JPH06508606A - リピドａ類似体／免疫原性担体コンジュゲート体、ワクチンとしてのその用途、及び多価高度免疫ガンマグロブリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 リピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート体、ワクチンとしてのその用途、 及び多価高度免疫ガンマグロブリン 本発明は米国政府からの援助によって行なわれた。従って米国政府は本発明に一 定の権利を有する。

関連特許出願との相互関係 本出願は米国特許出願第０７／３８５８６０号（１９８９年７月２７日出願、現 在出願放棄）の一部継続出願である米国特許出願筒０７１５０２５５５号（１９ ９０年４月２日出願、現在出願放棄）の一部継続出願である米国特許出願筒０７ ／６６９０８４号（１９９１年３月１５日出願）の一部継続出願である。また本 出願は米国特許出願筒０７／３８５８６０号（１９８９年７月２７日出願）の一 部継続出願である米国特許出願筒０７／４８７８９８号（１９９０年３月６日出 願）の一部継続出願である米国特許出願筒０７／６６９０８４号（１９９１年３ 月１５日出願）の一部継続出願である。これら関連出願の開示内容は参考文献と して本明細書に完全に包含させる。

発明の技術分野 本発明は薬品化学の分野に属するものである。特に本発明は医薬組成物、ならび にワクチンおよび多価高度免疫ガンマグロブリンとしてのその用途に関する。

発明の背景 米国内の病院では毎年約１９４０００人の患者が画面症を起こし、これらの患者 のうちの約７５０００人が死亡する［マキ（Ｄ、Ｇ、　Ｍａｋｉ）、ｒノソコミ アル・インフエク／ヨンス（Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）Ｊ 　、ディクソン（Ｒ，Ｅ、　Ｄｉｘｏｎ）編・１８３〜１９６頁、ヨーク・メデ ィカル・ブックス（Ｙｏｒｋｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｏｏｋｓ）、ニューヨーク （！ｊｅｔ　Ｙｏｒｋ）　（１９８１年）コ。死亡率のこの高い頻度は、強力な 抗生物質の積極的な使用にもかかわらず起こる。抗生物質療法の不十分な使用の ためにグラム陰性菌の外膜の薬物に対する相対的な不透過性が起こり、細菌性エ ンドトキシンの致死効果を薬物が阻止できなくなることに起因するのであろう［ チーグラー（Ｅ、Ｊ、　Ｚｉｅｇｌｅｒ）ら、ニュー・イングランド・ジャーナ ル・オブ・メディシン（Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、）、３０７巻、１２ ２５〜１２３０頁（１９８２年）、ボガード（Ｗ、Ｃ，Ｂｏｇａｒｄ、　Ｊｒ、 ）ら、インフェクシｇン・７ント・イミュ：−ｆイー（Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、　）、５５巻、８９９〜９０８頁（１９８７年）］。

リポ多糖（ＬＰＳ）エンドトキシンの致死効果を阻止する１方法は、抗ＬＰＳ抗 血清の投与である。またそのような抗血清は網内系によるグラム陰性菌の除去を も増強し得る。何人かの研究者は、抗血清を産生ずる免疫化剤としてエシェリキ ア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）またはサルモネラ・ミネソタ（Ｓ、　ｍ１ｎｎｅｓｏ ｔａ）のラフ型変異体を使用することにより、異なった動物モデルで幾つかのグ ラム陰性菌またはエンドトキシンによるチャレンジに対して広範囲なスペクトル で有効に防御できることを証明した［ブロード（Ａ、１．　Ｂｒａｕｄｅ）ら、 ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）、１０８巻、５０５〜５１２頁（１９７２年）、ブロード ら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディシージズ（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ 、　Ｄｉｓ、）、１３６巻、５１６７〜５１７３頁（１９７７年）、ダン（Ｄ、 Ｌ、　Ｄｕｎｎ）ら、サージヤリ−（Ｓｕｒ−ｇｅｒｙ）、９２巻、２１２−２ １９頁（１９８２年）　、マツ’ｒ−フ（ｆ、Ｒ，ＭｃＣａｂｅ）、ンヤーナル ・オブ・イムノロン−１１０８巻、６０１〜６１０頁（１９７２年）、マツケー プら、／ヤーナル・オブ・インフエクシャス・ディシージズ、１３６巻、５１６ １〜５１６６頁（１９７７年）、チーグラーら、ジャーナル・オブ・イムノロジ ー、１１１巻、４３３〜４３８頁（１９７３年）コ。これらの変異体は０−特異 多糖を欠いており、恐ら（大多数のグラム陰性菌が共有している抗原決定基を含 んだＬＰＳコアの表面部分で発現する。ラフ型変異体エシェリキア・コリＪ５に 対して生じたヒト抗血清による患者の受動免疫は、院内感染を規制するための抗 生物質の有効な補足物であることが判明した［チーグラーら、ニュー・イングラ ンド・ンヤーナル・オブ・メディンン、３０７巻、１２２５〜１２３ｏ頁（１９ ８２年）］。

現在、細菌性エンドトキシンの生物活性の大部分はＬＰＳ分子のリピドＡ部分に 存在することが認られている［ルデリッッ（０，Ｌｕｄｅｒｉｔｚ）ら、カレン ト・トピックスーイン・メンプラン・トランスポート（Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　 Ｍｅｍｂｒ、　Ｔｒａｎｓｐ、）、１７巻、７９〜１５１頁（１９８２年）］。

典型的なグラム陰性菌のＬＰＳは、０−多糖、Ｒ−コアオリゴ糖、およびリピド Ａからなる３つの主要な構造領域をもっている。〇−多糖の構造は同一種であっ ても微生物間で著しく変わり得る。その抗原性は細菌の血清型判定の根拠となっ ている。Ｒ領域は〇−抗原とリピドＡとの間のブリツノである。その構造はほと んどのグラム陰性菌で類似している。ＬＰＳに対する抗体は貧食または細菌の死 を促進し得る。〇−抗原はＬＰＳの最も抗原性である成分であるが、その毒性に ついてはまだほとんど知られていない。

これとは対照的に、リピドＡは分子の毒性中心を含んでおり、広範囲な細菌の属 にまたがって構造が極めて類似している。

ＬＰＳのリピドＡ領域は、炎症的変化を仲介するマクロファージ、好中球、およ び内皮細胞のような宿生細胞を直接刺激することにより、グラム陰性菌の組織侵 襲に対する複雑な一連の炎症反応を招来すると信じられる。反応は感染宿主に対 して有毒（血圧低下、凝固障害、死）であるとともに、有益（抗体生成の増大、 食細胞の動員、急性期タンパク質の合成）でもある。

リピドＡの構造を下式（１）に示す。

リビドＡは１位および４°位でリン酸化され、６個ないし７個のエステル結合し た脂肪酸を有するグルコサミンニ糖である。４分子の３−ヒドロキシテトラデカ ン酸がグルコサミンニ糖の２位、３位、２°位、および３°位に結合しており、 ２°位および３°位（さらに場合により２位）の３°−０Ｈ−１４：０残基のヒ ドロキシル基が直鎖式脂肪酸（ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸） で置換されて、アシルオキシアンル基を生成する。

リビドＡの構造−活性相関を解明するため、化学的に合成されたリピドＡ類似体 およびリピドＡの生合成前駆物質の生物活性が検討された。例えばルデリッッら レビュー・オブ・インフェクシャス・ディシージズ（Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃｔ、　 Ｄｉｓ、）、６巻、４２８〜４３１頁（１９８４年）］は、リビドＡ類似体の調 製、およびその化学構造と生物活性との関連性を報告した。著者らはグルコサミ ンニ糖のリン酸基置換が抗原性の発現に不可欠のものではなく、アミン結合した ３−ヒドロキシアシル残基は、活性を低下することなく非ヒドロキシル化脂肪酸 によって置換できることを報告した。また著者らは免疫決定基構造にはアミド結 合した脂肪酸とグルコサミンの連鎖領域が含まれていることを明らかにした。

ガラノス（Ｃ，Ｇａ１ａｎｏｓ）ら［レビュー・オブ・インフエクシャス・ディ ンージズ、６巻、５４６〜５５２頁（１９８４年）］は、家兎免疫のためタンパ ク質（エデスチン）へ結合させた１個のアミド結合した３−ヒドロキシミリスチ ン酸を保有しているグルコサミンニ糖を含む半合成リビドＡ免疫原の調製品を報 告した。類似の条件下での免疫により、リビドＡで被覆した酸処理細菌で得られ た抗体に匹敵する力価で抗体が産生された。

ベーリング（υ、Ｈ，Ｂｅｈｌｉｎｇ）ら［ジャーナル・オブ・イムノロジー、 １１７巻、８４７〜８５１頁（１９７６年）コは、Ｎ−バルミトイル−Ｄ−グル コサミン、Ｎ−オレイル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−ミリストイル−Ｄ−グルコサ ミン、Ｎ−デカノイル−Ｄ−グルコサミン、およびＮ−ステアロイル−Ｄ−グル コサミンを含んでいる合成糖脂質アジュバント類の調製品を報告した。著者らは 抗ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）またはガンマグロブリン（ＨＧＧ）へマグルチニン 力価を測定する検定で、ＬＰＳエンドトキンンを使用した場合と比較して、合成 糖脂質では、これに匹敵もしくは一層優れた免疫応答の増強が得られたことを報 告した。さらに著者らは、合成糖脂質が鶏胚致死、シュワルツマン皮膚検定、お よび内毒素の特徴的で感度の高い検定であるリムルステスト（Ｌｉｍｕｌｕｓ　 １ｙｓａｔｅ　ｔｅｓｔ）でなんら活性を示さないことを報告した。従って著者 らは、その他の点では非内毒素性である糖脂質によるマイトジェン効果およびア ジュバント効果は、エンドトキシンのすべての生物学的活性が、必ずしもこの極 めて複雑な分子の１つの構造サブユニ、ト、または１つの構造的特徴に関係する のではないことを示唆していると結論付けた。

ホノンズ（Ｄ、Ｓ、　Ｈｏｄｇｉｎｓ）　［ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ３７１ ０７２９７（１９８７年１２月３日公開）］はリピドＡをアシルオキシアシルヒ ドロラーゼ自身して式（ＴＩ）の化合物を生じることにより毒性の低いＬＰＳ誘 導体を報告した。

この変化した細菌性ＬＰＳは、ＬＰＳに対する抗体を誘導することによりグラム 陰性菌疾患を予防するワクチンとして、またはグラム陰性菌による敗血症を処置 または予防する解毒薬として、あるいは他の抗原に対する抗体生成を増強するア ジュバントとして治療的に有用である。またアシルオキシアシルヒドロラーゼ自 身も、グラム陰性菌疾患患者で内在性ＬＰＳを解毒するのに予防的または治療的 に有用であり得る。またこの酵素は治療用注入物から有毒なＬＰＳを除去するの に使用し得る。

ワクチンとして使用し、動物で受動免疫に使用できる抗体を産生ずるため、多数 の研究者がグラム陽性微生物およびグラム陽性微生物がら莢膜多糖を単離した。

莢膜多糖が免疫原性に乏しい場合は、それらを免疫原性ポリペプチドへ連結して 、免疫した動物の免疫応答を改良し得る。

ラシャガード（Ｔ、　Ｌａｇｅｒｇａｒｄ）ら［インフェクション・アンド・イ ミユニティ−１５８巻、６８７〜６９４頁（１９９０年）］は、破傷風トキソイ ドへ共有結合的に結合させたＩＩＩ型特異的な抗体の生成を誘導するグループＢ ストレプトコッカス（ｇｒｏｕｐ　Ｂ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）のＩＩＩ 型莢膜多糖調製品を報告した。

ファトム（＾、　Ｆａｔｔｏｍ）ら［インフエクション・アンド・イミユニティ −１５８巻、２３０９〜２３１２頁（１９９０年）］は、ヒト志願者へ投与する と型特異的な抗体を惹起するジフテリアトキソイドへ結合したストレプトコッカ ス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　Ｆ 型多糖調製品を報告した。

ガイヤー（Ｂ、　Ｇｕｙｅｒ）ら［メジカル・マイクロバイオロジー・アンド・ イムノロジー（Ｍｅｄ、　１ｌｉｃｒｏｂｉｏ１．　Ｉｍ＋ａｕｎｏ１．）、１ ７１巻、１３５〜１４３頁（１９８２年）コは、クレブシェラ・ニューモニエ（ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からオリゴ糖−タンパク質のコ ンジュゲート体の調製品を報告した。このコンジュゲート体は、非免疫動物と比 べて免疫した動物のＬＤＳ。を１０’係数まで増大した。そのうえ免疫した動物 の血清はクレブシェラ・ニューモニエでチャレンジしたマウスで受動的防御を伝 達した。

ノユニアソン（Ｒ，５ｃｈｎｅｅｒｓｏｎ）ら［インフエクンヨン・アンド・イ ミユニティ−１５２巻、５１９〜５２８頁（１９８６年）］は、ヒトへ注射した 破傷風トキソイドへ連結させたエシェリキア・コリ、ヘモフィルス・イングラン ド（Ｈｅｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）およびニューモコッカス （Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）　５　Ａ型（Ｐｎ６Ａ）の莢膜多糖調製品を報告 した。この著者らによれば、コンジュゲート体で誘導された抗体は免疫と相関し た二次生物活性を示した。Ｐｎ６Ａ抗体による受動免疫の結果、マウスにおける Ｐｎ６Ａ微生物のＬＤＳ。は約１０００００倍増加を来たした。

クリッツ（Ｓ、Ｊ、　Ｃｒｙｚ、　Ｊｒ、）ら［インフエクション・アンド・イ ミユニティ−１５５巻、１５４７〜１５５１頁（１９８７年）］はトトキシンへ 共有結合的に連結させたンユードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の〇−多糖調製品を報告した。家兎抗コンジュゲ ート体ＴｇＧをマウスへ受動的に伝達すると、致命的なンユードモナス・アエル ギノーザ火傷による敗血症の予防に極めて有効であった。

ジエニングス（Ｈ，Ｊ、　Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）ら［ジャーナル・オブ・イムノロ ノー、１４２巻、３５８５〜３５９１頁（１９８９年）］は、ナイセリア・メニ ンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）およびエシェリ キア・コリ上のエピトープに特異的な抗体を惹起するグループＢナイセリア・メ ニンギチジス多糖−破傷風トキソイドのコンジュゲート体の調製品を報告した。

／バー（Ｇ、Ｒ，５ｉｂｅｒ）ら［インフェクション・アンド・イミユニティ− １４５巻、２４８〜２５４頁（１９８４年）コは、ヘモフィルス・インフルエン ゼｂ１ストレプトコッカス・ニューモニエ、およびナイセリア・メニンギチジス に対するヒト高度免疫グロブリンの調製品を報告した。それぞれのワクチンは個 々の微生物に特異的である免疫原反応を付与する多糖を含んでいる。

ポｏ（Ｍ、　Ｆｏｒｒｏ）ら［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏ１．　Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、）、２３巻、３８５〜３９１頁（１９８６年）コは、ストレプトコッ カス・ニューモニエ６Ａ型およびナイセリア・メニンキチノスのグループＣの莢 膜多糖から誘導されたオリゴ糖ハプテンをジフテリア毒素と血清学的に類縁であ る無毒性変異体タンパクＣＲＭ１９７へ共有結合的に連結することによって合成 した人工的な分子調製品を報告した。誘導された血清抗体はストレプトコッカス ・ニューモニエ６Ａ型および６Ｂ型株の多糖莢膜を認識し、補体を介する溶菌に よってナイセリア・メニンギチシスのグループＣ細菌を殺滅した。

