JPH04507244A

JPH04507244A - リピドａ類似体／免疫原性担体コンジュゲートおよびそのワクチンとしての使用

Info

Publication number: JPH04507244A
Application number: JP2511078A
Authority: JP
Inventors: テング，ネルソン; サドフ，ジェラルド; バタチャルジー，アプルバ
Original assignee: ユニバックス・バイオロジクス・インコーポレイテッド
Priority date: 1989-07-27
Filing date: 1990-07-20
Publication date: 1992-12-17
Also published as: EP0484403A4; EP0484403A1; CA2064194A1; AU651319B2; WO1991001750A1; AU6079590A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】リピドＡ類似体／免疫原性担体コンンユヶートおよびそのワクチンとしての使用関連出願に対するクロスリファレンス本出願は、米国出願番号０７／３８５，８６０（出頓臼用９８９年７月２７日）の一部継続圧願である米国出願番号０７／４８７．８９８（出願田川９９０年３月６日）の一部継続出願であり、これらの開示は本明細書の一部を構成する。

本発明の分野本発明は、医薬組成物およびそれをワクチンとして使用する分野米国の病院において約１９４．０００人の患者が毎年菌血症に罹患しており、これらのうち約７５．０００人が死亡する。Ｍａｋｉ、　Ｄ、Ｇ。

＋　ｉｎ　Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、　Ｒ，Ｅ、　Ｄｉｘｏｎ　（ｅｄ、）、　ＰａｇｅＳ　１８３−１９６゜Ｙｏｒｋｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｏｏｋｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８１）。強力な抗生物質の積極的な使用にもかかわらず、この高い死亡率が生じている。抗生物質による治療の欠点は、薬物に対してグラム陰性細菌の外膜が比較的不浸透性であること、また薬物が細菌内毒素の致死的な作用を打ち消すことができないことに起因しているのかもしれない。Ｚｉｅｇｌｅｒ。

Ｅ、Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３０７：１２２５−１２３０　（１９８２）：　Ｂｏｇａｒｄ。

Ｗ、Ｃｌｒ　ｅｔ、ａｌ、、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５５：８９９−９０８　（１９８７）。

リポ多糖（ＬＰＳ）内毒素の致死的な作用に対抗するための１つのアプローチは、抗−ＬＰＳ抗血清を投与することである。またこのような抗血清は、網内系によるグラム陰性細菌の除去を促進することができる。幾人かの研究者等が、抗血清を生成させるための免疫剤として大腸菌もしくはＳ、　ｎ＋１ｎｎｅｓｏｔａの粗突然変異体を使用することにより、異なる動物モデルにおいていくつかのグラム陰性生物もしくは内毒素による攻撃に対する広スペクトルの保護に成功したことを示している。Ｂｒａｕｄｅ、　Ａ、１．、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０１３＋５０５−５１２　（１９７２）：　Ｂｒａｕｄｅ、　Ａ、１．、　ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、１３６：５１６７−Ｓ１７３　（１９７７）；　Ｄｕｎｎ、　Ｄ、Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｓｕｒｇｅｒｙ　９２：２１２−２１９　（１９８２）；　ＭｃＣａｂｅ、　１１．Ｒ，、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０８：６０１−６１０　（１９７２）：　ＭｃＣａｂｅ、　Ｗ、Ｒ，、ｅｔ一体は〇−特異的な多糖を欠いており、その表面に大部分のグラム陰性生物により共有されている抗原決定基を含んでいる可能性が高いＬＰＳコアの一部を発現している。粗突然変異体である大腸菌Ｊ５に対して生成させたヒト抗血清を用いた患者の受動免疫は、院内感染の制御のための抗生物質を効果的に補うものであることか示された。Ｚｉｅｇｌｅｒ、　Ｅｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、３０７：１２２５−１２３０　（１９８２）。

現在では、細菌内毒素の生物学的活性の大部分は、ＬＰＳ分子のリピドＡ部分に存在することが認識されている。Ｌｕｄｅｒｉｔｚ、　０．、　ｅｔ」二、　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　！Ａｅｍｂｒ、　Ｔｒａｎｓｐ、　１７：７９−１５１　（１９８２）。ｊ＠常のグラム陰性細菌のＬＰＳは３つの主要な構造上の領域を有している二〇−多糖、Ｒ−コアオリコ糖、およびリピドＡである。〇−多糖の構造は、生物間でまた同種内でも多様に変化する。その抗原性は、細菌の抗原型を決定するための基礎となる。Ｒ領域は〇−抗原およびリビドＡの間の架橋であり、その構造はほとんどのグラム陰性細菌において類似している。ＬＰＳに対する抗体は細菌の食作用または細菌の死を促進させ得る。〇−抗原はＬＰＳの最も抗原性のある構成成分であるが、毒性はほとんど知られていない。これとは対照的に、リビドＡは分子の毒性中心を含有しており、細菌種の広い範囲にわたり極めてよく似た構造を冑している。

ＬＰＳのリビドＡ領域は、炎症性変化を媒介するマクロファージ、好中球および内皮細胞等の宿主細胞を直接刺激することにより、グラム陰性ｍｍの組織侵入に対する炎症性応答の複雑な流れの原因となっていると考えられている。応答は感染宿主に対して毒性のものく低面圧、凝集障害、死）および有益なもの（抗体産生の増強、食細胞の流動化、急性期タンパク質合成）の両方である。

リピドＡの構造は以下の式（１）で示される・リビドＡは１および４゛位でリン酸化されたグルコサミンニ糖であり、６ないし７のエステル化された脂肪酸を有している。３−ヒドロキシテトラゾカッエートの４分子がグルコサミンニ糖の２、３．２゛および３゛位に結合しており、２′　および３゛位（時には２位）の３’−０Ｈ−１４：　Ｏ残基の水酸基は、通常の脂肪酸くドデヵノエート、テトラゾカッエート、ヘキサデカノエート）で置換されてアシルオキ／アシル基を形成している。

リピドＡの構造−活性の相関に対する知見を得るために、化学的に合成されたリビドＡ類似体および生合成されたリビドＡの前駆体Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　６：４２８−４３１　（１９８４）：は、リビドＡ類似体の製造およびその化学的構造と生物学的活性の関係を開示している。著者らは、グルコサミンニ糖のリン酸による置換は抗原性の発現にとって必須ではないこと、また活性が減少することな（アミン−結合３−ヒドロキシアシル残基を非−ヒドロキシ化脂肪酸と置換するこ七ができることを報告している。さらに著者らは、免疫決定基の構造はアミド−結合脂肪酸とグルコサミンの結合領域を含むことを指摘している。

Ｇａ１ａｎｏｓ、　Ｃ，ら［Ｒｅｖ、１ｎ４ｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　６：５４６− ５５２　（１９８４）コは、ウサギの免疫のためにタンパク質（エデスチン）に結合されたｔｉｌｌのアミド結合３−ヒドロキシミリスチン酸を有するグルコサミンニ糖を含む半合成リビドＡ免疫原の製造を開示している。リビドＡで被覆された酸−処理細菌を用いた同様の条件下での免疫により得られる抗体の力価に匹敵する力価の抗体が産生きれた。

