JP2000507252A - 免疫性物質を産生する方法及びワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 抗原的に活性な炭水化物部分（ＡＣＭ）から成る免疫性物質を産生する、通常の方法に於て、上記炭水化物部分の夫々は、同一の二価の架橋基を介してアミノ基を含有する免疫学的に活性なキャリヤー（ＩＡＣ）に共有結合される上記方法を開示する。免疫性物質は、構造式（Ｉ）で表わされる二価の架橋基を有する。免疫性物質に加えて、本発明は、ワクチン中の免疫成分として上記物質を使用することから成る。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫性物質を産生する方法及びワクチン 本発明は、免疫性物質を産生する方法に関し、この物質はワクチン中の免疫成 分として有用である。更に、本発明は、この様な免疫性物質、ワクチン及びワク チン混合物に関する。 本発明の免疫物質は、新たに生み出された架橋基を介して免疫学的に活性なキ ャリヤーに共有結合される、抗原的に活性な炭水化物部分から成る。 背景 ほとんどのヴィルレントバクテリアは、その表面、たとえばリポ多糖類及び莢 膜多糖類上に炭水化物を有する。莢膜多糖に対する抗体は、特に増大された食作 用及び細菌細胞の死滅をもたらす。一般に、既知の細菌種の多数の血清型がある 。たとえばその炭水化物莢膜構造に関連する肺炎レンサ球菌の８０種より多い公 知血清型がある。 細菌による多糖類は、Ｔ- ヘルパー細胞- 依存性でない抗原の古典的例であり 、したがってこれらがとにかく免疫性であるならば、これらは主として抗体のＩ gMクラスを誘発する。これは、Ｂ細胞のみがこれらに応答するので、その通りで あるが、Ｂ細胞は追加免疫効果も伝達するＴ細胞とは対照的に記憶機能を伝達す ることができない。 免疫学的に未熟な幼い子供、老人及び免疫抑制された人に於て、多糖類が、僅 かに免疫原であるか又は全く免疫原ではないと知られている。 したがってＴ細胞エピトープを有するキャリヤーに化学的接合する多糖類抗原 は、上記免疫学的に未熟な子供及び免疫抑制された大人に対するワクチンとして も有効である。 ワクチン- 産生産業は、接合(Conjugate)型ワクチンを産生する一般的方法を 長い間探究している。この様なワクチンを産生する一般的及び簡単な方法は、よ り一層実用的であるばかりでなく、処理及び特性もより一層容易にコントロール する。 発明の説明 本発明は、抗原的に活性な炭水化物部分から成る免疫性物質及び免疫学的に有 効なキャリヤーを産生する一般的方法を提供する。この物質は接合型ワクチン中 の免疫成分として有用である。 更に詳しくは、本発明は、抗原的に活性な炭水化物部分（ＡＣＭ）−この部分 の夫々は、同一の二価の架橋基を介してアミノ基を含有する免疫学的に活性なキ ャリヤー（ＩＡＣ）に共有結合される−から成る免疫性物質を産生する方法に於 て、上記二価の架橋基は次の構造式 を有し、これは抗原的に活性な炭水化物部分（ＡＣＭ）を還元アミノ化して、上 記部分(ＡＣＭ−ＮＨ₂）上にアミノ基を導入し、次いで上記アミノ基をイミノチ オラン でチオール化し、その時この様に産生されたチオール化物質が、Ｎ-ヒドロキシ スクシンイミドブロモアセタートでの処理によって活性化されるアミノ基を含有 する免疫学的に活性なキャリヤー（ＩＡＣ）に共有結合する、上記方法を提供す る。 更に、本発明は抗原的に活性な炭水化物部分（ＡＣＭ）−この部分の夫々は同 一の二価の架橋基を介してアミノ基を含有する免疫学的に活性なキャリヤー（Ｉ ＡＣ）に共有結合される−から成る免疫性物質に於て、上記二価の架橋基は 次の構造式を有する、上記物質を提供する。 本発明の免疫性物質はワクチン中の免疫成分として有用である。 本発明の好ましい実施態様に於て、免疫性物質の抗原的に活性な炭水化物部分 （ＡＣＭ）は、細菌によるＯ-多糖類及び（又は）莢膜多糖類に由来する。この 様な多糖類の具体例は、サルモネラ血清型ＢＯ及び（又は）ＤＯに由来するもの である。 