タルコツスキ−（＾、　Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ）ら［ジャーナル・オブ・イムノロ ジー、１４４巻、３７７０〜３７７８頁（１９９０年）］は、志願者で免疫応答 を惹起した多糖Ａｇ（ヘモフィルス・インフルエンゼｂ型、ナイセリア・メニン キチジスＡ１Ｃ１）゛、Ｗ−１３５血清グループ、およびストレプトコッカス・ ニューモニエの莢膜多糖）によるヒトの免疫を報告した。著者によれば、タンパ ク質担体と結合させた多糖ワクチンは抗多糖抗体の分泌細胞を一層高頻度で誘導 した。

カラカワ（ｆ、Ｗ、　Ｋａｒａｋａｗａ）ら［インフエクンヨン・アンド・イミ ユニティ−１５６巻、１０９０〜１０９５頁（１９８８年）］は、スタフィロコ ッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の５型お よび８型莢膜多糖の調製品を報告した。

５型および８型莢膜多糖に対する抗血清はヒト多形核白血球による莢膜化微生物 の型特異的な試験管内食作用を誘導した。

イイヌマ（Ｒ，Ｉｉｎｕｍａ）およびオキナガ（Ｋ、　Ｏｋｉｎａｇａ）　［ジ ャーナル・オブ・インフェクシャス・ディンージズ、１６０巻、６６〜７５頁（ １９８９年）］は、ラットて６型ストレプトコツカス・ニューモニエの多糖ワク チンで免疫することによる肺炎球菌菌血症の予防を報告した。多糖ワクチンは対 照と比較して有意に高い血清オプソニン活性を惹起し、６型多糖に対する抗体力 価を増加した。６型多糖に対するＩｇＧ抗体力価とオプソニン活性との間には密 接な相関があった。

バーカー（Ｃ，Ｊ、　Ｂａｋｅｒ）ら［ニュー・イングランド・ジャーナル・オ ブ・メディンン、３１９巻、１１８０〜１１８５頁（１９８８年）］は、妊婦を グループＢストレプトコッカスの多糖ワクチンで免疫すると、ワクチンによって 誘導された免疫グロブリンの上昇が生じることを報告した。ワクチンに反応した 母親の幼児の血清は試験管内でＩＩＩ型株の有効なオプソニン作用、寅食、およ び殺菌作用を一律に促進した。

ブラコブホル（＾　Ｐｒａｋｏｂｐｈｏｌ　）ら［インフェク／ヨン・アンド・ イミユニティ−１２７巻、１５０〜１５７頁（１９８０年）］はストレプトコッ カス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）からの多糖 調製品を報告した。この多糖は細胞全体または細胞壁で免疫した家兎で免疫原性 であった。

ファトム（＾、　Ｆａｔｔｏｍ）ら［インフエクション・アンド・イミユニティ −１５８巻、２３６７〜２３７４頁（１９９０年）コは、スタフィロコッカス・ アウレウスＣＰＳ／免疫原性ポリベプ千ドのコンジュゲート体の調製方法および ワクチンとしてのその用途について報告した。

ＬＰＳに対する能動免疫を誘導する免疫原としてのリピドＡ類似体の開発にもか かわらず、動物における敗血症ノヨックの処置または予防に使用できる新規化合 物の必要性は依然として存続している。さらにリピドＡ、グラム陰性微生物およ びグラム陽性微生物に特異的な多価高度免疫ガンマグロブリンの開発の必要性も なお依然として存続している。

発明の要約 本発明はリビトＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体に関するものであっ て、ここで該リビトＡ類似体は、下式（ＩＩＩ）　：［式中、ｎは１または２、 Ｒ１およびＲ３は同一または異なってもよく、水素、Ｃ２〜Ｃ１，アシル基、３ −ヒドロキシ０３〜Ｃｌ１ｌアンル基、３　（Ｃｍ〜ＣＩ２アシルオキシ）−０ ３〜Ｃｌ１ｌアンル基、および免疫原性担体への連鎖基からなる群から選ばれ、 Ｒ２はＣ２〜ＣＩ８アシル基、３−ヒドロキシ０３〜Ｃ１ａアンル基、３　（Ｃ ２〜Ｃ１２アシルオキシ）−０３〜ＣＩ８アシル基からなる群から選ばれ、Ｒ４ は水素、０２〜Ｃｌ１ｌアンル基、ホスフェート（リン酸）基、または免疫原性 担体への連鎖基（結合）であり、 ただしＲ１、Ｒ３、またはＲ４のうちの１つは免疫原性担体への連鎖基であって 、ここでその連鎖基は、リピドＡ類似体の動物における免疫応答刺激能を実質的 に妨害しない］ 特に本発明は、下式（ＩＶ）　： ［式中、ｎＳＲ’、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は前記と同意義、Ａは免疫原性担体 、 ｍは０または１、 ｐは１〜２００゜ ＬはリピドＡＱ似体の動物における特徴的な免疫応答刺激能を実質的に妨害しな い連鎖基であって、 Ｒ１およびＲ３は同一または異なってもよく、水素、ｃ２〜ｃ１８ア／ル基、３ −ヒドロキシＣ５〜Ｃ＋ａアンル基、３−　（Ｃ２〜ＣＩ２アシルオキシ）−Ｃ ８〜ＣＩ８アノル基からなる群から選ばれ、 Ｒ２はＣ２〜ＣＩ８アンル基、３　ＩヒＦｏ＋ンＣｓ〜Ｃ＋ｓ７シル基、３　（ Ｃ２〜Ｃ１２アンルオキ／）　Ｃｓ〜ｃｐｓアンル基からなる群から選ばれ、Ｒ ４は水素、Ｃ２〜ＣＤアノル基、またはボスフェート基である〕で示されるリビ ドＡ類似体／免疫原性担体のフンシュゲート体に関する。

本発明はまた、下式（〜′）。

［式中、ｎ、ｍ、ｐ、Ｌ、Ｒ’、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は前記と同意義である ］で示されるリピドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体に関する。

本発明はまた、本発明のリビドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体を薬 学的に許容し得る担体またはアジュバントとともに含有する敗血症ショックの予 防のためのワクチンに関する。

本発明はまた、本発明のリピドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体およ び製薬的に許容し得る担体を含有する医薬組成物を動物へ投与することからなる 動物における敗血症ショックを処置または防止（予防）する方法に関するもので あって、ここで該リピドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体は動物でＬ ＰＳに対する能動免疫を誘導し得る有効量で存在することからなる。

本発明はまた、本発明のリピドＡ類似体／免疫原性担体のフンシュゲート体の調 製に有用な中間体に関する。

本発明はまた、 （ａ）本発明のリピドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体、（ｂ）免疫 原性担体と結合していることある少なくとも１種類のグラム陽性菌および／また はグラム陽性菌、またはその抗原決定基、（Ｃ）製薬的に許容し得る担体、およ び（ｄ）所望によりアジュバント を含有する多価ワクチンを提供する。

本発明はまた、本発明のリピドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体に対 して特異的なガンマグロブリンの有効な中和量、およびグラム陽性菌および／ま たはグラム陽性菌特異的なガンマグロブリンの有効なオプソニン化量を含有する 多価高度免疫ガンマグロブリンを提供する。

本発明はまた （ａ）本発明のリピドＡ類似体／免疫原性担体、および免疫原性担体と結合する ことある少な（とも１種類のグラム陽性菌および／またはグラム陽性菌、または その抗原決定基で動物を免疫し、 （ｂ）所望により段階（ａ）の免疫化段階で動物を追加（ブースター）免疫し、 （Ｃ）その動物の血漿をプールし、 （ｄ）その細菌をオプソニン化しＬＰＳを中和するのに有効であるガンマグロブ リン画分をその動物から回収する ことからなる多価高度免疫ガンマグロブリンの調製方法に関する。

本発明はまた （ａ）本発明のリビドＡ類似体／免疫原性担体、および免疫原性担体と結合する ことある少なくとも１種類のグラム陽性菌および／またはグラム陽性菌、または その抗原決定基で動物を免疫し、 （ｂ）所望により段階（ａ）の免疫化段階で動物を追加免疫し、（Ｃ）その動物 の血漿をプールし、 （（１）その動物から、その細菌をオプソニン化しＬＰＳを中和するのに有効で あるカンマグロブリン画分を回収する ことによって得られた多価高度免疫ガンマグロブリンを提供する。

本発明はさらに、本発明のリピドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体に 対して特異的なガンマグロブリンの有効中和量、およびグラム陰性および／また はグラム陽性−特異的な多価高度免疫ガンマグロブリンの有効オプソニン化量を グラム陽性菌および／またはグラム陽性菌感染症に罹患している動物へ投与する ことからなるグラム陽性菌および／またはグラム陽性菌による敗血症の処置方法 を提供する。

本発明はまた、１またはそれ以上の容器手段を厳密に隔離して収納し得る区画を もった担体からなり、ここで第１の容器には本発明のリピドＡ類似体／免疫原性 担体のコンジュゲート体を含有することからなるグラム陽性菌および／またはグ ラム陽性菌による敗血症の処置のためのキットを提供する。

本発明はまた、１またはそれ以上の容器手段を厳密に隔離して収納し得る区画を もった担体からなり、ここで第１の容器には本発明のリピドＡ類似体／免疫原性 担体のコンジュゲート体に特異的な高度免疫ガンマグロブリンを含有することか らなるグラム陽性菌および／またはグラム陽性菌による敗血症を処置するための キットを提供する。所望によりこのキットは、さらに少なくとも１つのグラム陽 性菌および／またはグラム陽性菌に特異的なガンマグロブリンを含有し得る。

予期しなかつたことであるが本出願の発明者らは、グルコースおよびゲンチオビ オースのアンル誘導体が、これを免疫原性担体へ結合すると動物においてＬＰＳ に対する能動免疫を誘導することを発見した。この発見によって、敗血症ショッ クの予防に使用し得る安価なワクチンの容易な調製が可能になった。

図面の説明 第１図はＧ７５ゲル濾過カラムからのＦＤ−４ＰＳの溶出プロフィルを示したグ ラフである。

第２図はＧ７５ゲル濾過カラムからのＦＤ−７ＰＳの溶出プロフィルを示したグ ラフである。

第３図はＧ７５ゲル濾過カラムからのＩＮＴ−３の溶出プロフィルを示したグラ フである。

第４図はＧ７５ゲル濾過カラムからのＩＮＴ−４ＰＳの溶出プロフィルを示した グラフである。

第５図はＧ７５ゲル濾過カラムからのＫＰＯ−２ＰＳの溶出プロフィルを示した グラフである。

第６図はＣＬ−６ＢセフアロースカラムからのＦＤ４−ＰＳ−ＤＴコンジュゲー ト体の溶出プロフィルを示したグラフである。

第７図はＣＬ−６ＢセフアロースカラムからのＦＤ５−ＰＳ−ＤＴコンジュゲー ト体の溶出プロフィルを示したグラフである。

第８図はＣＬ−６ＢセフアロースカラムからのＦＤ７−ＰＳ−ＤＴコンジュゲー ト体の溶出プロフィルを示したグラフである。

第９図はＣＬ−６ＢセフアロースカラムからのＩＮＴ４−ＰＳ−ＤＴコンシュケ ート体の溶出プロフィルを示したグラフである。

第１０図はＣＬ−６ＢセフアロースカラムからのＫＰＯ２−ＰＳ−ＤＴコンジュ ゲート体の溶出プロフィルを示したグラフである。

第１１図はＣＬ−６Ｂセフアロースカラムからの高分子量（ＨＭＷ）および低分 子量（ＬＭＷ）のＫＰＯ２−ＰＳ−ＤＴコンジュゲート体の溶出プロフィルを示 したグラフである。

好ましい実施態様の説明 本発明は免疫原性担体へ連結したグルコースまたはゲンチオビオースのようなポ リグルコース分子を含むリビトＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体に関 するものであって、ここでグルコースまたはゲンチオビオース部分の少な（とも ０３位はアノル基（Ｒ２）で置換される。別の態様では、グルコースまたはゲン チオビオース部分の０２位はヒドロキシ基で置換されない（Ｒ’≠Ｈ）。コンシ ュケート体は動物へ投与するとＬＰＳに対する能動免疫を誘導するものである限 り、免疫原性担体はリビドＡ類似体分子の任意の遊離ヒドロキシル基へ連結し得 る。

好ましくは免疫原性担体はグルコースまたはポリグルコース部分のＣ１位または ０６位へ連結される。

本発明のリピドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体の対応物には、少な くとも１つの糖分子の少なくともＣ３位でア／ル化され、免疫原性担体へ連結さ れたすべての非アミノ糖および多糖類が含まれ、ここでコンジュゲート体は動物 へ投与すると、ＬＰＳに対する能動免疫を誘導する。

本発明のリビドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体は、コンジュゲート 体を動物へ投与すると、抗ＬＰＳ抗体が動物によって産生されて、ＬＰＳに対す る能動免疫が誘導されると考えられる。抗ＬＰＳ抗体の有効性は、例えば免疫し た動物の血清を第２の動物へ投与し、ついで第２の動物をＬＰＳ産生細菌でチャ レンジすることによって試験できる（実施例７参照）。抗ＬＰＳ血清を投与する と第２の動物の生存が増加し、コンジュゲート体はＬＰＳに対する免疫を誘導す ると考えられる。

また抗ＬＰＳ抗体はＬＰＳに対する周知の生物学的反応であるシュワルツマン反 応［リー（Ｌ、　Ｌｅｅ）ら、ツバイファッフｙ（Ｂ、ｆ、　Ｚｗｅｉｆａｃｈ ）ら編、［ジ・インフラマトリ−・プロセス（ＴＨＥ　ＩＮＦＬＡＭＭＡＴＯＲ Ｙ　ＰＲＯＣＥＳＳ）Ｊ　、ｙカブミック・プレス社（＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ）、ＮＹ、１９６５年、７９１頁］の抑制によって試験できる。

ＬＰＳまたは本発明の組成物の１つで能動的に免疫された動物（特に家兎）に好 適なＬ　Ｐ　Ｓチャレンジを与えて、局所的なツユワルツマン反応を誘発する。

紅斑、出血、または環元反応の予防または改善は抗ＬＰＳ抗体の存在の証拠であ る。別法としてＬＰＳまたは本発明の組成物の１つで免疫した動物の血清を未処 置家兎へ移し、ついでこの動物をツユワルツマン反応で試験する。反応の抑制は 抗体活性の尺変である。

本発明のワクチンは、グラム陰性微生物によるＬＰＳエンドトキンンの放出に起 因する動物における敗血症ショックの予防に有用である。そのようなグラム陰性 微生物として、サルモネラ、エンエリキア、ヘモフィルスおよびナイセリア、ク レブノエラ、／ゲラ（ＳｈｉｇｅＪｌａ）、シュードモナス、エンテロバクタ− ＣＥｎｔｅｒｏ−ｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクタ−（＾ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ ｅｒ）、およびバクテロイデス（Ｂａｃ、ｔｅｒｏｉ−ｄｅｓ）等が挙げられる が、それだけに限定されるものではない［バーシーズ・マニュアルＱオブＣノス テマティック・マイクロバイオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｕａｌｏｆ 　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）参照］０本発明のコンシ ュケート体は動物でＬＰＳに対する能動免疫を誘導するワクチンとして有用であ る。好ましくはそのような動物はヒトであるが、本発明はそれだけに限定される ものでない。本発明のワクチンの有益な効果を経験し得る任意の動物は本発明に よって処置し得る動物の範囲に包含される。

