JPH06340550A - 改良されたオリゴ糖結合体ワクチン - Google Patents

改良されたオリゴ糖結合体ワクチン

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JPH06340550A JP3270517A JP27051791A JPH06340550A JP H06340550 A JPH06340550 A JP H06340550A JP 3270517 A JP3270517 A JP 3270517A JP 27051791 A JP27051791 A JP 27051791A JP H06340550 A JPH06340550 A JP H06340550A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明はオリゴ糖結合体ワクチンの改良され
た製造方法に関するものである。本発明の他の面では、
莢膜多糖に応答する単一特異性および均質免疫を誘発す
るオリゴ糖ワクチンが製造される。 【効果】 本発明の特定態様は一般的な血清型の肺炎連
鎖球菌に対する免疫性を誘発するワクチンを提供するも
のである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】１．導入 本発明は、オリゴ糖結合体ワクチン類の改良された製造
方法に関するものである。本発明の別の面では、莢膜多
糖に対する単一特異性の均質な免疫応答を誘発するオリ
ゴ糖ワクチン類が製造される。本発明の特定態様は、小
児科患者並びに初老患者および虚弱または疾病により免
疫が減少している患者（例えば、エイズ患者も含む）で
の使用において特に重要な肺炎連鎖球菌の一般的血清型
に対する免疫を誘発するワクチン類を提供するものであ
る。
【０００２】２．発明の背景 ２.１.肺炎連鎖球菌により引き起こされる疾病 肺炎球菌（肺炎連鎖球菌）は、普通は対または短鎖中で
成長するグラム−陽性の莢膜化された球菌である。双球
菌形では、隣接限界が取り囲んでおりそして反対の端部
が僅かに尖っていて、有機体に小槍形を与えている。
【０００３】肺炎球菌は、莢膜を形成する複合多糖類に
基づいて血清型に分割することができる。８４血清型は
型−特異性抗血清であるノイフェルド膨化反応に対する
露呈により同定されている。全てのものが人間に対して
病原性であるが、型１、３、４、７、８、および１２が
最も頻繁に臨床的診療において遭遇する。型６、１４、
１９、および２３はしばしば子供で肺炎および中耳炎を
引き起こすが、大人ではそれほど一般的ではない（オー
ストリアン(Austrian)、１９８３、「ハリソンズ・プリ
ンシプルス・オブ・インターナル・メディスン(Harriso
n's Principlesof Internal Medicine)」中、ピーター
スドルフ(Petersdorf)他、編集、１０版、マックグロー
・ヒル・ブック・カンパニー、ニューヨーク、９１８−
９２２頁）。特に、肺炎球菌は子供の肺炎、敗血症、お
よび髄膜炎に対して応答する３種の主要病原体のうちの
１種である（マクミラン(McMillan)、１９８２、「コア
・テキストブック・オブ・ペディアトリックス(Core Te
xtbook of Pediatrics)」中、カヤ(Kaye)他、編集、２
版、Ｊ.Ｂ.リッピンコット・カンパニー、フィラデルフ
ィア、４９８頁）。
【０００４】２.２.肺炎球菌ワクチン類 進行中の肺炎球菌感染の平均的危険性より高い個体に
は、例えば心臓疾病の如き慢性の全身的病気、慢性の肺
臓気管疾病、肝臓疾病、腎不全、および悪性腫瘍が包含
される。これらの個体は肺炎球菌感染に対してワクチン
処理することが推奨される。この目的用に、肺炎球菌型
１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１
０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８
Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３
３Ｆ（これらは米国および世界の残りの国々における重
大な肺炎球菌疾病の９０％に応答する血清型または群を
含んでいる）の莢膜多糖類からなる２３種類のワクチン
類が入手可能である（ニューモヴァックスRメルク、シ
ャープ・アンド・ドーメ、およびイミューンR、レデル
レ・ラボラトリース）。６才以下の子供では種々の莢膜
抗原に対する免疫学的応答は免疫系の熟成特性の結果と
して種々の時点で生じしかも予防は成人で観察されるも
のより短い期間となるため、子供におけるこのワクチン
の効果は疑わしい（ハリソン他、上記引用文献）。比較
的小さい方の肺炎球菌血清型は小児科の大多数の肺炎球
菌感染の原因であると信じられているが（グレイ(Gray)
他、１９７９、ザ・ジャーナル・オブ・インフェクショ
ナル・ディジーズ(J. Infect. Disease)、１４０：９７
９−９８３）、これらはワクチンとして使用される精製
された莢膜多糖類に対する人間抗体応答の成熟が最も遅
い型も含んでいる（アンダーソン(Anderson)およびベッ
ツ(Betts)、１９８９、ザ・ジャーナル・オブ・ペディ
アトリック・インフェクショナル・ディジーズ(Pediatr
ic Infec. Dis. J.)、８：Ｓ５０−Ｓ５３、ボルゴノ(B
orgono)他、１９７８、プロシーディング・オブ・ザ・
ソサイエティ・フォア・エクスペリメンタル・バイオロ
イジー・アンド・メディスン(Proc. Soc. Exp. Biol. M
ed.)、１５７：１４８−１５４）。
【０００５】２.３.結合体ワクチン類 インフルエンザ菌ｂ莢膜多糖に対する人間子供の免疫応
答性は、莢膜抗原を担体蛋白質に結合させて「結合体」
ワクチンを製造することにより得られており、Ｔリンパ
球ヘルパー効果は担体蛋白質により誘発されそして免疫
の発生に対して応答性があると信じられている（ロビン
ス(Robbins)他、１９８４、「バクテリア性ワクチン類
(Bacterial Vaccines)」、ゲルマニエル(Germanier)編
集、アカデミック・プレス、ニューヨーク、２８９−３
１６頁）。クルース(Cruse)およびルイス(Lewis)、１９
８９、「結合体ワクチン類(Conjugate Vaccines)」、編
集クルース(Cruse)およびルイス(Lewis)、カーガー(Kar
ger)、バセル(Basel)、１−１０頁も参照のこと。同様
な方式は肺炎球菌ワクチン類の製造にも向けられてい
る。
【０００６】２.３.１.ワクチン類中の抗原としての元
のままの莢膜重合体 多くの研究者が、ワクチン中で有用であるかまたはワク
チンとして有用である元のままの莢膜重合体を単離しそ
して精製している。例えば、米国特許番号４,２２０,７
１７は、インフルエンザ菌ｂの莢膜重合体からの免疫学
的に活性なポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲ
Ｐ）の単離および精製方法を記載している。さらに、米
国特許番号４,２１０,６４１は、２００,０００より大
きい見掛け分子量を有しておりそして主としてガラクト
ース、グルコースおよびマンノースからなっており且つ
少量のオサミン類を含有しているインフルエンザ菌の多
糖抽出物に関するものである。
【０００７】数人の研究者は、より良好な免疫学的応答
を得るために調合物中でこれらのおよび他の元のままの
莢膜重合体を使用している。例えば、米国特許番号４,
１９６,１９２は精製された元のままのＰＲＰを含有し
ているワクチンおよび完全細胞パラ百日咳菌ワクチン調
合物を記載している。免疫原性増加用のこの方式は、若
い哺乳動物において高められた水準の抗−ＰＲＰおよび
抗−百日咳抗体を生じた。
【０００８】２.３.２.ハプテン類に対する抗血清を製
造するための担体蛋白質の使用 担体蛋白質は結合された莢膜重合体の免疫原性をさらに
増加させることができ、それらはハプテン類を免疫性に
させることもできる。ハプテン類とは、抗体またはリン
パ球受容体に対して特異的に結合できるがそれら自身で
は免疫応答を誘発しない分子であると定義されている
（すなわちそれらは免疫原性ではない）。免疫応答を引
き起こすためには、ハプテン類と称されている小／低分
子量または劣った免疫原性の分子は普通は不均質蛋白質
であるそれより大きい分子または担体と最初に結合され
なければならない。動物中へのハプテン−担体複合体の
注射が抗体のＢリンパ球による製造が得られ、それらの
一部は遊離している未結合ハプテン分子に対して特異的
に結合することができるであろう。
【０００９】最も初期に研究されたハプテン類は、例え
ばアニリンおよびｏ−アミノ安息香酸の如きアゾ染料化
合物であった。ランドスタイナー(Landsteiner)および
ランプル(Lampl)（１０１９、ツルナル・フュル・イミ
ュノロギー・フォルシュング(Z. Immun. Forsch)、２
６：２９３）は、これらの化合物をジアゾ化により血清
蛋白質に結合させた。これらの人工的に製造されたアゾ
−蛋白質を注射した時には、兎は結合された化学的部分
に対して特異性であった抗体の沈澱を生じた。
【００１０】ハプテン性化合物の他の例は、牛血清アル
ブミンまたは牛ガンマグロブリン（ＢＧＧ）に対してジ
