접합체의 용량이 마우스 모델에서 0.5 μg 내지 1 μg 범위에 있는, 폴리사카라이드-단백질 접합체.
  17. 제1항에 있어서, Hib PRP 폴리사카라이드-단백질 접합체에 대한 항체 역가가 비히클 대조군 항체 역가와 비교하여 1㎍ 용량에 대해 60배 이상이고 0.5 μg 용량에 대해 50배 이상인, 폴리사카라이드-단백질 접합체.
  18. 제1항에 있어서, 비히클 대조군과 비교하여 IgG 역가 값의 증가가,
    - MenA-TT 접합체에 대해 330배이고,
    - 조합된 MenA-TT+MenC-TT 접합체에 대해 220배이고,
    - MenC-TT 접합체에 대해 322배이고,
    - 조합된 MenA-TT+MenC-TT 접합체에 대해 250배인,
    폴리사카라이드-단백질 접합체.
  19. 제1항에 있어서, MenC에 대한 혈청 살균 검정(SBA) 역가가 비히클 대조군 또는 등록된 비교체 백신과 비교하여 MenC-TT 또는 MenC-TT+MenA-TT 접합체와 함께 상당히 높은, 폴리사카라이드-단백질 접합체.
KR1020167012126A 2013-10-11 2014-10-10 증진된 면역원성을 갖는 폴리사카라이드-단백질 접합체 및 이의 신속한 고생산 방법 KR20160062168A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109922828A (zh) * 2016-10-20 2019-06-21 Km生物医药股份公司 使用具有降低了的分子量的PRP的Hib结合疫苗的制造方法

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