特に本発明は、式（ＩＶ）　： ［式中、Ａは免疫原性担体、 ＬはリビドＡ類似体の動物における特徴的な免疫応答刺激能を実質的に妨害しな いりンカー基であって、 Ｒ１およびＲ３は同一または異なってもよく、水素、０２〜ＣＩ８アシル基、３ −ヒドロキシＣ３ルｃｏｇアシル基、３−　（Ｃ２〜ＣＩ２アンルオキシ）−０ ３〜ＣＩ、ア／ル基からなる群から選ばれ、 ｍはＯまたは１、 ｎは１または０１ ｐは１〜２００、 Ｒ２はＣ２〜Ｃ１ｓア／ル基、３−ヒドロキシＣ３〜Ｃ１８アシル基、３−（０ ２〜Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３〜ＣＩ８アンル基からなる群から選ばれ、Ｒ４ は水素、Ｃ２〜Ｃ１８アンル基、またはホスフェート基である］で示されるリビ ドＡ類似体／免疫原性担体のフンシュゲート体に関する。

本発明はまた、下式（Ｖ）： ［式中、ｎ、ｍＳｐ、Ｌ、Ｒ’、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は前記と同意義である ］で示されるリビドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体に関する。

「免疫原性担体」の語は動物にて免疫原性反応を誘導できる任意の巨大分子を意 味する。本発明のリビドＡ類似体などの多くの小分子は、それ自身で能動免疫を 誘導しないから、小分子に特異的である抗体の産生を誘導するには免疫原性担体 にその類似体を結合する必要がある。そのような免疫原性担体としては、ウシ血 清アルブミン、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、エデスチン、キーホ ールリンベットヘモシアニン、ツユ−トモナル毒素Ａ１コレラゲノイド、コレラ 毒素、百日咳毒素、ウィルスタンパク質、およびインターフェロン、インターロ イキン、または腫瘍壊死因子のような真核生物タンパク質等が挙げられるが、そ れだけに限定されるものてはない。そのようなタンパク質は当業者既知の方法に よって天然または組換え供給源から入手し得る。組換え供給源から入手する場合 は、免疫原性担体は少なくとも分子の免疫原性部分を含むタンパク質断片を含み 得る。本発明の実施に使用し得るその他の既知の免疫原巨大分子は、多糖類、ｔ Ｒさ”Ａ１ポリビニルアミン、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドン、４° 。

４゛−ンアミノジフェニルメタン−３，３°−ジカルボン酸および４−ニトロ− ２−アミノ安息香酸の混合重縮合物（比較的高分子量のもの）［セラ（Ｍ、　５ ｅｌａ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１６６巻、１３６５〜１３７４頁（ １９６９年）参照］のような非代謝性合成ポリマー、または糖脂質、脂質、また は炭水化物等であるが、それだけに限定されるものではない。好ましくは免疫原 性担体はタンパク質である。

「リンカ−基」の語は免疫原性担体をリピドＡ類似体へ連結するのに使用でき、 生体内で抗すピドＡ抗体の産生を妨害しない１またはそれ以上の２官能性分子を 意味する。リンカ−基は結合点で生体内の抗すピドＡ抗体の産生を妨害せず、従 って能動免疫の誘導を妨害しない限り、グルコースまたはゲンチオビオース部分 の任意の位置に結合し得る。

リピドＡ類似体を免疫原性担体へ連結するのに使用できるリンカ−基の例として は、 −（ＣＨ２）、−ＮＨ−（ｖＩ） ［式中、ｑは２〜１０］； ［式中、ｑは２〜５、Ｘは２〜１２］　；及び−（ＣＨ２）、−Ｃ−（ＶＩＩＩ ） ［式中、ｙは１〜３］ 等が挙げられる。

炭水化物部分を置換できる代表的なアンル基は、アセテート、プロピオネート、 ブタノエート、ペンタノエート、ヘキサノエート、ヘプタノエート、オクタノエ ート、ノナノエート、デカノエート、バルミトイル、オレイル、ミリストイル、 ステアロイル、３−ヒドロキシブタノエート、３−ヒドロキシペンタノエート、 ３−ヒドロキノヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート、３−ヒドロキ シオクタノエート、３−ヒドロキシブタノエート、３−ヒドロキシブタノエート 、３−ヒドロキシブタノエート、３−ヒドロキシバルミトイル、３−ヒドロキシ オレイル、３−ヒドロキシミリストイル、および３−ヒドロキシステアロイル基 等であるが、それだけに限定されるものではない。またＲ基の範囲に包含される ものとして、３−（Ｃ２〜ＣＩ２アシルオキシ）−置換した上記のＣ３〜ＣＩ８ アシル基が挙げられ、ここで０２〜ＣＩ２アシルオキシ基としては、アセテート 、プロパノエート、ブタノエート、ペンタノエート、ヘキサノエート、ヘプタノ エート、オクタノエート、ノナノエート、デカノエート、およびトチカッエート 基等が含まれるが、それだけに限定されるものではない。

好ましいリビドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体はゲンチオビオース から誘導され、下式（ＩＸ）　： （ＩＸ） を有する。

好ましいリピドＡ類似体／免疫原性担体のフンシュゲート体は、Ｃ１位で下式（ ）： を有する免疫原性担体へ連結されたゲンチオビオース過アセテートである。

もう一つの好ましいリビドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体は、Ｃ（ Ｘ［） を有する免疫原性担体へ連結されたアシルグルコース分子である。

もう一つの好ましいリビドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体は、０６ 位て下式（ＸＩＩ）　・ （Ｘｌ） を有する免疫原性担体へ連結されたアシルゲンチオビオース分子である。

もう一つの好ましいリピドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体は、Ｃ６ °位で下式（ＸＩＩＩ）　： （ＸＩ［Ｉ） を有する免疫原性担体へ連結されたアシルグルコース分子である。

Ｃ１位で連結されたリビドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体は、炭水 化物を、直接またはリンカ−基を介して式（ＸＩｖ）で示される免疫原性担体へ 連結することができる試薬によって、好適に置換し保護された炭水化物を処理す ることによって製造し得る（反応式Ｉ参照）。例えばゲンチオビオースまたはグ ルコースノ過アセテート（過酢酸）［式（ＸＶ）中、ｎは１または２、Ｒ１、Ｒ ２、Ｒ１、およびＲ４はＡｃ］を氷酢酸中でＨＢｒで処理し、アセトブロモサツ カリド誘導体（ＸＶＩ）を得ることができる。ついで、アセトブロモサツカリド 誘導体（ＸＶＩ）を２−アミノエタノール（ＸＶＩＩ）　、３−アミノプロパツ ール、４−アミノブタノール、または５−アミノペンタノールのようなリンカ− と反応させ、アミノエチル過アセテートサツカリド誘導体（ＸＶＩＩＩ）を得、 これを例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド （ＥＤＡＣ）で免疫原性担体（ＸＩＶ）に結合させて、化合物（ＩＶ）を得るこ とができる。ＥＤＡＣを使用してアミノ含有物質およびタンパク質問のコンジュ ゲート体を生成する方法はファイジエン（Ｆｅｉｊｅｎ）ら（米国特許第４５２ ６７１４号）によって報告されている。

別法として免疫原性ペプチドを、コハク酸または２個のカルボキシル基を有する 任意の他のリンカ−基のような第２の２官能性スペーサー基で誘導体化し、誘導 体（ＸＩＸ）を得ることができる。ついで式（ＸＩＸ）で示される誘導体をＥＤ ＡＣの存在で（ＸＶＩＩＩ）と縮合させて化合物（ＩＶ）を得ることができる。

Ｒ４がホスフェート基（リン酸基）である場合は、コンジュゲート体を作成する 前に、好適に保護されたグルコースまたはゲンチオビオース化合物をＨｇＣ１２ の存在でリン酸およびＮ−メチルイミダゾールの生成物と反応させることによっ て、ヒドロキシ基をリン酸化し得る。この反応で、遊離ヒドロキシ基にリン酸エ ステルを導入し得る。

免疫原性担体分子に対するリピトＡ類似体分子の割合は、免疫原性担体の分子量 、リピドＡ分子へ結合し得る免疫原性担体の結合部位の数、および固有のリピド Ａ部位の抗原性の特徴によってかなり変わり得る。一般に免疫原性担体分子に対 するリピトＡ類似体分子の割合は、約１・１〜約２００　：　１であり得る。好 ましくは割合は約５１〜約１００・１の範囲であり得る。一層好ましくは免疫原 性担体がジフテリアトキソイドである場合、ジフテリアトキソイド分子に対する リピドＡ類似体分子の割合は約５：１〜約４０：１の範囲であり得る。

反応式４ 免疫原性担体をＣ６位でリビドＡ分子へ連結する場合は、以下の反応式ＩＩに従 って、コンジュゲート体を、例えばゲンチオビオース（ＸＸ）のＣＵ位を塩化ト リチル（ＸＸＩ）で選択的にトリチル化して、Ｃ６°−トリチルゲンチオビオー ス誘導体（ＸＸＩＩ）を調製し得る。例えば無水酢酸で残りのヒドロキシ基をア セチル化すると、６°−０−トリチルゲンチオビオースへブタアセテート（ＸＸ ＩＩＩ）が得られる。例えばＨＢｒでトリチル基を除去すると、Ｃ６°−Ｏ−ヒ ドロキシゲンチオビオースへブタアセテート誘導体（ｘｘＩｖ）が得られ、この 誘導体を、ジフテリアトキソイドのコハク酸誘導体のような免疫原性担体へ連結 して（ＸＸＶ）を得ることができる。

反応式■ 本発明はまた、本発明のリピドＡ類似体／免疫原性担体の調製に有用な中間体に 関する。特に本発明は式（ＸＸＶＩ）（ＸＸＶＴ） （式中、ｎは２） て示される１−ブロモサツカリドに関する。

本発明はまた、式（ＸＸＶＩＩ）　： （ＸＸ■） で示される中間体に関する。

本発明はまた、式（ＸｎｌＩＩＩ）　：（ＸＸ■） を有するリピドＡ類似体／リンカ−のコンジュゲート体に関する。

特に本発明は、式（ＸＸＩＸ）　： を有するリピドＡ類似体／リンカ−のコンジュゲート体に関する。

本発明はまた、式（ＸＸＸ）　： バクター＊（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）である。好ましい菌はシュードモナ ス・アエルギノーザ、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス”／ユードマレイ（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、’／ニードモナス・マレイ（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｗａｌｌｅｔ）、およびシュードモナス・サッカロフィ リア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ−ｎａｓ　５ａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ）種等の細菌 が含まれるシュードモナス属である。最も好ましい菌はシュードモナス・アエル ギノーザ種の細菌である。

真正細菌目に含まれるものはアゾトバクテラツエー科（＾ｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅａｅ）、リゾビアラニー科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、アクロモバク テラツェー科（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒａｃｅ−ａｅ）、エシテロバクテリ アツエー科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、およびプルセララニー 科（Ｂｒｕｃｅｌｌ、ａｃｅａｅ）である。好ましいのはエシェリキア（Ｅｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａｅ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌｅａｅ）、プロテウ ス（Ｐｒｏｔｅｅａｅ）、エルンニア（Ｙｅｒｓｉｎｉｅａｅ）、およびエルウ ィニア（Ｅｒｖｉｎｉａｅ）を含むエンテロバクテリアツエー科である。エシェ リキアの中でも、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｅ）＠、　エドワージ エラ（Ｅｄｖａｒｄｓｉｅｌｌａ）属、ントロバクター（Ｃｉ　ｔｒｏｂａｃｔ ｅｒ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、およびンゲラ（Ｓｈｉｇｅ ｌｌａ）属が好ましい。エシェリキア属に含まれる好ましい菌はエシェリキア・ コリ種の細菌である。クレブシェラの中では、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ ｌａ）、二／テロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ハフニア（Ｈａｆ ｎｉａ）属およびセレイシア（Ｓｅ−ｒｒａｔｉａ）ＩｉｌＫが好ましい。クレ ブシェラ属の中で好ましい菌はクレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ ｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブンエラ拳オゼネ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ 　ｏｚａｅｎａｅ）、クレブシェラ・オキシド力（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘ ｙｔｏｃａ）およびクレブシェラ・リノスクレ０７千ス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ 　ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍａｔｉｓ）種等の細菌である。

好ましいダラム陽性菌は小球菌科（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｅａｅ）および連鎖球菌 科（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｃｏｃｃａｃｅａｅ　）である。小球菌科に含まれるもの はミクロコツカス（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａ ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属およびプラノコッカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ） 属である。スタフィロコッカスの中でもスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔ ａｐｈｙ−１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）種およびスタフィロコッカス・エ ビデルミゾイス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ−ｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ） 種の細菌は好ましい。連鎖球菌科に含まれるものは、ストレプトコッカス（Ｓｔ ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）＠、り五−コノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ） 属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、アエロコツカス（Ａｅｒ ｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびジェメラ（Ｇａｍｅｌｌａ）属である。好ましい菌 はストレプトコッカス・フエヵーリス（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅ ｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ 　ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・ミチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ■１ｔｉｓ）およびストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ ｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）種の細菌である。

本発明はまた、本発明のリピドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体に対 して特異的なガンマグロブリンの有効なオプソニン化量および中和量、および０ 抗原特異的なガンマグロブリンの有効なオプソニン化量を含有する多価高度免疫 ガンマグロブリンを提供する。この多価高度免疫ガンマグロブリンはさらにダラ ム陽性菌の少な（とも１種類の抗原決定基を含有できる。

高度免疫ガンマグロブリンは超免疫化した動物から分離することができる。本発 明の１またはそれ以上のコンジュゲート体を、好ましくは筋肉内または皮下注射 によって投与することにより動物を超（高度）免疫化することができる。標準的 には、コンジュゲート体は、各コンジュゲート体の成分として多糖約１０〜１１ ００ｕの範囲で有効に投与できる。各コンンユゲート体の成分として多糖約１２ ゜５〜５０ａｇの範囲が好ましい。

本発明のコンジュゲート体の最初の投与から約４〜６週間後に、各コンジュゲー ト体の成分として多糖約１０〜１１００Ｉ１を動物に再注射できる。好ましくは 多糖約１２．５〜５０１１ｇの注射を、所望により各コンシュケート体の成分と して動物に投与する。一般に２回目の注射では、抗原特異的な細胞表面抗体を保 有するＢ細胞数が指数関数的に増加する。また２回目の注射に重複して３回また はさらに引続いて注射を投与できる。当業界周知のように、この抗原の追加免疫 を反復することによって、超免疫化された動物が生じる。また注射に好適なアン コバントを使用すると、コンンユゲート体に対する免疫応答を増強し得る。

免疫した動物から分離した血漿は注射した抗原に対する比較的高濃度の抗体を含 有しており、便宜的に高度免疫血清と呼ばれる。超免疫化した動物から高度免疫 血清を分離する方法は、バーｏ　（Ｈａｒｌｏｔ）ら［アンチボディーズ（＾ｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ）、コールド・スプリング１　ハ／＜　−Ｈラボラトリ−（Ｃ ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ）、１９８８年 ］の方法に例示されるように当業界周知のものである。高度免疫ガンマグロブリ ン製剤は、例えばコーン分画法のような当業界既知の種々の方法を用いて高度免 疫血清から調製することができる［コーン（Ｅ、Ｊ、　Ｃｏｈｎ）ら、ノ・アメ リカン・ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサエティー（Ｊ、＾＋ａｅｒ、　Ｃｈ ｅｗ。

