JPH01500036A - 免疫原性複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 鰭尉犠的 １、８（７）」 本発明は、例えば、ヘモフィルス・インフルエンゼタイプｂ　［Ｈａｅｍｏ　ｈ ｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ　ｔｙｐｅ　ｂ　］　、ｘシエシェリキアリ［ ＥＳＣｈｅｒｉＣｈｉａ　ｃｏｌｉｌ　、ナイセリア・メニンギチジス　血清グ ループＡおよびｃ　［Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉ７　５ｅｒＯＱｒＯＵｐＳ 　Ａ　ａｎｄ　Ｃコ、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型３．６．１２． １４，１９．２３および５１（：５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｒｅｕｍｏｎ ｉａｅ　５ｅｒｏｔｙｐｅｓ３．６，１２，１４．１９．２３ａｎｄ　５１］、 ならびにシュードモナス［Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ］などを含む細菌により引 き起こされる感染および疾患に対する、新規なワクチン組成物、その製造プロセ スおよび人類を含む若い恒温動物の免疫に関する方法の分野に関連するものであ る。

２、発明の背景 精製された微生物莢膜ポリマー（ＣＰ）は成熟したヒトおよび動物において一般 的に免疫原性であり、そして相応する全身性感染に対するワクチンとして用いら れ得ることが公知である。この適用において用いられた場合、「莢膜ポリマー」 なる用語は、糖のポリマー、糖酸のポリマー、アミノ糖のポリマー、多価アルコ ールのポリマーおよび糖リン酸塩のポリマーなどのような、糖含有ポリマーに関 するものであり、アミノ酸含有ポリマーに関するものではない、これらの「莢膜 ポリマー」は、グリコシド結合以外の結合および上記に列挙したような糖以外の 成分を含むものではあるが、医学上において「莢膜多糖」と呼称される。

異なる細菌の莢膜ポリマーはヒトの第１年における免疫原性において広範に変化 する。いくつかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型３［Σ江並並並匹 匹　凹些鮫ｎ１ａｅ　５ｅｒＯｔｙｐｅ　３　］およびナイセリア・メニンギチ ジス血清グループＡ　［Ｎｅ１ＳＳｅｒｉａ　ｌ１ｌｅ恒７　５ｅｒｏａｒｏｕ ｐＡ］などのように穏健な活性である。被包性細菌［ｅｎｃａｐｓＵｌａｔｅｄ 　ｂａｃｔｅｒｒａコによる全身性感染に対する感性は、生命体の第１年におい てより大きなものである。幼児における多くのｍ曹莢膜ポリマーに対する免疫原 性応答は、年齢依存である、すなわち莢膜ポリマー（ＣＰ）に対する免疫適格性 は、約第６年齢までに成人のレベルへ増加する。

不活性なＣＰは、ヘモフィルス・インフルエンゼタイプｂ、ストレプトコッカス ・ニューモニエ血清型６および１２、ならびにナイセリア・メンニギチジス血清 グループＣのものである。幼児において中間の応答を与えるＣＰの例としては、 ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１９および５１がある。

２．１　ワクチンにおける抗原としてのｅ全ｔ　ポリマー 数々の研究者がワクチンにおいてないしはワクチンとして有用である完全な莢膜 ポリマーを単離し精製している。

例えば米国特許第４，２２０，７１７号は、ヘモフィルス・インフルエンゼｂの 莢膜ポリマーからの免疫学的に活性なポリリボシル　リビトール　ホスフェート （ＰＲＰ）の単離および精製に関するプロセスを述べている。さらに、米国特許 第４．２１０．６４１号は、２００．０００ドルトンより大きな見かけ分子量を 有し、そして主としてガラクトース、グリコースおよびマンノースからなり、ま た少量のオサメンを含有するヘモフィルス・インフルエンゼの多糖抽出物に関連 するものである。

焼入かの研究者が、よりよい免疫学的応答を達成するために、これらのおよびそ の他の完全な莢膜ポリマーを処方箋において利用している。例えば米国特許第４ ，１９６，１９２号は、精製された完全ＰＲＰおよび完全ボルデテラ・パータラ シス［Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　匹旦匹旦し］細菌を含むワクチンを開示している 。免疫原性を増加させるためのこのアプローチは、若い哺乳動物において、抗Ｐ ＲＰ抗体および抗パータツシス抗体の高められたレベルをまねくものであった。

２．２７−　を　るワクチン 他の研究者たちは、いわゆる「担体効果［ｃａｒｒｉｅｒ　ｅｆｆｅｃｔｌによ り抗体形成を高める努力において、莢膜ポリマーの担体タンパク質への複合［ｃ ｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　］を研究している０例えばシュネールソンら、ジャーナ ル　オブ　エクスベリメンタル　メディシン　１５２：３６１〜３７６（１９８ ０年＞　［５ｃｈｎｅｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｅｘ ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄ’ｒｃｉｎｅ　１５２：３６１−３７６　（１９ ８０）］は、ヘモフィルス・インフルエンゼムポリマー−タンパク冒複合体［ｃ ｏｎｊｕｇａｔｅ　］が、ヘモフィルス・インフルエンゼｂによって引き起こさ れた侵入性疾患に対する免疫性を与えることを明らかにしたことを述べている。

この引用文は、幼児における莢膜ポリマーの年齢に関連する免疫学的挙動を事実 として提供し、また血清アルブミン、カブトガニヘモシアニン［Ｌ　ｉｍｕｌｕ ｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ］およびジフテリア毒素を含 む種々のタンパク質との完全莢膜ポリマーの複合によりこの年齢依存性を克服し ようと努めるものである。複合の方法は、アジピン酸ジヒドラジドなどのような 結合剤の使用を包含するものである。

ゲーヤーら、メト、ミクロパイオル、イムツル、１６５：１７１〜２８８（１９ ７９年）　［Ｇｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　、　Ｍｅｄ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ＩＭｎｍｔｌｎＯｌ、１６５：１７１〜２８８（１９７ ９）］は、還元アミノ化によっであるクレブシェラ・ニューモニｚ［Ｋｌｅｂｓ ｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］莢膜多種フラグメントのニトロ　フェニル 　エチルアミン　リンカ−への複合体を調製し、そして次に、アゾカップリング を用いてこの誘導体化された糖はタンパク貸に付着された。

ｌ−兄肌曵見ヌ 本発明は、細菌莢膜ポリマー由来の莢膜ポリマーフラグメントの細菌の毒素、ト キソイドあるいは結合サブユニットへの還元アミン化による共有付着に関連する ものである。

本出願において用いられる場合、「トキソイド」なる用語は、毒素の抗原性を毒 素の毒性なしに有している毒素の形感を意味するものである。

本発明の免疫原性複合体は、莢膜ポリマーのフラグメントにおける還元基末端を 最初に形成し、そしてこれらを絹欝の毒素、トキソイドあるいは結合サブユニッ トと還元アミノ化によって反応させることによって調製される。還元末端基は、 選択加水分解（例えば酸または酸素による）含む任意の適当な方法によって、あ るいは酸化的開裂（例えば過ヨウ素酸塩による）によって形成され得る。この複 合体は、シアノボロハイドライド　アニオンを含有する水溶液中における還元ア ミノ化によって好ましく達せられる。

本発明の免疫原性複合体は、人類を含む若い哺乳動物において有効なレベルの抗 莢膜抗体形成の有効なレベルを引き出すワクチンを製造するために、薬理学的に 許容できる担体と処方され得る。このワクチンは、それぞれの被包性細菌によっ て引き起こされた若い哺乳動物における全身性感染に対する能動免疫を、哺乳動 物に免疫原性な量の該複合体を投与することによって誘導することに利用され得 る。

この免疫原性複合体は、莢膜ポリマーのみよりも低い年齢依存性であることが見 い出されており、また非常に若い恒温哺乳動物のそれぞれの被包性細菌による全 身性感染に対する能動免疫に関して有用である。

さらにまた、本発明の免疫原性複合体は、炭水化物をタンパク質に複合するのに 用いられてきたアジピン酸ジヒドラジドあるいはＰ−ニトロ　フェニル　エチル アミンのような潜在的に毒性の結合剤を含まないものである。

′！！ｌ後に、本発明の免疫原性複合体は、莢膜ポリマーのフラグメントを含む ものであって、完全な莢膜ポリマーを含むものではない、莢膜ポリマーの高度な 反復構造は、幼児において抗体産生のための受容力を拡大することのこれらの失 敗に関する部分的責任であろう。完全な（高度に重合された）ＣＰとタンパク質 の複合体は、ＣＰのみの場合の免疫学的欠点をほんの部分的に克服するにすぎな いであろう。

一方、担体上の莢膜ポリマーフラグメントの使用は、反復構造の欠点を迂回する ものである。さらにＣＰフラグメントを有する複合体のＣＰ決定基は、完全ＣＰ を有する複合体のＣＰ決定基よりも概して担体により近接しており、そして担体 へのこの近接は、より効果的な「担体効果」に必要とされるものである。

タンパク質担体に関して、さらに利点は、幼児が、定型的に予防接種される、例 えば破傷風あるいはジフテリアなどのような、細菌の毒素、トキソイドまたは結 合サブユニットの使用において存する。選択されたタンパク質担体に対する望ま れた免疫は、莢膜ポリマーに関連した病原体に対する免疫といっしょに導き出さ れる。

記載された結果を説明するためのいかなる理論に対する本願明細書を通じての言 及も本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである０本発明が作 用することによる方法、ここに記載された結果および利点の独立は、下記の詳細 な説明に対する言及により達成される。

４、　Ｈの号　ｔ；Ｂ 本発明の複合体は、担体タンパク質に共有結合した莢膜ポリマーの抗原決定基を 得るために、莢膜ポリマーフラグメントの還元末端基を細菌毒素またはトキソイ ドの第１アミノ基に反応させることによって形成される。該還元基は選択加水分 解または特定の酸化的開裂または両者の結合によって形成され得る。

少なくとも１つの還元末端を有する抗原性フラグメントは、個々の莢膜ポリマー の構造的特徴に依存して、種々の方法によって莢膜ポリマーから生成されること ができる。

過ヨウ素酸塩（あるいはバラ過ヨウ素酸、メタ過ヨウ素酸ナトリウムおよびメタ 過ヨウ素酸カリウムのような関連試薬）による限定された酸化的開裂は、アルデ ヒド末端を残す。このようなアプローチは、近接のジヒドロキシ基を有するポリ マーに限られるであろう、グリコシド結合の加水分解は、還元糖末端を生成する 。このような加水分解は、グリコシダーゼによって最も特異的に酸素的に行なわ れ得るが、この適用は、関連するグリコシダーゼが公知である、例えばストレプ トコッカス・ニューモニエ８　［Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃ。

匹匹　匣並胆酊並　８］などのようなかなりわずかの莢膜ポリマーに限定される であろう、酸による加水分解は、グリコシド結合の加水分解に一般的に用いられ る。このアプローチの利用性は、ポリマーが酸感受性非グリコシド結合を有する 場合あるいはポリマーが抗原特異性に重要な酸感受性分岐結合［ｂｒａｎｃｈ　 ｌｉｎｋａｇｅ　］を含有する場合には限定される。多糖類がホスフェート、サ ルフェートまたはエステル結合のようなグリコシド性炭素に対する塩基不安定結 合を有している場合には、塩基加水分解も使用できる。