ニトロフェニル（ＤＮＰ）として結合する時に免疫原性
になるジニトロフェノールおよびリゼルグ酸ジエチルア
ミドである。ホルムアルデヒドはハプテンとして行動す
ることが示されているが、製品からのホルムアルデヒド
蒸気に呈された人間または研究室内の人間は生体内での
それらの内因性高分子のホルミル化後に該化合物に対し
て「感化」され始める。
【００１１】ハプテン性行動は小さい有機分子に限定さ
れるものではなく、そしてインシュリンの寸法までのポ
リペプチドホルモン類はたとえ免疫原性であってもしば
しば劣悪な免疫原性である。従って、これらのホルモン
類に対する高い抗体力価を得るためには、それらを担体
分子と結合させる（またはこれらのポリペプチド類の多
くを一緒に架橋結合させることにより比較的大きい分子
を生成する）ことが必要である。
【００１２】担体分子の含有は、担体が単なる輸送役割
以上に作用するという点で、特に興味がある。オヴァリ
ー(Ovary)およびベナセラフ(Benaceraff)（１９６３、
プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・
エクスペリメンタル・バイオロイジー・アンド・メディ
スン(Proc. Soc. Exp. Biol. Med.)、１１４：７２３）
は、兎にＤＮＰ−ＢＣＧを注射することによりこれを示
した。動物中への多くの免疫原性物質の注射は露呈の免
疫学的「記憶」を生じるであろう。従って、その後に二
回目の注射をする時には、はるかに激しい免疫応答があ
る。実際にオヴァリーおよびベナセラフがＤＮＰ−ＢＣ
Ｇを再び注射した時には、ＤＮＰおよびＢＣＧの両者に
対して向けられた抗体の顕著に高められた水準をもたら
す強い第二応答があった。その代わりに二回目の注射を
ＤＮＰ−卵アルブミンを用いて行った時には、それより
はるかに弱い抗−ＤＮＰ抗体応答が見られた。応答にお
ける差異は担体効果と称されているものによるものであ
り、そしてそれにはヘルパーＴリンパ球が含まれている
ようである。
【００１３】予備的証明は、全ての蛋白質が一定ハプテ
ンに関して同等に有効な担体蛋白質とは限らないことを
示している。ロビンス(Robbins)他（インフェクショナ
ル・イミュノロジー(Infect. Immun.)、４０：２４５−
２５６）は、同一の多糖ハプテンが異なる蛋白質担体と
結合されておりそしてハプテンに対する抗体応答が定量
化されている実験的な蛋白質−多糖結合体ワクチン類に
関するデータを表示している。担体に関する主要な役割
を示している抗−ハプテン抗体の発生量において相当な
差異が見られた。
【００１４】特に肺炎球菌ワクチン類に関すると、リン
(Lin)およびリー(Lee)（１９８２、イミュノロジー(Imm
unology)、４６：３３３）が型６Ａおよび１９Ｆ多糖類
並びに蛋白質と結合された１９Ｆに露呈された成人およ
び若いハツカネズミでの免疫応答を研究した。１９Ｆ多
糖−蛋白質結合体を接種したハツカネズミでは１９Ｆ多
糖だけを接種した対照群中より相当高いＩｇＭおよびＩ
ｇＧ２抗体力価が誘発された。
【００１５】２.３.３.結合体を含有しているワクチン
類 他の研究者は、いわゆる「担体効果」による抗体生成を
増加させる研究において担体蛋白質に対する莢膜重合体
の結合を研究した。例えば、シュニールソン(Schneerso
n)他、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディ
スン(Journalof Experimental Medicine)、１５２：３
６１−３７６（１９８０）はインフルエンザ菌ｂにより
引き起こされる侵入性疾病に対する免疫を与えると開示
されているインフルエンザ菌ｂ重合体−蛋白質結合体を
記載している。該参考文献は子供における莢膜重合体の
年令−関連性免疫学的行動を記載しており、そして元の
ままの莢膜重合体と血清アルブミン類であるリムルス・
ポリフェムス・ヘモシアニンおよびジフテリア毒素など
の種々の蛋白質との結合によりこの年令−依存性を克服
しようとしている。結合方法は、例えばアジピン酸ジヒ
ドラジドの如き結合剤の使用を含んでいる。
【００１６】ゲイヤー(Geyer)他、メディカル・マイク
ロバイオロジカル・イミュノロジー(Med. microbiol. I
mmunol.)、１６５：１７１−２８８（１９７９）は、還
元性アミノ化によるニトロフェニル−エチルアミン結合
剤に対するある種の肺炎棹菌莢膜多糖フラグメントの結
合体を製造しており、そして次に誘導化された砂糖をア
ゾカップリングを使用して蛋白質に結合させた。
【００１７】１９７４年５月９日に出願されたマックイ
ンタイヤー(McIntire)による米国特許番号４,０５７,６
８５は、ハロアシルハライドとの反応により蛋白質抗原
と共有結合されている毒性が減じられた大腸菌脂肪多糖
に関するものである。
【００１８】１９８１年５月２７日に出願されたジェニ
ングス(Jennings)他による米国特許番号４,３５６,１７
０は、還元性アミノ化による多糖−蛋白質結合体の製造
に関するものである。
【００１９】アンダーソン(Anderson)（１９８３、イン
フェクション・アンド・イミュニティ(Infection and I
mmunity)、３９：２３３−２３８）は、無毒であるがジ
フテリア毒素の抗原的に同一な変種であるインフルエン
ザ菌型ｂ莢膜多糖からのオリゴ多糖類およびＣＲＭ197
の間の結合体に関するものである。
【００２０】スニッペ(Snippe)他（１９８３、インフェ
クション・アンド・イミュニティ(Infection and Immun
ity)、４２：８４２−８４４）は、莢膜多糖Ｓ３の部分
的な酸加水分解物から単離された六糖が還元性アミノ化
によりステアリルアミンと結合されておりそして次にリ
ポゾーム中に加えられている肺炎連鎖球菌型３に対する
半合成ワクチンに関するものである。生成した結合体／
リポゾームワクチンはハツカネズミ中での肺炎連鎖球菌
型３に対する予防を誘発することが観察された。
【００２１】１９８３年３月１４日に出願され１９８７
年５月５日に発行されたツアイ(Tsay)他による米国特許
番号４,６６３,１６０は、グラム−陰性バクテリアから
の無毒化された多糖が同種のグラム−陰性バクテリアか
らの無毒化された蛋白質と４−１２炭素部分により共有
結合されているバクテリアに関するものである。
【００２２】１９８４年１月５日に出願され１９８６年
１０月２８日に発行されたゴルドン(Gordon)による米国
特許番号４,６１９,８２８は、例えばインフルエンザ菌
ｂ、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、および大腸菌の如き病原
性バクテリアからの多糖分子と例えばジフテリアおよび
破傷風トキソイド類の如きＴ細胞依存性抗原との間の結
合体に関するものである。
【００２３】１９８４年８月１０日に出願され１９８９
年２月２８日に発行されたアンダーソン(Anderson)およ
びクレメンツ(Clements)による米国特許番号４,８０８,
７００並びに１９８６年３月２８日に出願され１９８８
年８月２日に発行されたアンダーソンによる米国特許番
号４,７６１,２８３は、還元性アミノ化によるバクテリ
ア性毒素類、トキソイド類、または結合用副単位に対す
る莢膜重合体フラグメントの共有結合に関するものであ
る。
【００２４】１９８６年７月２日に出願され１９８７年
１２月８日に発行されたポロ(Porro)他による米国特許
番号４,７１１,７７９は、３価の免疫活性を有している
グラム陽性バクテリアおよびグラム陰性バクテリアの莢
膜多糖類並びにＣＲＭ197、破傷風トキソイドまたは百
日咳毒素からの抗原性決定子からなるグリコ蛋白質結合
体ワクチンに関するものである。
【００２５】２.３.４.結合体ワクチン類の製造方法 莢膜多糖ハプテン類が担体蛋白質類と結合されている結
合体ワクチン類の製造は、下記の工程を経る。
【００２６】（ｉ）莢膜多糖を製造すべきである。
【００２７】（ii）多糖のフラグメントを使用する場合
には、それを元のままの多糖から分離すべきである。
【００２８】（iii）糖を活性化するかまたは結合可能
にすべきであり、すなわち蛋白質と共有結合可能な分子
を生成すべきである。
【００２９】（iv）糖を蛋白質と結合させる。
【００３０】これらの４工程を行うための当技術で公知
の種々の方法は表Ｉに挙げられている。
【００３１】