Ｓｏｃ、　）、６８巻、４５９頁（１９４６年）および米国特許第４９６５０６ ８号参昭］Ｃ一般に硫酸アンモニウムを使用する分別沈殿法によって血漿を免疫 学的に活性（免疫グロブリン）および免疫学的に不活性（アルブミンおよび凝固 因子）である画分に分離し得る。ついて免疫学的に活性な画分をペプシンで短時 間消化して分子の補体活性化成分を除去し、免疫原性を一層低める。ついで透析 および分別沈殿または遠心によって免疫学的に活性な成分を回収する［レミント ンズ・ファーマンニーティカル―サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈ ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）、マッグ・バブリッ’／ング・ カンパ−−−（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン （Ｅａｓｔｏｎ）、ペンシルバニア（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、１９９０年 参照コ。

「オプソニン化」および「中和」の語はともに体液性および細胞性免疫に関連す る活性に関するものである。例えば体液性免疫の場合、リピドＡ特異的抗体はリ ビト、へを「中和する」が、その他のどの型の毒素をも中和しない。これと対照 的に細胞性免疫は循環血液中の抗体に必ずしも完全には依存しない。例えば莢膜 をもった球菌であるストレプトコッカス・ニューモニエをマウスへ注射すると、 一般に死を伴なう。然しチャレンジ前に、ストレプトコッカス・ニューモニエに 対して特異的な抗体をマウスへ注射すると、一般に死は起こらない。この結果は チヤレンジする微生物の表面へ抗体が結合して表面を変化させ、それによって面 食を促進することに起因する。この活性を典型的に「オプソニン化」活性と呼ぶ 。

オプソニン化および中和活性を分析する方法は当業界既知のものである。これら の方法としては、家兎皮膚ンユワルツマンモデル（Ｒａｂｂｉｔ　Ｄｅｒｍａｌ 　Ｓｃｈｖｒｔｚｍａｎｌｌｏｄｅｌ）、ネズミ／ブタ／ムチンモデル（ｌｌｕ ｒｉｎｅ　）ｌｏｇ　Ｍｕｃｉｎ　Ｍｏｄｅｌ）、およびう、ソト好中球減少症 モデル（Ｒａｔ　Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ　Ｍｏｄｅｌ）等のような動物モデル が含まれる。

これらのモデルは通常の当業者周知のものである。例えばテンプ（Ｎ、Ｎ、Ｈ， Ｔｅｎｇ）らが報告したネズミ／ブタ／ムチンモデル［プロシーディングズ・オ ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・Ｕ　Ｓ　Ａ 　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、８２巻、１７９０〜１７９４頁（１９８５年 ）］を用いてオプソニン活性を測定することができる。

ネズミ／ブタ／ムチンモデルを用いて、シュードモナス・アエルギノーザ１３４ ＶＡ（フィッシャー・デブロン■型）、シュードモナス・アエルギノーザ・フィ ッシャー・デブロンＶＩ型、クレブシェラ・ニュモニエ、エシェリキア・コリ０ １１１・Ｂ４、エシェリキア・コリ０１７、またはストレプトコッカス・ニュモ ニ工の１８時間培養の段階的投与量をマウスに接種する。１またはそれ以上の１ ８時間培養の段階的投与量を１４％ブタ胃ムチンの等容量と混合し、この細菌浮 遊液０．５ａｌをマウス腹腔内へ注射する。この注射に先立って、本発明の高度 免疫ガンマグロブリンをマウスへ注射する。対照としてこの注射の非投与群を設 ける。

ついで防御比を計算することによって致命的な画面症に対する防御を測定できる 。

この比は高度免疫ガンマグロブリン処置群と未処置対照群間のＬＤ、。の比と定 義される。少な（とも５：１の防御比があれば、オプソニン活性陽性を示すもの とみなす。１０：１の比が好ましく、少なくとも１５：１の比が最も好ましい。

一般に本発明のグラム陰性菌およびダラム陽性菌コンジュゲート体に特異的なガ ンマグロブリンはオプソニン活性を示す。

さらにもう１つの例として、中和活性を皮膚シュワルツマン反応によってスクリ ーニングできる（テンプら、前掲）。このモデルでは、家兎の耳静脈に本発明の 高度免疫カンマグロブリンを接種する。対照としてリボ多糖またはイスコープ（ Ｉｓｃｏｖｅ）の培地のチャレンジ投与を家兎に行なう。チャレンジ注射部位で 出血性壊死の減少があれば、中和活性は明白である。一般に陽性反応の発生率が 約９０％以下であれば、中和活性があるとみなす。陽性反応の発生率が約１５％ 以下であることが好ましく、約１２％以下の発生率が最も好ましい。

好ましいＯ抗原特異的なガンマグロブリンは、本発明のグラム陽性菌のＯ抗原に 対して特異的であるガンマグロブリンである。特に好ましいのは、エシェリキア ・コリ、シュードモナス・アエルギノーザ、クレブシェラ・ニューモニエ、クレ ブシェラ・オキシト力、およびクレブシェラ・オゼネ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　 ｏｚａｎａｅ）の０抗原に対して特異的であるガンマグロブリンである。

本発明はまた （ａ）本発明のリピドＡ類似体／免疫原性担体、および免疫原性担体と結合され ていることある少なくとも１種類のグラム陽性菌および／またはグラム陽性菌、 またはその抗原決定基で動物を免疫し、（ｂ）所望により段階（ａ）の免疫化段 階で動物を追加免疫し、（Ｃ）その動物の血漿をプールし、 （ｄ）その動物からガンマグロブリン画分を回収し、その画分がその細菌をオプ ソニン化し、Ｌ　Ｐ　Ｓを中和するのに有効であることからなる多価高度免疫カ ンマグロブリンの調製方法に関する。

本発明はさらに、本発明のリビドＡ／免疫原性担体のコンジュゲート体に対して 特異的なガンマグロブリンの有効中和量、およびＯ抗原特異的な多価高度免疫ガ ンマグロブリンの有効オプソニン化量をそのような処置を必要とする動物へ投与 することからなるグラム陽性菌による敗血症の処置方法を提供する。処置は予防 的であることができ、あるいは実際に細菌感染症に罹患している動物に実施でき る。一般に有効中和量は体重１ｋｇ当たり５０〜１０００ｍｇであると考えられ る。

好ましくは体重１ｋｇ当たりガンマグロブリン１００〜５００ｍｇを投与する。

オブ゛ノニン活性については体重１ｋｇ当たり５０〜１０００ｍｇの範囲が有効 であると考えられる。好ましくは体重１ｋｇ当たりガンマグロブリン１００〜５ ００ｍｇを投与し得る。

本発明はまた、１またはそれ以上の容器手段を厳密に隔離して収納し得る区画を もった担体からなり、ここで第１の容器には本発明のリピドＡ類似体／免疫原性 担体を含有することからなるグラム陽性菌による敗血症の処置のためのキットを 提供する。このキットはまた、少なべとも１種類のグラム陽性菌および／または グラム陽性菌、またはその抗原決定基を免疫原性担体と結合させて含有する少な くとももう１つの容器手段を含むことができる。グラム陽性菌および陽性菌は殺 滅され、あるいは弱毒化された細菌である。好ましいグラム陽性菌および陽性菌 は多価ワクチン中で選ばれたものである。所望によりアジュバントを含有する追 加的な容器手段を加え得る。

本発明はまた、第１の容器に本発明のリピドＡ類似体／免疫原性担体に特異的な カンマグロブリンを含有するキットを提供する。この場合、グラム陽性菌または グラム陽性菌、またはその抗原決定基に特異的なガンマグロブリンを含有する第 ２の容器を提供できる。好ましいグラム陽性菌および陽性菌は多価ワクチン中で 選ばれたものである。

ワクチンまたは高度免疫ガンマグロブリンの投与は、非経口的に、静脈内、筋肉 内、皮下、鼻腔内、またはその他の任意の好適な手段で実施し得る。好ましくは 投与は皮下または筋肉山手段による。投与量は年令、体重、もしあれば併用処置 の種類、および投与する抗原の性質によって変わり得る。一般にコンジュゲート 体は動物体重１ｋｇ当たりコンジュゲート体０．０００１〜２５．Ｃｌｎｇの用 量で投与し得る。初回の投与に続いて４週間後に追加免疫用量を投与して、免疫 原応答を増強し得る。感染症および敗血症の危険が存在しない限り、さらに４〜 ６週間毎に追加免疫用Ｉを投与し得る。

本発明の方法に有用である本発明のリピドＡ類似体／免疫原性担体のコンシュケ ート体およびその他の抗原性コンシュケート体は、カプセル、液体溶液、懸濁液 、またはエリキンルのような経口投与用形態、または溶液または懸濁液のような 滅菌液体形態で使用し得る。食塩水またはリン酸緩衝化食塩水のような任意の不 活性担体が好ましく使用され、あるいは本発明の方法で使用される化合物が、本 発明の方法の使用に好適な溶解性を有するような任意の担体が使用される。好ま しくはリビドＡ類似体／免疫原性担体のフンシュゲート体は凍結乾燥形態または 弱酸性緩衝溶液である。グラム陰性およびダラム陽性コンジュゲート体は好まし くは弱塩基性溶液で貯蔵する。そのような溶液は凍結して保存すると安定性が改 良され得る。ワクチン類は１回用量製剤形態、または大量ワクチン注射計画に使 用できる多回投与用フラスコであり得る。ワクチンの調製方法および使用方法に ついては、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ、マツグ・パ ブリッンング・カンパニー、イーストン、ＰＡ、オゾール（Ｏｓｏｌ）編（１９ ９０年）、およびニュー・トレンズ・アンド・デベロップメンツ・イン・ワクチ ンズ（Ｎｅｗ　Ｔｒｅｎｄｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｔｓ　ｉｎ　Ｖａｃ ｃｉｎｅｓ）、ホラ−（ｖｏｌｌｅｒ）ら編、ユニバーンティー・パーク・プレ ス社（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ）、ボルチモア（Ｂａｌｔ ｉ−ｍｏｒｅ）、ＭＤ（１９７８年）を参照せよ。

本発明のリビドＡ類似体／免疫原性担体のコンジュゲート体を含有する本発明の ワクチンは、さらにリビドＡ類似体に特異的な抗体産生を増強するアジュバント を含有し得る。そのようなアジュバントとして、フロイントの完全アジュバント のような種々の油性製剤、ＭＤＰとして知られているンペプチド、サポニン、水 酸化アルミニウム、ボルデテラ・バーツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒ ｔｕｓｓｉｓ）、脱リン酸化したリビトＡ、またはインターフェロン等が挙げら れるが、それだけには限定されない。

フロイントのアノユバントは免疫原物質と混合される鉱油と水とからなる乳剤で ある。フロイントのアノユバントは強力ではあるが、通常ヒトには投与されない 。その代わりにアジュバントミョウバン（ａｄｊｕｖａｎｔ　ａｌｕｍ）　（水 酸化アルミニウム）がヒトへの投与に使用され得る。フンシュゲート体は水酸化 アルミニウム上へ吸収され、注射後、徐々に放出され得る。

またリビドＡ類似体／免疫原性ペプチドのフンシュゲート体は、フラトン（Ｆｕ −１１ｅｒｔｏｎ）の方法（米国特許第４２３５８７７号）に従ってリポソーム 内に内包され得る。

以上、本発明について全般的に説明したが、理解を深めるため以下に実施例をあ げて本発明をさらに詳細に説明する。実施例は単に発明を説明するためのもので あって、特に言及しない限り発明の範囲を限定する目的をもつものではない。

衷礁例 ングマ・ケミカル・カンパ＝−［５１ｇｌＢａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　 ＭＯ，セントルイス］かう入手されるオクタ酢酸ゲンチオビオースをジクロロメ タンに溶解しく５・ｌ中、１ｇ）、５℃にて４５分間、氷酢酸［Ｆ１ｕｋａ］　 （１０＊Ｉ）中、３３％ＨＢｒで処理し、それをアセトブロモ誘導体に変換した 。その反応混合物の総量と同じ量のジクロロメタンを加え、得られた混合物を分 岐漏斗に移した。有機層を等量の重炭酸ナトリウム飽和溶液で洗浄しく３−４回 ）、次いで水２容量で洗浄した。次に、有機層をＭｇ５Ｏ，て乾燥し、濾過し、 溶媒留去してシロップ状物質を得た。ジクロロメタン及びジエチルエーテルがら アセトブロモゲンチオビオースを結晶化し、濾過し、減圧乾燥器にて乾燥した。

得られた結晶性化合物はＴＬＣにて単一のスポットを与え、Ｈ−Ｉ　ＮＭＲスペ クトルは正確であった。

アセトブロモゲンチオビオース（クロロホルム５ｍｌ中、５ｇ）をトリエライト （ｄｒｉｅｒｉｔｅ）　１　ｇ　［Ｗ＾、　Ｈａｗｏｎｄ　Ｄｒｉｅｒｉｔｅ　 Ｃｏ、コの存在下に２−アミノエタノール（クロロホルム１Ｍｌ中、約０．５ｇ ５０．５１／）とカップリングさせた。その混合物を室温で一晩撹拌し、濾過し た。得られたアミノエチルゲンチオビオース・ヘプタアセテート（ＡＧＨ）をま ず、溶出溶媒として酢酸エチル−エタノール溶媒混液（１９：１）を使用するノ リ力ゲル（１，６Ｘ３４ｃ転総量５０ｍ１）のカラムクロマトグラフィーによっ て精製した。両分は、溶、出させる酢酸エチル−エタノール（１９：１）を用い るＴＬＣによってスクリーニングした。アミノエチル誘導体を含有する画分をま とめ、減圧下に溶媒留去し、５５℃の温エタノールから生成物を結晶化させた。

結晶性化合物はＴＬＣにおいて単一のスポットを与え、その融点は１７６−１７ ７℃であった。元素分析はＣ，４９，４４％；Ｈ，６，０５％：Ｎ、２．１％　 （Ｃ２ｓＨ４ｏＯｚｓＮとしテノ計算値：Ｃ，４９，５６％：Ｈ，５，９４％： Ｎ、２．０６％）であった。

遊離カルボキシル基の数とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶解性とを増大さセ ルタメ、ＢＳＡ　（ＰＢＳ中、４−５ｍｇｈｌ　でｌｏ−５’Ｏｍｇ）　を１） Ｈ８９１：て無水コハク酸（５１Ｃｈｇｈｌタンパク質：＾１ｄｒｉｃｈ　Ｇｏ ｌｄ　Ｌａｂｅｌ）でゆっくりと処理した。濃水酸化ナトリウムを添加してその ｐＨを８−８．５に維持させた。次いで、その反応混合物を水に対して徹底的に 透析し、得られたスクシニル化ＢＳＡ　（Ｓｕｃ−ＢＳＡ）を凍結乾燥した。

タンパク質担体及びＡＧＨリガンドの両者を溶解できる溶媒はジオキサンである ことが判明した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボンイ ミド（ｌＯ＋＋ｇ：　ＥＤＡＣ）の存在下、２０％１．４−ジオキサン中にて、 ５ｕｃ−ＢＳＡ　（１（ｂｇ）をＡＧＨとカップリングした。そのｐＨをベーハ ー紙を用いて追跡し、希塩酸の添加によりそのｐＨを５−６に維持した。ＥＤＡ Ｃ（１０窮ｇ）を３０分間隔で３回さらに加えた。得られたコンジュゲート体（ Ｓｕｃ−ＢＳＡ−ＡＧＨ）を水に対して透析し、次いで凍結させた。フェノール −硫酸検定による糖の還元分析により、このコンジュゲート体が２７．４％のＡ ＧＨを含有することが示された。これはタンパク質１モル当たりおよそ３５モル のりガントとなる。