この方法の有効性は、該ポリマーが他の塩基感応性非グリコシド性結合を有して いる場合には制限される。

ある莢膜ポリマーとしては、過ヨウ素塩（または関連する酸素酸類）により開裂 を可能にする隣位ジヒドロキシ基を欠いているものがある。しかしながら、この ような莢膜ポリマーの酸、塩基または酵素による先行する加水分解は、通常、酸 化性開裂を可能にする隣位ジヒドロキシ基を遊離することがある。例えば、酸加 水分解によるピルビン酸、酢酸塩、ギ酸塩等の除去あるいは酵素開裂によるシア リン酸の除去は、酸化性開裂の前に行なうことができる。もちろん、これは変性 される基が抗原性特異性に対して重要でないこれらの莢膜ポリマーに対する応用 に限られる。

この莢膜ポリマーが加水分解されてただ１個の官能性アルデヒド基を有する莢膜 ポリマーフラグメントを形成する場合には、（少なくとも２個のアミン基を有す る）多官能タンパク質に対する複合体化は、タンパク質の単分子が共有結合的に 結合している１個またはそれ以上の莢膜ポリマーフラグメントを有する複合体を 生ずることになる。タンパク質に付着する多数の莢膜ポリマーフラグメントが、 タンパク質に対する莢膜タンパク質フラグメントに対する相対的濃度および反応 物の全濃度を含めて複合化反応の条件の変化により通常規制されることが直ちに 判る。もちろん、反応性または反応速度に影響するいかなる反応パラメーター、 例えば時間、温度、ｐＨ等の規制も複合体のｉ＆終組成および構造を変える。

莢膜ポリマーフラグメントがフグメント（例えば非環状残基の隣接ジヒドロキシ 基の酸化開裂の結果として）の各端に位置する少なくとも１個の官能性アルデヒ ド基を有する場合には、多官能タンパク質に対する複合化は、種々のタイプの複 合体を生じる。例えば、このような反応物の連結は、特にタンパク質に多数の遊 離のアミン類があり、かつ莢膜ポリマーフラグメントがタンパク質に対して低分 子である場合に格子または網状構造を形成する能力を有している。架橋度および 網状または格子の全体サイズは、遊結反応の条件の通常の変更により規制できる 。

複合は、シュワルツとグレイ、アーク、バイオケム。

バイオフィズ、１８１：５４２〜５４９　（１９７７年）［Ｓｃｈ＊ａｒｔｚ　 ａｎｄ　Ｇｒａｙ　、　Ａｒｃｈ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ化プロセ スによって行なわれる。簡単に述べると、このプロセスは、還元莢膜ポリマーフ ラグメントと細菌毒素ないしトキソイドを、シアノボロハイドライドイオンある いは関心対象の還元末端を低減することもまた毒素ないしトキソイド莢膜ポリマ ーに悪影響を及ぼすこともないその他の還元剤の存在下で反応させることを含む ものである。

シアノボロハイドライドイオン（あるいはその同等物）は、第１に加水分解され た莢膜ポリマーフラグメントのカルボニル基とタンパク質のアミノ基との間で形 成されるシッフ塩基［５ｃｈｉｆｆ　ｂａｓｅ３中間体の緩和な選択的還元剤と して作用する。このようなイオンの第２の影響は、連結発生後に莢膜ポリマーフ ラグメントに残るいかなる反応性アルデヒド基のより低い還元である。必要によ り連結後に、シアノボロハイドライドイオン（またはその均等物）を遊離の未反 応アルデヒド基を還元するために添加することもできる。

これゆえに、活性な分子が最終製品の一部を形成する結合剤によって連結される 従来用いられていた連結法とは異なり、本発明において利用される還元アニオン は、最終製品中に取込まれない、これは最終製品の潜在的毒性（すなわち、不所 望の免疫原性）を制御する見地から重要なことである。共有結合の証拠は例えば ＰＲＰ部分と担体タンパク質との間の連合が、非共有結合を崩壊する極めて高い 能力を有する８Ｍ尿素の存在下において、タンパク質の塩析にかかわらず持続す るという事実によって示される。

好ましい担体タンパク質は、若い哺乳動物への投与に間で安全でありかつ担体と して免疫学的に有効なものである。

安全性は、−次毒性の欠如およびアレルギー性合併症の最小化された危険性を含 むものである。ジフテリアおよび破傷風トキソイドはこれらの基準を満たすもの である、すなわち好ましく調製されると、これらは非毒性であり、そして、アレ ルギー性反応の降下は十分に実証される。アレルギー性反応の危険性が生体に関 してかなり重要なものであるにもかかわらず、幼児に関しては最小化されている 。

「担体効果」において、弱い抗原ないしハブテンは、担体としてのより強い抗原 （すなわち、異種タンパク質）に付着されることによって、それのみで存在する よりも免疫原性なものとなる。動物が予め該担体のみで免疫されている場合、担 体抗原のみならず付着したより弱い抗原に対する高められた応答に関して「準備 された［ｐｒｉｍｅｄＪＪものとなる。幼児は破傷風およびジフテリア　トキソ イドで慣例的に免疫処置される。これゆえに、彼らは、これらのトキソイドのい ずれかに複合された莢膜ポリマー抗原のその後の提示に関して準備されたもので あろう。

通常、任意の異種タンパク質が担体抗原として与えられ得る。しかしながら、破 傷風およびジフテリアなどのようないくつかの細菌毒素は、これらが２つの部分 から構成され、その一方（「結合［ｂｉｎｄｉｎｇコ」サブユニット〉が、哺乳 動物細胞表面へ結合するための強い親和力を有しているということにおいて付加 的な利点を有する。考えられるところでは、このような「結合」タンパク質への 複合は、免疫系の細胞において、運搬される抗原により効果的な一次応答をなさ せるものであろう。

莢膜ポリマーが複合される担体タンパク質は、天然の毒素または脱毒化された毒 素（トキソイド）であり得る。また、かなり最近の変異技術によって、毒素と抗 原性的に同類であるが、非毒性である遺伝的に変容されたタンパク質が産生され ている。これらは「交差反応物質［ｃｒｏｓｓ　ｒｅａｃｔｉｎｇ　ｍａｔｅｒ ｉａ１３　ＪまたはＣＲＭと呼ばれている。ＣＲＭ１９７は、これが天然のジフ テリア毒素からの単一アミノ酸変化を有するものであり、そしてそれと免疫学的 に区別のつかないものであることから注目すべきものである。

ＣＲＭ　１ｇ７タンパク質を産生ずるコリネバクテリウムシフ−ｉ−リア株Ｃ７ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ　５ｔｒａｉｎＣ７ ）　（８１９７）は、メリーランド州ロックヴイル所在のアメリカン・タイプ・ カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　丁ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ５３２８１が付されている 。

莢膜ポリマーの天然の毒素への複合は毒性を低減するであろうが、有意な毒性が 残存しているであろう。これゆえにさらに脱毒性化が必要とされる。タンパク質 毒素の周知の脱毒性化は、タンパク質の遊離アミノ基と反応するフォルマリンを 用いるものである。残留毒性が、さらに考慮されるものである。さらにまた自発 的な再毒性化が、ワクチンの任意の個々のロフトであり得るものであり、そして このアプローチでの懸念の論争を残すものである。

あるいはまた、天然の毒素は、莢膜ポリマーへの複合の前に、周知的なトキソイ ドを生成するために７オルマリンで脱毒性化され得る。しかしながら、予めのフ ォルマリン処理は、莢膜ポリマーフラグメントの還元基との反応に有効な遊離ア ミノ基の数を低減する。これゆえに、ＣＲＭ類は、それらのアミノ基のいずれも フォルマリンによって占拠されていない一方、生来の毒性を有していないという ことにおいて重要な利点を有する。さらに利点はＣＲＭ類での作用において何ら 生物災害が存在しないことである。

免疫学的に天然の毒性と同一である０８Ｍ１９□の場合、フォルマリンでの処理 （しかしながら、脱毒性化する必要はない。）は免疫学的応答を極めて高めるも のである。これは、からだの機構による分解に対する分子の安定化および／また は架橋による凝集に起因するものであると考えられる（粒子の免疫原性は、サイ ズと共に増加する）。

すべての上記の理由により、破傷風およびジフテリア毒素が、担体タンパク質と して最良の候補であるが、さらに、また好ましいものであるその他のものもある 。これらのその他のものは、ジフテリアおよび破傷風で見出された安全性の遍歴 を有していないであろうが、これらを使用するためのその他の圧倒的な理由があ るだろう９例えば、これらが、担体としてさらにより一層効果的である、あるい は製品経済性が重要であるなどである。担体としてのその他の候補は、シュード モナス、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、百日咳薄およびエシェリキ ア・コリの毒性を含むものである。

ワクチンを処方するための好ましい担体媒体には、リン酸ナトリウム緩衝化食塩 水（ｐＨ７，４＞あるいはｐＨ６でリン酸ナトリウム緩衝化食塩水中に懸濁され た０、１２５Ｍリン酸アルミニウム　ゲルならびのその他の周知の媒体が含まれ る。ワクチンの使用に好適な他の医薬用担体も当業者に知られている。

一般的に、約５〜約１００μｑ、好ましくは約１０〜５０μｑを含有する本発明 のワクチンが、若い恒温哺乳動物において莢膜ポリマーに対する抗体の有効なレ ベルを引き出すのに望ましい。もちろん、正確な投与量は、定型的な投与址／応 答実験によって決定されるであろう。連続的に与えられた数回の少ない投与量が 単回注射として与えられた複合体の同じ量よりも優れたものであることが期待さ れる。

本発明のワクチンは、任意の年齢の恒温哺乳動物中へ注射によって投与され得、 そして特に、ヘモフィルス、インフルエンゼ　タイプｂ、エシェリキア・コリ、 肺炎球菌、髄膜炎菌、ストレプトコッカスおよびシュードモナス病原体によって 引き起こされる若い哺乳動物における全身性感染に対する能動免疫を誘導するた めに適用される。

５、実施例：　ＰＲＰ含有還元末端基の大きな、中ぐらいのおよび小さなフラグ メントの生成ならびにＣＲＭ　１９７への、″ ヘモフィルス・インフルエンゼタイプｂの莢膜ポリマーは、繰返し単位［−３− β−０−リボシル（１−１＞リビトール（５−ホスフェート１１　（ＰＲＰ）を 有する線状ポリマーである。一般に、ＰＲＰの加水分解は、全リボースの還元リ ボースに対する比が２５ないしそれ以下に下降するまで行なわれる。得られたサ イズ混合フラグメントは、複合のために、望まれるサイズ範囲のフラグメントを 単離するために分子ふるいカラムクロマトグラフィーによって分画される。フラ グメントを得るための方法は以下の通りである。

ａ、リボース２８．６１１Ｑを含有するナトリウムＰＲＰ（核酸舎監０．００６ ％）の試料が、蒸溜水で溶解されて１２５ｍ１容三角フラスコにおいて全容！９ ．２ｍｌとされ、そして水中で冷された。

ｂ、　Ｏ，ＩＮ　Ｈ２８０４１，０２ｍ１が加えられた。

Ｃ０酸性化ＰＲＰの０．０１ｍ１の二重のサンプルが、氷上に保持された試験管 へ移された（０分）。

ｄ、フラスコは沸騰水浴中へ３分間移され、そして次に氷水浴中で冷された。

ｅ、ステップＣが繰返された（３分サンプル）。

ｆ、サンプルは、Ｄ−リボースで標準化されたアルカリ性へキサシアノ鉄（ＩＩ Ｉ　）酸塩によって還元力に関して検定された。

ｇ、この結果（第１表参照）に基づいて、ステップｄが繰返された。

ｆ、ステップＣが繰返された（６分サンプル）。

ｉ、ステップｆｈｃ繰返された。

第１表 サンプル　還元リボースの　全リボース／±Ｚ至止ユヱ曳上　運ヱ又エニス此 ０分　０．４２　４９３ ３分　６゜０８　３４．０ ６分　９．６６　２１．４ 結果（第１表参照）は、加水分解の総モードが（１−１＞グリコシド結合であっ たと仮定すると、数平均鎖長は２１゜４モノマー単位、すなわち（リビトール− ５−ホスフェート−３−リボース）であることを示した。