Ｂｅｈｌｉｎｇ、　Ｕ、Ｈら［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１７：８４７−８５１　（１９７６）ｌは、Ｎ−バルミトイル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−オレイル−Ｄ− グルコサミン、Ｎ−ミリストイル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−デカノイル−Ｄ−グルコサミンおよびＮ−ステアロイル−Ｄ−グルコサミンを含む合成グリコリピドアジュバントの製造を開示している。著者らは、抗−ヒツジ赤面株細胞（ＳＲＢＣ）もしくはγ−グロブリン（ＨＧ　Ｇ　）［１球凝集素力価を計測する試験法において、ＬＰＳ内毒素の使用との比較の上でこの合成グリコリピドを用い、同等かまたはより優れた免疫応答の増強が得られたことを報告している。さらに、著者らはこの合成グリコリピドが内毒素性の感受性試験法と同様に特有のＬｉｍｕｌｕ這容菌試験、ヒョフ胚致死性およびンユヮルッマン皮膚検定、去（Ｓｈｗａｒｔｚｍａｎ　５ｋｉｎ　ａｓｓａのにおいて活性を持たないことを報告している。

従って著者らは、他の点ては非内毒素性のグリコリピドによる細胞分裂促進効果およびアジュバント効果は、内毒素の全ての生物学的性質がこの非常に複雑な分子の構造的サブユニ、トの１つまたは構造上の特徴の１つに関連しているわけではないことを示唆するものであると結論づけている。

Ｈｏｄｇｉｎｓ、　Ｄ、　Ｓ、　ＣＰ　ＣＴ出願公開番号ＷＯ３７１０７２９７（１９８７年１２月３日公開）コは、リピドＡをアンルオキ７アシルヒドロラーゼで処理することにより得られる、毒性が減少したＬＰＳ誘導体を開示している。この化合物は以下の式（１１）で示される。

この改変された細菌性ＬＰＳは、ＬＰＳに対する抗体を誘導することによりグラム−陰性細菌による疾病を予防するためのワクチン、グラム−陰性細菌による敗血症を治療もしくは予防するための解毒薬、または他の抗原に対する抗体の産生を増強させるためのアジュバントとして治療上有用である。また、アシルオキシアンルヒドロラーゼ自体は、グラム陰性細菌性の疾病に罹患している患者の内因性ＬＰＳを解毒するために予防的もしくは治療的に有用である得る。

またこの酵素は、治療用注射物から毒性のＬＰＳを除去するために用いることができる。

ＬＰＳに対する能動免疫を誘導するための免疫原としてのリピドＡ類似体の開発にもかかわらず、動物における敗血症性シヨ、りの治療または予防に用い得る新しい化合物に対する必要性は存在し読本発明は、リビドＡ類似体／免疫原性担体コンジニゲートに関する。ここで、該リピドＡ類似体は以下の式（ＩＩ＋）で示される［式中、ｎは１または２てあり：Ｒ’およびＲ３は同じかもしくは異なり、水素、Ｃ２〜Ｃ１，アシル基、３−ヒドロキシＣ５〜Ｃ１゜アシル基、３−（Ｃ，〜ＣＩｔアシルオキシ）−Ｃ１〜Ｃ１１ア／ル基および免疫原性担体への結合からなる群から選択され。

Ｒ１はＣ１〜Ｃ，アシル基、３−ヒドロキシＣ１〜ＣＩＩＩアシル基および３− （Ｃ，〜Ｃ１２アンルオキシ）−Ｃ３〜Ｃ＋ａアシル基からなる群から選択され、そしてＲ４は水素、Ｃ３〜Ｃ１，アシル基、ホスフェート基または免疫原性担体への結合である：ただし、Ｒ１、Ｒ３またはＲ４のうちの１つは免疫原性抗体への結合であり、該結合は動物における免疫応答を刺激するリビドＡ類似体の能力に実質的に干渉しないものである］。

特に、本発明は以下の式（ＩＶ）で示されるリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジニゲートに関する、［式中、ｎ、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ３およびＲ４は上記定義に同じであり；Ａは免疫原性担体であり。

ｍは０またはｌであり。

ｐは１から２００であり；しは動物における免疫応答を刺激するリビドＡ類似体の特有の能力に実質的に干渉しないリンカ−基であり：Ｒ―およびＲ″は同じかまたは異なり、水素、Ｃ２〜Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ１〜Ｃ＋ｓアシル基および３−（Ｃ，〜Ｃ１，アシルオキシ）−Ｇ、〜Ｃ１８アシル基からなる群から選択され；Ｒ１はＣ７〜Ｃ＋ｅアシル基、３−ヒドロキシＣ５〜ＣＩｓアシル基および３−（Ｃ，〜Ｃ１１アシルオキシ）−〇、〜Ｃ１８アシル基からなる群から選択され：そしてＲ４は水素、Ｃ７〜Ｃ＋ａアンル基またはホスフェート基であるコ。

さろに本発明は、以下の式（Ｖ）て示されるリピドＡｍ似体／免疫原性担体フンシュケートに関する：［式中、ｎ％ｍ、ｐ、Ｌ、Ｒ’、Ｒ″、Ｒ３およびＲ４は上記に定義した通りであるコ。

また本発明は、本発明のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲートを薬学的に許容し得る担体もしくはアジュバント共に含む敗面症性ショックの予防のだめのワクチンに関する。

さらに本発明は、本発明のリビドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート：および薬学的に許容し得る担体：を含む医薬組成物（動物においてＬＰＳに対する能動免疫を誘導するためにを効な量の該リピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲートが存在する）を動物に投与することからなる動物における敗血症性ショックを治療または予防するための方法に関する。

さらに本発明は、本発明のリビドＡ類似体／免疫原性担体コンンユゲートの製造のために有用な中間体に関する。

予想外に、本出願の発明者らは、グルコースおよびケンチオビオースのアシル誘導体を免疫原性担体に結合させると動物においてＬＰＳに対する能動免疫を誘導することを発見した。この発見により、敗血症性ショックの予防に用いられ得る安価なワクチンの容易な製造が可能となる。

好ましい態様の記述本発明は、免疫原性担体に結合したグルコースまたはケンチオビオース等のポリグルコース分子を含むリビＩ”Ａ類似体／免疫原性担体コンジュゲートに関する（ここで、グルコースまたはゲンチオビオース部分の少なくともＣ３位はアシル基（Ｒ’）で置換されている）。

免疫原性担体は、動物に投与したときにコンジュゲートがＬＰＳに対する能動免疫を誘導する限りは、リビドＡ類似体分子上のどの遊離の水酸基に結合していてもよい。免疫原性担体はグルコースまたはポリグルコース部分のＣ１またはＣ＠位に結合しているのが好ましい。

本発明のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲートの等飾物には、少なくとも１個の糖部分の少なくとも０３位でアシル化されていて免疫原性担体に結合している全ての非−アミノ糖および多糖であって、そのコンツユケートを動物に投与したときにＬＰＳに対する能動免疫を誘導するコンシュケートが含まれる。

本発明のリビドＡ類似体／免疫原性担体は、ＬＰＳに対する能動免疫を誘導すると考えられており、コンジュゲートを動物に投与した場合に抗−ＬＰＳ抗体が動物により産生される。抗−ＬＰＳ抗体の効力は、例えば免疫された動物の血清を第二の動物に投与し、次いでこの第二の動物をＬＰＳ−産生細菌でチャレンジすることにより試験することができる（後述の実施例７を参照）。抗−ＬＰＳ皿清の投与の結果、第二の動物の生存を向上させた場合に、フンシュゲートはＬＰＳに対する免疫を誘導したとみなされる。

また抗−ＬＰＳ抗体は、ＬＰＳに対する周知の生物学的応答であるツユワルツマン反応の阻害により試験することができる（Ｌｅｅ、　Ｌｅｔ　ａｔ、、Ｉｎ：　Ｚｗｅｉｆａｃｈ、　Ｂ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、（ｅｄｓ、）　ＴＨＥ　ＩＮＦＬＡ！ＩＩＭＡＴＯＲＹ　ＰＲＯＣＥＳＳ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、１９６５．　ｐ、　７９１）。ＬＰＳもしくは本発明の組成物のいずれかで能動免疫された動物、特にウサギに適当なＬＰＳチャレンジを行い、局所的なシュワルツマン反応を誘導する。紅斑、出血または壊死性反応の予防または改善は、抗−ＬＰＳ抗体の存在の証拠である。別法では、ＬＰＳもしくは本発明の組成物のいずれかで免疫した動物から得た血清を４［［Ｅ（ｔ４のウサギに移入し、次いで／ユワルツマン反応の試験をする。反応の阻害：ま抗体活性の測定値である。