実施例２ 過酢酸ゲンチオヒオースーＤＴフンシュゲート体の製造ＥＤＡＣの存在下、２５ ％１．４−ジオキサン及び０．０５Ｍ　ＮａＣ１中にて、５ＳＶＩ［スイス国、 ベルン］から入手したジフテリア・トキソイド（ＤＴ）をＡＧＨ（実施例１に従 って入手した）にカップリングした。得られたコンジュゲート体（ＤＴ−ＡＧＨ ）を水に対して透析し、凍結乾燥した。分析は、１６％のコンツユゲート体がＡ ＧＨを含有していることを示した。

実施例３ ヘプタ酢酸ゲンチオビオースＣ１コンジュゲートワクチンの調製ジフテリア・ト キソイドのスクシニル化・ジフテリア・トキソイドのロットＭ（各１５０ｄ、３ 　、　０　ｍ　ｇ　７ｍ１）の２つのボトルの内容物を一緒にし、滅菌した０、 ０５Ｍ　ＮａＣ１溶液２０　Ｃｈｉを加え、最終容量５０　Ｃｈｉとした。無水 コハク酸（１，０ｇ、結晶、アルドリッチ）を撹拌下にゆっくりと加え、その間 は２時間、滅菌した３、０Ｍ水酸化ナトリウム溶液によってｐＨを８．０から８ ．５の間に維持させた。

次いで、得られた反応混合物を１．０Ｍ塩酸でｐＨ７，０に中和し、パイロジエ ン（発熱物質）不含水を３回取り換える透析を４８時間行った（３Ｘ１０Ｌ）。

透析した溶液を５０個の滅菌ボトルに分取し、滅菌条件下に凍結乾燥した。

ＴＮＢＳ試薬法［Ｈ，Ａ、　Ｋｅｍｐ及びＭ、　Ｒ，＾］ｏｒｇａｎ；　Ｊ、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、　９４：６５−７２（１９８６）コによって、得られ た物質を一級アミノ基の存在について試験した。利用可能な一級アミノ基の９５ ％が置換されていることが見いだされた。

アセトブロモゲンチオビオースの製造 結晶性オクタ酢酸ゲンチオビオース（２，０ｇ、シグマ）をジクロロメタン（９ ９＋％、５ｍｆ）に溶解し、１０　ＯＮ！容量丸底フラスコにて、得られた溶液 に氷酢酸（８ｍ／）中、３３％ＨＢｒを加えた。このフラスコを氷／水浴中に４ ５分間入れた。反応混合物を撹拌しながら、ジクロロメタン３０１ｉ＋を加え、 得られた混合物を分岐漏斗を使用し、冷水（３０ｍｌ）、重炭酸ナトリウム飽和 溶液（２×４０＊ｊ’）、及び冷水（４０ｍ／）で順次洗浄した。得られたノク ロロメタン層を無水硫酸ナトリウム（２，０ｇ）で乾燥し、４０℃又はそれ以下 の温度で回転エバポレーターにて蒸発乾固した。得られた乾燥生成物をジエチル エーテル（５ｍｌ＞に溶解し、室温にて１時間結晶化させ、次いで一晩５℃にて 放置した。得られた結晶化合物を濾過し、冷エーテルで洗浄し、乾燥器において 室温にて減圧下に乾燥した。収量・１．４ｇ（７０％）。この物質は溶媒として 酢酸エチル、ｎ−ヘキサン（２：　１）を用いるＴＬＣにて単一のスポットを与 えた（Ｒ，ｆ値：０．４３）。これは結晶アセトブロモゲンチオビオースであっ た。

アセトブロモゲンチオビオースの３−アミノプロパツールへのカップリング結晶 アセトブロモゲンチオビオース（１，０ｇ）を乾燥クロロホルム（５ｍｌ。

９９．９＋％）と混合し、この溶液に乾燥トリエライト（１，０ｇ）を加えた。

得られた混合物を撹拌し、３−アミノプロパツール（４００μｍ１９８％）を加 えた。反応バイアルをアルミ箔で包み、室温にて１６時間撹拌した。この反応混 合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた濾液を冷水（１０ｍｌ）で洗浄し、次 いでクロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、再び濾過した。清澄な濾液 を、洗浄したシリカゲルＧ−６０カラム（２，ＯＸ４０ｃｍ）に載せ、酢酸エチ ル：エタノール（３：　１）で溶出した。カラム画分は酢酸エチル：エタノール （１９；１）のＴＬＣによって試験し、Ｒｆ値０．６５で移動する成分を含有す る両分をまとめ、回転エバポレーターによって蒸発乾固した。

得られた乾燥生成物を、５０℃に暖めておいたエタノール（１０ｓ＆’）中に溶 解した。次いで、混合物を２時間かけてゆっくりと室温にまで冷却させた。アミ ノプロピルゲンチオビオース・ヘプタアセテート（ＡＰＧＨ）はこれらの条件で 結晶化した。この結晶性物質を濾過し、冷エタノール（５ｍｌ＞で洗浄し、乾燥 器において室温にて減圧下に乾燥した。収量は３５（ｂｇ　（３６％）であり、 融点は１６４−１６５℃であった。

元素分析（ＣｉｅＨｕＯ＋ｓＮとして）計算［：Ｃ，５０，２５％、Ｈ，６，０ ６％；Ｎ、２．　０２％実測値：Ｃ，４９，５０％；Ｈ，ｅ、１２％；Ｎ、１． 　９８％。

この最終化合物はアミノプロピルゲンチオビオース・ヘプタアセテート（ＡＰＧ 以下のすべての操作は滅菌層流フード内にて行った。

凍結乾燥したＳｕｃ、ＤＴの６つのボトル（各ボトル当たりＳｕｃ、ＤＴ　２５ ｍｇ）にパイロノエン不含水３．０１を加えた。ボトルから得たＳｕｃ、ＤＴ温 溶液まとめ、滅菌領　２２μｍ膜で濾過した。最終容量は１８ｍｌであった。１ ．４−ジオキサン（４、５ｍｊ）を領　２２μｍ膜で濾過し、それを先の溶液に 加え、２０％ジオキサンとした（総容量２２．　５Ｍ１）。

了ミノプロピルゲンチオビオース・ヘプタアセテ−１−（ＡＰＧＨ，１０１００ ｌを１．４−ジオキサン（４，Ｑｗｊりに溶解し、得られた溶液にパイロジエン 不含水（１６ｍｌ）を加え、２０％ジオキサンとした（２０ｍ／）。この溶液を ０．２２μｍ膜で滅菌濾過し、それをＳｕｃ、ＤＴの溶液に加えた。まとめた容 量は４２゜５Ｉであった。この混合物のｐＨを滅菌０．ＩＮ塩酸にて５．８に調 節した（オートクレーブ処理プローブを使用）。

１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤ Ｃ，１，０２ｇ）を上記の反応混合物に加え、滅菌０．ＩＮ塩酸の添加によって そのｐＨを５．５から５．６に１時間維持させた。１時間後、ＥＤＣ１，１０ｇ を加え、そのｐＨを５．４から５．５に１時間維持させた。次いで、反応混合物 を滅菌（オートクレーブ処理）した透析チューブに移し、滅菌したパイロジエン 不含水（４Ｘ　６　Ｌ）を４回交換する透析を３６時間行った。透析した溶液を 多重容量の滅菌バイアルに分配し、凍結乾燥した。これはＳｕｃ、ＤＴ−ＡＰＧ Ｈロット＃ＡＫＢ　Ｘ−２６であった。

このコンジュゲート体のハプテン量をフェノール硫酸法（Ｄｕｂｏｉｓら、　Ａ ｎａｌ、Ｃｈｅｒａ、　２８：３５０（１９５６））によって測定し、それが４ ，２％であることが判明した。この生成物の無菌性、毒性及び発熱性を常法によ り試験した。

実施例４ ゲンチオビオース−タンパク質担体コンジュゲート体のＬＰＳ特異的抗体への結 合 オクタ酢酸ゲンチオビオースは水に不溶であるが、このタンパク質コンジュゲー ト体は水に容易に溶解する。これらの可溶性フンシュゲート体の抗−リピドＡヒ トモノクローナル抗体（グラム陰性細菌間の顕著な抗原変異性に関与する側層の 結合を妨げるウリジン・５°−ジホスフェートガラクトース・４−エピメラーゼ 酵素が欠損している大腸菌０１１１　Ｈ４の３５突然変異体を用いて免疫した動 物の牌臓から人手されるエプスタイン・バール・ウィルス（ＥＢＶ）形質転換白 血球とへテロミエローマＳＨＭＡ６　（Ｈ４）との融合によって入手）への結合 能を酵素結合固相免疫検定（ＥＬＩＳＡ）によって試験した。第１表に示してい るように、ＢＳＡ−ゲンチオビオース・オクタアセテートとジフテリア・トキソ イド−ゲンチオビオース・オクタアセテートコンジュゲート体とは共に上記のヒ トモノクローナル抗体を結合できる。この実験により、上記のコンジュゲート反 応の間でも重要な結合エピトープは無傷のままで保持されていることが判明した 。

従って、リビドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート体を動物に投与すれば、 抗−リピドＡ抗体がインビボにおいて産生されることは当業者ならば予想できる はずである。

５ｕｃ−ＢＳＡ−ＡＧＨフンシュゲート体　２．　５００ＳＬＩＣ−ＢＳＡ一対 照　６４０ ＤＴ−ＡＧＨフンシュゲート体　４８ ＤＴ対照　０ エタノール中のＡＧＨ１，２８０ 大腸菌リビドＡ　２，５６０ Ｓｕｅ−ＤＴ−ＡＰＧＨ３，２００ 使用するミョウバンは［レソープタン（Ｒｅｈｓｏｒｐｔａｎ）Ｊと呼ばれる滅 菌懸濁液であり、＾ｒｍｏｕｒ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎ ｙから入手されるものである。この調製物は製造元が特記しているように２％Ａ 　Ｉ　２０３　（Ｗ／Ｖ）を有している。

レソープタン懸濁液（１０４ｍ／）を滅菌した０、９％ＮａＣ１（２２１＠１） で希釈し、希釈ミョウバン懸濁液３２５ｗ１を得た。この希釈ミョウノくン懸濁 液を滅菌バイアル（それぞれ５．　Ｃｈｉ＞に分配し、オートクレーブ処理（加 圧滅菌）した。この製剤は懸濁液１１１１当たりＡ−（ｚＯｓ　６．４ｍｇ又は アルミニウム金属３゜３８ｗｇを含有している。

ワクチンの組成 Ｓｕｃ、ＤＴ−ＡＰＧＨリピドＡ類似体Ｃ１−コンジュゲートワクチンは以下の 組成を有している： ハプテン　４．２％ タンパク１　８４％ 水分　１２％ ハプテン：タンパク質のモル比　４．２：１凍結乾燥ワクチンの各ボトル（１ｍ ｌ充填）は乾燥重量ベースでワクチン１．５１ｇを含有している。１回ヒト用量 はワクチン１００μｇである。従って、凍結乾燥ワクチンのロットＡＫＢ　Ｘ− ２６の各バイアル（１ｍｌ充填）は１５回分の用量を含有している。

ワクチンの製剤化 凍結乾燥ワクチンの各ボトルは、注射用水で調製された希釈ミョウバン懸濁液（ ５ｍＡ）のボトル、及びワクチン再構成のための滅菌０．９％ＮａＣＩ（５ｍＡ りのボトルを付随する。凍結乾燥ワクチンは滅菌０．　９％ＮａＣｎ４．　Ｏｍ ｌで再構成する。この溶液を希釈ミョウバン懸濁液３．５ｍｌと混合し、最終容 量７．　５ｍｆのワクチン製剤とする。この製剤は１１ｆｆ当たりワクチン２０ ０μｇ、及び１ｍ１当たりアルミニウム１．５７ｓ＋ｇを含有している。ヒト用 量はこのワクチン製剤Ｑ、５ｍｌであった。従って、１回ヒト用量はワクチン１ ００μｇ及びアルミニる。再構成したワクチンは２時間以内に使用する。ボトル 内に残ったワクチンは廃棄する。

除外基準 以下の基準を満たさないワクチンのロットは安全性及び発熱性の基準を満たす場 合であっても臨床試験から排除する：（ａ）　ハプテンとタンパク質とのモル比 は４．０：１又はそれ以上でなければならない。

（ｂ）４適間隔で行う２つの免疫の後における、アジュバントとしてミョウバン と共にウサギに投与するワクチン５０μｇ用量は、プレート抗原としてハプテン のＢＳＡコンンユゲート体を使用するＥＬＩＳＡによって測定する力価がハプテ ンよりも少なくとも２０倍高くあるべきである。

安定性 以下の５つの表はゲンチオビオース−トキソイドコンジュゲート体の安定性に関 するものである。ワクチンをマイナス（−）７０℃で保存する。それを解凍の２ 時間以内に使用し、その後に処理する。それは保存剤を含有していない。

第２表は、トキソイドから解離した遊離のハプテン量が３５分にわたって約５％ で一定であることを明らかに示している。第３表では、強い免疫原性が維持され ている証拠が示されている。第４表、５表及び６表はスクシニル化されているが コンジュゲートされていないトキソイドはハプテンに対して免疫応答を起こさず （第４表）、リビドＡフンシュゲート化ワクチンは保存７力月後に非常に免疫原 性であることを示している（第５表）。

第６表は、ウサギにおける用量応答検定から得られたデータを示している。この 実験は保存に必要な温度である一７０℃にて１年保存した後に行った。得られた データは１μｇ用量ては有効でなく、１０μｇ用量がより免疫原性であり、臨床 的に使用される用量を包含する５０及び１００μｇ用量が非常に免疫原性である ことを示している。

従って、水分量が高（でも、保存免疫原性のための推奨されている０℃以下の温 度は維持させる。

第２表 ロット＃ＡＫＢ　Ｘ−２６ 第４表 第５表 Ｓｕｃ、ＤＴ−ＡＰＧＨリビドＡ類似体コンジュゲートワクチンに対するウサギ 上記第６表において、データは終点の力価で表している。使用する抗原はＢＳ八 に対するヘプタ酢酸ゲンチオビオース・コンジュゲート体であった。動物は１、 及び１４日目に予防接種し、０及び２１日目に採血した。各用量は筋肉内投与す る５０μｇであった。終点力価は、各平板における対称試料の光学密度よりも少 なくとも３倍高い光学密度を与える血清の最大希釈度で計算した。

オクタ酢酸ゲンチオビオースタンパク質／ジフテリア・トキソイドコンジュゲー ト体を第７表に概略示す免疫計画に従ってウサギに投与した。次いで、ＥＬＩＳ Ａによって抗体力価を測定した。ウサギ１及び２から得た血清を、一連の抗原に 特異的な抗体について検定した。第８表は、ウサギ血清がＬＰＳ及びジフテリア ・トキソイドとの反応性は有しているが、ＡＰＧＨとの反応性はごく僅かである ことを示している。

スペーサー基を有しない破傷風トキソイド−ＡＰＧＨコンジュゲート体（ＴＴ− ＡＰＧ）（）に対しても、ウサギ血清を検定した。以下の第９表に示す結果は、 抗体がこのコンジュゲート体とも特異的であることを示しており、この抗体は分 子のＡＰＧＨ部分と反応することが確かめられた。

次に、煮沸したＪ５におけるＬＰＳに対する抗体特異性を特異的吸着実験によっ て測定した。各実験では、ウサギの血清を１＋５００に希釈し、それを１０％容 量のバック細胞で煮沸Ｊ５生物に２回吸着させた。最初の吸着は２時間行い、次 いて第２の吸着を一晩行った（両吸着ともに４℃）。Ｊ５生物をＧＬＣによって 分析し、カラクトースが不含であることが見いだされた。ウサギ１及び５の最終 採血由来の血清を、ＴＴ−ＡＰＧＨを使用するＥＬＩＳＡによって吸着前及び吸 着後に検定した。得られた結果を第１０表に示す。