【表１】 表Ｉ 多糖の 多糖の 多糖の 蛋白質に対する 参考文献 製造 分解 活性化 結合 1981年5月27日に出願され アルデヒド発生 シアノホウ素 1982年10月25日に発行さ 用に過ヨウ素酸 水素化物を用い れたジェニングスによる を使用した る還元性アミノ 米国特許番号4,356,170 化 1983年3月14日に出願され アルデヒド発生 1)縮合剤例えば 1987年5月5日に発行され 用に過ヨウ素酸 カルボジイミド たツアイによる米国特許 を使用した の存在下で蛋白 番号4,663,160 質と結合された 4-12炭素部分 ii)還元剤例え ばシアノホウ素 水素化物の存在 下でシッフ塩基 反応により4-12 炭素部分を有す る蛋白質と結合 された多糖 1984年1月5日に出願され 熱処理により *臭化ジシアン *蛋白質のアジ1 986年10月28日に発行さ 200,000-2,000, ピン酸ヒドラジ れたゴルドンによる米国 000の間の分子 ン誘導体中で存 特許番号4,619,828 寸法に調節され 在するように、 た多糖類 4-8炭素原子の スペーサー架橋 を介して結合さ れた 1984年8月10日に出願され 少なくとも１個の還元性 シアノホウ素 1989年2月28日に発行さ 末端を有する抗原性フラ 水素化物の存在 れたアンダーソンおよび グメントを製造するため 下での還元性ア クレメンツによる米国特許 に種々の方法、例えば ミノ化による 番号4,356,170 過ヨウ素酸による分解、 結合(約2-3週 グリコシダーゼによる 間) 加水分解、または酸加 水分解、が使用された "CRM197に対する肺炎 デンマーク 還元性フラグメントを製造 燐酸塩緩衝液 連鎖球菌の莢膜重合体 型6A、 するための0.1N HCL中の 中でシアノホ フラグメントの結合" エリ・リリ 100℃における酸加水分解 ウ素水素化物 という題の上記の ー・カンパ を用いて18日6 .5.章 ニー 間にわたり 37℃において CRM197に結合19 86年7月2日に出願され 100℃におけ 第一級アミノ 有機溶媒、例198 7年12月8日に発行さ る6-40時間の 基を末端還元 えばジメチルれた ポロによる米国特許 酸加水分解。 性基（例えば スルホキシド、番号 4,711,779 適している シアノホウ素 の存在下で ハプテン類は ナトリウムを トキソイドに 1000-2000ダル 用いて）加え 結合 トンの分子量 その後に（例 を有する。 えばアジピン 酸の存在下で) エステルに転 化させること により活性化 肺炎連鎖球菌型6A用 100℃におけ アンモニア性 ジメチルスル る39時間の 緩衝液中で ホキシドの存 酸加水分解 (第一級アミノ 在下で室温で 基を加えるた 15時間にわた めに）シアノ りCRM197に ホウ素ナトリ 結合 ウムの存在下で 2週間活性化、 アジピン酸のスク シンイミジルエス テルを含有してい るジメチルスルホ キシドの水溶液中 で対応する一官能 性エステルに転化 ３．発明の要旨 本発明は、新規な方法を用いるバクテリア性莢膜多糖類
から誘導されたオリゴ糖類の共有結合に関するものであ
る。
【００３２】この方法によると、最近用いられている方
法より相当速い製造速度でグリコ結合体を効率的に合成
することができる。本発明のグリコ結合体はワクチン調
合物中で使用することができ、そして免疫原性であるこ
とが示されている。
【００３３】特定態様では、本発明は肺炎連鎖球菌莢膜
多糖類から誘導されたオリゴ糖類を取り込んでいるグリ
コ結合体の製造に関するものである。本発明の方法は主
要疾病の大部分に肺炎連鎖球菌感染が伴われているよう
な小児科集団に特に適しているワクチン調合物中で使用
できる肺炎連鎖球菌グリコ結合体を高収率で効率的に製
造することができる。免疫原性結合体は莢膜重合体だけ
のものより年令依存性が少ないことが見いだされてお
り、そして非常に若い温血哺乳動物のそれぞれ莢膜化さ
れたバクテリアによる全身的感染に対する活性免疫化用
に有用である。
【００３４】本発明の他の面では、本発明のグリコ結合
体は驚くべきことに単一特異性の均質な免疫応答を誘発
することが見いだされ、それにより自己免疫反応および
関連する後−ワクチン化症候群の発生が有利に避けられ
る。
【００３５】重要なことに、本発明の免疫原性結合体は
蛋白質に対する炭水化物の結合においてこれまでに使用
されていた例えばアジピン酸ジヒドラジドまたはｐ−ニ
トロ−フェニルエチルアミンの如き有能な毒性結合剤を
含有していない。
【００３６】３.１.略語および定義 ＣＲＭ197 ジフテリア毒素と抗原的に架橋反応性であ
る無毒の蛋白質 ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド ＤＰ 重合度 ＭＩＣ 最小抑制濃度 ＳＤ 置換度 ＳＩＤＥＡ アジピン酸のスクシンイミジルジエステル ＳＩＤＥＳ 琥珀酸のスクシンイミジルジエステル ４．図面の簡単な説明 図１.オリゴ糖−蛋白質結合体の合成用の一般的工程 Ａ.高分子量多糖類を酸加水分解して２.５×１０3の平
均分子量のオリゴ糖類を生成する。
【００３７】Ｂ.オリゴ糖類を（１）ｐＨ＝９における
ジアミノエタン［Ｈ2Ｎ(ＣＨ2)2ＮＨ2］との反応により
活性化し、ホウ素水素化ピリジン（ＰｙＢＨ3）を用い
て還元し、次に（２）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）中でスクシンイミジルジエステルおよびアジピン酸
（ＳＩＤＥＡ）と反応させる。
【００３８】Ｃ.活性化されたオリゴ糖類をリシン残基
を介して担体蛋白質と結合させる。
【００３９】図２.結合工程における「特別仕様」スペ
ーサーの使用 Ａ.オリゴ糖および炭素数が４のアジピン酸結合剤の間
のアミド結合（矢印）を有する、ポロ(Porro)他、（１
９８５）、モレキュラー・イミュノロジー(Mol. Immuno
l.)、２２：９０７−９１９により記載されているこれ
までの工程により製造されたグリコ結合体。スペーサー
の全長は約１０.４Ａである。
【００４０】Ｂ.２個の炭素残基（矢印、ジアミノエタ
ンにより製造された）およびアミド結合がオリゴ糖およ
びＳＩＤＥＳとの反応により製造された炭素数が２の琥
珀酸結合剤の間に存在している、本発明に従い製造され
たグリコ結合体。スペーサーの全長は約１０Ａである。
【００４１】Ｃ.２個の炭素残基（矢印、ジアミノエタ
ンにより製造された）およびアミド結合がオリゴ糖およ
びＳＩＤＥＡとの反応により製造された炭素数が４のア
ジピン酸結合剤の間に存在している、本発明に従い製造
されたグリコ結合体。スペーサーの全長は約１４.５Ａ
である。
【００４２】図３.アジピン酸対琥珀酸誘導体スペーサ
ーを含有している活性化されたオリゴ糖類に対するＣＲ
Ｍ197の結合の効果。結合反応の生成物のＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（銀染色）。
【００４３】Ａ.レーン１：分子量基準（９２.５Ｋ、６
６.２Ｋ、４５.０Ｋ、３１.０Ｋ、２１.５Ｋ）。
【００４４】レーン２：ＣＲＭ197（１μｇ）対照。
【００４５】レーン３：スペーサーとしての琥珀酸を有
する結合されたオリゴ糖 ６Ａ−ＣＲＭ197（２μｇ）（５０％ＤＭＳＯ中のＣＲ
Ｍ197の１：１モノエステル／合計アミノ基比）。
【００４６】レーン４：スペーサーとしての琥珀酸を有
する結合されたオリゴ糖 ６Ａ−ＣＲＭ197（２μｇ）（５０％ＤＭＳＯ中のＣＲ
Ｍ197の１：２モノエステル／合計アミノ基比）。
【００４７】レーン５：スペーサーとしてのアジピン酸
を有する結合されたオリゴ糖 ６Ａ−ＣＲＭ197（２μｇ）（５０％ＤＭＳＯ中のＣＲ
Ｍ197の１：１モノエステル／合計アミノ基比）。
【００４８】レーン６：スペーサーとしての琥珀酸を有
する結合されたオリゴ糖 １４−ＣＲＭ197（２μｇ）（５０％ＤＭＳＯ中のＣＲ
Ｍ197の１：４モノエステル／合計アミノ基比）。
【００４９】レーン７：スペーサーとしての琥珀酸を有
する結合されたオリゴ糖 １９Ｆ−ＣＲＭ197（２μｇ）（５０％ＤＭＳＯの不存
在下でのＣＲＭ197の１：４モノエステル／合計アミノ
基比）。
【００５０】レーン８：スペーサーとしての琥珀酸を有
する結合されたオリゴ糖 ２３Ｆ−ＣＲＭ197（２μｇ）（５０％ＤＭＳＯ中のＣ
ＲＭ197の１：２モノエステル／合計アミノ基比）。
【００５１】レーン９：ＣＲＭ197（１μｇ）対照。
【００５２】Ｂ.レーン１：ＣＲＭ197（１μｇ）対照。
【００５３】レーン２：ＣＲＭ197対照（１μｇ、レー
ン１と比較して異なるロット）。
【００５４】レーン３：スペーサーとしてのアジピン酸
を有する結合されたオリゴ糖 ２３Ｆ−ＣＲＭ197（２μｇ）（５０％ＤＭＳＯ中のＣ
ＲＭ197の１：２モノエステル／合計アミノ基比）。
【００５５】レーン４：分子量基準（９２.５Ｋ、６６.
２Ｋ、４５.０Ｋ、３１.０Ｋ、２１.５Ｋ）。
【００５６】レーン５：スペーサーとしてのアジピン酸
を有する結合されたオリゴ糖 ２３Ｆ−ＣＲＭ197（２μｇ）（５０％ＤＭＳＯ中のＣ
ＲＭ197の１：２モノエステル／合計アミノ基比）。
【００５７】レーン６：ＣＲＭ197（１μｇ）対照。
【００５８】ＣＲＭ197対照（１μｇ、レーン１と比較
して異なるロット）。
【００５９】レーン７：スペーサーとしてのアジピン酸
を有する結合されたオリゴ糖 ６Ａ−ＣＲＭ197（２μｇ）。
【００６０】Ｃ.レーン１：分子量基準（９２.５Ｋ、６
６.２Ｋ、４５.０Ｋ、３１.０Ｋ、２１.５Ｋ）。
【００６１】レーン２：ＣＲＭ197（１μｇ）対照。
【００６２】レーン３：スペーサーとしてのアジピン酸
を有する結合されたオリゴ糖 ６Ａ−ＣＲＭ197（２μｇ）。
【００６３】レーン４：スペーサーとしてのアジピン酸
を有する結合されたオリゴ糖 １４−ＣＲＭ197（２μｇ）。
【００６４】レーン５：スペーサーとしてのアジピン酸
を有する結合されたオリゴ糖 １９Ｆ−ＣＲＭ197（２μｇ）。
【００６５】レーン６：スペーサーとしてのアジピン酸
を有する結合されたオリゴ糖 ２３Ｆ−ＣＲＭ197（２μｇ）。
【００６６】レーン７：分子量標識（９２.５Ｋ、６６.