本発明のワクチンは、グラム陰性微生物によるＬＰＳ内毒素の放已に起因する動物における敗血症性ショックの予防に有用である。

ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、　Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅＳり＜含まれるが、こ本発明のコンシュケートは、動物においてＬＰＳに対する能動免疫を誘導するワクチンとして有用である。このような動物はヒトであるのが好ましいが、本発明はそのように限定することを意図していない。本発明のワクチンの有益な効果を享受し得るいかなる動物も、請求の範囲に記載した本発明に従って処理し得る動物の範囲内にある。

特に本発明は、以下の式（１ｖ）で示されるリビドＡ類似体／免疫原性担体コンンユケートに関する。

［式中、Ａは免疫原性担体であり：しは動物における免疫応答を刺激するリピドＡ類似体の特有の能力に実質的に干渉しないリンカ−基てあり。

Ｒ’およびＲ３は水素、Ｃ７〜Ｃｔｓアシル基、３−ヒドロキシＣ０〜Ｃ１８ア／ル基および３−（Ｃ，〜Ｃ１ｔアンルオキシ）−〇、〜Ｃ１゜アシル基からなる群から選択され；ｍは０または１であり。

ｎは１または２てあり。

ｐは１から２００であり。

Ｒ’はＣ７〜ＣＩ１１アシル基、３−ヒドロキシＣ３〜Ｃ＋８アンル基および３ −（Ｃ，〜Ｃ１□アシルオキシ）−Ｃ３〜Ｃｔｏアンル基かろなる群から選択され：そしてＲ４は水素、Ｃ７〜Ｃ１゜アシル基またはボスフェート基である］。

さらに本発明は、以下の式（Ｖ）で示されるリビドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲートに関する・［式中、ｎ、ｍ、ｐ、Ｌ、Ｒ’、Ｒ″、Ｒ３およびＲ４は上記に定義した通っである〕。

°゛免疫原性担体”という用語は、動物における免疫原性反応を誘導することができるいかなる巨大分子をも意味する。本発明のリピドＡ類似体等の多くの小分子はそれ自体によっては能動免疫を誘導しないので、小分子に特異的な抗体の産生を誘導するために該類似体を免疫原性担体に結合することが２．要である。このような免疫原性担体にはつ／血清アルブミン、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、エデスチン、キーホール・リンベットヘモシアニン（ｋｅｙｈ。

ｌｅ−１ｉｍｐｅヒｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、シュードモナス毒素Ａ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｌ　ＴｏｘｉｎＡ）、コレラゲメイド、コレラ毒素、百日咳毒素、ウィルスタンパクおよび真核生物性タンパク質（例えば、インターフ−ロン、インターロイキン、もしくは唾瘍壊死因子）等のタンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。このようなタンパク質は、当業者に既知の方法により自然のもしくは組換え型の供給源から得られる。組換え型の供給源から得た場合には、免疫原性担体は少なくとも分子の免疫原性部分を含むタンパク質フラグメントを含むものであってよい。本発明を実施する際に使用し得る他の既知の免疫原性巨大分子には多糖、ｔ　ＲＮ　Ａ　、非代謝性合成ポリマーであるポリビニルアミン、ポリメタクリル酸ポリビルピロリドン、４’４’−ジアミ／ジフェニルメタン−３，３″−ジカルボン酸と４−ニトロ−２−アミ７安曹香酸の混合ポリ縮合体（比較的高分子量を有する）ｒ、５ｅｔａ、　Ｍ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　１６６：１３６５−１３７４　（１９６９）を参ｐ、ｇ　３もしくはグリコリピド、リビドししくは炭水化物が自まれるが、これらに限定されない。好ましくは、免疫原性担体はタンパク質である。

”リンカ−基°゛という用語は、免疫原性担体をリビドＡ類似体に結合するのに用いることができ、インビボで抗すピドＡ抗体の産生に干渉しない１またはそれ以上の二官能性分子を意味する。リンカ−基は、結合部位がインビボにおける抗 −リビドＡ抗体の産主に干渉せず、能動免疫の誘導に干渉しない限りは、グルコースまたはゲンチオビオース部分のどの部位に結合してもよい。

リピドＡ類似体を免疫原性担体に結合するのに用いられ得るリンカ−基の例としては以下のものが含まれる。

−（ＣＨ、）、−Ｎ　Ｈ−（Ｖｌ）［式中、ｑは２〜１０であるコ。

−（、Ｃ）（、）、−＼Ｈ−Ｃ，（Ｃ）（、）、Ｃ−［式中、ｑは２〜５、Ｘは２〜Ｉ２である］、そして５式中、ｙは１〜３である；。

炭水化物部分て置換され得る通常のアシル基には、アセテート、プロピオネート、ブタノエート、ペンタノエート、ヘキサノエート、ヘプタノエート、オクタノエート、ノナ／エート、デカ／エート、バルミトイル、オレリル、ミリストイル、ステアロイル、３−ヒドロキシブタノエート、３−ヒドロキシペンタノエート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート、３−ヒドロキシオクタ／エート、３−ヒドロキシノナノエート、３−ヒドロキシデカ／エート、３−ヒドロキシデカ／エート、３−ヒドロキシパルミトイル、３−ヒドロキシオレイル、３−ヒドロキシミリストイルおよび３−ヒドロキシステアロイル基が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらにＲ基の範囲内には３− （Ｃ，〜Ｃｉｔアシルオキシ）−置換された上記のＣ３〜Ｃ１８アシル基が含まれ、ここてＣ２〜ＣＩ！アシルオキシ基にはアセテート、プロパ／エート、ブタノエート、ペンタノエート、ヘキサ／エート、ヘプタノエート、オクタノエート、ノナノ二−ト、テヵノエートおよびトデヵノエート基が含まれるが、これらに限定されるものではない。