、ｊ、　ＩＮ　ＮａＯＨ０，１０２０＋１が加えられ、そしてｐＨが指示紙によ って評価された（約ｐＨ６＞。

ｋ、中性化加水分解物が凍結乾燥された。

１、　バイオ−ゲルＰＩＯ［Ｂｉｏ　−Ｇｅｔ　ＰＩＯコ　（バイオラットイン コーホレーテッド［Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　Ｉｎｃ、コが０゜１Ｍトリエチルアンモ ニウムアセテート中で平衡化され、そして直径１．５ＣＩのクロマトグラフィー カラムに注がれ、９８ｃｍのゲル床高さを与えた。

ｍ、凍結乾燥化された物質（ステップｋ）は、水２゜７ｍｌで再水和され、そし て１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート０．３ｍｌが加えられた。この溶液は 該カラムへと適用されそして溶出が３．５ｍ１分画の採取を行ないながら実行さ れた。

ｎ、リボシル残余物の溶出は、Ｄ−リボースを標準として用いるオルシノール反 応によるリボース含量に関するそれぞれの分画の０．００５ｍ１サンプルの検定 によって測定された。

０、分画は、第２表に示されるようなり、ＭおよびＳの３つのプール中へ合併さ れ、そして該プールは全リボースおよび還元リボースに関して検定された。

Ｌｉ五 含まれる　全リボース　全リボース／　見積デ　分画のＶｅ／ＶＯ１ニル分員− 一　ミクロモル　湿元見杢二区比はヱ致　の範皿−−−Ｌ　１５〜１８　５７７ 　３１．２　１１，０（）Ｏ５１，０３Ｍ　１９〜２３　７４４　１８．６　６ ．８（）０　１．（）９〜１．３８３　２４〜３４　１１８０　９．１　３，４ ００　１．３９〜１．９９０総加水分解はグリコシド的であるとの仮定の上での ものである。

ｐ、該プールは凍結乾燥され、水１０ｍ１で再水和され、再凍結乾燥され、そし て水１．５ｍｌで再水和された。Ｒｔ＠の溶液１．２ｍｌがマイクロ遠心分離管 へ移され、そして複合反応のための調製物に凍結乾燥された。

ａ、凍結乾燥されたフラグメントＬ、ＭおよびＳを含有するマイクロ遠心分離群 ならびに空の遠心分離管（Ｃないしは比較対照）へ、リン酸カリウム緩衝液ｐＨ ８、ＣＲＭ１ｇ７２．７ｍＱおよびナトリウムシアノボロハイドライド４ｍａが 添加され、そして最終容藍が０．２ｍｌおよびリン酸緩衝液が０．２Ｍとなった 。

ｂ、鎖管は不断に混合しながら３７℃でインキュベートされた。

０、１８時間後に、鎖管は７０００Ｇで２分間遠心分離された。

ｄ、タンパク質の大部分が沈澱物中にあるという決定の後に、沈澱物は、１ｍｌ 以下の水で４回洗浄された。

ｅ、洗浄された沈澱物は、尿素で８Ｍにされて、５０℃にあためられ、食塩水に 対して４℃で１晩透析され、そして遠心分離された。上澄み液は分離されそして 硫酸アンモニウムで９５％飽和したものとされ、４℃で１晩保たれ、そして遠心 分離された。得られた沈澱物は、９５％飽和硫酸アンモニウム０．４ｍｌで３回 洗浄され、そして水１ｍｌに懸濁された。れらのコロイド状懸濁液は、それぞれ ＣＲＭ、９７−ＰＲＰ−Ｌ、ＣＲＭ、９７−ＰＲＰ−Ｍ、ＣＲＭ、９７−ＰＲＰ −ＳおよびＣＲＭ　−８とラベルされた。

ｆ、該調製物は、ウシアルブミンを標準として用いるフォリンフェノール反応［ ＦＯｌｉｎ　ｐｈｅｎｏｌ　ｒｅａｃｔｉｏｎコによってタンパク質に関して、 またＤ−リボースを標準として用いるオルシノール反応によってリボシル残余物 に関して検定された。該調製物は、ｐＲＰｆｊｃｆｌ活性に関して、ヒト抗ＰＲ Ｐ抗体への標識された天然のＰＲＰの結合を阻止するそれらの能力（５０μｇタ ンパク質／　ｍｌの濃度において）によって検定された（第３表）。

第３表 抗原活性 試験さｈな　結合した　（ｒｌＧ　ＰＲＰ調製物／〉天然のＰＲＰ　０．５ｎ！ ＩＩ／　ｍｌ　６．７　−〉天然のＰＲＰ　５ｎｇ／　ｍｌ　０．９４　−ＣＲ Ｍ１ｇ７−Ｃ３４，３０，０ ＣＲＭ１９７−　ＰＲＰ　−Ｓ　２．　ＯＯ，ＩＣＲＭ１ｇ７−ＰＲＰ−Ｍ　２ ．５　０．０８ＣＲＭ１ｇ７−ＰＲＰ−Ｌ　３．９　０．００にのようにＣＲＭ 　１　ｇ７がＰＲＰフラグメントなしにシアノボロハイドライドにさらされた比 較対照調製物が思った通りに不活性であったのに対し、ＰＲＰフラグメントとの ０３Ｍ１９７の複合体の試験されたすべてのものは、抗原性的に活性であった。

調製物は、高分子量精製ＰＲＰと比較して、ウサギにおける免疫抗原性に関し検 定され、そして結果は第４表に示される。ＰＲＰ対照またはＣＲＭ　−Ｃ対照を 与えられたウサギは、抗ＰＲＰ抗体におけるかろうじて検知できる増加をもたら した。３種のＣＲＭ　１ｇ７−　Ｐ　ＲＰ複合体のいずれかを与えられたウサギ は、それぞれの注射の後に進歩的な増加をもたらし、３度回の注射の後の力価は 、免疫前よりも１０００倍も大きなものであった。示されない実験において、０ ３Ｍ１９７とＰＲＰフラグメント調製物りの単なる混合物がウサギにおいて検定 され、そして抗ＰＲＰ抗体を誘い出すことはないことが見出された。

第４表 る放射線抗原により測定された、それぞれの力価である。

複合体によって誘導された抗ＰＲＰ抗体の防御能は、第４表のウサギ血清の殺菌 活性を試験することによって評価された。殺菌価は、アンダーソンら、ジャーナ ル　オブクリニカル　インベステイゲーション　第６５巻、第８８５〜８９１頁 （１９８０年）　［Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　 Ｃｆ１ｎｉｃａＩ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、　Ｖｏｌｕｍｅ　６５．１） ａｐｅｓ８８５−８９１（１９８０）コの方法によってヘモフィルス・インフル エン上５株Ｅａｇ［Ｈ。

Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　ｂ　５ｔｒａｉｎ　ＥａＱコに対して測定された。第５ 表は、予防接種前は、血清は最近を殺すことができないものであった（逆数力価 く２）ことを示す、３回の注射の後、ＣＲＭ１９□−ＰＲＰ複合体を与えられた ウサギの逆数力価は１６ないしそれ以上に上昇したが、一方ＣＲＭ　１ｇ７対照 を与えられたウサギの力価は２未満にとどまった。

（以下余白） 監一旦一人 ＰＲＰのオリゴ糖Ｓ、ＭおよびＬとのＣＲＭ　１９７の複合体のＣＲＭｌ、７で 予防接Ｎ″′された離乳ウサギの血清のへモフィルス・インフルエンゼｂ　Ｅａ 　に・　る細９０％を超える殺菌のための ゛の 予防　３回 ウサギ　ｆ麦ムムな１２±２　農種剪　匡財蓋３　ＣＲＭ　１ｇ７対照　〈２＜ ２ ４　ＣＲＭ　１ｇ７対照　〈２〈２ ５　ＣＲＭ１ｇ７−　ＰＲＰ　−Ｓ　＜２　１２８６　ＣＲＭ　−ＰＲＰ−８＜ ２　≧２５６７　ＣＲＭ　−ＰＲＰ−Ｍ　＜２　１６８　ＣＲＭ１ｇ７−　ＰＲ Ｐ　−Ｍ　＜２　６４９　ＣＲＭ　−ＰＲＰ−Ｌ　＜２　６４１０　ＣＲＭ１ｇ ７−　ＰＲＰ　−Ｌ　＜２　３２“第４表において述べたものと同様の予防接種 。

６、実施例：ＣＲＭ１９７に対するＰＲＰフラグメントの この実施例において、ＣＲＭ　１ｇ７に対するＰＲＰフラグメントＳの比率は変 化され、そしてＣＲＭｌ、７成分の抗原活性の維持がＰＲＰ成分への添加におい て調べられた。

ａ、マイクロ遠心分離管ＡおよびＢに、上記で述べた（すなわちステップ０およ びｐ）フラグメントＳの溶液０゜１５ｍ１がそれぞれ加えられた。該溶液は凍結 乾燥された。

ｂ、管Ａは、２Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８の０゜０１５ｍ１．０．ＯＬＭリ ン酸ナトナトリウム緩衝液ｐＨ７中　ｍＱ／　ｍｌのＣＲＭ１ｇ７の０．１ｍｌ 、および２００　ｍＱ／　ｍｌナトリウムシアノボロハイドライドの０．０１５ ｍ１を与えられた。

Ｃ０管Ｂは該ｐＨ８の緩衝液０．００２ｍ１および該ＣＲＭ１９７溶液０．１ｍ ｌを与えられた。得られた溶液は凍結乾燥された。この固体は、水０．０１５ｍ １で懸濁され、そして該ｐＨ８の緩衝液０．００２ｍ１が加えられた。

ｄ、管ＡおよびＢは３７℃で１３日間インキュベートされた。管Ｂに対してシア ノボロハイドライド０．００２ｍ１がさらに添加された。双方の管は、３７℃で さらに３日間インキュベートされた。（減少した反応容量によって、Ｂにおける 反応物の濃度はＡのものよりも高くなったことをしるす。） ｅ、　Ａに対し、水０．０６ｍ１および飽和硫酸アンモニウム（Ｓ　Ａ　Ｓ　） 　０　、８　ｍｌが加えられた。Ｂに対しては、水０．１７５ｍ１および５Ａ８ ０．８ｍｌが加えられた。

ｆ、鎖管は、０℃で１時間インキュベートされ、そして８０００Ｇで２０分間遠 心分離された。上澄み液が除去された。

ｇ、沈澱物は、８０％Ｓ　Ａ　Ｓ　１　ｍｌ中への懸濁、８０００Ｇで２０分間 の遠心分離そして上澄み液の除去によって洗浄された。

ｈ、沈澱物は、水０．１ｍｌで懸濁され、そして５ＡＳＯ，４ｍｌが添加された 。

ｉ、ステップｆと同じ。

ｊ、ステップｇと同じ。

ｋ、　Ｂにおける沈澱物は、９．５Ｍ尿素０．０８４ｍ１で溶解され（最終濃度 は８Ｍと見積られた。）、水０．１ｍｌおよび５ＡＳ０．８ｍｌが添加され、そ して沈澱物がステップｆにおけるようにして単離された。この沈澱物はステップ ｇにおけるようにして洗浄された。