２Ｋ、４５.０Ｋ、３１.０Ｋ、２１.５Ｋ）。
【００６７】図４.肺炎連鎖球菌オリゴ糖６Ａ−ＣＲＭ
197結合体に対する兎のＩｇＧ応答。莢膜多糖類に対し
て誘発されたＩｇＧアイソタイプの親和性価の抑制−Ｅ
ＬＩＳＡ分析。
【００６８】Ａ.型６Ａ莢膜多糖類。
【００６９】Ｂ.遊離形またはＣＲＭ197と結合された型
６Ａオリゴ糖（ＤＰ＝１０）。
【００７０】Ｃ.分子スペーサーにより活性化されたか
またはＣＲＭ197と結合された型１４オリゴ糖（ＤＰ＝
１２）。
【００７１】５．発明の詳細な記載 本発明は、担体蛋白質に対するバクテリア性莢膜多糖類
から誘導されたオリゴ糖類の共有結合に関するものであ
り、本発明の方法は新規方法により新規なグリコ結合体
を生成する。
【００７２】開示を明白にするために、本発明の詳細な
記載を下記の章に分割するが、それらは限定のためでは
ない。
【００７３】（ｉ）オリゴ糖類の製造 （ii）オリゴ糖類の活性化 （iii）蛋白質に対するオリゴ糖類の結合 （iv）グリコ結合体の免疫化学特性 （ｖ）ワクチン調合物および投与 （vi）肺炎球菌オリゴ糖結合体ワクチンの利用 ５.１.オリゴ糖類の製造 高分子量莢膜多糖は商業的に購入できるか（アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション）（ＡＴＣＣ）
（ロックヴィル、メリーライド）、またはポロ(Porro）
他、１９８３、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・スタンダーズ(J. Biol. Stand.)、１１：６５−７１
により記載されている方法により得られる。肺炎連鎖球
菌、インフルエンザ菌ｂ、髄膜炎菌、大腸菌、チフス
菌、ミュータンス連鎖球菌、クリプトコッカス・ネオフ
ォルマンス、肺炎棹菌、黄色葡萄球菌、および緑膿菌の
莢膜中で見いだされるものなどの多糖を使用することが
できるが、それらに限定されるものではない。
【００７４】特定の莢膜重合体の構造特徴に依存する種
々の方法により、少なくとも１個の還元性末端を有する
抗原性フラグメントを莢膜重合体から製造することがで
きる。過ヨウ素酸塩（または関連試薬）による限定され
た酸化性分解はアルデヒド末端を残存させるが、そのよ
うな方式は非−環式残基上での隣接ジヒドロキシ基を有
する重合体に限定されるであろう。グリコシド結合の加
水分解は還元性砂糖末端を生じる。そのような加水分解
は最適にはグリコシダーゼにより酵素的に実施すること
ができるが、この適用はそれ用のグリコシダーゼが知ら
れている例えば肺炎連鎖球菌８の如き比較的わずかな莢
膜重合体に限定されるであろう。グリコシド結合の加水
分解用には、酸性加水分解が一般的に使用される。重合
体が酸−敏感性の非−グリコシド結合を含有している場
合または重合体が抗原特異性にとって重要な酸−敏感性
分枝鎖結合を含有している場合には、この方式の使用は
限定されるであろう。
【００７５】本発明の特定態様では、肺炎連鎖球菌型６
Ａ莢膜多糖を約１０-2Ｍ酢酸中で約１００℃において約
３０時間にわたり加水分解することができ、肺炎連鎖球
菌型１４莢膜多糖は約０.５Ｍトリフルオロ酢酸中で約
７０℃において約７時間にわたり加水分解することがで
き、肺炎連鎖球菌型１９Ｆ多糖は約１０-2Ｍ酢酸中で約
５０℃において約４８時間にわたり加水分解することが
でき、そして肺炎連鎖球菌型２３Ｆ多糖は約０.２５Ｍ
トリフルオロ酢酸中で約７０℃において約３時間にわた
り加水分解することができる。
【００７６】本発明に従うと、蛋白質と結合されるオリ
ゴ糖類は好適には３−６個の間の繰り返し単位（すなわ
ち約１０−３０個の単糖残基）からなっており、そして
より好適には３−４個の間の繰り返し単位（すなわち約
１５個の単糖残基）からなっており、その理由はグリコ
結合体中に取り込まれるこの長さのオリゴ糖類が最適な
免疫原性であることが示されているからである。
【００７７】５.２.オリゴ糖類の活性化 オリゴ糖類は、還元性アミノ化およびその後の例えばジ
エステルの如き二官能性分子との反応により活性化でき
るが、該ジエステルは限定用のものではない。本発明の
方法の概略は、図１および本発明の方法をポロ(Porro)
他、１９８５、モレキュラー・イミュノロジー(Mol. Im
munol.)、２２：９０７−９１９中に記載されている方
法と比較している表IIに示されている。これまでの工程
を使用すると活性化時間は７−１４日であり、これは本
発明に従い１５分間に短縮されていることに注目すべき
である。また、これまでの工程を使用すると還元時間は
７−１４日であり、これも本発明に従い４８時間に短縮
されていることに注目すべきである。従って、本発明は
完了させるためにはこれまでの方法より１２−２６日も
短い日数が必要である。例えば５０℃の如き高温に炭水
化物を露呈すると変性を引き起こす可能性があるため、
このことは重要な利点である。
【００７８】
【表２】 表II.肺炎連鎖球菌オリゴ糖類の末端−還元性単位の化学的活性化 パラメーター これまでの工程 本発明の工程 加えられた基 ＮＨ2 ＮＨ(ＣＨ2)2ＮＨ2 試薬（ｐＨ） アンモニア性緩衝液(９) ジアミノエタン(９) 活性化温度 ５０℃ １００℃ 活性化時間 ７−１４日 １５分間 還元剤 シアノホウ素水素化Ｎａ ピリジンボラン 還元温度 ５０℃ ５０℃ 還元時間 ７−１４日 ４８時間 生じた生成物 オリゴ−ＮＨ2 オリゴ−ＮＨ(ＣＨ2)2ＮＨ2 活性化用二官能性 ＳＩＤＥＡ（アジピン酸の ＳＩＤＥＳまたは スペーサー スクシンイミジルジエステル） ＳＩＤＥＡ（琥珀酸また はアジピン酸のスクシン イミジルジエステル） 反応温度 ２５℃ ４℃ 反応時間 ４時間 ２時間 生じた生成物 オリゴ−ＮＨ−モノエステル オリゴ−ＮＨ(ＣＨ2)2ＮＨ− モノエステル 反応の効率 ２５−３０％ ７０％ 本発明の方法に従うと、オリゴ糖の末端−還元性単位の
還元性アミノ化は２個のアミノ基を含有している分子を
用いて実施される。本発明の好適態様では、還元性アミ
ノ化は一定モル量のオリゴ糖を０.２Ｍ ＫＨ2ＰＯ4中で
約ｐＨ＝９で約２５−１００℃の温度そして好適には好
適には１００℃において約１−６０分間そして好適には
約１５分間にわたり１０モル倍過剰量のジアミノエタン
溶液と反応させることにより実施される。その後に、製
造時のオリゴ糖のモル濃度の２５倍に相当するモル量の
ピリジンボランを加えることができ、そして反応は約２
５−１００℃の間そして好適には約５０℃において約１
−７２時間そして好適には約４８時間にわたり実施され
る。
【００７９】生じた還元性アミノ化反応の生成物を次に
二官能性分子と反応させることができ、ここでは各官能
基は活性化されたオリゴ糖の末端アミノ基および担体蛋
白質の構造中に存在しているアミノ基と反応することが
できるため、二官能性分子はオリゴ糖および担体蛋白質
を一緒に結合させるために作用できる。本発明の好適態
様では、二官能性基はジエステルであり、そしてより特
に蛋白質の有効なグリコシル化を伴うことが示されてい
るアジピン酸のジエステルである。本発明の好適な特定
態様では、上記の還元性アミノ化を受けたオリゴ糖をさ
らに琥珀酸またはより好適にはアジピン酸のスクシンイ
ミジルエステルと反応させ、ここでこの反応はジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液中でのＳＩＤＥＡ（また
はＳＩＤＥＳ）のモル濃度の約１／５に等しいモル濃度
（アミノ基として）のアミノ化されたオリゴ糖を用いて
約０−２５℃の間そして好適には約４℃において約０.
５−５時間そして好適には約２時間にわたり最適に実施
することができる。次に活性化されたオリゴ糖を１,４
ジオキサン（８０％容量／容量）を用いる沈澱により集
めることができ、それにより上澄み液中に過剰のＳＩＤ
ＥＡ（またはＳＩＤＥＳ）が残る。
【００８０】５.３.蛋白質に対するオリゴ糖類の結合 本発明に従い利用できる蛋白質には、若い哺乳動物に対
する投与に関して安全であり且つ免疫学的に有効な担体
蛋白質として作用できる蛋白質が包含される。特定態様
では、細胞表面蛋白質、膜蛋白質、毒素類およびトキシ
ノイド類を使用することができる。安全に関する基準に
は、初期毒性の不存在およびアレルギー反応の最小危険
性が包含される。ジフテリアおよび破傷風トキシノイド
類がこれらの基準を満たしており、すなわち、適切に製
造されるとそれらは無毒であり且つアレルギー反応の兆
候は許容可能なほど低い。アレルギー反応の危険性は成
人にとってはかなりであるかもしれないが、それは子供
にとっては極微である。本発明の別の特定態様に従う
と、適切な担体蛋白質には下記のものが包含されるがそ
れらに限定されるものではない：サルモネラ・フラゲリ
ン、ヘモフィルス・ピリン、ヘモフィルス１５ｋＤａ、
２８−３０ｋＤａ、および４０ｋＤａ膜蛋白質類、大腸
菌易熱性エンテロ毒素ＬＴＢ、コレラ毒素、並びにロタ
ウィルスＶＰ７並びにＲＳ合胞ウィルスＦおよびＧ蛋白
質類を含むウィルス性蛋白質類。
【００８１】「担体効果」では、弱い抗原が担体として
の比較的強い抗原（すなわち不均質蛋白質）と結合され
ることによりそれが単独で表示される場合より免疫原性
が大きくなる。動物をあらかじめ担体だけで免疫化する
場合には、動物に初回抗原刺激を与えることができそし
て担体抗原だけでなく結合されたハプテン基にも増加し
た免疫応答を生じることができる。子供は日常的に破傷
風およびジフテリアトキソイド類で免疫化されている。
従って、彼らはこれらのトキソイド類のいずれかと結合
された莢膜重合体抗原のその後の表示用に初回抗原刺激
を受けている。
【００８２】一般的には、不均質蛋白質が担体抗原とし
て作用できるであろう。しかしながら、例えば破傷風お
よびジフテリアの如きある種のバクテリア性毒素類は、
それらが二部分からなっておりそれの一方（「結合」副
単位）が哺乳動物細胞表面に対する結合に関する強い親
和性を有しているという別の利点を有しているかもしれ
ない。考えられるところ、そのような「結合性」蛋白質
に対する結合により担持された抗原は免疫系の細胞中で
の応答をより効果的に開始させることができるであろ
う。
【００８３】莢膜重合体が結合される担体蛋白質は本来
毒素であるかまたは無毒化された毒素（トキソイド）で
あることができる。また、比較的最近の突然変異技術に
より、毒素と抗原的に似ているが無毒である遺伝子変更
された蛋白質を製造することもできる。これらは「交差
反応物質」すなわちＣＲＭと称されている。ＣＲＭ197
は注目の価値があり、その理由はそれが天然ジフテリア
毒素から１個のアミノ酸変更を有しておりそしてそれと