好ましいリビドＡ類似体／免疫原性担体コンシュケートはゲンチオビオースから得られるものであり、以下の式（ＩＸ）で示される好ましいリビドＡ類似体／免疫原性担体コンシュケートは、０１位で免疫原性担体に結合されたゲンチオビオースパーアセテートであり、以下の式＜Ｘ）で示される：別の好ましいリピドＡ類似体／免疫原性担体コンシュケートは、Ｃ１位で結合されたアンルグルコース分子であり、以下の式（ＸＩ）で示される池の好ましいリビドＡ類似体／免疫原性担体コンンユヶートは、Ｃ＠゛位で免疫原性担体に結合されたアンルゲンチオビオース分子であり、以下の式（Ｘｌ＋）で示される：池の好ましいリビドＡ類似体／免疫原性担体フンシュゲートは、Ｃ８゛位で免疫原性担体に結合されたアシルグルコース分子量あり、以下の式（Ｘｌｌ＋）で示される：ＣＩ位で結合されたリピドＡ類似体／免疫原性担体フンシュケートは、直接もしくはリンカ−基を介して式（ＸＩＶ）で示される免疫原性担体に炭水化物を結合し得る試薬で、適当に置換および保護された炭水化物を処理することにより製造することができる（反応式ｌを膠照）。例えば、ゲンチオビオースまたはグルコースパーアセテートＵ式（Ｘｉ’）、ｎ−１または２．Ｒ１、Ｒ１、Ｒ３およびＲ’＝Ａ、ｃ］は、木酢酸中、ＨＢｒで処理してアセトブロモ誘導体（Ｘ／Ｖｌ）を得ることができる。次いで、アセトブロモ誘導体（ＸＶＩ）を２−アミ／エタノール（ＸＶｉｌ）、３−アミノプロパツール、４−アミノブタ／−ルｔ、しくは５−アミノペンタノール等のリンカ−と反応させて、アミノエチルパーアセテート糖誘導体（ＸＶＩＩ＋）を得ることができ、これを例えば１−エチル−３ −（３−ジメチルーアミノブロビル）カルホジイミＦ（ＥＤＡＣ）を用いて免疫原性担体（ＸＩＶ）に結合して式（ＩＶ）を得ることができる。アミ７１含有物質とタンパク質のコンジュゲートを形成するためのＥＤＡＣの使用は、米国特許番号４．５２６．７１４別法として、免疫原性ペプチドをコハク酸もしくは２＠のカルボキシル基を有する池のリンカ−基のいずれが等の第二の二官能性スペーサー基を用いて誘導化することかでき、誘導体（ＸＩＸ）が得られる。次いで、式（ＸＩＸ）で示される誘導体をＥＤＡＣの存在下に式（Ｘ■ＩＩ＋）と縮合して式（Ｉｖ）を得る。

Ｒ４がホスフェート基である場合には、適当に保護されたグルコースもしくはゲンチオビオース化合物をリン酸およびＮ−メチルイミダゾールの生成物と）（ｇｃＩｔの存在下に反応させることにより、コンジュゲートを製造する前に水酸基をリン酸化し得る。この反応により遊離水酸基においてリン酸エステルを製造することができる。

免疫原性担体分子１伺当たりのリビドＡ類似体分子の比は、免疫原性担体の分子量、リビドＡ分子に結合し得る免疫原性担体上の結合部位の数および特定のリピドＡ分子の抗原的特徴により大きく変化する。一般に、リピドＡ類似体分子の免疫原性担体分子に対する比は、約１１から約２００１となり得る。好ましくは、その比は約５１から約ｔｏｏ：ｌの範囲である。免疫属性担体がンフテリアトキソイドである場合には、リピドＡｌｌ似体分子のシフテリアト牛ソイド分子に対する比は約５：１から約４０・ｌの範囲内であるのがより好ましい。

反応式Ｉ免疫原性担体かリピドＡ分子に０６位で結合する場合に：ｉ、反応式１１に従い、例えばケンチオビオース（ＸＸ）のＣ８゛−位を塩化トリチル（ＸＸＩ）で選択的なトリチル化により本フンシュゲートを製造することができ、０８°−トリチルゲンチオビオース誘導体（ＸＸ１１）が得られる。残存している水酸基を例えば無水酢酸でアシル化することにより、６“−ｏ−トリチルゲンチオビオース　ヘプタアセテ−）（ＸＸｌｌｌ）を得る。例えば、ＨＢｒを用いてトリチル基を除去することによりＣ６゛−ヒドロキシゲンチオビオースへブタアセテート誘導体くＸＸＩＶ）を得、これを／フチリアトキソイドのスクシネート誘導体等の免疫原性担体に結合して式（ＸＸＶ）を得ることができる。

（ＸＸ）（ＸＸＩＩ）さらに本発明は、本発明のリビドＡ類似体／免疫原性担体の製造に有用な中間体に関する。特に、本発明は以下の式（ＸＸＶＩ）て示されるｌ−ブロモ−糖に関する：［式中、ｎは２である］。

また本発明は以下の式（ＸＸＶＩＩ）で示される中間体に関する。

また本発明は、以下の式（ＸＸＶＩＩ＋）で示されるリビドＡ類似体／リンカーフンシュゲートに関する。

特に本発明は、以下の式（ＸＸＩＸ）て示されるリピドＡＭ似体／リンカーフンシュケートに関する゛また本発明は以下の式、（ＸＸＸ）で示されるリピドＡ類似体／リンカーコンジ１ゲートに関する：また本発明は以下の式（ＸＸＸＩ）で示されるリビドＡ類似体／リンカーフンジニゲートに関する：また本発明は以下の式（ＸＸＸＩＩ）て示されるリピドＡ類似体／リンカーコンツユゲートに関する：本発明のコンジュゲートは当業者に既知の任意の方法により精製してよい。例えば、逆層クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーまたは反応生成物を水　′に対する透析の後に凍結乾燥することによりコンジュゲートを精製し得る。別法では、固相支持体上に固定化した抗− リビドＡ抗体を有するカラムにコンジュゲート溶液を通すことによりフンシュゲートを精製し得る（リビドＡに対する抗体を製造する方法については本出願の実施例部分を参照）。

本発明のリビドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲートを含有するワクチンは、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔的投与もしくは池の適当な方法により投与することがてきる。皮下もしく：よ筋肉内による投与か好ましい。投与する用量は、年令、体重、同時に行う治療が存在すればその種類、および投与する抗原の性質に（次弾するてあろう。一般には、フンシュゲートをｏ、ｏｏｔから２５．０μｇ　／’　ｋ　ｇ　（動物体重）の投与量で投与し得る。免疫原性応答を増強するために初めの投薬に続いて４週間後に追加免疫の投薬を行ってよい。

感染および敗血症性ショックの危険が存在している限りはさらに６ケ月毎の追加免疫の投薬を行い得る。

本発明の方法において有用なリビドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲートは、経口投与のためのカプセル、液体溶液、懸濁液もしくはエリキンル剤等の形で、または溶液もしくは懸濁液等の無菌液体形で用いられ得る。生理食塩水、またはリン酸緩衝食塩水、または本発明の方法で用いられる化合物が本発明の方法における使用に対して適当な溶解性を有するような担体等の不活性担体を用いるのが好ましい。ワクチンは単回用量の調製物の形で、もしくは大量接種プログラムに甲いられ得る多回用量フラスコとすることができる。

ワクチンの調製および使用方法については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　！ａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ、　０ｓｏｌ　（ｅｄ、）（１９８０）、およびＮｅ１ｖ　Ｔｒｅｎｄｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ、　Ｖｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、（ｅｄｓ、）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ　（１９７ｇ）を？照のこと。

本発明のリビドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲートを含有する本発明のワクチンは、さらにリビドＡ類似体−特異的抗体の産生を増強するアジュバントを含み得る。このようなアジュバントには、様々な油剤、例えばフロイントの完全アジュバント、ＭＤＰとして凹、脱リン酸化リビドＡ、もしくはインターフェロン等が含まれるが、これらに限定されるものではない。

フロイントのアジュバントは、免疫原物質と１昆合された水と鉱油のエマルジョンである。フロイントのアジュバントは強力であるが、通常ヒトには投与されない。その代わりに、アジュバントアルム（水酸化アルミニウム）をヒトへの投与に用い得る。水酸化アルミニウム上にコン／ユケートを吸収させることができ、注射後にそこからフンシュケートか徐々に遊離する。

Ｆｕｌ　１ｅｒｔｏｎ（米国特許番号４，２３５．８７７）に従い、リビドＡ類似体／免疫原性ペプチドコ／シュケートをリボノーム内に包入することもてきる。

以上に本発明を一般的に説明したか、以下に示す実施例を参照することにより本発明をさらに理解することができる。以下の実施例は本発明の範囲を限定しようとするものではない。