ルドリッチ）を加えた占この混合物を室温で一晩撹拌した。

する両分をまとめ、蒸発乾固した。

ミルウォーキー）１７ｍＪを加えた。この混合物を室温にて一晩撹拌し、次いで それを破砕氷４００ｗ１中に注いだ。得られた沈殿物を濾取し、冷水で洗浄し、 減圧下に乾燥した（収量＋５．５ｇ）。

６’−〇−トリチルーゲンチオビオース・ヘプタアセテート１．０ｇを氷酢酸５ ．０■ｌに溶解し、得られた溶液に氷酢酸［Ｆ１ｕｋａ］中、３３％ＨＢｒを加 え、２％ＨＢｒとした。この混合物を氷水５　Ｃｈｉ中に注加し、得られた沈殿 物（トリチル・プロミド）を濾別した。

水溶液をジクロロメタン（５０ｍｌりで抽出し、有機層を重炭酸ナトリウム飽和 溶液、冷水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固した。得られた固 形生成物をジエチルエーテルから結晶化した。収量：１５ｏ■ｇ０Ｄ、６°−ヒ ドロキシ−ゲンチオビオース・ヘプタアセテート・スクシニル−ジフテリアトキ ソイド（ＳＵＣ−ＤＴ）コンジュゲート体の製造１−エチル−３−（３−ジメチ ルアミノプロピル）カルボジイミド（１８ｍｇ。

ＥＤＡＣ）の存在下、２０％１．４−ジオキサン［Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃ　Ｃｏ、　］中、スクシニル−ＤＴ　（７，２冒ｇ）を６′−ヒドロキ シ−ゲンチオビオース・ヘプタアセテート（３，５ｍｇ）とカップリングした。

このｐＨを０．ＩＮ塩酸を用いて５７から６０の間に維持させた。ＥＤＡＣ（１ ０璽ｇ）を３０分間隔でさらに２回加えた。得られたコンジュゲート体（６’− ０−５ｕｃＤＴ−ＧＨ）を水に対して透析し、次いで凍結乾燥した。フェノール −硫酸検定による糖還元の分析により、このコンジュゲート体は２０％の６°− ＨＧＨを含有することが示された。これはタンパク賀１モル当たり約３０モルの りガントである。

実施例７ ６°−０−５ｕｃＤＴ−ＧＨワクチンの免疫原性試験凍結乾燥コンジュゲート体 を滅菌したリン酸緩衝化食塩水に終濃度２００ａｇ／諺ｆまで溶解し、それを４ ℃にて酸化アルミニウム［Ｒｈｅｓｏｒｐｔａｒ］に一晩吸着させることにより 、免疫試験のためのワクチンを調製した。ＮＺＷウサギに５０μｇ用量でワクチ ンを筋肉内投与し、免疫計画の間、定期的に血清を採取した。ワクチンは０．３ ．６．９．１２及び１６週目に投与した。免疫原性は、プレート抗原として異種 破傷風コンジュゲートワクチン（１°−０−ＡＰＧＨ）を濃度２Ｉｇ／ｍｌで使 用するＥＬＩＳＡによって測定した。血清は３回処理し、１１５ｏ希釈度で始め 、光学密度（ＯＤ）が１．０である力価の光学密度（ＯＤ）単位にデータを変え る。各投与後１週間目に得た連続採血の結果を第１１表に示す。

第１１表 ６’−０−３ｕｅ−ＤＴ−ＧＨワクチンの免疫原性上記の結果は、ワクチンが免 疫した各ウサギにおいてリガンド特異的な抗体を誘導することを示している。こ れらの抗体の保護効果を測定するため、ブタのムチンのチャレンジモデルにおい てマウスを保護するそれの保護能を検定した。免疫したウサギから１４週目に得 た血清プール、又はワクチンを投与していない対照ウサギから入手した血清プー ルを滅菌濾過し、それをマウス１匹当たり１．Ｏ１ｌ用量でＮＳＡマウスに腹腔 内投与した。２時間後、ブタムチンの１４％調製物中に懸濁したシュードモナス ・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株１３４Ｖ Ａ４．８Ｘ１０３から４．８Ｘ１０’でマウスをチャレンジした。次の７２時間 にわたり１時間ごとにマウスを調査し、死亡時刻を記録した。以下の第１２表は これらの試験結果を示すものである。

蒼　薫 蒼 これらのデータは、そのワクチンが免疫原性であり、またそのワクチンがビルレ ントなグラム陰性細菌によるチャレンジに対してマウスを保護する抗体を産生さ せることを示している。

実施例８ 局在シュワルツマン反応からの能動及び受動的保護Ａ、　能動免疫：　３匹のウ サギを水酸化アルミニウムゲル（２０：１、Ｖ／Ｖ）中の５ｕｅ−ＤＴ−ＡＰＧ Ｈ（実施例３を参照のこと）で２回免疫し、次いで食塩水に入れた抗原を４回注 射した。局在シュワルツマン反応の進行を試験するため、各ウサギに大腸菌０６ 　ＬＰＳ　５Ｑμｇを皮下注射し、次いで２３時間後に食塩水０．１１中、ＬＰ Ｓ　２５μｇを静脈注射した。３匹の免疫ウサギのうち１匹のみが、出血反応は 無かったが紅斑を呈し、他方、非免疫ウサギ３匹では３匹ともに紅斑が陽性であ り、２匹が出血反応を示した。壊死は認められなかった。

Ｂ、　受動免疫：　血清を試験するウサギを完全フロイントのアジュバント中、 ５ｕｃ−ＤＴ−ＡＰＧＨ（実施例３）で１回免疫し、次いで食塩水中抗原を７回 注射した。これらの高度免疫ウサギから入手した血清は、ＴＴ−ＡＰＴＧＨを用 いるＥＬＩＳＡの測定では抗体力価１　：　６４００であった。

試験ウサギに食塩水０．２ｍｉ中、大腸菌０６　ＬＰＳ　１００μｇを皮肉注射 した。２１時間後、ウサギに高度免疫血清又は正常血清１５１１＋を静脈内投与 （耳静脈）し、２時間後に０２ｍｌ中ＬＰ５２０μｇの静脈注射によってチャレ ンジした。正常血清を投与した対照ウサギでは、５匹中４匹が出血し、１匹が組 織壊死を起こした。高度免疫血清を投与した５匹のウサギ中、１匹のみが陽性の 紅斑反応を示し、壊死の徴候はいずれも認められなかった。

従って、５ｕｃ−ＤＴ−ＡＰＧＨに対する能動及び受動免疫は共に、ＬＰＳ誘発 性のンユワルツマン反応に対して有意な保護を与え、さらには、インビボにおい て作用できる抗−ＬＰＳ抗体の誘導能がその組成物において確認された。

Ａ、　大腸菌リポポリサッカライドの調製　−大腸ｍ０１８を入手し、トリブチ カーゼ・ダイズブロス中で増殖させる。その細胞を遠心によって洗浄した。１ｅ ｓｔｐｈａｌら、　Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｅｒ　７：１４Ｂ−１５５（１９５ ２）のフェノール水沫の変法に従って、その細胞ペーストからフェノール抽出し 、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を調製し、次いでＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、 及びプロナーゼで順次処理し、さらに第２のフェノール抽出及びエタノール精製 透析及び凍結乾燥を行った。

Ｂ、　毒素への調製 ５ｈｉｌｏａｃｈ、　Ｊら、　ｉｎ　Ｙｕ、　Ｐ１編、　ＦｅｒＩＩｌｅｎｔａ ｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ≠戟O ｐｐｌｉａｔｊｏｎｓに記載されているようにして、毒素ＡをＰｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　１０３の培養物の上演から精製する。

Ｃ４大腸菌−毒素Ａコンジュゲート体の調製Ｃｈｕ、　Ｃ，Ｙ、ら、　Ｉｎｆｅ ｃ、Ｉｍｍｕｎ、　４０：２４５−２５６（１９８３）に記載されている方法に 従って、コンツユケート体を調製した。精製リポポリサ・ツカライドを脱毒素化 し、ポＩＪす・ツカライドをゲル濾過してサイズ化した。このポリサ・ツカライ ドを活性化し、アノピン酸ジヒドラジド又は他の適当なスペーサーを加える。誘 導化ボリサ・ツカライトを、タンパク質の活性化により担体タンノ々り質にコン ジュゲートする。この反応は２４−４８時時間待し、フンシュゲート体をクロマ トグラフィー１こよってｌＩ。

コンツユゲート反応体と分離する。

実施例９の大腸菌−毒素Ａコンジュゲート体を実施例７に記載してＬ）る免疫試 験のために調製した。結果は、このワクチンが免疫した各ウサギ１；１ノガンド 特異的抗体を誘導することを示した。これらの抗体の保護効果を測定するため、 ブタムチンチャレンジモデルにおいてマウスに対するそれらの保護能を実施例７ （こＳ己載しているようにして検定した。結果は実質的なオプソニン活性を示し てＬ）る。

クレブシェラ−ジフテリア・トキソイドコンジュゲート体の免疫原性試験クレブ シェラ・ニューモニア０１　（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　 ０１）を実施例９に記載しているようにして増殖させ、調製し、ＬＰＳを回収す る。５ＳＶＩ　［ベルン、スイス］から得たジフテリアトキソイド（ＤＴ）を実 施例９に記載しているようにＬＰＳにカップリングし、コンジュゲート体を得た 。次いで、このコンジュゲート体を１０−１２週令のマウスに注射し、コンジュ ゲート体に特異的な抗体を実施例７に記載しているように回収する。

このコンジュゲート体もニトロセルロース紙を用いる電気泳動によって分離し、 各マウスから抽出した血清をウェスターン・プロット法に従って抗体結合性に関 し試験した。試験したマウスの約７０％がこのコンジュゲート体に特異的である ことが判明した。

クレブンエラーＤＴコンジュゲート体に特異的な抗体を実施例７に記載している ブタムチンモデルに従ってさらに試験した。得られた結果は実質的なオプソニン 活性を示している。

実施例１２ ／ニードモナス・アエルギノサー毒素Ａフンシュゲート体の免疫原性試験ツユ− トモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、 Ｆｉｓｈｅｒ　Ｄｅｖｌｏｎ　ｌ型を、Ｂｌｕｍｅｎｔａｌｓ、　１．１．ら、 ＾ｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５３：２０１３−２０２ ０（１９８７jに従う て増殖させた。ＬＰＳ及び毒素を分離し、次いで実施例７に記載しているように コンツユゲート化した。このコンジュゲート体をマウスに注射し、コンジュゲー ト体に特異的な抗体を回収し、実施例１１に記載のようにして免疫学的に試験し た。得られた結果は実質的なオプソニン活性を示している。

実施例１３ スタフィロコッカス・アウレウス−毒素Ａコンジュア−１体スタフィｏ　：＋　 ’ｙカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　５型 及び８型をＦａｔｔｏｗ、＾１ｉｒａ、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍ ｕｎｉｔｙ　５８：２３６７−２３７４（１９９０）に記載のようにして増殖さ せた（これを引用によって本明細書に包含させる）。実施例７に記載のようにし て莢膜多１！（莢膜ポリサッカライド）を分離しコンジュゲート化し、スタフィ ロコッカス・アウレウス−毒素Ａコンジュゲートを得た。このコンシュ・デート 体をマウスに注射し、コンジュゲート体に特異的な抗体を回収し、実施例１１１ こ記載のようにして免疫学的に試験した。得られた結果は実質的なオプ゛ノニン 活性をポリサッカライド及びリピドＡ類似体をそれぞれ５０μｇ含有する実施例 ６．９及び１１−１３のコンジュゲート体をヒトボランティアζこ注射しｔ二。

約４−６週の後、ボランティアに再度ポリサ・ツカライド５０μｇ（各コンジュ ゲート体中）を注射した。各ホランテイアから血漿を回収し、受動赤血球凝集試 験又１ｔＥＬＩＳＡなどの他の適当な手段によって抗体をスクリーニングした。

最ｌＪ＼の抗体力価である５μｇ７ｍｌを示すボランティアは、応答ドナーと考 えられる。この応答ドナーから得た血漿をプールし、保存した。この血漿は注射 抗原に対する比較的高濃度の抗体を含有しており、高度免疫血清と呼ぶのが適当 なものである。好ましくは、この血漿を、有効なＬＰＳ中和活性及び細菌オブノ ニンイヒ活性２こつＧ）てもそれぞれツユワルツマン及びブタムチンモデルにお し）てさら１こスクリーニングした。次いで、高度免疫ガンマグロブリン調製物 をＣｏｈｎ画分方法を使用して調製したｃＣｏｈｎ、　Ｅ、Ｊら、　Ｊ、Ａｍｅ ｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　６８：４５９（１９４６）を参照のこと。要すれＩｉ １トナーにコンツユケート体を再度注射し、最小の抗体レベルを達成させる。

画面症の症状を持つ叡者から血液を採取した。直接ダラム株手法によってこの血 液を高濃度の細菌の存在について試験した。グラム陰性及びグラム陽性細菌を計 数した。画面症と同定された患者に実施例１４の高度免疫ガンマグロブ１ノンを ２５０ｍｇ／ｋｇで筋肉内注射した。注射しｔ二患者から６時間間隔で血液を採 取し、グラム陰性及びグラム陽性細菌を再度計数しｔこ。各採取間隔後（こ（ま グラム陰性及び陽性の両細菌の存在が有意に減少することが見いだされた。さら に、敗血症ショックの徴候が減少し、又は排除された。

実施例１６ クレブシェラ及び大腸菌ポリサッカライドの精製及びコンジュゲート調製反応式 ■に従い、以下のグラム醜性微生物のポリサッカライドを精製した：Ｐｓ’ｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ　Ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ　（血清型ＰＡ　ＦＤ−４、ＰＡ　ＦＤ −５、ＰＡ　ＦＤ−７、ＰＡ　ＩＮＴ−３、ＰＡ　ＩＮＴ−４）、Ｋｌｅｂｓｉ ｅｌｌａ　（Ｋ　Ｐ　Ｏ−２、ＫＰＯ−３）、及び大腸菌（０−１８）。

反応式■ 細菌細胞 ■ 温フェノール抽出 ↓ 粗製ＬＰＳ ↓ 加水分解 超遠心 濾過 凍結乾燥 ↓ 粗製ＰＳ ↓ セファデックスＧ−７５ によるゲル濾過 ↓ 凍結乾燥 ↓ 精製ＰＳ 第１−５図はＰ、アエロギノサ（ＦＤ−４、ＦＤ−７、ＩＮＴ−３及びＩＮＴ− ４）、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　（Ｋ　Ｐ　Ｏ−２）から入手したポリサ・ツ カライトのゲル濾過による溶出プロフィルのグラフをそれぞれ示している。

精製シュードモナスポリサッカライドをＥＤＡＣ反応によって誘導化し、また精 製クレブシェラポリサッカライドをＣｈｕら、　Ｉｎｆ、＆　Ｉｍｍｕｎ、５９ ：　４４５０−４４５８　（１９９１年１２月）に記載されている方法を使用す るＣＮＢＲ反応によって誘導化した。