他の好ましい実施態様に於て、上記抗原的に活性な炭水化物部分（ＡＣＭ）は 、肺炎レンサ球菌莢膜多糖類の異なる血清型に由来する。 なおまた好ましい実施態様に於て、上記抗原的に活性な炭水化物部分（ＡＣＭ ）は、ヘモフィルスインフルエンザ莢膜多糖類に由来する。 抗原的に活性な炭水化物部分（ＡＣＭ）を、合成によって産生してよい。 本発明の免疫性物質の免疫学的に活性なキャリヤー（ＩＡＣ）は、ポリペプチ ドに由来するのが好ましい。 本発明の好ましい実施態様に於て、このポリペプチドは破傷風トキソイド、ジ フテリアトキソイド、コレラサブユニットＢ又はＨ．インフルエンザからのプロ テインＤである。 本発明は、ヒト又は動物ワクチン中に本発明の免疫性物質を使用することも包 含する。 を包含する。 ワクチンは更に医学専門家によって証明された、ワクチン中に使用される他の 成分、たとえばアジュバントを包含する。 以下に本発明を例によって説明するが、これによって限定されない。 例１サルモネラティフィムリウムＯ-多糖のチオエチルアミン誘導体の調製 サルモネラティフィムリウムオクタサッカライド（４．１マイクロモル；７． ５ｍｇ）を、０．６ＮＨ₄Ｃｌ（メルク社）１ｍｌ中に溶解し、ＮａＣＮＢＨ₃２ ０ｍｇを室温で攪拌しながら加える。６日後、アミン含有誘導体をバイオゲル（ BioGel）Ｐ-２(BioRad)上でゲル透過クロマトグラフィーによって脱塩し、凍結 乾燥する。次いでサルモネラティフィムリウムオクタサッカライド誘導体を０． １Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）０．５ｍｌ中に溶解する。１０モル 過剰の２-イミノチオラン（アルドリッヒ、ステインハイム、ドイツ）及びジチ オトレイトール５ｍｇを加え、反応混合物を１０時間室温で攪拌する。次いで反 応混合物をバイオーゲルＰ-２(BioRad社、スウェーデン)カラム（１．５×２０ ｃｍ、２５ｍＭ酢酸ピリジニウム緩衝液（ｐＨ５．２）で溶離）上でゲル透過ク ロマトグラフィーに付す。得られた分画を、フエノールー硫黄法によってその炭 水化物含有量に関して及び５，５'-ジチオ−ビス−(２-ニトロ安息香酸） （Pierce，Inc.，ロックフォード、イリノイ州、米国）を用いてそのチオール基 に関して測定する。炭水化物含有分画は、予想されたモル割合でチオール含有分 画と一致することが証明され、それ故反応は等モル量で進行したことが確かめら れる。この分画を貯留し、減圧で蒸発して、濃縮し、次いで濃厚なオクタサッカ ライド誘導体上に窒素を吹きつける。ブロモアルキル化された破傷風トキソイドの調製 Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドブロモアセタート(Sigma社、セントルイス、ミ ズリー、米国)（５ｍｇ）を、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３） ０．４ｍｌ中に溶解する。この溶液に、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．３）１．０ｍｌ中に溶解された破傷風トキソイド２．５ｍｇを、攪拌しなが ら加える。反応を室温（２４℃）で８時間進行させる。次いで反応混合物を０． １Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）で溶離されるセファデックスＧ-２ ５（ＰＤ-１０）（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）カラム上でゲル透 過性クロマトグラフィーに付する。所望の物質を含有する分画を貯留する。破傷風トキソイド-サルモネラオクタサッカライド接合体の調製 ０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）１．