１、　ＡおよびＢにおける沈澱物は、水０．２ｍｌで懸濁された。懸濁液は８０ ００Ｇで３０分間の遠心分離することによって可溶性（ｓ＞分画および不溶性（ ｉ）分画へ分ｍされ、そしてＳ分画（上澄み液）は、０．０１Ｍリン酸ナトリウ ム緩衝液ｐＨとされそして貯蔵された。

ｍ、　ｉ分画（沈澱物）は、以下のようにしてより可溶性にされた：ｉ分画は尿 素で８Ｍとされ、そしてこれは０゜０１Ｍリン酸ナトリウムＭ衡液ＰＨ７に対し ての透析によって段階的に除去された。得られた溶液はそれぞれのＳ分画へ再び 組合させた。

ｎ、調製物ＡおよびＢは、フォリンフェノール試薬［Ｆｏｌｉｎ　ｐｈｅｎｏｌ 　ｒｅａｇｅｎｔコでタンパク質含量に関して、また上記した検定法によってＰ ＲＰ抗原活性に関して試験された。以下に示すように、双方ともＰＲＰ活性を有 するが、ＢはＡよりも約１３漬浸れていた。

ｎｇＰＲＰ当量／ 一胤製曳一　Ｌｌり２パフ１ ＣＲＭ１９７−ＰＲＰ−Ｓナンバー２．Ａ　Ｏ，０３８ＣＲＭ１９１−ＰＲＰ− Ｓナンバー２．Ｂ　Ｏ，５００、調製物ＡおよびＢは、マサチューセッツ　デパ ートメント　オブ　パブリック　ヘルスによって供給された精製ジフテリアトキ ソイドのサンプルへの抗体の結合の阻止によってＣＲＭ抗原性（ジフテリアトキ ソイド（ＤＴ＞としての活性）に関して試験された。以下に示すように、双方と も、重量にもとづいた場合、概ねＤＴと等しい活性を有するが、ＢはＡよりも約 ４倍返（優れていた。

試験された　結合した抗体、　タンパク質１μｇなし ＤＴ、０．５μｇ／ｍｌ　２　、４３ ＤＴ、５μ（１／ｍｌ　２．５６ Ｄ　Ｔ　、　５０μＱ／ｍｌ　１−　、９３ＣＲＭ　−ＰＲＰ　−３１，２５０ ，５２ナンバー２．Ａ、５０μｇ／ｍ？ ＣＲ）ｌ　−ＰＲＰ　−３１，６７２，０ナンバー２．Ｂ、　５μｉｌｌ／ｍｌ ｐ、　ｔｌｉ製物ＡおよびＢは、１６μｇタンパク質／　ｍｌで０．０１２５Ｍ リン酸アルミニウム緩衝液ｐＨ６中に懸濁され、そして第４表に述べられた処方 （しかしながら動物は、着手時に８週齢であり、またジフテリアトキソイドの予 めの注射によって準備されていなかった。）において、３回の０．５ｍｌ注射が ウサギに与えられた。血清はステップ０において調べた結合検定法において抗体 に関して試験された。ＡおよびＢの双方とも、第６表に示すように、ＤＴに対す るならびにＰＲＰに対する抗体を誘導するものであった。別個の比較対照実験は 、ＣＲＭ１９１調製物で注射されない状態において同じ宿舎の同様のウサギが抗 ＤＴ抗体僅におけるこのような増加が発現しなかつたことを示した。

（以下余白） 災」Ｌ五 ５　Ａ　ＰＲＰ、＋１０／ｍ　４７　６０　２１０１３．５００ＤＴ、Ａ４ｏｏ Ｏ，１３６０，１６８１，２８３，８１６Ａ　ＰＲＰ　２１　２５　１９　４２ ０ＤＴ　Ｏ，０７２０，０４９０，２６２３，２３７Ａ　ＰＲＰ　＜２０　２０ 　２０００１０．５００ＤＴ　Ｏ，１５５０，１３４０，１５５０，６７６３Ｂ 　ＰＲＰ　＜２０　２７　１６００　４９００ＤＴ　Ｏ，０７５０，０６１０， ２２７２，４５８Ｂ　ＰＲＰ　２３　＜２０　２９００２６．（Ｋ）ＯＤＴ　０ ．０Ｂ５　０．０２３　０．２３１　２．０７７、実施例：　ＰＲＰの非常に小 さなフラグメントリジフテリア毒素、ジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ１９７ への　４ 還元末端基を有するＰＲＰの非常に ハさｔフラグメントの生成 ａ、　ＰＲＰＯット２０（７）溶液１２ｍ１が、０℃でＨ（１で０．１Ｍとされ 、ガラス製フラスコ中に封じ込められた（０分）。

ｂ、該フラスコは沸騰水浴中に４分間移され、次に氷水洛中に冷やされた。

Ｃ９微量の生成した白色のコロイドは、エーテルでの抽出によって除去され、得 られた透明な溶液は凍結乾燥された。

ｄ、パイオーゲルＰ１０（バイオ　ラット　インコーホレーテッド）は０．０１ Ｍ酢酸アンモニウム中で平衡化されそして直径１．５Ｃｍのクロマトグラフィー カラム中に注がれ、９８Ｃｉｌのゲル床高さを与えた。

ｅ、凍結乾燥された物質は水１．５ｍｌで再水和されそしてＮＨ４０Ｈで中和さ れた。この溶液が該カラムに適用され、溶出が行なわれた。

ｆ、２．０〜２．４のＶ　ｅ　／　Ｖ　ｏ比で溶出するフラグメントが集められ 、分画ｖｓと命名された。

ｇ、分画ｖｓの供給を二倍とするために、ａ−ｆのステップが繰返された。

ｈ、組合された分画ｖｓは、Ｄ−リボースで採準化されたアルカリ性へキサシア ノ鉄（ＩＩＩ　）酸塩法によって検定された場合に総計４７μｍｏｌの還元糖活 性を含む４ｍｌの溶液を得るために、凍結乾燥され再水和された。

ＰＲＰ　−ｖｓフラグメントの天然ジフテリア毒素、天然ジフテリアトキソイド およびＣＲＭｌ、７への、人　の；、Ｉ 以下のタンパク質は、本実施例において担体として用いられる。

（１）ＤＴｘ−精製ジフチリア毒素、ロット１マサチユーセツツ　パブリック　 ヘルス　バイオロジック　ラボラトリーズ［Ｈａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｅｓ　Ｐ ｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓコか ら得られた。部分的脱毒毒性化がＰＲＰＶＳへの結合によって行なわれる。

残余毒性はバペンヘイマーら、イムノケミストリー。

下におけるフォルマリン処理によって除去される。

（２）ＤＴｄ−周知のく正式な）トキソイド、ロフトＣＰ−２７ 上記マサチューセッツ　ラボラトリーズ　よりまた得られた。

（３）　ＣＲＭ１９７−毒素タンパク質の抗原性的に変異されたバージョン 毒素と抗原性的に同一であるが非毒性である。

複合方法は以下の通りである。

ａ、　タンパク質、リン酸カリウムＭ街液（２５℃でｐＨ８，０およびＰ　ＲＰ 　ｖｓが、次に示す様式においてガラス製遠心分離管中で組み合された。

混甑　久Ｚパｌｌ　ｌ！ＩＬ　ＰＲＰｖｓ（１）　３０ｍｇ　ＤＴｘ　２４０μ ｍｏｌ　Ｐ　２０μｍｏｌ（２）　３０ｍｇ　ＤＴｄ　２４０μｍｏｌ　Ｐ　２ ０μ１ｎＯＩ（３）　１０ｍｇ　ＣＲＭ１ｇγ８０μｍｏｌ　Ｐ　６．７μｍｏ ｌｂ、溶液は親媒化され、そして凍結乾燥物は、以下に表として示されるように 、２％ｗ／ｖ　ＮａＣＮＢＨ３水溶液で溶解された。溶液（４）は凍結乾燥され ず、ただこの述べられた成分の指示容量において調製された。溶液（４）のｐＨ は８．０であった。

（３）　０．４１７１１ Ｃ１鎖管は３７℃でインキュベートされた。

ｄ、１４日（ＬＴ−ＢＮＴに関しては３８℃て１８日）後に、飽和硫酸アンモニ ウムの４容量当量が添加された。

これらの懸濁液は０℃で３時間保たれ、次に９０００Ｇで２０分間遠心分離され た。

ｅ、沈澱物は、中性の７０％飽和硫酸アンモニウム１０ｍ１をそれぞれ用いて２ 回洗浄された。

ｆ、洗浄された沈澱物は、９．５Ｍ尿素の最小の容量で溶解されそして０．０６ ７Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，８に対して透析された。

合　のフォルマリン１理 ａ、複合体はさらに０．０２５Ｍリジンをまた含むものであるリン酸ナトリウム 緩衝液に対してさらに透析された。少藍のサンプルが、フォルマリン化の前に毒 性試験のために取って置かれた。） ｂ、フォルマリンが０．２％Ｗ／Ｖの最終濃度まで添加された。

Ｃ９約２４℃で１７日間（ＬＴ−ＢＮＴに関しては７日間）のインキュベーショ ンの後、溶液は、リン酸ナトリウムに対して広範に透析された。

ｄ、遠心分離が少藍の不溶性物質を除去するために行なわれた。

最終的容器製品を得るための手順 ａ、等強性リン酸ナトリウム緩衝液における抗原溶液（１）〜（３）は、０．２ ２ミクロン「ミレックス［）ｆｉｌｌｅｘ］　Ｊフィルターユニット（ミリボア 　コーポレーション［ＭｉｌｌｉｐＯｒｅ　Ｃｏｒｐ、コ）を通過させられ、そ して滅菌リン酸Ｍ街食塩水を含有する瓶中に注入された。

ｂ、調製物はローリ−法［Ｌｏｖｒｙ　ｍｅｔｈｏｄコを用いてタンバク質に関 して検定された。

Ｃ０チメロサールが沢過されてそして新たに作られた１％Ｗ／Ｖ溶液の１／１０ ０容量となるように溶液中に注入された。１０ａ＋Ｊのサンプルが殺菌試験のな めに取られた。！Ｋが、手動の滅菌単回使用充填具（マルチプル　アディッティ ブ　セット、トラベノール　ラボラトリーズ［）ｌｕｌｔｉｐｌｅＡｄｄｉｔｔ ｖｅ　Ｓｅｔ、　ｒｒａｖｅｎｏｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓコ）へ取付けら れた。２ｍｌガラス瓶が満たされ、栓をされ、密封され、そして４℃で胛蔵する なめに迅速に移された。

Δ　；。１　における ａ、タンパク質分画のリン酸エステル含量ＰＲＰはリボシル−リビトール−ホス フェートの繰返し単位から構成される。これゆえに、５％トリクロロ酢酸（ＴＣ Ａ）によって沈澱可能な分画におけるリン酸エステルの比色検定は、タンパク質 中のＰＲＰフラグメントの取り込みの敏感な指針である。

タンパク質１００μｇを含有するサンプルが３ｍｌの容量においてＴＣＡ５％に 作成され、氷上に２０分間保持され、そして４℃において２０００Ｘｇで１５分 間遠心分離された。沈澱物は、５％ＴＣＡの別の３ｍｌで洗浄され、次にエタノ ール５ｍｌで洗浄された。洗浄された沈澱物は、有機リン酸エステルを無機リン 酸塩（Ｐｉ）に添加するなめに灰化され、そして該Ｐｉは、チェノら、アナル、 ケム０．践：５６）コの方法によって定量された。結果は以下の通りである。