実施例ケートの調製Ｓ　ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から人手したゲンチオビオース　オクタアセテートをジクロロメタンに溶解しく５ｍ【中にＩｇ）、５°Ｃで４５分間、氷酢酸（１０ｍｌ　：　Ｆｌｕｋａ）中の３３％ＨＢｒて処理することによって、アセトブロモ誘導体に変換した。この反応混合物の合計容量に等しい量のジクロロメタンを加え、この混合物を分別ロートに移した。有機相を等容量の飽和炭酸水素ナト１．１ウム溶液で洗浄しく３〜４回）、続いて水で洗浄した（２回）。次いて、この有機層をＭｇＳＯ４て乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発させて７０．ブを得た。

アセトブロモケニンチオビオースをジクロロメタンおよびジエチルエーテルから結晶化させ、濾過し、真空テンケータ−中で乾燥した。

この結晶化合物はＴＬＣて単一スポットを与え、Ｈ−ＩＮＭＲスペクトルは正しいものであった。

アセトフ゛ロモゲンチオビオース（３ｍｌのクロロホルム中に５ｇ）を、ドライエライト（ｌ　ｇ　：　Ｌ　Ａ、　Ｈａｍｍｏｎｄ　Ｄｒｉｅｒｉｔｅ　Ｃｏ、　）の存在下に２−アミノエタノール（１ｍ’ｌのクロロボルム中に０．５ｍｌ、約０．５ｇ）に結合させた。この混合物を室温で一晩撹拌し、次いて濾過した。得られたアミ／エチルゲンチオビオースへブタアセテート（ＡＧＥ（）を、初めに、溶離溶媒として酢酸エチル−エタノール溶媒混合液（１９，１）を用いるシリカゲルカラム（１，６Ｘ２４ｃｍ；全容量５０ｍ１）のクロマトグラフィーによって精製した。溶離に酢酸エチル−エタノール（１９・１）を用いるＴＵＣによって分画をスクリーニングした。アミノエチル誘導体を含有する分画を合わせ、溶媒を真空下に蒸発させ、生成物を５５°Ｃの熱エタノールから結晶化させた。この結晶化合物はＴ　Ｌ　Ｃで単一スポットを与え、１７６〜１７７°Ｃの融点を宵していた。元素分析値は次のよってあった：Ｃ４９，４４％：Ｈ６，０５％；Ｎ２．１％ＣＣ、、Ｈ、、Ｏ、、Ｎとしての計算値、Ｃ４９５６％；Ｈ５，９４％；Ｎ　２．０６％）。

り７血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）の溶解性および遊離のカルボキシル基の数を増加させるために、ＢＳＡ（ｌ　０〜５０ｍｇ：　ＰＢＳ中に４〜５　＠ｇ／　ａｌｌ）をｐＨ８〜９の無水フハク酸（５〜１０　ｍｇ／　ｍｇタンパク質；　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｇｏｌｄ　Ｌａｂｅｌ）でゆっくりと処理した。濃ＮａＯＨを添加することによってＩ）Ｆ（を８〜８．５に維持した。次いて、この反応混合物を水に対して徹底的に透析し、得られたスクシニル化したＢＳＡ（Ｓ　ｕｃ− Ｂ　Ｓ　Ａ）を凍結乾燥した。

ジオキサンは、タンパク質担体とＡＧＨリガンドの両方を溶解しうることがわかった溶媒である。Ｓｕｅ−ＢＳＡ（１０ｍｇ）を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（１０１ｇ：　ＥＤＡＣ）の存在下、２０％の１．４−ジオキサン（２〜３ｎＬ：Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中てＡＧＨに結合させた。ｐＨ紙を用いてｐＨをモニターし、希ＭＣＩを添加することによって５〜６に維持した。３０分の間隔を置いてＥＤＡＣ（ＬＯｍｇ）をさらに３回加えた。得られたコンジュゲート（Ｓ　ｕｃ−Ｂ　Ｓ　Ａ　−Ａ　Ｇ　Ｈ）を水に対して透析し、次いで凍結させた。フェノールー硫酸検定による還元糖の分析によって、このコンジュゲートが２７４％のＡＧＨで構成されていることがわかった。これは、１モルのタンパク質あたり約３５モルのりガントに相当する。

実施例２　ゲンチオビオースパーアセテート−ＤＴフンシュゲートの調製Ｓ　Ｓ　Ｖ　Ｉ　（Ｂｅｒｎ、　５ｖｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からのジフテリア　トキソイド（ＤＴ）を、ＥＤＡＣの存在下、２５％　１．４−ジオキサンおよび０．０５　Ｍ　Ｎ　ａＣｌ中においてＡＧＨ（実施例１に従って得た）に結合させた。得られたコンジュゲート（ＤＴ−ＡＧＨ）を水に対して透析し、凍結乾燥した。分析により、このコンジュゲートの１６％がＡＧＨで構成されていることが示された。

実施例３　アミノプロピルゲンチオビオースへブタアセテ−ドースクンニル−ＤＴフンシュゲートのＲ１！３−アミノプロパ／−ルをアセトブロモゲンチオビオースに結合させた（実施例１において２−アミノエタノールについて記載したように）。ジフテリア　トキソイド（ＤＴ）をスクシニル化して５ｕｃ−ＤＴを得（実施例１においてＢＳＡについて記載したように）、次いてこれをアミノプロピルゲンチオビオースへブタアセテート（ＡＰＧＨ，実施例２に従う）に結合させて５ｕｃ−ＤＴ−ＡＰＧＨを得た。

実施例４　ゲンチオビオース−タンパク質担体コンジュゲートのＬＰＳ特異的な抗体への結合ゲンチオビオース　オクタアセテートは水に不溶性であるが、本タンパク質コンジ二ゲートは容易に溶解する。これらの可溶性フンシュゲートの抗−リピドＡヒトモノクローナル抗体と結合する能力を、酵素結合固相免疫検定（ＥＬＩＳＡ）によって試験した［このモノクローナル抗体は、グラム陰性細菌における顕著な抗原的多様性の原因である側鎖の結合を妨げる酵素ウリジン　５゛−ジホスフェートガラクトース　４−エピメラーゼを欠損している大腸ｍｏ　１１ｌ−Ｂ４のＪ５突然変異体で免疫された患者の牌臓からのエプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）形質転換されたリンパ球とヘテｃミエローマＳＨＭＡ６（Ｈ４）の融合によって得た］。表１に示すように、ＢＳＡ−ゲンチオビオース　オクタアセテートとジフテリア　トキソイド−ゲンチオビオース　オクタアセテートの両コンンユゲートは、ヒトモノクローナル抗体と結合することができた。これらの実験は、重要な結合エピトープがコンジュゲート化過程中に無傷のまま残っていることを示す。従って、当業者なら、このリビドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲートを動物に投与したときに抗−リビドへ抗体がインビボで産生されることを予測するであろう。

５ｕｃ−ＢＳＡ−ＡＧＨ：Ｉンジュゲー）　２．５６０Ｓ　ｕｃ−Ｂ　Ｓ　Ａ一対照　６４０ＤＴ−ＡＧＨフンシュゲート４８ＤＴ対照　０エタノール中のＡＧＨ１，２８０大腸菌リピドＡ　２，５６０Ｓａｃ−ＤＴ−ＡＰＧＨ３，２００Ｓ　ｕｃ−Ｄ　Ｔ　（対照）　０／タンパク質コンジユゲートのインビボ免疫原性ケンチオビオース　オクタアセテート　タンパク’ｉｔ／ジフテリアトキソイドコンジュゲートを、表２に示した免疫化スケジユールに従ってウサギに投与した。次いて、抗体力価をＥＬ［ＳＡによつて測定した。次に、ウサギ１および２がらの血清について、一連の抗原に特異的な抗体を検定した。表３は、ウサギ血清がＬＰＳおよびジフテリア毒素との反応性を有しているが、ＡＰＧＨとの反応性はごくわずかであることを示している。