０ｍｌ中のブロモアルキ ル化された破傷風トキソイド（１ｍｇ）を混合し、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩 衝液（ｐＨ８．３）中に溶解されたオクタサッカライドのメルカプトブチル- イ ミジル誘導体５ｍｇと共に攪拌する。反応を２４時間室温（２４℃）で窒素下に 続ける。次いで得られた接合体を塩溶液に対して透析する。最後に、接合体を凍 結乾燥し、炭水化物含有量及びたん白質含有量夫々の測定から、得られた接合体 が平均して１７．５モル炭水化物／モル破傷風トキソイドの置換を有することが 分る。更に、この接合体は Pharmacia Phastシステム(Pharmacia、ウプサラ、ス ウェーデン）上でポリアクリルアミドゲル電気泳動によって特定化される。これ は約１５−２０モル炭水化物／モル破傷風トキソイドの置換度合と予想した通り に一致する泳動を有することを示す。 例２ ヘモフィルスインフルエンザタイプＢ(HiB) 莢膜多糖（１５ｍｇ）を、３０分 間４℃で０．０２Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム（４ｍｌ）中で酸化して砕く。反 応をエチレングリコール２０μｌの添加によって停止し、HiB オリゴ糖(HiB-OLS ) をバイオゲルＰ- ２中でゲル透過クロマトグラフィーによって単離する。得ら れた HiB-OLSの分子量は１．１kDa であり、これはデキストリンで検定されたバ イオゲルＰ- ２カラム上でのクロマトグラフィーによって表わされる。HiB-OLS( １２ｍｇ) を凍結-乾燥し、水素化シアノホウ素ナトリウム５ｍｇを含有する０ ．４Ｍ塩化アンモニウム０．５ｍｌ中に溶解する。混合物を、３７℃で６日間攪 拌する。アミノ化された HiB-0LSを、酢酸ピリジニウム緩衝液で溶離されるバイ オゲルＰ- ２カラム上で単離し、凍結乾燥し、０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液、ｐＨ８ ．３、０．５ｍｌ中に溶解する。固形２- イミノチオランハイドロクロライド（ ９ｍｇ）を、攪拌された HiB-OLS溶液に加え、反応を６時間、室温で続ける。Hi B-OLS のメルカプト-ブチルイミダート誘導体を、バイオゲルＰ- ２中でクロマ トグラフィーによって単離する。凍結乾燥された誘導体を、０．１Ｍ重炭酸塩- ２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３、２ｍｌ中に溶解する。 Ｈ．インフルエンザからの精製されたプロティンＤ(Janson等、Infect． Immunity;59，119;1991)を、０．１Ｍ重炭酸塩、ｐＨ８．３（５ｍｇ／ｍｌ）１ ｍｌ中に溶解する。ブロモ酢酸のＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル（３ｍ ｇ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０μｌ中に溶解し、攪拌されたプロテ ィンＤ溶液に加える。ｐＨを８．３とし、攪拌を２時間続ける。ブロモアセチル 化されたプロティンＤを蒸留水に対する透析によって過剰の試剤から分離し、限 外濾過によって濃縮する。 ０．１重炭酸塩- ２ｍＭ ＥＤＴＡ（０．５ｍｌ中で４．７ｍｇ）中のブロモ アセチル化されたプロティンＤ溶液を、チオール化された HiB-0LSの攪拌された 溶液に滴加し、ｐＨを８．３に調整し、反応を２４時間、室温で窒素下に実施す る。カップリング反応の進行を、４−１５％ポリアクリルアミド勾配ゲル(Phast System，Pharmacia)中でＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いて追跡する。反応を２- メルカ プトエタノール２０μｌの添加によって終了し、接合体を蒸留水に対する示量透 析によって過剰の試剤から精製する。得られたHiB(OLS)-TTd接合体の炭水化物及 びたん白質分析は、６モル炭水化物／モルたん白質の置換度を示す。 