ＰＲＰ繰返し単位／ ｎ　ｎｏｔ　Ｐｉ／　タンパク質の −丈之１四−Ｌ呈ヱンパ２ヌ　堕丞ヱ均玄−一一（１）ＤＴｘ−ＰＲＰｖｓ　０ ．　１　１　６．　８（２）ＤＴｄ−ＰＲＰＶＳ　０　、１　０　６　、２（３ ）ＣＲＭ１９７−ＰＲＰｖｓ　０　、１０　６　、２ｂ−！へ迷整煎公逝 複合抗原のサンプルが、メルカプトエタノール−ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ アクリルアミドゲル電気泳動（ＭＥ−８ＤＳ−ＰＡＧＥ）により、それぞれの出 発担体タンパク質調製物と並んで同じゲルにおいて分析された。

ＤＴｄ　−ＰＲＰｖｓは、ＤＴｄと同様に、分子量６１，０００ドルトンでの分 散バンドを示した。これに対し、ＤＴｘ−ＰＲＰＶＳおよびＣＲＭ１９７−　Ｐ ＲＰｖｓは、出発タンパク質とはかなり異なるものであった。これら２つの複合 体のタンパク質は、堆積ゲル（４％アクリルアミド）の始めにもしくは中にある いは分離ゲット［ｇｅｔ　］の始めに集められた。これゆえ、複合体は、恐らく フォルマリン処理からの架橋結合による、高分子凝集体に転化していると思われ る。ＤＴｄ−ＰＲＰＶＳはまたいくらかの凝集した物質を含んでいる。

ＬＴ−ＢＮＴ−ＰＲＰＶＳの電気泳動的分析は、本雪的にすべてが凝集形態にあ ることを示した。

Ｃ，タンパク　ｌ゛）　のＰＲＰ　２、抗ＰＲＰ抗体を結合するための複合体の 能力が、ＰＲＰロット１９で目盛り定めされた、ヒト抗ＰＲＰ抗体による標識化 ＰＲＰ結合の阻止によって測定された。（タンパク質結合ポリマー７ラグメント は、高分子ｌポリマーに対する重呈−当員形式において抗体に結合することが仮 定できないゆえに、定量的化学組成はこれらのデータから推論され得ない。） （以下余白） ３　Ｈ−ＰＲＰ結合　ｎｇ　ＰＲＰ当量／−ヱＺズ止−塁阻止％　Ａ五又Ｚパｆ ｌＰＢＳ対照　（０）　− ＰＲＰ１９．０．５ｎｇ／　ｍｌ　６．　７　−ＰＲＰ１９．　５ｎｇ／　ｍｌ 　３２　−ＰＲＰ１９，５０ｎＱ／　ｍｌ　９０　−Ｄ丁Ｘ−ＰＲＰＶＳ、　２ 　４　０　、５５μｇタンパク質／ｍｌ ＤＴｄ−ＰＲＰｖｓ、　４８　２．　２５μｇタンパク質／ｍ１ ＣＩ？）ｆ　１９７−ＰＲＰｖｓ、　３８　１　、４５μｑタンパク質／　ｍｌ ｄ、タンパク質１単位当りのジフテリアトキソイド抗原当量 抗ＤＴｄ抗体と反応する調製物の能力の維持が、ＬＴ−ＢＮＴ−ＰＲＰｖｓ複合 体を除くすべてのものに関して、精製ＤＴｄが検定管（固相）に付着される酸素 結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）の阻止によって測定された。付着ＤＴｄへの 抗体結合の阻止は、流体層において用いた同じＤＴｄによって目盛り定めされる 。

抗体結合　ｎｇ　ＰＲＰ当量／ 一丈Ｚズ土−例風止２ｉ１Ａ−且叉２バｆｌＰＢＳ対照　（０）　− 〇Ｔｄ、　５μＱタンパク質／ｍｌ　２４　−り丁ｄ、　５０μｑタンパク質／ ｍｌ　５０　−ＤＴｘ−ＰＲＰｖｓ、　４　６　０　、　６　８５０μｇタンパ ク質／　ｍｌ ＤＴｄ−ＰＲＰｖｓ、　５８　２．　１５０μｇタンパク質／　ｍｌ ＣＲ）ｌ　１９７−ＰＲＰｖｓ、　２６　０　、１１５０１ｔＱタンパク質／ｍ ｌ ｅ、ジフテリア毒性活性 本来のＤＴｘならびにフォルマリン処理前および後の複合体ＤＴｘ−ＰＲＰｖｓ が、非免疫成体ウサギの皮膚中への注射によって毒性活性に関し力価評価された 。０．００２μｇおよび０．０２μｇの投与量で、ＤＴｘは予期された皮膚病変 をもたらした。フォルマリン処理前のＤＴｘ−ＰＲＰｖｓは０．２ＪｔｇがＤＴ ｘ　０．００２μｇとほぼ等しい（複合による毒性における１００倍の低減）と いうような投与量依存性病変をもたらした。フォルマリン処理の後、病変は２μ ｇ程も高い投与量によっても発生しなかった（ＤＴｘと比較して少なくとも１０ ００倍の低減）。複合体ＤＴｄ　−ＰＲＰＶＳおよびＣＲＭ、、７−　ＰＲＰｖ ｓの最高２μｇまでの投与量が同様に試験されたが、病変は発生しなかった。

ｆ、放射線抗原結合により計測された、離乳ウサギにおける抗ＰＲＰｔ″′体応 答の誘導 抗原は、リン酸アルミニウムアジュバント（０，０１２５Ｍ　Ａｊ）、ｐＨ６＞ と結合され、タンパク質２５μｇを含む０．５ｍｌ投与量とされた。２匹のウサ ギ（それぞれの抗原に関して）は第７適齢で始められる３３！！間注射を与えら れたが、該ウサギは仮定の「担体準備［ｃａｒｒｉｅｒ　ｐｒｉｍｔｎＯ３」効 果のなめに第５週齢でＤＴｄのみでの注射をされていた。すべての動物（ウサギ １〜７）は３回目の予防接種の後に、少なくとも１０μｇ　／　ｍｌの力価を有 して、既往パターンにおける抗ＰＲＰ上昇を有した。抗原ＣＲＭ１，７−ＰＲＰ ＶＳ、およびＤＴｄ−ＰＲＰｖｓは、ＤＴｄで「準備され」でいなかった２匹の ウサギにおいてさらに試験された。これら（ウサギ７〜１０）は「準備された」 ウサギにおけるものと同様な強力な抗ＰＲＰ応答を起こした。

ｇ、ＥＬＩＳＡによって計測された、離乳ウサギにおけるＤ　Ｔ　ｄ　ｔ”体応 答ノｊ　３ 前述の分節の同様の「準備されていなかった」ウサギ（７〜１０）の抗ＤＴｄ抗 体応答は次の通りである：上昇は２回目の注射の後概ね１０倍および３回目の注 射の後さらに２〜５倍であった。

ｈ、　ンプル調Ｓ勿の生殖Ｘｖ− サンプルは、増殖培地としてフルイド　チオグリコレート［Ｆｌｕｉｄ　丁ｈｉ ｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ］　（ビービーエ／し　カタログナンバー１１２６０． 　ＯットＤ４Ｄ　ＬＫＬ　［ＢＢＬ　ｃａｔ、　ｎＯ，１１２６０，ｌｏｔ　Ｄ ４Ｄ　ＬＫＬ］　’）を用いて測定された場合生殖不能であることが見出された 。

８、実施例：幼児におけるワクチンとしてのジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ 　１ｇ７に複合したＰＲＰフラグメントの １〜２才の年齢範囲の８人の幼児の２つのグループ、（および第１８カ月齢でジ フテリアトキソイドタンパク質での定型的予防接種を受ける特に免疫される幼児 ）は、以下のように最初のおよび第２回目の予防接種を受けた。グリープＩは、 前述の節において述べるように調製されたＣＲＭ１ｇ７−　ＰＲＰｖｓの注射を 受け（食塩水中にタンパク質２５μｇ、皮下的）、グループＩＩは、前述の節に おいて述べるように調製されたＤＴｄ−ＰＲＰＶＳの注射を受けた（食塩水中に タンパク質２５μｇ、皮下的）。

最初の臨検においては、予防接種前血液標本が採取され、幼児が予防接種され、 次にアナフィラキシ−反応の徴候に関して２０分間観察された。第２の臨検にお いては、第１の臨検における手順が繰返された。第３の臨検においては、２回目 の血液標本が採取された。それぞれのグループからひとりの、２人の幼児は、親 との相談の後に、ＰＲＰに対する抗体を防御レベルへ高めることを試みるために 第３回目の予防接種を与えられた。予防接種の間の間隔は１±１１２力月であっ た。

グループＩＩＩは、別の部位でのジフテリアトキソイドと同時にワクチンを受け る約１８カ月齢の幼児から構成されたいた。このグループは、一方がＣＲＭ　１ ｇ７−　Ｐ　ＲＰ　ＶＳワクチンを受け、他方がＤＴｄ−ＰＲＰｖｓワクチンを 受ける２人の幼児を含むものであった。

徴候が体温の測定、全身性疾病の挙動指示の表記、および注射部位での炎症の観 察によって、連続する４日の同記録された。これらの徴候は第７表に要約される 。

（以下余白） 星−ヱー人 ＰＲＰＶＳのＣＲＭ　ｉ　ｒａ　ｙおよび正式シフテリアト　ソイドへの　人　 に・　る悪ＣＲ）ｆ　１９７−ＰＲＰ熱　１／８　０／８　０／１正常でない挙 動　０／８　０／８　０／１局部的炎症　１／９＠２／９　０／１ 局部的痛み　１／９″　２／９　０／ＩＤＴｄ−ＰＲＰｖｓ　執０／８　０／８ 　０／１正常でない挙動　０／８　０／８　０／１局部的炎症　１／９’　０／ ９　０／１局部的痛み　１／９’　Ｏ／９　０／１０同時的に別の部位でのジフ テリアトキソイドタンパク質を受けたひとりの幼児を含むものである。局部的徴 候は見られなかった。全身性徴候は、ジフテリアトキソイドタンパク貢ワクチン の効果と区別することができないゆえに書留められない。

６８Ｍ１９□−Ｐ　ＲＰ　ｖｓ予防接種に関して、ひとりの幼児が初回予防接種 の晩に、軽い熱（９９，８Ｆ’　）を有し、またそれぞれ初回の１つ、２回目の １つおよび３回目の１つの予防接種の直後に軽い局部的炎症の例があった。ＤＴ ｄ−ＰＲＰｓｖに関しては、初回の１つ、２回目の１つの予防接種の直後に軽い 局部的炎症の例があった。該ワクチンの投与は、他の点では悪性反応のないもの であるらしかった。

瓜潅抗体多層 ＰＲＰに対する抗体ならびにジフテリアトキソイドに対するＩｇＧ抗体が測定さ れた。ＣＲＭ１９７−ＰＲＰｖｓでの予防接種に関して、−貫した抗ＰＲＰ応答 パターンが見られた。第８表を参照のこと、初回の注射の後にはっきりと・した 上昇が、２回目の注射の後に通常わずかにより大きな上昇が、そして１つの３回 目の注射の後に大きな上昇があった。最終的力価は、ＰＲＰのみでの予防接種に よってもたらされるものをかなり超えた、およびＯｏ　１５μｇ　／　ｍｌの見 積り防御最小レベルをがなり超えたものであった。高められた応答は、ＰＲＰの みに対する応答が防御に関し通常不十分である１８力月齢未満の４人の幼児にお いて特に明白であり、そしてこれらの４人における最終力価の重量平均（８，４ μｇ／ｍｌ＞は、ＰＲＰワクチンのみでの１２〜１７力月齢幼児の予防接種後に 見られるものの１７５倍である。ジフテリアトキソイドタンパク質での同時的な 初回予防接種を受けた幼児はまた優れた応答を有した。