表２ウサギのＮＯワクチン　投与量　アンユバント　日ｌおよび２　５ｕｃ−ＤＴ− ＡＰＧｔ（２００μｇ　７０インド　４／１１／８８０ノド　ＡＫＢ　ＩＩＩＡ　２００μｇ　フロイント　４／’２０／８ｇ置換：５２％４２００μｇ　なし　４／２９／８８１５０μｇ　なし　５／２５／８８１５０μｇ　なし　６／３０／８８１５０μｇ　なし　８／１５／８８１５０μｇ　なし　１０／２８／１１１８１５０μｇ　なし　１／　４／８９１／１２／８９に動物から採血３および４　５ｕｃ−ＤＴ−ＡＰＧＩ（ロットＡＫＢ　ＩＩＩ−Ａ−１７１置換：２０％１５および６　５ｕｃ−ＤＴ−ＡＰＧＨＯノドＡＫＢ’／−３３Ａ置換＝４４％１４匹の動物すべてを同じ　１００μｇ　Ａｌｕｍ　１１／　２／８８スケノコールで免疫　１００μｇ　Ａｌｕｍ　１１／３０／８８１ＯＯμｇ　なし　１２／３１／８８ｉｏｏμｇ　なし　！／１３／８９１００μｇ　なし　２／１７７８９ ”スクシニル化ジフテリア毒素のＡＰＧＨによる置換を重量％て表す。

表３抗原　ウサギ　採血前　採血後４／１１　４／２９　５／１３　６／１７　？／１１１　１５０ａ３００　４００　８００　８００２　２００　２００　３００　Ｂｏｏ　１．０００Ｍｅｎ　Ｇｒ　ＢＬＰＳ　ｌ　ｔｏｏ　２００　３００　２００　３００ＰＧＨ１＜ｔｏｏ　＜１００　ｔｏｏ　１５０　１５０２　＜１００　１００　１００　１５０　２５０Ｔ１　３００　１．６００　６，４００　１２．８００　＞１２．８００２　３００　１２．８００　１２．８００　＞ｔ２，８００　＞ｔ２．８００また、ウサギ［ｍ’ｒｉｌｌを、スペーサーグループを持たない破傷風トキソイド−ＡＰＧＨフンシュケート（ＴＴ−ＡＰＧＨ）に対して検定した。

表４に挙げた結果は、抗体がこのフンシュゲートに対しても特異的であることを示し、抗体が分子のＡＰＣＨ部分と反応性であることを確認、した。

抗原　ウサギ　採血前　採血後１　ｔｏｏ１１２，８００２　１００　＞１２，８００３　１００　４．８００　１．６００４　１００　８００　１．６００５　ｔｏｏ　ｌ、２００　３．２００次に、煮沸したＪ５上のＬＰＳに対する抗体特異性を特異的な吸着実験によって測定した。それぞれの実験において、ウサギの血清をｌ：５００に希釈し、バックした細胞の１０容量％で煮沸Ｊ５生物に２回吸着させた。１回目の吸着は２時間であり、それに続く２回目の吸着は一晩であった（両方とも４°Ｃで）。このＪ５生物をＧＬＣによって分析し、ガラクトースを含まないことがわかった。次いて、ウサギ１および５の最後の採血からの血清を、ＴＴ−ＡＰＧＨを用いてＥＬＩＳＡにより吸着前および吸着後に測定した。この結果を表５に示す。

ウサギＮｏ、　減少（％）＃５　実験１　３９％実験２　４２％＃ｌ　２７％ ’Ｏ，Ｄ、＝Ｑ、４ての減少率。

表５に示すように、血清をＪ５ＬＰＳに吸着させたときには、抗体力価の有意の減少が存在した。これらのデータは、コンジ−ゲートで免疫された動物の血清が員沸Ｊ５上のＬＰＳと反応性であるという予測を確認するものである。

）Ｊｕｌ１６　６’−置換ゲンチオビオースへブタアセテート　スクンニルージ７テリア　トキソイド（ＳＵＣ−ＤＴ）コンジュゲートの調製Ａ、６’−０−１−リチルーゲンチオビオースの調製ゲンチオビオース（４ｇ　；　Ｓｉｇｍａ）をピリジン（６０ｍｌ）に撹拌しながら徐々に加え、得られた懸濁液にトリフェニルメチルクロリド（４ｇ：Ａｌｄｒｉｃｈ）を撹拌しながら加えた。この混合物を室温で一晩撹拌した。

溶媒を回転式エバポレーターで蒸発させ、残留ピリジンをトルエン（３×Ｌ　５ｍ１）と共蒸留することによって除去した。固体生成物をジクロロメタン（３０ｎ＋１）に溶解し、この溶液を洗浄したシリカゲルカラム（２，ＯＸ　７０ｃ＋ａ）にかけた。最初に、過剰のトリチルクロリドを酢酸エチルで溶離した。次に、６’−０−１−リチルーゲンチオビオースをメタノールで溶離した。生成物を含宵する分画を合わせ、蒸発乾固させた。

６°−ｏ−トリチル−ゲンチオビオースをピリジン（３５ｍｌ）に溶解し、この溶液に無水酢酸（１７ａｌｌ　；　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ。

ｎ、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　ＩＩ）を撹拌しながら加えた。この混合物を室温で一晩撹拌し、次いで砕いた氷（４００ｍｌ）中に注いだ。得られた沈澱を濾過し、冷水で洗浄し、真空下で乾燥した（収量５５ｇ）。

６’−ｏ−トリチル−ゲンチオビオース　ヘプタアセテート（１，０ｇ）を氷酢酸（６，０ｍ１）に溶解し、この溶液に氷酢酸中の３３％ＨＢｒ（Ｆｌｕｋａ）を加えて２％ＨＢｒにした。この混合物を氷水（５０ｍｌ）中に注ぎ、得られた沈澱（臭化トリチル）を濾去した。

水性溶液をジクロロメタン（５０ｍｌ）で抽出し、有機相を飽和ＮａＨＣＯ，溶液および冷水で洗浄し、無水硫酸ナトＩＪウムで乾燥し、蒸発乾固させた。固体生成物をジエチルエーテルから結晶化したく収ｊ１１５０ｍｇ）。

スフ／ニル−ＤＴ（７，２ｍｇ）を、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボンイミド（１８ｍｇ：　ＥＤＡＣ）の存在下、２０％　１．４ −ンオキサン（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、）中で６°−ヒドロキシ−ゲンチオビオースへブタアセテート（３，５ｍｇ）に結合させた。Ｑ、ＩＮ　ＨＣＩてｐｉ（を５，７〜６．０に維持した。３０分の間隔をおいてＥＤＡＣ（１０ｍｇ）をさらに２回加えた。得られたコンシュ結乾燥した。フェノール−硫酸検定による減少糖の分析によって、このコンジュゲートが２０％の６° −ＨＧＨで構成されていることがわかった。これは、１モルのタンパク質あたり約３０モルのリガンドに相当する。

実施例７６°−０−３ｕｃＤＴ−ＧＨワクチンの免疫原性２００μｇ／ｍｌの最終ａ度になるように凍結乾燥コンジュゲートを滅菌リン酸緩衝食塩水に溶解し、次いで４°Ｃて一晩、酸化アルミニウム（Ｒｈｅｓｏｒｐｔａｒ）に吸着させることによって、免疫化を調べるためのワクチンを調製した。このワクチンを１用量あたり５０μｇでＮ　Ｚ　Ｗウサギに筋肉的投与し、免疫化スケジュールの間に血清を定期的に集めた。ワクチンはＯ１３，６，９，１２、および１６週目に投与した。免疫原性は、２μｇ／ｍｌの濃度でプレート抗原としてヘテロローガス破傷風コンジュゲートワクチン（１′−〇−３ｕｃＤＴ−ＧＨ）を用いて、ＥＬｒＳＡにより測定した。血清は１１５０希釈から始めて３回試験し、結果は光学密１ｆ（０，０，）単位、即ちＯＤが１０に等しい力価に変えた。それぞれの投与の１週間後に得た連続採血の結果を表６に示す。