は免疫学的に区別できないからである。
【００８４】天然毒素に対する莢膜重合体の結合は毒性
を減少させることができるが、かなりの毒性が残ってい
るかもしれない。従って、蛋白質毒素のその後の無毒化
においてはホルマリンが使用され、それは蛋白質の遊離
アミノ基と反応する。残存毒性はまだ心配であろう。さ
らに、特定ロットのワクチンを用いる自発的な無毒化も
可能であり、そしてこの方式には懸念事項が残ってい
る。
【００８５】一方、天然毒素をホルマリンを用いて無毒
化して莢膜重合体への結合前に一般的なトキソイドを製
造することもできる。しかしながら、これまでのホルマ
リン処理は莢膜重合体フラグメントの還元性基との反応
用に利用できる遊離アミノ基の数を減少させる。従っ
て、ＣＲＭはそれらが固有には毒性を有していないがそ
れらのアミノ基はホルマリンにより結合されるという意
義ある利点を有している。別の利点はＣＲＭを用いる作
業時に生体に対する害が無いことである。
【００８６】天然毒素と免疫学的に同一であるＣＲＭ
197の場合には、（無毒化する必要はないが）ホルマリ
ンを用いる処理が免疫学的応答を大きく増加させる。こ
れは架橋結合による身体の機構および／または凝集によ
る変性に対する分子の安定化によるものと考えられる
（粒子の免疫原性は寸法に応じて増加する）。
【００８７】上記の全ての理由のために、破傷風および
ジフテリア毒素が担体蛋白質用の主要候補であるが他の
適切なものもある。これらの他のものはジフテリアおよ
び破傷風を用いて観察された安全性歴を有していない
が、それらを使用する別の圧倒的な理由があるかもしれ
ない。例えば、それらは担体として有効であるかもしれ
ず、または生産の経済性が相当なものであるかもしれな
い。担体用の他の候補には、シュードモナス、葡萄球
菌、連鎖球菌、百日咳菌および大腸菌の毒素類が包含さ
れる。
【００８８】本発明の特定態様では、活性化されたオリ
ゴ糖類を下記の如くして精製されたＣＲＭ197蛋白質と
結合させることができる。
【００８９】菌株ジフテリア菌により製造されたＣＲＭ
197を培養媒体から、下記の６章中に記載されている如
くして、バクテリア性培養をミリポール膜中に通し、蛋
白質を濾液から沈澱させ、そしてＣＲＭ197をイオン交
換クロマトグラフィーにより精製することにより、分離
できる。一方、当技術で公知のいずれかの方法により実
質的に純粋なＣＲＭ197を得ることもできる。
【００９０】蛋白質に対する活性化されたオリゴ糖の末
端官能基の結合を促進させるために、活性化されたオリ
ゴ糖を有機溶媒および任意に他の試薬（例えば縮合剤）
の存在下で担体蛋白質と共有結合させることができる。
本発明の特定の好適態様では、末端エステル基を有する
活性化されたオリゴ糖を下記の如くして担体上に存在し
ている遊離アミノ基と共有結合させることができる。
【００９１】活性化されたオリゴ糖をジメチルスルホキ
シド中に溶解させ、そして次に担体蛋白質（例えば、限
定されるわけではないが約２ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＲＭ
197）の水溶液に、担体蛋白質のモノエステル−活性化
されたオリゴ糖／全アミノ基のモル比が約１：２となり
そしてＤＭＳＯの最終的濃度が約５０容量／容量％とな
るような方法で、加える。結合反応は４℃において実施
され、そして反応は約２時間でほぼ完了するが、反応の
収率を各型特異性グリコ結合体に関する最高値にまで増
加させるためには反応を一夜続けることが適している。
このようにして得られたグリコ結合体を次にゲルクロマ
トグラフィーにより精製する。
【００９２】１価ワクチンの合成用には、単一血清型の
バクテリアから誘導されたオリゴ糖類を蛋白質に結合さ
せることができる。多価ワクチンの合成用には、異なる
種類または異なる血清型のバクテリアから誘導されたオ
リゴ糖類の混合物を担体蛋白質と結合させることにより
グリコ結合体を製造することができ、或いは、単一型の
オリゴ糖を異なるオリゴ糖類を用いる別の反応で担体蛋
白質と反応させることにより製造されたグリコ糖を混合
することもできる。従って、多価ワクチンは結合された
オリゴ糖類の均質または不均質集団を有する担体蛋白質
である。
【００９３】５.４.グリコ結合体の免疫化学的特性 上記の方法により製造されたグリコ結合体の免疫原性の
確認を人間への投与前に兎、豚、モルモット、ハツカネ
ズミ、鼠、または山羊などの適当な動物系で試験するこ
とができるが、それらの動物に限定されるわけではな
い。本発明の特定態様では、鼠（体重が約２ｋｇ）に燐
酸もしくは水酸化アルミニウムの存在下でまたは不存在
下でグリコ蛋白質性結合体を皮下接種させることができ
る。約２.５μｇのオリゴ糖が２ｋｇの兎に対する適切
な投与量であろう。次に抗体力価を酵素−結合された免
疫吸収剤検定（ＥＬＩＳＡ）または当技術で公知の他の
方法により評価することができる。本発明のグリコ結合
体に対して生じた抗体は抗原を免疫沈澱させることがで
きないため、免疫沈澱に基づく抗体検定は力価の測定用
には推奨されない。
【００９４】５.５.ワクチン調合物および投与 ワクチンを調合するために適している担体媒体には、燐
酸ナトリウムで緩衝された食塩水（ｐＨ７.４）または
燐酸ナトリウムで緩衝された食塩水中にｐＨ６において
懸濁されている０.１２５Ｍ燐酸アルミニウムゲルおよ
び他の一般的媒体が包含される。
【００９５】一般的には、約５−約１００μｇの、好適
には約１０−５０μｇの、オリゴ糖を含有しているワク
チン類が若い温血哺乳動物中での莢膜重合体に対する抗
体の有効水準を与えるのに適している。もちろん、正確
な投与量は日常的な投与量／応答実験により決められる
であろう。子供用ワクチン類を製造するためのグリコ蛋
白質性結合体の濃度は約２５−２００μｇのオリゴ糖の
範囲内である。体重によってはそれより多い投与量を投
与することもできる。連続的に与えられる数回の少ない
投与量の方が単独注射として与えられる同量の結合体よ
り優れていると予測される。
【００９６】本発明のワクチン類は全年令の温血哺乳動
物に対して投与することができ、そして病原体であるイ
ンフルエンザ菌ｂ、大腸菌、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、
および緑膿菌により引き起こされる若い哺乳動物におけ
る全身的感染に対する活性な免疫化を誘発するために特
に適している。
【００９７】本発明に従うと、ワクチンは皮下に、静脈
内に、筋肉内に、腹腔内に、経口的に、または鼻内に適
用することができる。ワクチンは可溶性もしくは微細粒
状形のまたはリポゾームなどの微球もしくは微小胞中に
加えられたグリコ結合体であることができる。
【００９８】５.６.オリゴ糖結合体ワクチン類の利用 本発明の好適態様では、莢膜化された病原性バクテリア
に指定されているグリコ結合体ワクチン類を使用して、
感受性個体がこれらの試薬により引き起こされる感染が
進行するのを予防する。感受性個体には、未成熟の免疫
系を有する若い子供、無脾症個体、並びに折衷された免
疫系もしくは慢性疾病、特に後天性免疫不全症候群（エ
イズ）、造血悪性腫瘍、糖尿病、慢性心臓疾病、慢性肺
疾病、および鎌状赤血球貧血症、の個体が包含される。
本発明のグリコ結合体は、担体蛋白質に対するそれらの
結合のために、それらが有するオリゴ糖類の免疫原性を
増加させる。
【００９９】従って、本発明のグリコ結合体は肺炎連鎖
球菌、インフルエンザ菌、大腸菌、髄膜炎菌、チフス
菌、ミュータンス連鎖球菌、クリプトコッカス・ネオフ
ォルマンス、肺炎棹菌、黄色葡萄球菌、および緑膿菌な
どの多糖莢膜を有するバクテリアによる感染に対して予
防するためのワクチン化において使用することができ
る。肺炎連鎖球菌の菌株は子供では特に有毒であり、そ
して特に本発明により提唱されるものには型１、２、
３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１
１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９
Ｆ、２０、２２Ｆ、２３、および３３Ｆが包含される。
【０１００】特定態様では、本発明のワクチン類は単一
特異性の均質免疫応答を誘発させるために使用できる。
単一特異性の免疫応答には多くの利点が含まれており、
それらには（ｉ）実質的に全ての抗体が特異的対掌体に
向けられておりそして同一の親和性一定値により特徴づ
けられている均質な特異性、（ii）優れた抗−バクテリ
ア性活性を有する高い親和性一定値、（iii）より安全
なワクチンを生成する増加された目標特異性および宿主
関連抗原との交差反応性の不存在、並びに（iv）単一特
異性抗体の減じられた沈澱活性による減じられた補体活
性化が包含され、それらがより安全なワクチンを生成す
る。
【０１０１】別の態様では、本発明は担体蛋白質に対し
て本発明の方法により結合されたペプチド類もしくはリ
ポオリゴ糖または他の表面オリゴ糖ハプテン類を認識す
るワクチン類を製造するために使用できる。そのような
ワクチン類は例えば腫瘍細胞に対する免疫性の誘発にお
いてまたは化学療法もしくは生活性試薬と結合された抗
−腫瘍抗体の製造において使用することができ、そのよ
うな抗−腫瘍活性は本発明の方法を用いて担体蛋白質に
対して腫瘍−特異性抗原またはそれの対掌体を結合させ
ることにより誘発することができる。
【０１０２】
【実施例】
６．実施例：多価肺炎球菌オリゴ糖結合体ワクチンの生
成 ６.１.多糖の製造 肺炎連鎖球菌型６Ａ莢膜多糖、肺炎連鎖球菌型１４莢膜
多糖、肺炎連鎖球菌型１９Ｆ莢膜多糖、および肺炎連鎖
球菌型２３Ｆ莢膜多糖はアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションから得られた。
【０１０３】６.２.多糖の加水分解 ６.２.１.肺炎連鎖球菌型６Ａ多糖の加水分解 ２ミリグラムの型６Ａ肺炎連鎖球菌莢膜多糖を１０ｍＭ
の酢酸を含有している１ｍｌの水溶液中にｐＨ＝３.４
において溶解させ、次に油浴中に浸漬されている密封ア
ンプル中で１００℃の温度において３０分間にわたり加
水分解させた。生成したオリゴ糖類を次にＮａＣｌの１
５ｍＭ溶液を用いてｐＨ７.０において４℃でコンディ
ショニングされているセファデックスＧ１５（ファーマ
シア、ウップサラ）上でのクロマトグラフィーにより反
応混合物から分離した。
【０１０４】次にクロマトグラフィー流出液を、カバッ
ト(Kabat)により報告されている工程（１９６４、「実
験的免疫化学(Experimental Immunochemistry)」、Ｅ.