ジフテリアトキソイドに対するＩｇＧ抗体は、８人の幼児のうち６人（ならびに 、処置の一部としてジフテリアトキソイドをまた受けた第９番目の幼児）におい て増加した。

該抗体レベルは、しばしば非常に大きく増加したので、用いられた予防接種後の 血清の希釈（１／１０００）は、上昇の最大範囲を示すのに不十分なものとなっ た。

ＤＴｄ−ＰＲＰｖｓでの予防接種に関して、抗ＰＲＰ応答は、−ｍ的に初回およ び２回目の双方の予防接種後に増加した。（第９表参照）。しかしながら、全く 応答が検知されなかった２人の幼児（１２力月齢および１４力月齢）があり、そ してひとりの幼児は、３回目の注射が与えられるまで防御的レベルに近づかなか った。ジフテリアトキソイドでの同時的な初回予防接種を受ける幼児は優れた応 答を有した。ジフテリアトキソイドに対するＩｇＧ抗体における上昇はすべての 幼児において見られた。

第８表 １回目後　４．５　＞１０ ２０２回目後　２．０　４．３ ４　１６力月齢　予防接種前　０．０２５　０．０６１６１回目後　０．９２　 ５．７ ２回目後　２９　９．１ ５　２７力月齢　予防接種前　０．０２５　３．０１回目後　１０　＞１０ １０１回目後　２２　６．９ １回目後　２８　＞１０ ２０２回目後　５０　＞１０ ８　３０力月齢　予防接種前　１．３　４．８１回目後　６．５　１０ １０１回目後　１．４　＞１０ 策」Ｌ五 １回目後　０．０８０　３．１ １回目後　＜０．００６　１０ この実施例は、ヘモフィルス・インフルエンゼタイブｂ莢膜ポリマーフラグメン トのジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ　１９７への複合体の注射は危険性のな いものらしいことを示すものである。ＣＲＭ　１ｇ□−Ｐ　ＲＰ　ＶＳ予防接種 は、高い力価によるもののみならず２回目の予防接種の後の上昇により察知され る、担体効果による抗ＰＲＰ応答の高まりの明白な徴候を与えた。

ＤＴｄ　−ＰＲＰｖｓはより低い感受的高まりを有した。有望な説明は、ＣＲＭ 　−ＰＲＰＶＳが高分子凝集であるのに対し、ＤＴｄ−ＰＲＰＶＳは、本来のト キソイドと同様な単一分子形態において主に存在するということである。

９、実施例：ストレプトコッカス・ニューモニエの莢膜ポ１マーフー　メントの ＣＲＭ　１９７へ役捜金−−−−−いくつかのその他細菌は、これらが敗血症お よび髄膜炎を引き起こす、特に乳児において引き起すことにおいて、これらが、 抗体が防御的である莢膜ポリマーを有することにおいて、そしてこれらの莢膜ポ リマーが成熟したヒトにおいては免疫原性であるが乳児において免疫原性でない ことにおいて、ヘモフィルス・インフルエンゼｂと類似している。その重要な一 例はストレプトコッカス・ニューモニエ（鉦）血清型６　［５ｔｒｅｐｔｏｃｏ ｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　（Ｓｔ）＞５ｅｒｏｔｙｐｅ　６］である。

これは上述したような生命脅迫性感染を引き起すのみならず、幼児における中耳 炎のかなり有力な原因である。（グレイら、ジャーナル　オブ　インフェクシャ ス　ディジイーズ、第１４２巻、第９２３〜９３３頁、１９８０年［Ｇｒａｙ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓ ｅｓ。

Ｖｏｌｕｍｅ　１４２．　ｐａｇｅｓ９２３−３３．１９８０　コ　）　。

ＰＲＰに関して述べられたアプローチがまた、抗原特異性を維持しつつ、選択的 加水分解により還元基を生成され得る任意の莢膜ポリマーに対して適用可能であ る。以下の非限定的実施例においては、莢膜ポリマーフラグメントは、選択的酸 加水分解によって、１．６　（ストレプトコッカス・ニューモニエ　血清型６） から生成され、そしてＣＲＭｌ、　Ｓｐ、６のＣＰのサンプル（ダニツシュ　タ イプ６Ａ、エリ　リリー　カンパニー１：Ｄａｎｉｓｈ　ｔｙｐｅ　６Ａ、　Ｅ ｌｉｆｉｌｌｙ　Ｃｏ、　、ＩＩ　）が、Ｄ−グルコースで標準化されたフェノ ール−硫酸法によって全ヘキソースに関して、およびＤ−グルコースでまた標準 化されたアルカリ性へキサシアノ鉄（ＩＩＩ　）酸塩法によって還元能に関して 検定された。

２、パイレックス［ＰｉｌｅＸｊ管が、水０．６６ｍｆで溶解された互ｚ、　６ ＣＰ　３．３ｒｌＪＱを与えられた。このサンプルは０℃に冷やされ、０．１Ｎ 　ＨＣＱ　０．０７３ｍ１が加えられ、そして骸骨は密封された。

３、骸骨は沸胱水浴中へ１０分間浸され、次に０℃に再び冷やされた。微址のサ ンプルがステップ１で述べるような還元能に関して検定された。

ｓｐ、　６　０分　〉３５０ １０分　６．５ ４、加水分解された調製物（検定に用いられた２％を除く）は凍結乾燥された。

乾燥物は、水０．１ｍｌで溶解され、マイクロ遠心分離管に移され、そして再度 凍結乾燥さ１、再乾燥された加水分解物に対し、２Ｍリン酸カリウム！ｌｊ液ｐ Ｈ８の０．００４ｍ１、およびＯ，０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７の０． ２ｍｌ中に溶解されたＣＲＭ１９７の１ｍｇが加えられた。得られた混合物は、 凍結乾燥されそして水０．０５ｍ１に再懸濁された（見積り全容置０゜０６３　 ｍｌ　）。

２、鎖管に対し、２００　ｍｇ／　ｍｌナトリウムシアノボロハイドライド０． ００７ｍ１が加えられ、そして該調製物は３７℃て゛１８日間インキュベートさ れた。

３、　８０％飽和硫酸アンモニウム（Ｓ　Ａ　Ｓ　）　０　、６　ｍｌが添加さ れた。

４、鎖管は０℃で１時間インキュベートされ、そして８０００Ｇで１５分間遠心 分離された。上澄み液が除去された。

５、沈澱物は、０．０１Ｍリン酸ナトリウムでｐＨ８に緩衝された８０％５Ａ８ ０．６ｍｌ中への懸濁およびこれに続＜８０００Ｇで１５分間の遠心分離によっ て洗浄された。

６、沈澱物は０．５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４０，０２ｍ１および９．５Ｍ尿素０．２ ｍｌで懸濁された。

７、　ＳＡＳｌｍｌが加えられ、沈澱物がステップ４と同様にして単離されそし てステップ６と同様にして約８Ｍで尿素中に懸濁された。

８、懸濁液は８０００Ｇで１５分間遠心分離された。

９、上澄み液は分離されそして０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７に対し て４℃で透析された。

１０　、ＣＲＭ１ｇ７一旦旦、６と呼称される、この透析された調製物は以下に 関して、すなわち、フォリン　フェノール反応によりタンパク質に関して、放射 線標識された旦Ａ　ＣＰへの抗体の結合の阻止により＆抗原性に関して（第３表 においてＰＲＰに関して述べたものと同様）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）へ の抗体結合の阻止によりＣＲＭ１９□抗原性に関して（ＣＲＭ１ｇ７−　Ｐ　Ｒ Ｐ　−Ｓナンバー２の記載のステップ０において述べたものと同様）、ならびに ジフテリアトキソイド（ＤＴ）への抗体結合の阻止により抗ｃｐ免疫原性に関し て（ＣＲＭ　１ｇ７−　Ｐ　ＲＰ　−Ｓナンバー２の記載のステップｐにおいて 述べたものと同様）検定された。第７表を参照のこと。

ｎｇＣＰ当ｉ／　ｎｇＤＴ当ｉ／ （以下余白） 匪−上旦一人 比較対照およびＣＲＭ　１９７での ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６フラ　メントの　八　での　ＣＰ　 ２、年齢でのサンプルにおいて結合した Ｉ　Ｓｐ６　ＣＰ、　２５μＤ　６６７７３　Ｓｐａ細苫、２５μＱ　４　１０ 　１２　１６４　ｎ　８　１２　２２　２１ ５　ＣＲＨ１ｇ７−　Ｓｐ＆、２５μＱ　４　６　３０　４９“血清サンプルを 採取する直前に皮下的に注射された。血清サンプルは第６，８および１０週週齢 採取された。

“血清２５μΩが１４０−標識化Ｃｐ　２ｎＣｉとインキュベートされた。

１０、実施例：　ＣＲＭ　１９７に対する酸化開裂によりるＰＲＰフー　メント の　Δ 本実施例では、最終複合体は、２成分よりなる。すなわち、非毒性の免疫原性ジ フテリア毒素ＣＲＭ　！ｅｔに共有結合してよく定義された鎖長のＰＲＰのフラ グメント類である０本実施例では、過ヨウ素酸塩酸化および超［９ｒによる分離 の条件は莢膜ポリマー（ＰＲＰ）フラグメント類の鎖長をコントロールする。

複合体は、フラグメントの両端にアルデヒド基を有する莢膜ポリマーフラグメン トより構成される。かくして、各フラグメントは、両端において、恐ら＜ＣＲＭ のリジン残基においてＣＲＭと共有結合し得る。産生物の構造は、「格子」と考 えられる。

複合体の組成および恐らく構造は、複合の化学反応において２成分の濃度を変え ることにより変えることができる。

ＰＲＰ−ＣＲＭ複合体ワクチン用のＰＲＰフラグメント産生するために使用され るＰＲＰは、つぎの仕様を有している。

タンパク質含量　く１．０％ 核酸含藍　く１．０％ エンドトキシン（ＬＡＬ）　＜１．ＯＦυ／μＱ　ＰＲＰ分子寸法　（Ｋｄ）　 ＜０．３（セファロースＣＬ−４８）＜０．６（セファロースＣＬ−２８） ＰＲＰフーグメントの　゛ ａ、　ＰＲＰＣ５〜７■／ｍｌ）の溶液を４℃に冷却しかつ２Ｍのリン酸塩緩衝 液（ＰＨ７，０）を添加して最終濃度を０．２Ｍのリン酸塩とした。

ｂ、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（０，２〜０．３モルｌ０４１モル　ＰＲＰ）を 急速に攪拌しながら添加し、この溶液を暗所にて一夜４℃で培養した。

Ｃ１反応溶液をＨＩＰ３ｏ中空糸（アミコン、３０，０００）１ｗカットオフ） を用いて限外濾過した。保持物を２５０ｍ１の食塩水で４回洗浄した。ｒ液を集 めＨＩＰ、、中空糸（アミコン、１０．０００ＬＩＷカツトオフ）を用いて限外 濾過した。保持物を２５０ｍ１の食塩水で４回洗浄した。ついで保持物をｍ１当 りＰＲＰ３５■以上に濃縮した。