退」　６’　０−３ｕｃ−ＤＴ−ＧＨワクチンの免疫原性ウサギ＃　０週目　１週目　４週目　７週目　１００週目１３３週目１７週目Ｒｏｏ８２２　ｔｏ　２．２０ｇ　１．８４４　２．９４７　３，６６１　１２０６ＲＯＯ９２０２７４４３１，０５３２，４２３１３，０９７６，８８４ＲＯＩＯ２３ｇ２　２１５　９２６　３，８９０　３．９２５　２．７７５ＲＯ１２１５５５４７４６６３２，５９７２，８９７２，０８ｆｉＲＯ１４１３４３２，３７４１，２３２１，２３２，１，３１２５９０この結果は、ワクチンが免−疫したそれぞれのウサギにリガンド特異的な抗体を誘導したことを示している。これら抗体の保護効率を測定するために、ブタムチンチャレンジモデルにおいてマウスをｆ保護する能力を検定した。免疫したウサギから１４４週目得てプールした血清、またはワクチン投与を行なわなかった対照ウサギから得てプールした血清を滅菌濾過し、１匹のマウスあたりｌ；Ｏｍｌの用量でＮＳＡマウスに腹腔内投与した。２時間後にこのマウスを、ブタムチンの１４％７Ａ製物中に！！４濁させた４、８Ｘ　１０３〜４８×１０５のａｅｒｕｇｉｎｏｓａてチャレンジした。次の７２時間にわたって１時間毎にマウスを調べ、死亡時間を記録した。この結果を表７にま群　チャレンジ　７２時間　ｐ＊　生存時間　ｐ＊Ｑ（ｎ□１０）　（ｃｆｕ）　生存（％）　（平均±Ｓ、　Ｅ、　Ｍ、　、）免疫　４．８ｘ　１０’　７０　０．００４９　６０．６±６．４１　０．０００１正ｘ　４．５ｘｔｏ３ｏ　’　ｔｇ４’：ｏ：ａ。

免疫　４．８ＸＩＯ’　４０　０．０１　４７．６＊７．０１　、　０．００２２正常　４．８Ｘ１０’　０　１８．０：０免疫　４．ｇｘｔｏ５ａｏ　０．０１　ａ７．ｉヨ゛７．５３　０．０００１正常　４１３ＸＩＯ’　Ｏ−１８，０ ”：０＊このチャレンジ用量より少ない用量を投与したすべての対照に対する免疫群のＸ２分析。

＊＊スチューデントのし一検定（片側）。

これらのデータは、ワクチンが免疫原性であり、猛毒のグラム陰性細菌によるチャレンジからマウスを１呆護する抗体を産生じたことを示している。

実施例８　局所的なンニワルッマン反応からの能動１呆護および受動保護Ａ、能動保護３匹のウサギを水酸化アルミニウムゲル（２０・１、ｗ／ｗ）中の５ｕｃ−ＤＴ −ＡＰＧＨ（実施例３を参照）で２回免疫し、次いで食塩水中の抗原を４回注射投与した。局所的なシュワルツマン反応の出現を調へるために、それぞれのウサギに大腸菌０６　ＬＰＳ（５０ｇｇ）を皮内注射し、その２３時間後に食塩水（０，１ｍ１）中のＬＰＳ（２５μｇ）を静脈内注射した。３匹の免疫したウサギのうちの１匹だけが出血反応はなかったか陽性の紅斑を示し、一方、３匹の免疫していないウサギのうちの３匹が紅斑に陽性であり、２匹が出血反応を有していた。壊死は観察されなかった。

Ｂ　受動保護血清を試験しようとするウサギを完全フロインドア／ユパント中の５ｕｃ−ＤＴ −ＡＰＧＨ（実施例３）で１回免疫し、次いで食塩水中の抗原を７回注射した。

これらの超免疫したウサギから得た血清は、ＴＴ−ＡＰＴＧＨを用いてＥＬ　Ｉ　ＳＡで測定すると１　＋６４００の抗体力価を有していた。

被験ウサギに、食塩水（０，２ｍ１）中の大腸ｆ１０６　ＬＰＳ（１００μＢ）を皮内注射した。この２１時間後にウサギに、超免疫血清または正常血清（１５ｍｌ）を静脈内（耳静脈）注射し、２時間後に０．２ｍｌ中のＬＰＳ（２０ｇｇ）の静脈内注射でチャレンジした。正常血清を投与した対照ウサギにおいては、５匹のうちの４匹が出血を示し、１匹が組織の壊死を有していた。超免疫血清を投与した５匹のウサギのうちの１匹だけが陽性の出面反応を示し、壊死の徴候を示すウサギはいなかった。

このように、５ｕｃ−ＤＴ−ＡＰＧＨに対する能動および受動免疫の両者はＬＰＳ誘導のンユワルッマン反応に対して有意の原論を与え、インビボで作用しうる抗−ＬＰＳ抗体を誘導する本組成物の能力がさらに確認された。

以上に本発明の詳細な説明したか、本発明の範囲または仕置の暢様に影響することなく任意かつ広い等画な範囲の組成、〆ｓ度、配合およびその池のパラメーターを用いて本発明を実施しうろことは当業者の理解するところであろう。