例３ リボシルリビトールリン酸塩１０量体の完全な合成アミノ誘導体（ＲＲＰ₁₀） を、０．１Ｍ重炭酸塩、ｐＨ８．３（１ｍｌ中に５ｍｇ）中に溶解する。固形２ -イミノチオランハイドロクロライド（２．３ｍｇ）を、攪拌されたＲＲＰ₁₀溶 液に加える。室温で６時間後、チオール化されたＲＲＰ₁₀をバイオゲルＰ- ２カ ラム上で精製し、凍結乾燥し、次いで０．１Ｍ重炭酸塩、ｐＨ８．３、０．４ｍ ｌ中に溶解する。 子ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、０．１Ｍ重炭酸塩（１ｍｌ中に１．５ｍ ｇ）中に溶解し、ＤＭＦ（３０μｌ中に１．２ｍｇ）中のブロモ酢酸のＮ- ヒド ロキシスクシンイミドエステルを加え、ｐＨを８．３に調整し、混合物を室温で ２時間攪拌する。ブロモアセチル化されたＢＳＡを０．１Ｍ重炭酸塩- ２ｍＭＥ ＤＴＡ、ｐＨ８．３で溶離されるＰＤ-１０カラム上で単離する。 ブロモアセチル化されたＢＳＡ（０．２ｍｌ中に１．２ｍｇ）を、チオール化 されたＲＲＰ₁₀溶液に滴加し、１８時間窒素下で攪拌する。反応を２- メルカプ トエタノール２０μｌによって停止する。ＲＲＰ₁₀-ＢＳＡ接合体を、限外濾過 セル（カットフィルターＫＤａ）中でくり返し洗滌し、蒸留水に対する示量透析 して未結合オリゴ糖及び他の試剤から精製する。接合体の置換度は５モル炭水化 物／モルたん白質である。 例４ 肺炎球菌多糖タイプ１４(PnPs14)(ATCC No77217から得られ、GMP 下に調製さ れる) を蒸留水（２０ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ中に溶解し、１０分インパルス、次い で３分静止の反復周期を用いて音波処理して砕く。３０サイクル（全体で５時間 ）の後、多糖の分子量は平均５０ＫＤａに減少し、これはセファクリルＳ- ３０ ０中でクロマトグラフィーによって示される。崩壊されたPnPs14を透析し、凍結 乾燥する。回収されたPnPs14（３２ｍｇ）を、水素化シアノホウ素ナトリウム１ ０ｍｇを含有する０．４Ｍ塩化アンモニウム１ｍｌ中に溶解し、４日間３７℃で 攪拌する。アミノ化されたPnPs14を、バイオゲルＰ- ２カラム上でクロマトグラ フィーによって過剰の試剤から分離し、凍結乾燥し、０．１重炭酸塩緩衝液、ｐ Ｈ８．３、１ｍｌ中に溶解する。固形２- イミノチオランハイドロクロライド（ １．７ｍｇ）を、PnPs14溶液に加え、混合物を６時間室温で攪拌する。次いでPn Ps14のメルカプトブチル- イミジル誘導体をバイオゲルＰ- ２上でカラムクロマ トグラフィーによって単離し、凍結乾燥する。 破傷風トキソイド(TTD;２ｍｇ)(Statens Seruminstitut、コペンハーゲン、デ ンマークから得られる)を０．１Ｍ重炭酸塩、ｐＨ８．３、１ｍｌ中に溶解し、 ＤＭＦ中のブロモ酢酸のＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル（１０μｌ中に １．８ｍｇ）を加える。反応混合物のｐＨを８．３に調整し、混合物を１時間、 室温で攪拌する。ブロモアセチル化されたＴＴｄを０．１Ｍ重炭酸塩-２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３で溶離されるＰＤ- １０カラム(Pharmacia)上でクロマト グラフィーによって単離し、限外濾過によって０．５ｍｌに濃縮する。 誘導されたPnPs14（３０ｍｇ）を０．１Ｍ重炭酸塩- ２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．３、１．５ｍｌ中に溶解し、ブロモアセチル化されたＴＴｄ溶液を攪拌しな がら滴加する。ｐＨを８．３に調整し、攪拌を２４時間、室温で窒素下に続ける 。カップリング反応を、ＳＤＳ- ＰＡＧＥ４−１５％ポリアクリルアミド勾配ゲ ル(Phast System，Pharmacia)によって追跡する。