ｄ、保持物をオルシノール検定によりボースを、ｉたアルカリ性フェリシアン化 物検定により還元性基を分析した。少量の保持物を、溶出液として０．１５Ｍの 食塩水を用いかつオルシノールおよびアルカリ性フェリシアン化物検定によるフ ラクションのそれぞれを分析することによりバイオゲル（Ｂｉｏｇｅｔ）　Ｐ　 −１００カラム（０，７Ｘ２５ａｌ＞上で分析しな。分析結果は、保持物質が重 量平均ＤＰ約２０でＤＰＩ５〜３０を有する多Ｎ類よりなることを示した。

酸化開裂鎖長（ＤＰ＞よりつくられた莢膜ポリマーフラグメントは、（リボース 単位／還元基）Ｘ２として定義される。

過ヨウ素酸で酸化されたＰＲＰの二つのバッチは、ｄ項と同様に分割され、かつ 下記のように特徴づけられる。

扛−鼠一五 １４　３６．５　４１．０　１２．７　５．９１５　２４．１　３２．５　１１ ．０　９．４１６　２５．３　２４．５　１３．２　１１．８１７　２５．４　 ２２．８　１４．４　１４．３１８２３．２　２０．２　１３．６　１４．６１ ９　２０．２　１９．Ｑ　１１．９　１４．２２０　２０．４　１７．７　９． ３　１２．４２１　１６．１　１６．０　＆、７　１０．０２２　１１．７　１ ２．３　７．２　７．１ＣＲＭ　ＰＲＰ複合イ ａ、　ＣＲＭタンパク質を、０．２Ｍのリン酸ナトリウムＭＳ液（ｐＨ７，０＞ に溶解し、最終濃度１００　ｎｇ／ρとしな。

ｂ、親油化した少糖類を蒸留水中で再構成し、適量（平均ＤＰ２０＞をＣＲＭタ ンパク質に添加し、かつ溶液を混合した。

ｄ、ナトリウムポロハイドライド（１００倍還元剤）を添加し、かつこの溶液を 室温で２時間放置した。

ｅ、複合体を１０倍の６Ｍの尿素で希釈して沈澱を溶解し、この溶液をＹＭ−３ ０（３０，０００）１ｗカットオフ）膜を有するアミコン攪拌セルを用いて限外 濾過した。

ｆ、溶液を滅菌食塩水を用いてｒ液がペントースおよびシアン化物イオンが陰性 になるまで繰返し限外濾過した。

致終撲倉体例ｕ貫 第１１表は、酸化されたＰＲＰの種々のバッチからのＰＲＰ　ＣＲＭ　１９７　 および種々の複合物から得られるロフトの種々の性質を表わす。

（以下余白） 夏＝上ニー五 反し！合物中の　ｊｌｉＥ１合氷中の　Ｋｄ″ＰＲＰ　ＰＲＰ／ＣＲ）ｌ　比　 ＰＲＰ／ＣＲ）ｌ　比　（七ファロースワクチ＞ｒＢト番号　【！り烈ヱｔ　− （ｙ！」Ｌ乙ｙｐコー　ニＣＡ（ｖＺ巨９ｙ−ＣＬ−４８）５　２番　１．０　 ０．２５　０．２７６　２番　２．０　０．６２　０．３１７　３番　１．０　 ０．３８　０．３６８　３番　２．０　０．５７　０．４４９　６番　１．０　 ０．６０　０．４８１０　６番　２．０　０．４２　０．４８１１　７番　１． ０　０．２７　０．３０１２　７番　２．０　０．４２　０．４８ｍ５０％の物 質（タンパク質）が溶出するときのＫｄボトリング ａ、　ＣＲＭ−ＰＲＰ複合体を０．８ミクロンツいで０゜２２ミクロンのフィル ターを用いて滅菌濾過して拝呈した滅菌容器に移した。

ｂ、試料を無菌的に除去し、ローリ−検定によりタンパク質を分析した。

ｃ、　Ｐ別した物質の容量およびｉ＆終容器を拝呈することにより測定した。

ｄ、滅菌食塩水中の１％チメロサル（Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）　ｃｙ＞１を０． ２２ミクロンの滅菌フィルターを通じて添加し、最終溶液中の０．０１％のチメ サロールを得た。

ｅ、ワクチンを０．２２ミクロンのフィルターを通じて濾過した滅菌食塩水で最 終審ｌにした。

ｆ、溶液を混合し、かつ５．５ｍｌを、（ブチルグレイゴム）で密栓し、密閉し て２〜８℃で貯蔵した滅菌して発熱物質のない１０ｍ１のガラスビンに移した。

邑朕薬朋亙丘透二 ワクチンロット　タンパク質　ＰＲＰ 二１」Ｌ−一　工り１祉［ユＬ近鉱１−　Ｋｄ“５　５０　１２．５　０．２７ ６　５０　３１．０　０．３１ ７　５０　１９．０　０．３６ ８　５０　２８．５　０．４４ ９　５０　３０．０　０．４８ １０　５０　２１．０　０．４８ １１　５０　１３．５　０．３０ １２　５０　２１．０　０．４８ “配合例は全て０．９％　ＮａＣ１）および０．０１％のチメロサル内で調製し た。

ｍ″’５０％の物質（タンパク質）が溶出するときのＫｄ披翌ｉ血抗厘ユ憇上 ＰＢ８０．５％トウィーン中のワクチンの一連の希釈物を、ジフテリアトキソイ ドで予め被覆したマイクロタイマープレートのウェルに２個ずつ添加した。つい で、プールされた高く滴定されたポリクローナルヒトジフテリア抗毒素直情また はヒトポリクローナル抗ＰＲＰ血清をウェルに添加し、このプレートを２０℃で ２４時間培養した。抗体結合を、酵素で標識した抗ヒト免疫グロブリンでウェル の培養を、さらに酵素基質による６０分間の培養および光学密度の定置により測 定した。結果を第１２表に示す。

（以下余白） ！−１２−人 ＰＲＰ−ＣＲＭ　Δ　の−″″　２、 ヒトポリクローナル抗ジフテリアトキソイドおよび　ＰＲＰｒ　の結への 結合に関する抑制剤の等漬物 り丁−）ｌａｓｓ　’　（１） ロット５番　１．５　８７．０ ロット６番　１．１　５７．０ ロット１番　３．３　９．３ ０ット８番　２．９　８．０ “マサチューセッツ・パブリック・ヘルス・バイオロジック・ラボラトリーヌが ら提供されたジフフリアトキソイド、ロッドＤＣ９２７ 第１２表のデータは、ワクチンの種々のロッドが試験管内抗原性を保有すること を示している。すなわち、これらはＰＲＰおよびジフテリアトキソイドに対する ポリクローナル抗体に匹敵する。このデータはまた、ＰＲＰ抗原が比較的さらさ れ、一方、ジフテリアトキソイドエピトープがより低いウェルでありかつ変わり やすくさらされることを示す。

におけ　７、 ａ、　ウサギ 第１３表は、２５μｇのワクチンで０．１および２週間で若いウサギにワクチン 投与した三つの実験を示す、全てのワクチンは、免疫原生でありかつエリサ検定 により測定されたように抗ＰＲＰ応答を与えることを示す、適度な抗ＰＲＰ応答 が２５μｇの複合体ワクチンの１回の注射後でもみられた。

ｂ、　マウス 若いスイスウェブスターマウスのワクチン投与により得られた結果は、再び抗Ｐ ＲＰ応答（データは示さず）を示した。

（以下余白） 匪−上旦一人 ＰＲＰ−ＣＲＭ複合体の種々のロットに対するウィーン１ン　ウ　における　Ｐ ＲＰ Ｏ週間　２週間　３週間 ワクチンロット　μｇ／ｒｎｌ　μｇ／ｍｌ　μｇ／ｍ１番′：１（Ｇ！ｔｒ） 　（ＧＭＴ）　（ａＨｒ）５　０．１　０．２３　７．５６ ６　０．１　０．３８　２．８６ ７　０．２　０．８６　９．７０ Ｂ　０．１　０．８７　７．６１ ９　０．１　０．３６　３．８Ｂ １０　０．１　０．９２　１．８４ １１　（）、１　０．２１　５．０１ １２　０．１　０．３１　２．３３ ヒト幼旧における　原性 幼児被験者は健康であり、かつヒブ（Ｈｉｂ）ワクチンによるさきの免疫は有し ておらずまたワクチンにた対する重大な逆反応も有していなかった。第１４表（ それぞれ１８．７および２ケ月）に示す齢の始めに、これらは放血し、ＰＲＰ複 合体の２５μｇの皮下第１注射を与え、少なくとも２０分間観察し、かつ観察の ためにその両親にわたし、可能な局部的および系統的逆反応を記録した。

７ン月および２ケ月のグループのためには、第１４表に示す時間の経過後に、同 一ワクチンによる第２免疫化のなめにこの方法を繰返した。さらに時間が経過し たのち（第１４表参照）これらは再び第２応答測定のために放血された。

第１４表からみられ得るように、単一注射は、１８ケ月および７ン月齢のグルー プにおける抗体増加に友好であり、一方、２ヶ月齢の幼児ではく母方のＩｇＧ抗 体の減少が期待されているにもかかわらず）抗体の適度の増加が観察された。全 ての幼児で、抗ＰＲＰ抗体の適当なレベルが第２免疫化後１〜２ケ月で観察され た。２回の免疫化後の６ン月齢の幼児における応答は、抗体の保護レベルを誘発 するに充分であった。

第１４表 ２５　のワク　ンに・　る　ＰＲＰ　体部Ｘワクチン　小児の　抗　体　μｇ　 ／　ｍｌ　’１　齢（月）ｉ″　１０　２゜ １８−２３　８４　０．４０　１ケ月　６．５３７−１５　８８　０．１５　１ 〜２ケ月　４．５４　１〜２ケ月　１８．９２−６　３０　０．１７　２ケ月　 ０．２５　２ケ月　１．２３″幾何平均滴定 １１、実施例ニジフチリアトキソイドに対する過ヨウ素酸塩で酸化された肺炎球 菌多糖類のツブ１ン 第１５表は、過ヨウ素酸塩で酸化された肺炎球菌多糖類がジフテリアトキソイド にカップリングされている種々の実験の概略を示す。この表に示された肺炎球菌 莢膜多糖類（ＰｎＰＳ）のタイプ、表示された量の過ヨウ素酸ナトリウムにより ３７℃で９０分間反応させ、ついでセントリコン−１０（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ− １０）限外ｒ過装置（アミコン）で濾過することにより回収された。

酸化されたＰＳは、４■の精製トキソイドロットＣＣＤ２７および１０■のＮ　 ａ　ＣＮ　Ｂ　Ｈｓの全量の０．７５ｍ１で３７℃でｐＨ８で３時間反応させた 。タンパク質フラクションを沈澱により回収し、９０％の飽和硫酸アンモニウム で洗浄した。ＰｎＰＳ等価物は、ＰｎＰＳおよび１４Ｃ標識ＰｎＰｓに対するヒ ト血清を用いてラジオ抗原結合抑制により検定した。

星−上旦一遣 還元アミノ化によるジフテリアトキソイドに対する過ヨウ素酸塩で酸化された肺 炎球菌りＦ　ＰｎＰＳ）のカップリング ＰｎＰ９　１０■ＰＳと反応する　１０４　カップリング反応後のタンパク１フ ラクシ３ンにおいて９４７　ｐｍｏＩ　ＦｍされたＰｎＰＳｉｌｉ性（μｆ　Ｐ Ｓ／μｇタンパク組 ３　５０　０．１ ６４　４　０．２ １２　４　０、１ １４　６　０．１ ２３　４　０、１ ある具体例に対する特定のものについて本発明を記述したので、本発明の理解後 には本発明が関連する当業者にとっては、種々の変更ないし変性は添付の請求の 範囲により定義されているような本発明の精神および範囲を逸脱しない限りさな れ得る。