Ａ.ラバット(Rabat)およびメイヤー(Mayer)、５３８−
５４１）、チェン(Chen)他（１９５６、アナリティカル
・ケミストリー(Anal. Chem.)、２８：１７５６−１７
５８）、並びにポロ(Porro)他（１９８１、アナリティ
カル・バイオケミストリー(Anal. Biochem.)、１１８：
３０１−３０６）に従い分析して、メチル−ペントース
類、燐、および還元基、例えばアルデヒド基、の存在を
認定した。分析は、３.９６のメチルペントース／アル
デヒド比、０.９６のメチルペントース／燐比、および
４.１２の燐／アルデヒド比を示した。
【０１０５】緩衝液を用いるセファデックスＧ−５０ス
ーパーファイン（ファーマシア）上でのゲルクロマトグ
ラフィーは、約２,５００の分子量に相当する０.５３８
の分布定数（Ｋｄ）（ヘキソースによる）を示した。
【０１０６】Ｎ.Ｍ.Ｒ.、ガスクロマトグラフィーおよ
び化学量論的分析はオリゴ糖類が約３−４個の基礎的繰
り返し単位からなっていることを示しており、その中に
は免疫優性糖であるガラクトースが見いだされた。
【０１０７】６.２.２.肺炎連鎖球菌型１４多糖の加水
分解 ２ミリグラムの型１４肺炎連鎖球菌莢膜多糖を０.５Ｍ
トリフルオロ酢酸を含有している１ｍｌの水溶液中に溶
解させ、次に油浴中に浸漬されている密封アンプル中で
７０℃の温度において７時間にわたり加水分解させた。
生成したオリゴ糖類を次にＮａＣｌの１５ｍＭ溶液を用
いてｐＨ７.０において４℃でコンディショニングされ
ているセファデックスＧ１５（ファーマシア、ウップサ
ラ）上でのクロマトグラフィーにより反応混合物から分
離した。
【０１０８】次にクロマトグラフィー流出液をヘキソサ
ミンおよびアルデヒド含有量に関して分析し、そして
３.１７のヘキソサミン対アルデヒド比を有することが
見いだされた。ガスクロマトグラフィーおよび化学量論
的分析は、３−４個の基礎的繰り返し単位に相当する分
子寸法を示した。ガスクロマトグラフィーにより測定さ
れたガラクトースの脱分枝鎖は１０％以内であった。１
５ｍＭ ＮａＣｌを用いるｐＨ７.０におけるセファデッ
クスＧ−５０スーパーファイン（ファーマシア）上での
ゲルクロマトグラフィーは、オリゴ糖に関しては、合計
ヘキソースにより測定された０.３０の分布定数（Ｋ
ｄ）を示した。
【０１０９】６.２.３.肺炎連鎖球菌型１９Ｆ多糖の加
水分解 ２ミリグラムの型１９Ｆ肺炎連鎖球菌莢膜多糖を１０ｍ
Ｍの酢酸を含有している１ｍｌの水溶液中にｐＨ＝３.
４において溶解させ、次に油浴中に浸漬されている密封
アンプル中で５０℃の温度において４８時間にわたり加
水分解させた。生成したオリゴ糖類を次にＮａＣｌの１
５ｍＭ溶液を用いてｐＨ７.０において４℃でコンディ
ショニングされているセファデックスＧ１５（ファーマ
シア、ウップサラ）上でのクロマトグラフィーにより反
応混合物から分離した。
【０１１０】次にクロマトグラフィー流出液を、カバッ
ト(Kabat)により報告されている工程（１９６４、「実
験的免疫化学(Experimental Immunochemistry)」、Ｅ.
Ａ.ラバット(Rabat)およびメイヤー(Mayer)、５３８−
５４１）、チェン(Chen)他（１９５６、アナリティカル
・ケミストリー(Anal. Chem.)、２８：１７５６−１７
５８）、並びにポロ(Porro)他（１９８１、アナリティ
カル・バイオケミストリー(Anal. Biochem.)、１１８：
３０１−３０６）に従い分析して、メチル−ペントース
類、燐、および還元基、例えばアルデヒド基、の存在を
認定した。分析は、３.５のメチルペントース／還元さ
れたメチルペントース比、および３.２のメチルペント
ース／燐比を示した。
【０１１１】セファデックスＧ−５０スーパーファイン
（ファーマシア）上でのゲルクロマトグラフィーはオリ
ゴ糖に関するＫｄ＝０.４６（ヘキソースによる）を示
し、そしてガスクロマトグラフィーおよび化学量論の組
み合わせ分析は３−４個の規則的繰り返し単位に相当す
る寸法を示した。
【０１１２】６.２.４.肺炎連鎖球菌型２３Ｆ多糖の加
水分解 ２ミリグラムの型２３Ｆ肺炎連鎖球菌莢膜多糖を０.２
５Ｍトリフルオロ酢酸を含有している１ｍｌの水溶液中
に溶解させ、次に油浴中に浸漬されている密封アンプル
中で７０℃の温度において３時間にわたり加水分解させ
た。生成したオリゴ糖類を次にＮａＣｌの１５ｍＭ溶液
を用いてｐＨ＝７.０において４℃でコンディショニン
グされているセファデックスＧ１５（ファーマシア、ウ
ップサラ）上でのクロマトグラフィーにより反応混合物
から分離した。
【０１１３】次にクロマトグラフィー流出液を、カバッ
ト(Kabat)により報告されている工程（１９６４、「実
験的免疫化学(Experimental Immunochemistry)」、Ｅ.
Ａ.ラバット(Rabat)およびメイヤー(Mayer)、５３８−
５４１）、チェン(Chen)他（１９５６、アナリティカル
・ケミストリー(Anal. Chem.)、２８：１７５６−１７
５８）、並びにポロ(Porro)他（１９８１、アナリティ
カル・バイオケミストリー(Anal. Biochem.)、１１８：
３０１−３０６）に従い分析して、メチル−ペントース
類、燐、および還元基、例えばアルデヒド基、の存在を
認定した。分析は、４.５−４.５のメチルペントース／
アルデヒド比、２.３のヘキソース／メチルペントース
比、および２.９の燐／アルデヒド比を示した。
【０１１４】ガスクロマトグラフィーおよび化学量論的
分析は、３.５−４.５個の間の基礎的繰り返し単位の存
在を示した。ガスクロマトグラフィーにより測定された
ラムノースの脱分枝鎖は８％以下であった。
【０１１５】セファデックスＧ−５０スーパーファイン
（ファーマシア）上でのゲルクロマトグラフィーは、
０.３８の分布定数（Ｋｄ）（ヘキソースによる）を示
した。
【０１１６】６.３.肺炎連鎖球菌オリゴ糖ハプテン類の
免疫化学的特性 肺炎連鎖球菌型６Ａ、１４、１９Ｆ、および２３Ｆオリ
ゴ糖類が元の莢膜多糖類に対する抗体と相互反応する能
力を、ポロ(Porro)他（１９８５、モレキュラー・イミ
ュノロジー(Mol. Immunol.)、２２：９０７−９１９）
中に記載されている如くして、ハプテン（すなわちオリ
ゴ糖）が抗体免疫沈澱反応に対する均質抗原（莢膜多
糖）を抑制する能力を測定する技術を使用して測定した
（低分子量ハプテン類は均質抗体に対して試験された時
は免疫沈澱反応を示さない）。
【０１１７】「示差免疫電気泳動」と称されている方法
は下記の如くして実施された：免疫電気泳動用のプラス
チック板支持体は３個の１％（重量／容量）アガロース
室（アガロースＭ−ＬＫＢ、ブロンマ、スウェーデン）
を含有していた。第一室は０.０５％（容量／容量）の
莢膜多糖に対する対照抗血清を含有していた。第二室は
０.０５％（容量／容量）の既知量の対照莢膜多糖を用
いて３７℃において１５分間にわたりあらかじめ培養さ
れている莢膜多糖に対する対照抗血清を含有していた。
第三室は０.０５％（容量／容量）の既知量のオリゴ糖
ハプテンを用いてあらかじめ培養されている莢膜多糖に
対する対照抗血清を含有していた。４回の連続的な２倍
希釈における莢膜多糖の電気泳動分離を次に７０Ｖ／ｃ
ｍにおいて２０ｍＭトリス−バルビチュレート緩衝液、
ｐＨ＝８.８、中で９０分間にわたり行った。電気泳動
後に、板を銀−染色し、乾燥し、そして定量化した。オ
リゴ糖分子による抑制は、ハプテンを用いて予備培養さ
れた対照抗血清を含有している室の中で現れる比較的高
い「ロケット」免疫沈澱により証明された。ハプテンの
最小抑制濃度は
【０１１８】
【数１】 により計算され、ここで ＣHa＝ゲル中で試験されたハプテンの濃度 ｈAg＝対照抗原がゲル中にあった時に得られた「ロケッ
ト」免疫沈澱の高さにより測定された直線の切片 ｈHa＝試験されたハプテンがゲル中にあった時に得られ
た「ロケット」免疫沈澱の高さにより測定された直線の
切片 同様に、
【０１１９】
【数２】 種々の寸法のオリゴ糖ハプテン類を試験した。
【０１２０】オリゴ糖が特異性抗体により莢膜多糖類の
免疫沈澱を遮蔽する能力も、放射免疫拡散の非電気泳動
方法により試験された。この方法により、オリゴ糖分子
による抑制はあらかじめ一定量の抑制剤（オリゴ糖）を
用いて培養された特異性抗体を含有している１重量／容
量％アガロース中の抗原（莢膜多糖）の拡散により生成
した大きい半径の免疫沈澱により証明された。一定ハプ
テンに関する最小結合濃度（ＭＣＣ）が実験的に得られ
たら、特異性を次に前記式：
【０１２１】
【数３】 に従い計算する。
【０１２２】