この方法によれば、精製シュードモナスポリサッカライド（５，ｏ璽ｇ／ｍｆ水 ）を、ｐＨ装置にてＩＮ水酸化ナトリウムを用い、そのｐＨを１１．０とし、同 重量のＣＮＢｒ　（Ｉｇ／ｘｉ’アセトニトリル）を加える。１．ＯＮ水酸化ナ トリウムを用い、４℃にて６分間そのｐＨを１１．０に維持させる。０．５Ｍ重 炭酸ナトリウム中、同量の０．５Ｍ　ＡＤＨを加え、１．０Ｍ塩酸を用いてその ｐＨを８．５に調節する。得られた反応混合物を３−８℃にて一晩掻き混ぜ、３ −８℃にて０．２Ｍ　ＮａＣ１に対し透析した。外液を水と交換し、さらに水を ４回交換することで透析を２日間続行した。透析バッグの内容物を凍結乾燥し、 水（２０ｍ　ｇ　／菖１）に溶解し、Ｇ−２５セフアデツクスカラム（５Ｘ５０ ｃ＋＋）に通し、排出容量物を凍結乾燥した。

フンシュゲート Ｃｈｕら、　Ｉｎｆ、＆　Ｉｍｍｕｎ、　５９：４４５０−４４５８　（１９９ １年１２月）に記載されている方法を使用し、誘導化ポリサッカライドをタンパ ク質担体ＤＴ又はＢＳＡにカップリングした。この操作によれば、誘導化ポリサ ッカライド（ＰＳ）を水に２０ｍｇ／ｉｆで溶解し、それを等重量のＴＴ−２Ｃ ｈｇｈ１食塩水に加え、得られた混合物を水浴中に入れ、０．１Ｍ塩酸によって そのｐＨを５．６に調節する。ＥＤＡＣを０．０５Ｍに加え、そのｐＨをｐＨ装 置内にて４時間５．６に維持させる。得られた反応混合物を３−８℃にて０．２ Ｍ塩化ナトリウムに対し透析した（外液を２回毎日交換する）。この物質を１０ ℃にて１４，７００ｘＧで１時間遠心し、得られた上清を０．２Ｍ塩化ナトリウ ム−０，０１％チメロサール（Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）中ＣＬ−６Ｂセファロー スカラムに適用した。溶出容量物を３−８℃で保存した。

この操作法によって以下のコンジュゲート体を入手した：　ＦＤ４−ＰＳ−ＤＴ 。

ＦＤ５−ＰＳ−ＤＴＳＦＤ７−ＰＳ−ＤＴ、ＩＮＴ３−ＰＳ−ＢＳＡ、ＩＮＴ４ −ＰＳ−ＤＴ、ＫＰＯ２−ＰＳ−ＤＴ、及びＫＰＯ３−ＰＳ−ＤＴ０ＦＤ４−Ｐ Ｓ−ＤＴ、ＦＤ５−ＰシーＤＴ、ＦＤ７−ＰＳ−ＤＴ、ＩＮＴ４−ＰＳ−ＤＴ、 及びＫＰＯ２−ＰＳ−ＤＴコンジュゲート体の溶出プロフィルをそれぞれ第６− １０図に示す。

特定のカップリング剤との置換の程度を第１３表に示す。

それぞれのコンジュゲート体におけるポリサッカライド及びタンパク質担体の含 量を第１４表に示す。

実施例１７ マウスを以下の物質によって免疫した：１、ＫｐＯＩ　ポリサッカライド ２、ＫｐＯｌ−ＤＴ　ＨＭＷコンジュゲート体３、ＫｐＯｌ−ＤＴ　ＬＭＷコン ジュゲート体４、ＫｐＯｌ−ＤＴ混合コンジュゲート体５、ＫｐＯ１脱毒素ＬＰ Ｓ　（ｄＬＰＳ）６、ＤＴコンツユゲート化ＫｐＯ１ｄＬＰＳこれらの物質は、 脱毒性ＬＰＳを使用するＫｐＯｌ　ｄＬＰＳ以外はＣｈｕら、　Ｉｎｆｅｅｔ、 　Ｉ”ｍａ＋ｕｎ、　５９：４４５０−４４５８　（１９９１）に従って調製し た。ＨＭＷ及びＬＭＷは、ゲル濾過により得られる高分子量及び低分子量ポリサ ッカライドコンジュゲート体である（第１１図を参照）。

脱毒性ＬＰＳ−ＤＴコンジュゲート体を以下の操作によって入手した。

ＬＰＳからｄＬＰＳ ＬＰＳ　４０ｇをＯ，ＩＭ　ＮａＯＨ８ｍ／ｌ：溶解する。

６５℃に２時間加熱する。

冷却する。

６Ｍ塩酸でｐＨ７，０に中和する。

２日間透析する。

凍結乾燥する。

ｄＬＰＳのＤＴへのカップリング ｄＬＰＳ　１０１１ｇを水１ｉに溶解する。

ｐＨを確認し、それを５．５に調節する。

ＤＴ　１０１ｇを水１ｉに溶解する。

ｐＨを確認し、それを５．５に調節する。

ＥＤＣ４０■ｇをｄＬＰＳに加え、１分後にＤＴ溶液を加える。

ｐＨを確認し、それを０．ＩＮ塩酸で５．５に調節する。

３０分でｐＨを５．０にする。

１時間そのｐＨを維持させる。

さらにＥＤＣ４０ｇｇを加える。

３０分でｐＨを５．０にする。

１時間そのｐＨを５．０に維持させる。

２日間透析し、凍結乾燥する。

リン酸緩衝液中、セファロース６Ｂによりコンジュゲート体を精製する。

実施例１ 第１５表のデータは、コンジュゲート体によって免疫した動物から得られたＥＬ ＩＳＡ単位を表している。数字が高い程、免疫原性は高い。

食塩水　ＮＤ　ＮＤ　１．Ｉ ＫＩＩＯＩ　Ｐｓ単独　１　１．１　１Ｋｌ）０１　ＨＭＷコンジュゲート体　 １．８　１５．５　４１．９ＫｐＯＩ　ＬＭＷコンジュゲート体　ＮＤ　５１． ２　ＮＤＫｐＯｌ　ミックス　ＮＤ　２８．９　ＮＤＤＴ　プライム化　１１． ４ Ｅｘｐ、２ ＫｐＯｌ　ｄＬＰＳ　１．３　１２．３　２３．１ＫｐＯ１ｄＬＰＳ−ＤＴ　１ ．５　３．９　６．３下記の結果（第１６表）は、アビジン−ビオチンＥＬＩＳ Ａにて算定したＩｇＧ及びＩｇＭ力価の数学的平均である。５ｕｔｔｏｎら、　 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、８２：２１５−２２４（１９８５）を参照のこ と。マウス（２０）のグループは、ＨＭＷコンジュゲート体５μｇＰｓ／２週間 間隔で３回注射で免疫した。血清をスクリーニングし、高い応答血清（２０）を まとめ、１００ＥＬＩＳＡ単位に帰属し、各平板にて参照値として用いた。

結果は以下の事項を示している： （１）　Ｐｓ−ＤＴコンジュゲート体は、それらの分子サイズ及び不均質性にか かわらず強力である。

（２）ポリサッカライドのみでは免疫原性でなく、コンジュゲート体は免疫原性 である。

（３）本発明者らは、担体ブライミングによって示されるように免疫応答にＴ細 胞依存性を与えた。

（４）ｄＬＰＳのみに対する応答又はコンジュゲート操作の後の応答は同じであ る。

第一１６表 ＥＬＩＳＡデータの概要 クレブンエラ試験Ｎｏ、ＩＭ−９１−０６及びＩＭ−９１−０４大腸菌−ＰＳコ ンジュゲート体による動物免疫大腸菌の以下の０血清型は精巣外（ｅｘｔｒａ− ｔｅｓｔｉｎａｌ）の部位、主として血液がら得た最も優勢な単離物である。０ １．０２．０４．０６．０７．０８．０９．０１１．０１８．０２２．０２５． ０７５゜上記のデータは以下の試験から抽出したものである（第１７表）。

大腸菌由来のＰＳをｆｅｓｔｐｈａｌ、　Ｏ，及びＪａｎｎ、に、、　Ｍｅｔｈ 、Ｃａｒｂ、Ｃｈｅｗ　５：８３−９１　（１９６５）に従って、フェノール− 水抽出しさらに精製することで単離した。得られた大腸菌単離体由来のＰＳを以 下のようにして免疫原性担体とコンジュゲート化した：コンジュゲート化 工程Ｉ Ｒ−Ｏｆ（＋　ＣＮＢＲ−−−−６分−−−−−−−−＋　Ｈ２Ｎ−ＮＦＩ−α １−（ＣＨｚ）４−Ｃｏ−ＮＨ−ＮＪ−−−−−−−−ＲＣ−ＮＨＮＨ２ＣＯ（ ＣＨ２）４ＣＯＮＨＮＨ２（ＰＳ−ＡＨ）工程２ ＋ タンパク質−ＣＯＯＩＩ　＋　ＰＳ−＾Ｈ−−−−−−→カルボジイミド（ＥＤ ＡＣ）　−−−−タンパク質−ＣＯＮＨＮＨＣＯ（ＣＨ２）４ＣＯＮＨＮＨ−Ｃ Ｆ３夕〉バク質−ＰＳコンジュゲート体それぞれのＡＤＨ及びタンパク質の相対 量を以下の第１８表に示す。

第１８表 以下の動物プロトコールを次に示すように改作した：１）　ＰＳ対コンジュゲー ト体の免疫原性：２）２回目注射のブースタ一応答：及び３）担体プライミグ応 答 各グループ１０匹の動物をＰＳ　２．　５μｇ単独、又はＤＴとコンジュゲート させたＰＳ　２．　５μｇを用いて免疫した。動物は２適間隔で１．２又は３回 免疫し、最後の免疫の後１通口に採血した。

参照血清は、１０−２０匹の動物を５μｇ／用量×３（２適間隔）で免疫して入 手した。これらのマウスから得られた血清をプールし、１００ＥＩｊＳＡ単位と 帰属した。

マウスから得た血清をアビジン−ビオチン基礎ＥＬＩＳＡによって別々に分析し た。各平板には参照及び試験血清が２つ含有されている。

データ（第１９表）はＥＬＩ　ＳＡ単位の数学的平均で表している。

結　果 Ａ）ポリサッカライド単独では免疫原性でない。

Ｂ）コンジュゲート体は免疫原性であり、Ｔ細胞依存性免疫応答を示した（ブー スタ一応答及び担体ブライミグ）。

第２０表のデータは、大腸菌〇−特異的ＰＳの交叉反応性の程度を測定した結果 を示す（各血清型に特異的な抗体を他の血清型との交叉反応性について試験した ）。

１）　３つの注射グループのうち高い応答体を、別のＰＳでそれぞれ被覆した平 板にて試験した。適当な参考物質を各平板に使用した。

２）結果は、適当な参考物質を１００Ｕとして使用し、ＧＭＥＬＩ　ＳＡ単位で 表している。

＊このタイプは例外的に高いバックグランドである。

結　論 コンジュゲート体は血清型−特異的な抗体を惹起させる。

交叉反応があるにしても、それはバックグランドよりも低い。

次に、４つの大腸菌ＰＳＡ−コンジュゲート体を含有する４価ワクチンを、ＰＳ 単独に対してマウスに注射した。次いで、各血清型の免疫原性応答を測定した（ 第２１表）。

１、ＰＳ単独では免疫原性でない。

２　コンツユゲート体は、（ａ）　免疫原性であり、（ｂ）　ブースタ一応答を 示し、（ｃ）　担体ブライミグを示す。

３　交叉反応はあったとしても極めて低い。

４　多価ＰＳワクチンは依然として免疫原性でない。

５　多価ワクチンでは、コンツユゲート体は一価ワクチンの場合と同じ強度を示 した。

ユニまで本発明を十分に説明してきたが、当業者にはこれが組成、濃度、製剤及 び他のパラメーターについて広い等値範囲が本発明の範囲又は態様を逸脱するこ とな〈実施できることは理解されよう。本明細書にて引用するすべての特許及び 刊行物はそれらすべてが完全に本明細書に包含される。

国際調査報告 −〇ｒｌＩＩＩＩ＋−＾ｐｐＨ＊ｍｅ＋＋　Ｎｏ心ＡＩＩ＊２７６２０１３Ｉｎ ｔ＊ｍａｔＩｏｎｊｌ＾ｐｐｌＩｃａａｏｎＮｏ、ＰＣＴＡＪＳ１１２１０２０ ９３Ｐ（Ｔ／ＩｓＡ／２０４ ＰＣＴｎＳＡＩ２０４　’°ｔｅｍｓｔ＋ｏｎ＊ＩＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎ ｏ、　ＰＣＴＡｊＳ９２１０２０９３フロントページの続き （７２）発明者　バタチャルジー、アプルバアメリカ合衆国メリーランド２０８ ７９、ガイサースバーグ、カリプソ・レーン８６０５番