国際調査報告 一瞳ｍ−浦−＾ρ−−０市・ＩＩ−Ｍ？／ＩＪＳ只７Ｊｖ＋ｎｔｎ

Claims (74)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも２個のカルボニル基を有しまた細菌性病原体の莢膜ポリマーから 誘導された莢膜ポリマーフラグメントの還元アミノ化産物と、細菌毒素またはト キソイドとから構成される免疫原性複合体。
2. ２．莢膜ポリマーが成熟したヒトにおいて免疫原性でありかつヒト乳児において より免疫原性の低いものである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
3. ３．還元アミノ化がシアノボロハイドライドアニオンの存在下でなされるもので ある請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
4. ４．毒素またはトキソイドがジフテリア毒素またはトキソイドである請求の範囲 第１項に記載の免疫原性複合体。
5. ５．トキソイドがジフテリアＣＲＭ１９７である請求の範囲第４項に記載の免疫 原性複合体。
6. ６．毒素またはトキソイドが破傷風毒素またはトキソイドである請求の範囲第１ 項に記載の免疫原性複合体。
7. ７．毒素またはトキソイドがシュードモナス毒素またはトキソイドである請求の 範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
8. ８．毒素またはトキソイドがスタフイロコッカス毒素またはトキソイドである請 求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
9. ９．毒素またはトキソイドがストレプトコッカス毒素またはトキソイドである請 求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
10. １０．毒素またはトキソイドが百日咳菌毒素またはトキソイドである請求の範囲 第１項に記載の免疫原性複合体。
11. １１．毒素またはトキソイドがエシェリキア・コリ毒素またはトキソイドである 請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
12. １２．細菌性病原体がヘモフィルス・インフルエンゼタイプｂである請求の範囲 第１項に記載の免疫原性複合体。
13. １３．細菌性病原体がエシェリキア・コリである請求の範囲第１項に記載の免疫 原性複合体。
14. １４．細菌性病原体がナイセリア・メニンギチジスである請求の範囲第１項に記 載の免疫原性複合体。
15. １５．細菌性病原体がナイセリア・メニンキチジス血清グルーブＡである請求の 範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
16. １６．細菌性病原体がナイセリア・メニンギチジス血清グループＣある請求の範 囲第１項に記載の免疫原性複合体。
17. １７．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエである請求の範囲第１ 項に記載の免疫原性複合体。
18. １８．細菌病原体がストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６，１２，１４， １９，２３および５１からなる群から選ばれたものである請求の範囲第１項に記 載の免疫原性複合体。
19. １９．細菌病原体がヘモフィルス・インフルエンザタイプｂである請求の範囲第 ５項に記載の免疫原性複合体。
20. ２０．細菌病原体がストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６，１２，１４， １９，２３および５１よりなる群から選ばれたものである請求の範囲第５項に記 載の免疫原性複合体。
21. ２１．フラグメントが酸化開裂により莢膜ポリマーから誘導されたものである請 求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
22. ２２．フラグメントが過ヨウ素酸塩酸化によって莢膜ポリマーから誘導されたも のである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
23. ２３．フラグメントが最初に酸、塩基または酵素で処理し、ついで該処理により 発生するアルデヒド基を酸化剤で処理することにより莢膜ポリマーが製造された ものである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
24. ２４．約１０〜約３０の単量体単位および少なくとも２個のカルボニル基を有し かつストレプトコッカス・ニューモニエまたはヘモフィル細菌の莢膜ポリマーか ら誘導された莢膜ポリマーフラグメントの還元アミノ化産物および細菌毒素また はトキソイドよりなる免疫原性複合体。
25. ２５．莢膜ポリマーが成熟したヒトにおいて免疫原性であり、かつヒト乳児にお いてより免疫原性の低いものである請求の範囲第２４項に記載の免疫原性複合体 。
26. ２６．還元アミノ化がシアノボロハイドライドの存在下に行なわれる請求の範囲 第２４項に記載の免疫原性複合体。
27. ２７．毒素またはトキソイドがジフテリア毒素またはトキソイドである請求の範 囲第２４項に記載の免疫原性複合体。
28. ２８．トキソイドがＣＲＭ１９７である請求の範囲第２４項に記載の免疫原性複 合体。
29. ２９．毒素またはトキソイドが破傷風毒素またはトキソイドである請求の範囲第 ２４項に記載の免疫原性複合体。
30. ３０．毒素またはトキソイドがシュードモナス毒素またはトキソイドである請求 の範囲第２４項に記載の免疫原性複合体。
31. ３１．毒素またはトキソイドがスタフィロコッカス毒素またはトキソイドである 請求の範囲第２４項に記載の免疫原性複合体。
32. ３２．毒素またはトキソイドがストレプトコッカス毒素またはトキソイドである 請求の範囲第２４項に記載の免疫原性複合体。
33. ３３．毒素またはトキソイドが百日咳毒素またはトキソイドである請求の範囲第 ２４項に記載の免疫原性複合体。
34. ３４．毒素またはトキソイドがエシエリキア・コリ毒素またはトキソイドである 請求の範囲第２４項に記載の免疫原性複合体。
35. ３５．細菌性病原体がヘモフィルス・インフルエンゼタイプｂである請求の範囲 第２４項に記載の免疫原性複合体。
36. ３６．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエである請求の範囲第２ ４項に記載の免疫原性複合体。
37. ３７．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６，１２，１４ ，１９，２３および５１よりなる群から選ばれたものである請求の範囲第２４項 に記載の免疫原性複合体。
38. ３８．細菌性病原体がヘモフィルス・インフルエンザタイプｂである請求の範囲 第６項に記載の免疫原性複合体。
39. ３９．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエである請求の範囲第２ ８項に記載の免疫原性複合体。
40. ４０．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６，１２，１４ ，１９，２３および５１よりなる群から選ばれたものである請求の範囲第２８項 に記載の免疫原性複合体。
41. ４１．フラグメントが酸化開裂により莢膜ポリマーから誘導されるものである請 求の範囲第２４項に記載の免疫原性複合体。
42. ４２．フラグメントが過ヨウ素酸塩酸化により莢膜ポリマーから誘導されるもの である請求の範囲第２４項に記載の免疫原性複合体。
43. ４３．フラグメントが最初に該ポリマーを酸、塩基または酵素で処理し、ついで 該処理により発生するアルデヒド基を酸化剤で処理することにより莢膜ポリマー から産生されるものである請求の範囲第２４項に記載の免疫原性複合体。
44. ４４．少なくとも２個のカルボニル基を有し、また細菌性病原体の莢膜ポリマー から誘導された莢膜ポリマーのフォルマリン処理された還元アミノ化産物と、細 菌毒素またはトキソイドとから構成される免疫原性複合体。
45. ４５．約１０〜約３０の単量体単位の鎖長および少なくとも２個のカルボニル基 を有しかつストレプトコッカス・ニューモニエまたはヘモフィルス・インフルエ ンザ細菌より誘導される莢膜ポリマーフラグメントのホルマリン処理による還元 アミノ化産物および細菌毒素またはトキソイドよりなる免疫原性複合体。
46. ４６．細菌、トキソイドがジフテリアトキソイドである請求の範囲第４４項また は第４５項に記載の免疫原性複合体。
47. ４７．トキソイドがＣＲＭ１９７である請求の範囲第４４項または第４５項に記 載の免疫原性複合体。
48. ４８．細菌毒素またはトキソイドが破傷風毒素またはトキソイドである請求の範 囲第４４項に記載の免疫原性複合体。
49. ４９．少なくとも２個のカルボニル基を有しまた細菌性病原体の莢膜ポリマーか ら誘導された莢膜ポリマーフラグメントと、細菌毒素またはトキソイドとの還元 アミノ化産物を、シアノボロハイドライドイオンの存在下において達成される還 元アミノ化で形成することでなる免疫原性複合体の調製方法。
50. ５０．莢膜ポリマーが成熟したヒトにおいて免疫原性でありかつヒト乳児におい てより低い免疫原性である請求の範囲第４９項に記載の方法。
51. ５１．毒素またはトキソイドがジフテリア毒素またはトキソイドである請求の範 囲第４９項に記載の方法。
52. ５２．毒素またはトキソイドがＣＲＭ１９７である請求の範囲第４９項に記載の 方法。
53. ５３．毒素またはトキソイドが破傷風細菌議素またはトキソイドである請求の範 囲第４９項に記載の方法。
54. ５４．毒素またはトキソイドがシュードモナス毒素またはトキソイドである請求 の範囲第４９項に記載の方法。
55. ５５．毒素またはトキソイドがスタフィロコッカス毒素またはトキソイドである 請求の範囲第４９項に記載の方法。
56. ５６．毒素またはトキソイドがストレプトコッカス毒素またはトキソイドである 請求の範囲第４９項に記載の方法。
57. ５７．毒素またはトキソイドが百日咳歯毒素またはトキソイドである請求の範囲 第４９項に記載の方法。
58. ５８．毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットがエシェリキア ・コリからのものである請求の範囲第４９項に記載の方法。
59. ５９．病原体がヘモフィルス・インフルエンゼタイプｂである請求の範囲第４９ 項に記載の方法。
60. ６０．病原体がエシェリキア・コリである請求の範囲第４９項に記載の方法。
61. ６１．病原体がナイセリア・メニンギチジスである請求の範囲第４９項に記載の 方法。
62. ６２．病原体がストレプトコッカス・ニューモニエである請求の範囲第４９項に 記載の方法。
63. ６３．病原体がシュードモナスである請求の範囲第４９項に記載の方法。
64. ６４．病原体がヘモフイルス・インフルエンゼｂである請求の範囲第５１項に記 載の方法。
65. ６５．病原体がストレプトコッカス・ニューモニエである請求の範囲第５１項に 記載の方法。
66. ６６．フラグメントが酸化開裂により莢膜ポリマーから誘導されたものである請 求の範囲第４９項に記載の方法。
67. ６７．フラグメントが過ヨウ素酸塩酸化によって莢膜ポリマーから誘導されたも のである請求の範囲第４９項に記載の方法。
68. ６８．フラグメントが最初に該ポリマーを酸、塩基または酵素で処理し、ついで 該処理により発生するアルデヒド基を酸化剤で処理することにより莢膜ポリマー から産生されるものである請求の範囲第４９項に記載の方法。
69. ６９．該還元アミノ化産物をフォルマリンで処理することでさらに構成される請 求の範囲第４９項に記載の方法。
70. ７０．細菌トキソイドがジフテリアトキソイドである請求の範囲第６９項に記載 の方法。
71. ７１．トキソイドがＣＲＭ１９７である請求の範囲第６９項に記載の方法。
72. ７２．細菌毒素またはトキソイドが破傷風毒素またはトキソイドである請求の範 囲第６９項に記載の方法。
73. ７３．請求の範囲第１項または第２３項の免疫原性複合体および医薬的に許容し 得る担体からなる、ヒトにおける抗莢膜ポリマー抗体の有効レベルを誘い出すワ クチン。
74. ７４．請求の範囲第７３項のワクチンの有効量を投与することでなる、莢膜ポリ マーを有する細菌性病原体に対してヒトを能動免疫する方法。