未反応ブロモアセチル基を、 ２- メルカプトエタノール２０μｌの添加によって阻害する。硫酸アンモニウム を０． ８Ｍに加え、ｐＨを６． ５に調整する。混合物をブチル- セファロース （Pharmacia，ウプサラ、スウェーデン）カラム上に付与し、非結合PnPs14及び 過剰の試剤を、２０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．５中の０．８Ｍ硫酸アンモニ ウムで洗滌して除去し、PnPs14-TTd接合体を２０ｍＭリン酸塩緩衝液のパルスで 溶離する。接合体の炭水化物及びたん白質含有量の分析は、４モル炭水化物／モ ルたん白質の置換度を示す。 肺炎球菌多糖タイプ２３Ｆ(ATCC No200 9269)を、PnPs23F-TTd 接合体中に生 じる同一プロトコルに従う破傷風トキソイドへの接合に使用する。 肺炎球菌接合体ワクチンの調製 凍結乾燥されたPnPs14-TTd及びPnPs23F-TTd 接合体を、１．５１μｌ接合体サ ッカライド／ｍｌの濃度で０．９％塩化ナトリウム３．３２ｍｌ中に溶解し、３ ％水酸化アルミニウムアジュバント(Superfos Biosector,デンマーク)１． ６８ ｍｌを加え、接合体を室温で１時間の回転によってアジュバントゲル上に吸収さ せる。得られたワクチン調製物は４μｇ接合体多糖／ｍｌ及び１％水酸化アルミ ニウムアジュバントを含有する。単純多糖を含有するコントロールワクチン調製 物を同一方法で調製する。 免疫プロトコル 生れて８週目の雌性非近交ＮＭＲＩマウスを、水酸化アルミニウムアジュバン ト上に吸着されたPnPs14-TTd又はPnPs23F-TTd 接合体ワクチン０．２５ｍｌ（ワ クチン／薬用量で炭水化物含有量に対して１μｇ）の皮下注射によって免疫化す る（各グループ中に５匹）。コントロールマウスを、同一方法で単純Ps14又は単 純Ps23F によって免疫化する。促進剤投与量（炭水化物含有量に対して１μｇ） を、２８日目に皮下に投与する。マウスは第一免疫及び促進剤免疫７日後毎に眼 窩上叢で出血する。血清を分析するまで−２０℃で保存する。血清抗体力価をEL ISA(酵素結合抗体免疫吸着アッセイ)によって測定する。 ＥＬＩＳＡ マイクロタイタープレート(Nunc.デンマーク)を、０．１重炭酸塩、ｐＨ８． ６中に溶解された、問題となる肺炎球菌多糖０．１ｍｌ（１０μｇ多糖／ｍｌ） と共に１８時間、＋４℃でインキュベートする。プレートを３７℃で１時間ＰＢ Ｓ−０．２％アジ化ナトリウム中で２％ＢＳＡによって阻害する。プレートをト ウィーン- ＰＢＳで洗滌し、２０００倍に希釈されたウサギ抗マウスＩｇＧ- ア ルカリホスファターゼ接合体又はウサギ抗マウスＩｇＭ- アルカリホスファター ゼ接合体と共に１時間、３７℃でインキュベートする。トウィーン- ＰＢＳ洗滌 後、１Ｍジエタノールアミン緩衝液−０．５Ｍ塩化マグネシウム中のｐ- ニトロ フエニルリン酸塩溶液（１ｍｇ／ｍｌ）、ｐＨ９．８を加え、２０分後その吸収 性は Titertek Multiscan reader（EFALAB，フィンランド）中に４０５ｎｍで表 示される。 免疫実験の結果 PnPs14-TTd及びPnPs23F-TTd 接合体で免疫されたNMRIマウスに於ける第一（３ 週）及び第二（６週）ＩｇＧ及びＩｇＭ応答を、表１及び表２に示す。 表１ PnPs14-TTd接合体又は単純多糖で免疫化されたNMRIマウスに於けるＩｇＧ及び ＩｇＭ力価 平均力価±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。 IgG力価 IgM力価 PnPs14-TTd PnPs 14 PnPs14-TTd PnPs 14 免疫前血清 5±2 2±2 77±37 105±30 3週 20369±5032 152±117 ±2306±614 179±24 6週 105817±32230 13±11 ±2991±795 217±62 表２ PnPs23F-TTd接合体又は単純多糖で免疫化されたNMRIマウスに於けるＩｇＧ及 びＩｇＭ 平均力価±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。 