【表３】 表III 肺炎連鎖球菌オリゴ糖ハプテン類の免疫化学的特性 オリゴ糖型 ＤＰ ＭＷ (MICPs/MICHp) (MCCPs/MCCHp) DIEPによる IRIDによる 6A 2 1.5K 10-3 3.5 2.5K 10-3 10-3 10 7.0K 10-1 14 5 3.5K n.t. 10-1 15 10.4K n.t. 10-1 19F 3.5 2.2K 10-3 10-4 23F CH3COOH(hyd) 3 2.3K 10-3 10-2 6 4.5K 10-1 10-1 TFA(hyd) 4.5 3.4K 10-4 5×10-3 9.5 7.2K 10-1 10-1 n.t. = 試験不能 DIEP = 示差免疫電気泳動 IRID = 放射免疫拡散の抑制 MIC = 最小抑制濃度 MCC = 最小合計濃度 ６.４.肺炎連鎖球菌オリゴ糖類の末端−還元単位の活性
化 上記の６.２章に記載されている如くして得られたオリ
ゴ糖ハプテン類を水中に約５ｍｇ／ｍｌの最終的濃度と
なるまで溶解させた。各溶液に、１ミリリットルの溶液
容量に対して０.１ｍｌの０.２Ｍ ＫＨ2ＰＯ4を加え、
そして必要量のジアミノメタン（一般的には、１ミリリ
ットルの溶液に対して２μｌのジアミノメタンの量が必
要である）によりｐＨを９.２−９.４に高めた。混合物
を１００℃に１５分間にわたり保ち、この時点で１ミリ
リットルの溶液容量に対して約４μｌの量のピリジンボ
ランを加えた。ｐＨを１Ｎ ＮａＯＨにより調節した。
次に混合物を密封されたアンプル中で油浴に５０℃にお
いてその後４８時間にわたり移した。その後に、アミノ
−活性化されたオリゴ糖溶液を１Ｎ ＨＣｌにより中和
し、そしてセファデックスＧ−１５スーパーファイン
（１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.０１）上で精製した。集
められたクロマトグラフィー留分類を貯蔵し、そして凍
結乾燥した。次に、凍結乾燥された残渣をＤＭＳＯ中に
１０ｍｇ／ｍｌにおいて溶解させ、そして凍結乾燥され
た化合物中に存在しているアミノ基の量に関して５：１
モル／モル比に相当するモル量のＳＩＤＥＡ（またはＳ
ＩＤＥＳ）に加えた。反応を室温において４時間にわた
り進行させ、そして次にエステル活性化されたオリゴ糖
を沈澱させるために該溶液に４容量の１,４ジオキサン
（最終的濃度１,４ジオキサン中８０％）を加えた。遠
心により集められた沈澱を１,４ジオキサンを用いて３
回洗浄し、そして結合工程で使用されない場合には−２
０℃以下に保たれた。４種のオリゴ糖類のそれぞれに関
する活性化工程の収率は表IVに示されている。
【０１２３】
【表４】 表IV 肺炎連鎖球菌オリゴ糖活性化： 工程の収率（％重量／重量） 血清型 オリゴ-NH(CH2)2NH2 オリゴ-NH(CH2)2NH-モノエステル 全体 6A 75 93 70 14 73 90 66 19F 100 100 100 23F 50 90 45 Xg(±s.d.) 74.5(±20) 93.3(±4.7) 70(±23) ６.５.活性化されたオリゴ糖のＣＲＭ197蛋白質に対す
る結合 ６.５.１.ＣＲＭ197蛋白質の製造 ジフテリア菌Ｃ７（Ｂtx-197）により製造されたＣＲＭ
197をミリポールＸＭ−５０（ＮＭＷＬ５×１０-4）膜
を用いる分子濾過により培養媒体から分離した。次に濾
液に硫酸アンモニウムの飽和溶液（６５％重量／容量）
を加えることにより沈澱させた。沈澱した蛋白質を遠心
により集め、そして０.０１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ＝７.
２）中に再溶解させた。
【０１２４】０.０１Ｍ燐酸塩緩衝液中でｐＨ７.２にお
いてコンディショニングされた２.５×１００ｃｍＤＥ
ＡＥ−セファロース６Ｂ／ＣＬカラム（ファーマシア、
アップサラ）を用い、溶離剤として０.０１Ｍ燐酸塩中
の０.０９Ｍ ＮａＣｌを用いるイオン−交換クロマトグ
ラフィーにより、ＣＲＭ197をさらに精製した。
【０１２５】還元条件下でのＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（パッペンハイマー(Pappenheimer)他、１
９７２、イミュノケミストリー(Immunochem.)、９：８
９１−９０６）は、得られたＣＲＭ197の８０％がそれ
の元の分子形で得られた。蛋白質の純度は１ミリグラム
当たり約４００のフロキュレーション限度（Ｌｆ）であ
ることが見いだされた。
【０１２６】６.５.２.活性化されたオリゴ糖類の結合 結合工程は、担体蛋白質ＣＲＭ197のリシン残基のエプ
シロン−アミノ基に対するモノスクシンイミジルエステ
ル−活性化されたオリゴ糖ハプテン類の結合からなって
いる。
【０１２７】肺炎連鎖球菌方６Ａ、１４、１９Ｆ、およ
び２３Ｆ莢膜多糖類のモノスクシンイミジルエステル
（アジピン酸の）を含有しているジメチルスルホキシド
を次に２ｍｇ／ｍｌのＣＲＭ197を含有しているｐＨ＝
８.０の０.１Ｍ炭酸水素塩溶液に加えてエステルで活性
化されたオリゴ糖対担体蛋白質の全アミノ基のモル比が
１：２である５０％水溶液を製造した。
【０１２８】このようにして得られた混合物を、穏やか
に撹拌しながら、４℃において１５時間保った。４種の
血清型のそれぞれからのオリゴ糖類を蛋白質に分離反応
で結合させた。得られたグリコ結合体の物理化学的特性
のまとめを表Ｖに示す。
【０１２９】
【表５】 表Ｖ グリコ結合体特性 SD MW結合体 (モルオリゴ/血清型 DPオリゴ MWオリゴ (SDS-PAGE) モル蛋白質 %(w/w)結合体蛋白質 6A 3 2.1K 77.6K 7 100 14 5 3.5K 85.1K 6 100 19F 3 1.9K 69.2K 4 10023F 6 4.5K 85.0K 5 100 ６.５.２.１.結合剤としてアジピン酸のスクシンイミジ
ルエステル対琥珀酸のスクシンイミジルエステルを使用
する結合効果の比較 琥珀酸のスクシンイミジルエステル（ＳＩＤＥＳ）との
反応により製造された活性化されたオリゴ糖類は構造式
【０１３０】
【化１】
【０１３１】を有しており、一方、アジピン酸のスクシ
ンイミジルエステル（ＳＩＤＥＡ）との反応により製造
された活性化されたオリゴ糖類は構造式
【０１３２】
【化２】
【０１３３】を有しており、そしてそれによりオリゴ糖
と結合された蛋白質の間の種々の寸法の結合剤を生成し
た（図２参照）。ＳＩＤＥＳおよびＳＩＤＥＡで活性化
されたオリゴ糖類を用いる結合の効果を評価した。図３
Ａ、ＢおよびＣ中に示されている如く、結合剤がＳＩＤ
ＥＡから誘導された時だけ蛋白質は完全にグリコシル化
された形であるようである（少量のＣＲＭ197の遊離帯
が検出可能であるかまたは検出できない場合）。
【０１３４】６.６.肺炎連鎖球菌グリコ結合体の免疫原
性 ４種のグリコ結合体抗原の数種の調合物を製造しそして
１価調合物（１回の投与当たり２.５−５.０μｇオリゴ
糖）または多価調合物（１回の投与当たり２.５μｇの
各オリゴ糖）中で鉱物佐薬としての水酸化アルミニウム
［Ａｌ(ＯＨ3)］を用いておよび用いずに（多価調合物
中でのみ１回の投与当たり１ｍｇが投与された）、表V
I）中に示されているスケジュール：型−特異性グリコ
結合体に従い）鼠で試験した。ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動またはロケット免疫電気泳動による多
価調合物の上澄み液の処理は検出可能量の遊離蛋白質を
示さないため、Ａｌ(ＯＨ3)に対する４種のグリコ結合
体の完全吸収が採用された条件下で生じた。各グリコ結
合体の平均投与は約２.５μｇのオリゴ糖および１３μ
ｇの担体蛋白質ＣＲＭ197（ジフテリアトキソイドの平
均人間ワクチン投与に相当する）を含有していた。免疫
化スケジュールは初回投与および４週間離した２回の追
加投与を含んでいた。採血は０、４、６、および１０週
に行われた。
【０１３５】
【表６】 表VI 兎およびハツカネズミに関する免疫スケジュール並びにワクチン類の投与量 ０、４、８週における免疫化 ０、４、６、１０週における採血 Ａ.可溶性の１価（単一型）調合物 １投与量（０.５ｍｌ）：２.５μｇのオリゴ糖および １３μｇ（５Ｌｆ）のＣＲＭ197 １投与量（０.５ｍｌ）：５.０μｇのオリゴ糖および ２６μｇ（１０Ｌｆ）のＣＲＭ197 Ｂ.可溶性の多価（混合４型）調合物 １投与量（０.５ｍｌ）：２.５μｇの型−特異性オリゴ（合計＝ １０μｇオリゴ）および 合計５２μｇ（２０Ｌｆ）のＣＲＭ197 Ｃ.Ａｌ(ＯＨ)3−ａｄｓ多価（混合４型）調合物 １投与量（０.５ｍｌ）：２.５μｇの型−特異性オリゴ（合計＝ １０μｇのオリゴ類）および 合計５２μｇ（２０Ｌｆ）のＣＲＭ197と １ｍｇのＡｌ(ＯＨ)3 表VIIは、型−特異性抗体のＲＩＡ（ＦＡＲＲ方法）推
定量並びに免疫化された動物数に対する応答動物数を示
している。比（Ｒ）は各免疫化投与後に達した倍増を示
している。
【０１３６】表VIIIは、ＩｇＧアイソタイプＡｂに関す
るＥＬＩＳＡ力価並びに免疫化された動物数に対する応