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１及びＲ３は同一又は異なっていてよく、水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル 基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ） −Ｃ３−Ｃ１８アシル基、及び免疫原性担体との連鎖基の中から選ばれる基であ り、Ｒ２はＣ２−Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び ３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から選ばれる基 であり、Ｒ４は水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、ホスフェート基、又は免疫原性担 体との連鎖基である。 但し、Ｒ１、Ｒ３又はＲ４のうち１つが免疫原性担体との連鎖基であり、該連鎖 基はリピドＡ類似体の動物における免疫応答刺激能を実質的に妨害しないもので ある。］ で示されるリピドＡ類似体を含有するリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲ ート体、 （ｂ）免疫原性担体とコンジュゲートされていることある少なくとも１つのグラ ム陰性菌又はその抗原決定基、 （ｃ）製薬的に許容され得る担体、及び（ｄ）要すれば、アジュバント を含有する多価ワクチン。
2. ２．該リピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート体が式：▲数式、化学式、 表等があります▼ ［式中、Ａは免疫原性担体であり、 ｍは０又は１であり、 ｎは１又は２であり、 ｐは１から２００であり、 ＬはリピドＡ類似体の動物における免疫応答の特徴的刺激能を実質的に妨害しな いリンカー基であり、 Ｒ１及びＲ３は同一又は異なっていてよく、水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、３− ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ ３−Ｃ１８アシル基の中から選ばれる基であり、Ｒ２はＣ２−Ｃ１８アシル基、 ３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ） −Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から選ばれる基であり、Ｒ４は水素、Ｃ２−Ｃ１６ アシル基、又はホスフェート基である］で示されるコンジュゲート体であって、 動物に投与した場合にＬＰＳに対する能動免疫を誘導するものである請求項１に 記載の多価ワクチン。
3. ３．該リンカー基が−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨ−［ここに、ｑは２−３］である請求 項２に記載の多価ワクチン。
4. ４．Ｌが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｑは２−５であり、ｘは２−１２である］で示される基である請求項２ に記載の多価ワクチン。
5. ５．Ｌが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｙは１−３である］ で示される基である請求項２に記載の多価ワクチン。
6. ６．該免疫原性担体が、ウシ血清アルブミン、ジフテリア・トキソイド、エデス チン、Ａ毒素及びコレラゲノイドの中から選ばれるタンパク質である請求項１に 記載の多価ワクチン。
7. ７．該リピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート体が式：▲数式、化学式、 表等があります▼ ［式中、Ａは免疫原性担体であり、 ｍは０又は１であり、 ｐは１から２００であり、 ＬはリピドＡ類似体の動物における免疫応答の特徴的刺激能を実質的に妨害しな いリンカー基であり、 Ｒ１及びＲ３は、水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８ア シル基、及び３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中か ら選はれる基であり、 Ｒ２はＣ２−Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び３− （Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から選はれる基であ り、Ｒ４は水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、又はホスフェート基である］で示され るコンジュゲート体であって、動物に投与した場合にＬＰＳに対する能動免疫を 誘導するものである請求項１に記載の多価ワクチン。
8. ８．免疫原性担体がウシ血清アルブミン、ジフテリア・トキソイド、エデスチン 、Ａ毒素及びコレラゲノイドの中から選ばれるタンパク質である請求項７に記載 の多価ワクチン。
9. ９．該リンカー基が−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨ−［ここに、ｑは２−５］である請求 項７に記載の多価ワクチン。
10. １０．該リンカー基が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｑは２−５であり、ｘは２−１２である］で示される基を含有する請求 項７に記載の多価ワクチン。
11. １１．Ｌが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｙは１−３である］ で示される基である請求項７に記載の多価ワクチン。
12. １２．該リピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート体が式：▲数式、化学式 、表等があります▼ ［式中、ｐは１から２００である］ で示されるものである請求項１に記載の多価ワクチン。
13. １３．該リピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート体が式：▲数式、化学式 、表等があります▼ ［式中、ｐは１から２００である］ で示されるものである請求項１に記載の多価ワクチン。
14. １４．該リピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート体が式：▲数式、化学式 、表等があります▼ ［式中、Ａは免疫原性担体であり、 ｍは０又は１であり、 ｎは１又は２であり、 ｐは１から２００であり、 ＬはリピドＡ類似体の動物における免疫応答の特徴的刺激能を実質的に妨害しな いリンカー基であり、 Ｒ１及びＲ３は同一又は異なっていてよく、水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、３− ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ ３−Ｃ１８アシル基の中から選ばれる基であり、Ｒ２はＣ２−Ｃ１８アシル基、 ３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ） −Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から選はれる基であり、Ｒ４は水素、Ｃ２−Ｃ１８ アシル基、又はホスフェート基である］で示されるコンジュゲート体であって、 動物に投与した場合にＬＰＳに対する能動免疫を誘導するものである請求項１に 記載の多価ワクチン。
15. １５．Ｌが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［ここに、ｘは２−１２である］ で示される基である請求項１４に記載の多価ワクチン。
16. １６．該免疫原性担体がウシ血清アルブミン、ジフテリア・トキソイド、エデス チン、Ａ毒素及びコレラゲノイドの中から選ばれるタンパク質である請求項７に 記載の多価ワクチン。
17. １７．該リピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート体が式：▲数式、化学式 、表等があります▼ ［式中、Ａは免疫原性担体であり、 ｍは０又は１であり、 ｐは１から２００であり、 ＬはリピドＡ類似体の動物における免疫応答の特徴的刺激能を実質的に妨害しな いリンカ−基であり、 Ｒ１及びＲ３は水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシ ル基、及び３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から 選はれる基であり、 Ｒ２はＣ２−Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び３− （Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から選ばれる基であ り、Ｒ４は水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、又はホスフェート基である］で示され るコンジユゲート体であって、動物に投与した場合にＬＰＳに対する能動免疫を 誘導するものである請求項１に記載の多価ワクチン。
18. １８．該免疫原性担体がウシ血清アルブミン、ジフテリア・トキソイド、エデス チン、Ａ毒素及びコレラゲノイドの中から選ばれるタンパク質である請求項１７ に記載の多価ワクチン。
19. １９．該リンカー基が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［ここに、ｘは２−１２である］ で示される基である請求項１７に記載の多価ワクチン。
20. ２０．該リビドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート体が式：▲数式、化学式 、表等があります▼ ［式中、ｐは１から２００である］ で示される請求項１に記載の多価ワクチン。
21. ２１．該リピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲート体が式：▲数式、化学式 、表等があります▼ ［式中、ｐは１から２００である］ で示される請求項１に記載の多価ワクチン。
22. ２２．グラム陰性菌がエシェリヒア・コリ、シュードモナス・アエルギノサ、ク レブシエラ・ニューモニア、クレデシエラ・オキシトカ、又はクレブシエラ・オ ゼネ、又はそれらの抗原性決定基である請求項１に記載の多価ワクチン。
23. ２３．該成分（ｂ）が莢膜多糖である請求項１に記載の多価ワクチン。
24. ２４．（ｅ）免疫原性担体とコンジュゲートされていることある、少なくとも１ つのグラム腸性菌、又はその抗原性決定基をさらに含有している請求項１に記載 の多価ワクチン。
25. ２５．グラム陽性菌がミクロコッカス、ストレプトコッカス又はスタフィロコッ カスである請求項２４に記載の多価ワクチン。
26. ２６．該成分（ｅ）が莢膜多糖である請求項２４に記載の多価ワクチン。
27. ２７．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１及びＲ３は同一又は異なっていてよく、水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル 基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ） −Ｃ３−Ｃ１８アシル基、及び免疫原性担体との連鎖基の中から選ばれる基であ り、Ｒ２はＣ２−Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び ３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から選ばれる基 であり、Ｒ４は水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、ホスフェート基、又は免疫原性担 体との連鎖基である。 但し、Ｒ１、Ｒ３又はＲ４のうち１つが免疫原性担体との連鎖基であり、該連鎖 基はリピドＡ類似体の動物における免疫応答刺激能を実質的に妨害しないもので ある。］ で示されるリピドＡ類似体を含有するリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲ ート体に特異的なガンマグロブリン及び少なくとも１つのＯ抗原に特異的なガン マグロブリンを含有する、ＬＰＳを中和しグラム陰性菌をオプソニン化するのに 有効である多価高度免疫ガンマグロブリン。
28. ２８．Ｏ抗原特異的なガンマグロブリンがエシェリヒア・コリ、シュードモナス ・アエルギノサ、クレブシエラ・ニューモニア、クレブシエラ・オキシトカ、又 はクレブシエラ・オゼネに特異的である請求項２７に記載の多価高度免疫ガンマ グロブリン。
29. ２９．少なくとも１つのグラム陽性菌に特異的であるガンマグロブリンをさらに 含有することを特徴とする、ＬＰＳを中和し少なくとも１つのグラム陰性菌及び 少なくとも１つのグラム陽性菌をオプソニン化するのに有効である請求項２７に 記載の多価高度免疫ガンマグロブリン。
30. ３０．ガンマグロブリンがミクロコッカス、ストレプトコッカス及びスタフィロ コッカスの中から選ばれる少なくとも１つのグラム陽性徴生物に特異的である請 求項２９に記載の多価高度免疫ガンマグロブリン。
31. ３１．（ａ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１及びＲ３は同一又は異なっていてよく、水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル 基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ） −Ｃ３−Ｃ１８アシル基、及び免疫原性担体との連鎖基の中から選ばれる基であ り、Ｒ２はＣ２−Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び ３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から選ばれる基 であり、Ｒ４は水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、ホスフェート基、又は免疫原性担 体との連鎖基である。 但し、Ｒ１、Ｒ３又はＲ４のうち１つが免疫原性担体との連鎖基であり、該連鎖 基はリピドＡ類似体の動物における免疫応答刺激能を実質的に妨害しないもので ある。］ で示されるリピドＡ類似体を含有するリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲ ート体及び、免疫原性担体にコンジュゲートされていることある少なくとも１つ のグラム陰性菌又はその抗原決定基によって動物を免疫し、（ｂ）工程（ａ）の 免疫工程によって該動物を所望によりブースター免疫し、（ｃ）該動物から血漿 を採取し、そして（ｄ）該細菌をオプソニン化しＬＰＳを中和するに有効なガン マグロブリン画分を核動物から回収する、 ことを特徴とする多価高度免疫ガンマグロブリンを調製する方法。
32. ３２．（ａ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１及びＲ３は同一又は異なっていてよく、水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル 基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ） −Ｃ３−Ｃ１８アシル基、及び免疫原性担体との連鎖基の中から選ばれる基であ り、Ｒ２はＣ２−Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び ３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から選ばれる基 であり、Ｒ４は水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、ホスフェート基、又は免疫原性担 体との連鎖基である。 但し、Ｒ１、Ｒ３又はＲ４のうち１つが免疫原性担体との連鎖基であり、該連鎖 基はリピドＡ類似体の動物における免疫応答刺激能を実質的に妨害しないもので ある。］ で示されるリピドＡ類似体を含有するリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲ ート体、免疫原性担体にコンジュゲートされていることある少なくとも１つのグ ラム陰性菌又はその抗原決定基及び少なくとも１つのグラム陽性菌又はその抗原 決定基によって動物を免疫し、 （ｂ）工程（ａ）の免疫工程によって該動物を所望によりブースター免疫し、（ ｃ）該動物から血漿を採取し、そして（ｄ）該グラム陰性菌及びグラム陽性菌を オプソニン化しＬＰＳを中和するに有効なガンマグロブリン画分を該動物から回 収する、ことを特徴とする多価高度免疫ガンマグロブリンを調製する方法。
33. ３３．（ａ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１及びＲ３は同一又は異なっていてよく、水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル 基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ） −Ｃ３−Ｃ１８アシル基、及び免疫原性担体との連鎖基の中から選ばれる基であ り、Ｒ２はＣ２−Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び ３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から選ばれる基 であり、Ｒ４け水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、ホスフェート基、又は免疫原性担 体との連鎖基である。 但し、Ｒ１、Ｒ３又はＲ４のうち１つが免疫原性担体との連鎖基であり、該連鎖 基はリピドＡ類似体の動物における免疫応答刺激能を実質的に妨害しないもので ある。］ で示されるリピドＡ類似体を含有するリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲ ート体及び、免疫原性担体にコンジュゲートされていることある少なくとも１つ のグラム陰性菌又はその抗原決定基によって動物を免疫し、（ｂ）工程（ａ）の 免疫工程によって該動物を所望によりブースター免疫し、（ｃ）該動物から血漿 を採取し、そして（ｄ）該細菌をオプソニン化しＬＰＳを中和するに有効なガン マグロブリン画分を該動物から回収する、 ことによって入手される多価高度免疫ガンマグロブリン。
34. ３４．（ａ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１及びＲ３は同一又は異なっていてよく、水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル 基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ） −Ｃ３−Ｃ１８アシル基、及び免疫原性担体との連鎖基の中から選ばれる基であ り、Ｒ２はＣ２−Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び ３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から選ばれる基 であり、Ｒ４は水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、ホスフェート基、又は免疫原性担 体との連鎖基である。 但し、Ｒ１、Ｒ３又はＲ４のうち１つが免疫原性担体との連鎖基であり、該連鎖 基はリピドＡ類似体の動物における免疫応答刺激能を実質的に妨害しないもので ある。］ で示されるリピドＡ類似体を含有するリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲ ート体、免疫原性担体にコンジュゲートされていることある少なくとも１つのグ ラム陰性菌又はその抗原決定基及び少なくとも１つのグラム陽性菌又はその抗原 決定基によって動物を免疫し、 （ｂ）工程（ａ）の免疫工程によって該動物を所望によりブースター免疫し、（ ｃ）該動物から血漿を採取し、そして（ｄ）該グラム陰性菌及びグラム陽性菌を オプソニン化しＬＰＳを中和するに有効なガンマグロブリン画分を該動物から回 収する、ことを特徴とする多価高度免疫ガンマグロブリンを調製する方法。
35. ３５．グラム陰性菌敗血症を処置する方法であって、式：▲数式、化学式、表等 があります▼ ［式中、Ｒ１及びＲ３は同一又は異なっていてよく、水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル 基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ） −Ｃ３−Ｃ１８アシル基、及び免疫原性担体との連鎖基の中から選ばれる基であ り、Ｒ２はＣ２−Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び ３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から選ばれる基 であり、Ｒ４は水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、ホスフェート基、又は免疫原性担 体との連鎖基である。 但し、Ｒ１、Ｒ３又はＲ４のうち１つが免疫原性担体との連鎖基であり、該連鎖 基はリピドＡ類似体の動物における免疫応答刺激能を実質的に妨害しないもので ある。］ で示されるりピドＡ類似体を含有するリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲ ート体に特異的な高度免疫ガンマグロブリンの有効中和量、及びＯ抗原特異的な ガンマグロブリンの有効オプソニン化量を含有する多価高度免疫ガンマグロブリ ンを、このような処置を必要としている動物に投与することを特徴とする方法。
36. ３６．グラム陰性又はグラム陽性菌敗血症を処置する方法であって、式：▲数式 、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１及びＲ３は同一又は異なっていてよく、水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル 基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ） −Ｃ３−Ｃ１８アシル基、及び免疫原性担体との連鎖基の中から選はれる基であ り、Ｒ２はＣ２−Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び ３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から選はれる基 であり、Ｒ４は水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、ホスフェート基、又は免疫原性担 体との連鎖基である。 但し、Ｒ１、Ｒ３又はＲ４のうち１つが免疫原性担体との連鎖基であり、該連鎖 基はリピドＡ類似体の動物における免疫応答刺激能を実質的に妨害しないもので ある。］ で示されるリピドＡ類似体を含有するリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲ ート体に特異的な高度免疫ガンマグロブリンの有効中和量、グラム陰性菌特異的 なガンマグロブリンの有効オプソニン化量、及びグラム陽性菌特異的なガンマグ ロブリンの有効オプソニン化量を含有する多価高度免疫ガンマグロブリンを、こ のような処置を必要としている動物に投与することを特徴とする方法。
37. ３７．１つ又はそれ以上の容器手段が厳密に隔離されて収容されるよう区画化さ れたキャリアー手段を含有する、グラム陰性又はグラム陽性菌敗血症を処置する ためのキットであって、第１の容器が式：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１及びＲ３は同一又は異なっていてよく、水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル 基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ） −Ｃ３−Ｃ１８アシル基、及び免疫原性担体との連鎖基の中から選ばれる基であ り、Ｒ２はＣ２−Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び ３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から選ばれる基 であり、Ｒ４は水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、ホスフェート基、又は免疫原性担 体との連鎖基である。 但し、Ｒ１、Ｒ３又はＲ４のうち１つが免疫原性担体との連鎖基であり、該連鎖 基はリピドＡ類似体の動物における免疫応答刺激能を実質的に妨害しないもので ある。］ で示されるリピドＡ類似体を含有するリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲ ート体を含有し、及び少なくとも１つの別の容器手段が免疫原性担体にコンジュ ゲートされていることある少なくとも１つのグラム陰性又はグラム陽性菌又はそ れらの抗原決定基を含有しているキット。
38. ３８．１つ又はそれ以上の容器手段が厳密に隔離されて収容されるよう区画化さ れたキャリアー手段を含有する、グラム陰性又はグラム陽性菌敗血症を処置する ためのキットであって、第１の容器手段が式：▲数式、化学式、表等があります ▼ ［式中、Ｒ１及びＲ３は同一又は異なっていてよく、水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル 基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ） −Ｃ３−Ｃ１８アシル基、及び免疫原性担体との連鎖基の中から選ばれる基であ り、Ｒ２はＣ２−Ｃ１８アシル基、３−ヒドロキシＣ３−Ｃ１８アシル基、及び ３−（Ｃ２−Ｃ１２アシルオキシ）−Ｃ３−Ｃ１８アシル基の中から選ばれる基 であり、Ｒ４は水素、Ｃ２−Ｃ１８アシル基、ホスフェート基、又は免疫原性担 体との連鎖基である。 但し、Ｒ１、Ｒ３又はＲ４のうち１つが免疫原性担体との連鎖基であり、該連鎖 基はリピドＡ類似体の動物における免疫応答刺激能を実質的に妨害しないもので ある。］ で示されるリピドＡ類似体を含有するリピドＡ類似体／免疫原性担体コンジュゲ ート体に特異的な高度免疫ガンマグロブリンを含有し、及び少なくとも１つの別 の容器手段が少なくとも１つのグラム陰性又はグラム陽性菌又はそれらの抗原決 定基に特異的な高度免疫ガンマグロブリンを含有するキット。
39. ３９．該第１の容器手段が、少なくとも１つのグラム陰性菌又はグラム陽性菌又 はそれらの抗原決定基に特異的な高度免疫ガンマグロブリンをさらに含有してい る請求項３８に記載のキット。