IgG力価 IgM力価 PnPs23F-TTd PnPs23F PnPs23F-TTd PnPs23F 免疫前血清 0.1±0.1 0.1±0.1 11±6 2±1 3週 692±220 0.2±0.1 492±43 94±44 6週 15951±9731 1.4±1.2 444±120 153±54 結論として、２３Ｆも１４種の肺炎球菌莢膜接合体ワクチンも、極めて強いか つ促進しうるＩｇＧ応答を誘発する。予想した通り単純多糖のどちらも、ＩｇＧ 力価で何らの顕著な増加を誘発しない。接合体に対するＩｇＭ応答は、予想した 通りあまりはっきりしないが、単純多糖を用いて得られる応答よりもかなり高い 。これから、本発明によればたん白質キャリヤー(TTd)への種々のPnPsの共有結 合は、単純多糖と違って、強いＴヘルパー細胞-依存性応答及びまた免疫学的記 憶を誘発する、強い免疫性のPnPs調製物を得るのに適する方法であることが証明 される。この様な本発明の免疫性調製物は、免疫学的に未熟な子供及び免疫抑制 された大人に有効なワクチンに必要とされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/102 Ａ６１Ｋ 39/09 39/112 39/102 39/112 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗原的に活性な炭水化物部分（ＡＣＭ）−この部分の夫々は、同一の二価の 架橋基を介してアミノ基を含有する免疫学的に活性なキャリヤー（ＩＡＣ）に共 有結合される−から成る免疫性物質を産生する方法に於て、上記二価の架橋基は 次の構造式 を有し、これは抗原的に活性な炭水化物部分（ＡＣＭ）を還元アミノ化して、 上記部分(ACM-NH₂)上にアミノ基を導入し、次いで上記アミノ基をイミノチオラ ン でチオール化し、その時この様に産生されたチオール化物質が、Ｎ-ヒドロキ シスクシンイミドブロモアセタートでの処理によって活性化されたアミノ基を含 有する免疫学的に活性なキャリヤー（ＩＡＣ）に共有結合されて、所望の免疫性 物質を産生することを特徴とする上記方法。 ２．抗原的に活性な炭水化物部分（ＡＣＭ）−この部分の夫々は同一の二価の架 橋基を介してアミノ基を含有する免疫学的に活性なキャリヤー（ＩＡＣ）に共有 結合される−から成る免疫性物質に於て、上記二価の架橋基は次の構造式 を有することを特徴とする、上記物質。 ３．免疫性物質が、ワクチン中の免疫成分として有用である、請求の範囲２記載 の免疫性物質。 ４．抗原的に活性な炭水化物部分（ＡＣＭ）が、細菌によるＯ-多糖類及び（又 は）莢膜Ｖｉ-多糖類に由来する、請求の範囲２又は３記載の免疫性物質。 ５．多糖類が、サルモネラ血清型ＢＯ及び（又は）ＤＯに由来する、請求の範囲 ４記載の免疫性物質。 ６．抗原的に活性な炭水化物部分（ＡＣＭ）が、肺炎レンサ球菌莢膜多糖類に由 来する、請求の範囲第２又は３記載の免疫性物質。 ７．抗原的に活性な炭水化物部分（ＡＣＭ）が、ヘモフィルスインフルエンザ莢 膜多糖類に由来する、請求の範囲２又は３記載の免疫性物質。 ８．抗原的に活性な炭水化物部分（ＡＣＭ）を合成により産生する、請求の範囲 ６記載の免疫性物質。 ９．免疫学的に活性なキャリヤー（ＩＡＣ）がポリペプチドから導かれる、請求 の範囲２ないし８のいずれかに記載の免疫性物質。 10．ポリペプチドが破傷風トキソイドである、請求の範囲９記載の免疫性物質。 11．ポリペプチドがプロティンＤである、請求の範囲９記載の免疫性物質。 12．ヒト又は動物ワクチン中に、請求の範囲２ないし１１のいずれかに記載の免 疫性物質を使用する方法。 13．免疫成分が請求の範囲２ないし１１のいずれかに記載の免疫性物質であるワ クチン。 14．請求の範囲１３記載の少なくとも２種のワクチンを含有するワクチン混合物 。