国際調査報告ｆ’ｃＴ／ＩＪＲ９０１０４０Ｆ＋７ＰＣＴ／ＵＦＩ９０１０４０１１７

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下の式で示されるリピドＡ類似体を含有するリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１およびＲ３は同じかもしくは異なり、水素、Ｃ２〜Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキンＣ３〜Ｃ１６アシル基、３−（Ｃ２〜Ｃ１２アシルオキシ）− Ｃ３〜Ｃ１６アシル基、または免疫原性担体への結合からなる群から選択され；Ｒ２はＣ２〜Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３〜Ｃ１６アシル基、および３ −（Ｃ２〜Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３〜Ｃ１６アシル基からなる群から選択され：Ｒ４は水素、Ｃ２〜Ｃ１８アシル基、ホスフェート基、または免疫原性担体への結合であり；そしてｎは１または２である：ただし、Ｒ１、Ｒ３またはＲ４のうちの１つは免疫原性担体への結合であり、該結合は動物における免疫応答を刺激するリピドＡ類似体の能力に実質的に干渉しないものである］。
２．動物に投与したときにＬＰＳに対して能動免疫を誘導する、以下の式で示されるリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート；▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ａは免疫原性担体であり；ｍは０または１であり；ｎは１または２であり；ｐは１から２００であり；Ｌは動物における免疫応答を刺激するリピドＡ類似体の特有の能力に実質的に干渉しないリンカー基であり；Ｒ１およびＲ３は同じかまたは異なり、水素、Ｃ２〜Ｃ１６アシル基、３−ヒドロキシＣ３〜Ｃ１８アシル基、および３−（Ｃ２〜Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３〜Ｃ１８アシル基からなる群から選択され；Ｒ２はＣ２〜Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３〜Ｃ１８アシル基、および３−（Ｃ２〜Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３〜Ｃ１８アシル基からなる群から選択され；そしてＲ４は水素、Ｃ２〜Ｃ１８アシル基またはホスフェート基である］。
３．リンカー基が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｑは２〜３である］で示される請求項２に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート。
４．Ｌが、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｑは２〜５であり、ｘは２〜１２である］で示される請求項２に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート。
５．Ｌが、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｙは１〜３である］で示される請求項２に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート。
６．免疫原性担体が、ウシ血清アルブミン、ジフテリアトキソイド、エデスチン、トキシンＡ、およびコレラゲノイドからなる群から選択されるタンパク質である請求項１に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート。
７．動物に投与したときにＬＰＳに対して能動免疫を誘導する、以下の式で示されるリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ａは免疫原性担体であり；ｍは０または１であり；ｐは１から２００であり；Ｌは動物における免疫応答を刺激するリピドＡ類似体の特有の能力に実質的に干渉しないリンカー基であり；Ｒ１およびＲ３は水素、Ｃ２〜Ｃ１６アシル基、３ −ヒドロキシＣ３〜Ｃ１６アシル基、および３−（Ｃ２〜Ｃ１２アシルオキシ） −Ｃ３〜Ｃ１８アシル基からなる群から選択され；Ｒ２はＣ２〜Ｃ１６アシル基、３−ヒドロキシＣ３〜Ｃ１５アシル基、および３ −（Ｃ２〜Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３〜Ｃ１８アシル基からなる群から選択され；そしてＲ４は水素、Ｃ２〜Ｃ１８アシル基またはホスフェート基である］。
８．免疫原性担体が、ウシ血清アルブミン、ジフテリアトキソイド、エデスチン、トキシンＡ、およびコレラゲノイドからなる群から選択されるタンパク質である請求項７に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート。
９．リンカー基か、式： −Ｏ−（ＣＨ２）４−ＮＨ− ［式中、ｑは２〜５である］で示される請求項７に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート。
１０．リンカー基が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｑは２〜５であり、ｘは２〜１２である］で示される請求項７に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート。
１１．Ｌが、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｙは１〜３である］で示される請求項７に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート。
１２．以下の式で示されるリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｐは１〜２００である］。
１３．以下の式で示されるリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｐは１〜２００である］。
１４．動物に投与したときにＬＰＳに対して能動免疫を誘導する、以下の式で示されるリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ａは免疫原性担体であり；ｍは０または１であり；ｎは１または２であり；ｐは１から２００であり；Ｌは動物における免疫応答を刺激するリピドＡ類似体の特有の能力に実質的に干渉しないリンカー基であり；Ｒ１およびＲ３は同じがまたは異なり、水素、Ｃ２〜Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３〜Ｃ１８アシル基、および３−（Ｃ２〜Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３〜ＣＩ６アシル基からなる群から選択され；Ｒ２はＣ２〜Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３〜Ｃ１６アシル基、および３−（Ｃ２〜Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３〜Ｃ１６アシル基からなる群から選択され；そしてＲ４は水素、Ｃ２〜Ｃ１８アシル基またはホスフェート基である］。
１５．Ｌが、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｘは２〜１２である］で示される請求項１４に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート。
１６．免疫原性担体が、ウシ血清アルブミン、ジフテリアトキソイド、エデスチン、トキシンＡ、およびコレラゲノイドからなる群がら選択されるタンパク質である請求項１４に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート。
１７．動物に投与したときにＬＰＳに対して能動免疫を誘導する、以下の式で示されるリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ａは免疫原性担体であり；ｍは０または１であり；ｐは１から２００であり；Ｌは動物における免疫応答を刺激するリピドＡ類似体の特有の能力に実質的に干渉しないリンカー基であり；Ｒ１およびＲ３は水素、Ｃ２〜Ｃ１８アシル基、３ −ヒドロキシＣ３〜Ｃ１８アシル基、および３−（Ｃ２〜Ｃ１２アシルオキシ） −Ｃ３〜Ｃ１８アシル基からなる群から選択され；Ｒ２はＣ２〜Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３〜Ｃ１８アシル基、および３ −（Ｃ２〜Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３〜Ｃ１８アシル基からなる群から選択され；そしてＲ４は水素、Ｃ２〜Ｃ１６アシル基またはホスフェート基である］。
１８．免疫原性担体が、ウシ血清アルブミン、ジフテリアトキソイド、エデスチン、トキシンＡ、およびコレラゲノイドからなる群から選択されるタンパク質である請求項１７に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート。
１９．リンカー基が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｘは２〜１２である］で示される請求項１７に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート。
２０．以下の式で示されるリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート：免疫原性タンパク質▲数式、化学式、表等があります▼［式中、ｐは１〜２００である］。
２１．以下の式で示されるリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート：免疫原性タンパク質▲数式、化学式、表等があります▼［式中、ｐは１〜２００である］。
２２．（ａ）動物においてＬＰＳに対する能動免疫を誘導するに有効な量で存在する請求項１に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート；および（ｂ）薬学的に許容しうる担体；を含有する動物の敗血症性ショックを予防するためのワクチン。
２３．アジュバントをさらに含有する請求項２２に記載のワクチン。
２４．コンジュゲートが、式： ▲数式、化学式、表等があります▼免疫原性タンパク質［式中、ｐは１〜２００である］で示される請求項２２に記載のワクチン。
２５．コンジュゲートが、式： ▲数式、化学式、表等があります▼免疫原性タンパク質［式中、ｐは１〜２００である］で示される請求項２２に記載のワクチン。
２６．コンジュゲートが、式：免疫原性タンパク質▲数式、化学式、表等があります▼［式中、Ｐはし〜２００である］で示される請求項２２に記載のワクチン。
２７．コンジュゲートが、式：免疫原性タンパク質▲数式、化学式、表等があります▼［式中、Ｐは１〜２００である］で示される請求項２２に記載のワクチン。
２８．（ａ）動物においてＬＰＳに対する能動免疫を誘導するに有効な量で存在する請求項１に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート；および（ｂ）薬学的に許容しうる担体；を含有する医薬組成物を動物に投与することからなる動物の敗血症性ショックを治療または予防するための方法。
２９．有効な量が、動物の体重１ｋｇあたり０．００１〜２５．０μｇである請求項２８に記載の方法。
３０．コンジュゲートが、式： ▲数式、化学式、表等があります▼免疫原性タンパク質［式中、Ｐは１〜２００である］で示される請求項２８に記載の方法。
３１．コンジュゲートが、式： ▲数式、化学式、表等があります▼免疫原性タンパク質［式中、ｐは１〜２００である］で示される請求項２８に記載の方法。
３２．コンジュゲートが、式：免疫原性タンパク質▲数式、化学式、表等があります▼［式中、ｐは１〜２００である］で示される請求項２８に記載の方法。
３３．コンジュゲートが、式：免疫原性タンパク質▲数式、化学式、表等があります▼［式中、ｐは１〜２００である］で示される請求項２８に記載の方法。
３４．以下の式で示される化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｎは２であり；Ｒ１およびＲ３は同じかまたは異なり、水素、Ｃ２〜Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３〜Ｃ１８アシル基、および３−（Ｃ２〜Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３〜Ｃ１８アシル基からなる群から選択され；Ｒ２はＣ２〜Ｃ１８アシル基、３− ヒドロキシＣ３〜Ｃ１８アシル基、および３−（Ｃ２〜Ｃ１２アシルオキシ）− Ｃ３〜Ｃ１８アシル基からなる群から選択され；そしてＲ４は水素、Ｃ２〜Ｃ１８アシル基またはホスフェート基である］。
３５．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される化合物。
３６．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される化合物。
３７．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される化合物。
３８．請求項１に記載のリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲートを動物に投与し、超免疫された血清を集めることからなる超免疫血清の製造方法。