答動物数を示している。比−Ｒ1−Ｒ2−Ｒ3は各免疫化
投与後の力価における倍増を示しており、一方、比−Ｒ
1、−Ｒ2、−Ｒ3は予備力価に関する一定の免疫化投与
に関する力価における倍増を示している。表IXは、生き
ている連鎖球菌上での多糖カプセルの認識における誘導
されたＩｇＧ抗体の官能性に関する定性的結果を報告し
ている（クエルラング反応またはノイフェルド試験）。
【０１３７】表Ｘは、ヴェロ細胞検定により推定されて
いる如く、担体蛋白質ＣＲＭ197による鼠中で誘導され
たジフテリア毒素−中和力価を示している。そのような
対照ＦＤＡ抗血清が対照用として使用され、μ／ｍｌで
表されている力価も含まれている。
【０１３８】
【表７】 表VII 担体蛋白質ＣＲＭ197と共有結合された肺炎連鎖球菌型６Ａ、１４、１９Ｆ、２３Ｆのオリゴ糖類***で免疫化された**兎のＲＩＡ−推定力価* 可溶性形 Al(OH)3-ads形 0週 4週 6週 11週 0週 4週 6週 11週 型6A n.d. n.d. 230(1/6) 495(6/6) n.d. 538(5/5) 3,190(5/5) 4,064(5/5) R=6.0 R=1.3 型14 n.d. n.d. 150(2/6) 195(2/6) n.d. 77(3/6) 203(4/5) 216(5/5) R=2.6 R=1.1 型19F n.d. n.d. n.d. 75(6/6) n.d. 72(6/6) 108(5/5) 188(5/5) R=1.5 R=1.7型23F n.d. n.d. 400(1/6) 140(1/5) n.d. 283(3/6) n.d. 246(5/5) * 力価、ｎｇＮAb、の幾何学的平均として表示されてい
るデータ。応答動物対免疫化された合計動物は括弧内に
ある。
【０１３９】** 可溶性およびＡｌ(ＯＨ)3−吸収（１ｍ
ｇ／投与量）形の４種のグリコ結合体の多価調合物。各
グリコ結合体は平均２.５μｇのオリゴ糖および平均１
３μｇの蛋白質ＣＲＭ197を含有していた。０、４およ
び９週において免疫化。０、４、６および１１週におい
て交配。
【０１４０】*** 型６Ａおよび１９Ｆオリゴ糖類は平均
ＤＰ＝３を有していた。
【０１４１】型１４および２３Ｆオリゴ糖類は平均ＤＰ
＝５を有していた。
【０１４２】**** 型６Ａのグリコ結合体は１単位の担
体蛋白質当たり７に等しいオリゴ糖類の平均置換度（Ｓ
Ｄ）を有していた。
【０１４３】型１４グリコ結合体に関するＳＤは６であ
り、型１９Ｆに関しては４であり、そして関しては２３
Ｆに関しては５であった。
【０１４４】
【表８】 表VIII 鉱物佐薬Ａｌ(ＯＨ)3に吸収された肺炎連鎖球菌ＤＰ＝３＋６莢膜オリゴ糖類型 ６Ａ、１４、１９Ｆ、２３Ｆのグリコ結合体を含む多価ワクチンにより誘発され たＩｇＧアイソタイプＡｂ力価のＥＬＩＳＡ結果* 予備力価 初回 １回追加 ２回追加 (０週) (４週) (６週) (１０週) 型６Ａ <50(0/5) 4,800(5/5) 51,200(5/5) 130,000(5/5) R1>96.0 R2=10.7 (α<0.01) R3=2.5 (α<0.01) R2′>1,027 R3′>2,600 型１４ <50(0/5) 360(5/5) 4,480(5/5) 19,000(5/5) R1>7.2 R2=12.4(α<0.01) R3=4.4 (α<0.01) R2′>89.3 R3′>396.0 型１９Ｆ <50(0/5) 2,080(5/5) 18,560(5/5) 35,200(5/5) R1>41.6 R2=9.0 (α<0.01) R3=1.9 (α<0.01) R2′>371.2 R3′>704.0 型２３Ｆ <50(0/5) 880(5/5) 1,280(5/5) 11,880** R1>17.6 R2=1.5(α<0.01) R3=9.3 (α<0.01) R2′>25.6 R3′>237.6 * 反応背景の２倍のＡＢＳ価を示す最高血清希釈度の逆数
の幾何学的平均として表示されている力価。
【０１４５】**値は異常に高い応答動物兎の力値を含ん
でいる。血清型２３Ｆに関しては５匹の免疫化されたう
ちの最良および最悪の応答動物の２匹を捨てて、ここで
は残りの３匹の兎の結果である： (週０) (週４) (週６) (週１１) <50(0/5) 667(3/3) 1,333(3/3) 2,667(3/3) R1>13.3 R2=2.0 (α<0.01) R3=2.0 (α<0.01) R2′>26.7 R3′>53.3
【０１４６】
【表９】 表IX ＣＲＭ197とＤＰ＝３−６オリゴ−結合体に対する兎血清Ａｂの免疫学的官能性 定量的分析 （莢膜認識に関する膨化反応* ） 型６Ａ 肺炎連鎖球菌： 陽性反応 型１４ 肺炎連鎖球菌： 陽性反応 型１９Ｆ肺炎連鎖球菌： 陽性反応 型２３Ｆ肺炎連鎖球菌： 陽性反応 * オーストリアン（１９７６）、Mt. Sinai J. Med.、
４３：６９９−７０９の方法に従い行われた。
【０１４７】
【表１０】 表Ｘ 担体蛋白質ＣＲＭ197に共有結合された肺炎連鎖球菌のオリゴ糖類を用いて合成 された多価グリコ結合体により免疫化された兎中で誘発されたヴェロ細胞検定を 用いる抗ジフテリア力価* 予備力価 初回 １回追加 ２回追加 (０週) (４週) (６週) (１１週) 可溶性形 <10 <10 25(0.019 1,920(1.4 μ/ml) μ/ml) R=2.5 R=77.0 Al(OH)3-ads <10 20(0.015 1,280(0.96 3,840(2.9 μ/ml) μ/ml) μ/ml) R=64.0 R=3.0 ＦＤＡ対照抗血清は６μ／ｍｌを含有しておりそして１
／８,０００希釈度で５０％予防を与えた。
【０１４８】* ジフテリア毒素に対する露呈後に3Ｈ−
ロイシン導入により推定されている如く、抗血清のプー
ルが細胞の５０％予防を示してい希釈度の逆数として表
示されている力価。
【０１４９】括弧内の数は対照としてＦＤＡ対照抗血清
を用いて測定された力価、μ／ｍｌ、を示している。
【０１５０】６.７.鎖長ＤＰ＝１０−２０のオリゴ糖は
亜最適免疫原性である 上記の合成方式に従うが２種の「領域−価」の鎖長すな
わちＤＰ＝３−５およびＤＰ＝１０−２０を有する型６
Ａ、１４、１９Ｆ、および２３Ｆ肺炎連鎖球菌の糖類を
用いて、２群のグリコ結合体ワクチンを合成した。例え
ばＤＰ＝３オリゴ糖の如きはるかに短い鎖長と比較し
て、ＤＰ＝２０以上のオリゴ糖も（選択された担体蛋白
質ＣＲＭ197に対する結合時に）初回および追加能力に
関して最適免疫原であるかどうかが次に問題となった。
【０１５１】兎を表XI中に略記されている処方を用いて
免疫化した。表XIIおよびXIII中に表示されているＡｌ
(ＯＨ)3に吸着されているそれぞれＤＰ＝１０−１４お
よびＤＰ＝３−６の肺炎連鎖球菌オリゴ糖類により誘発
されるＩｇＧアイソタイプ抗体のＥＬＩＳＡ結果に関す
る結果を比較することにより示されている如く、ＤＰ＝
１０−１４は増加した免疫原性を有していなかった。実
際には、ＤＰ＝３−５オリゴ糖結合体のＩｇＧ初回およ
び追加活性はＤＰ＝１０−１４オリゴ糖結合体を用いて
観察された活性よりはるかに大きかった。偶然でなく、
研究された４種全ての炭水化物構造体には同様な結果が
得られた。さらに、ＤＰ＝１０−１４を有するグリコ結
合体によるジフテリア毒素の中和は鎖長ＤＰ３−６を有
するグリコ結合体を使用して得られるものより効果的で
ないことが見いだされた（表XVI）。従って、鎖長ＤＰ
＝１０−２０のオリゴ糖類は本発明の結合体中では官能
性であるが、ＤＰ＝３−６のオリゴ糖類は抗体の比較的
高い力価を誘発する。
【０１５２】
【表１１】 表XI 兎に対する免疫化スケジュール グリコ結合体のモデルを２.５μｇの炭水化物の投与量で注射した。試験された モデルは共有結合されたオリゴ糖類の鎖長だけが異なっているため、対応する量 の担体蛋白質は下記の如くであった： 炭水化物の 蛋白質担体の 投与量 投与量 重量比 (μｇ) (μｇ) (ｗｗ) ＤＰ＝３−６ ２.５ １２.５ ０.２ オリゴ−ＣＲＭ197 ＤＰ＝１０−１４ ２.５ ２.５ １.０ オリゴ−ＣＲＭ197 ０、４および８週において免疫化 ０、４および１０週において採血
【０１５３】
【表１２】 表XII 可溶性形の肺炎連鎖球菌ＤＰ＝１０−１４莢膜オリゴ糖類型６Ａ、１４、１９Ｆ 、２３Ｆのグリコ結合体を含む多価ワクチンにより誘発されたＩｇＧアイソタイ プＡｂ力価のＥＬＩＳＡ結果 予備力価 初回 １回追加 ２回追加 (０週) (４週) (６週) (１０週) 型６Ａ <100 <100 <100 500 (2/5) 型１４ <100 300 2,400 (3/5) 4,600 (3/5) 型１９Ｆ <100 <100 <100 <100型２３Ｆ <100 <100 <100 <100
【０１５４】
【表１３】 表XIII 可溶性形の肺炎連鎖球菌ＤＰ＝３−６莢膜オリゴ糖類型６Ａ、１４、１９Ｆ、 ２３Ｆのグリコ結合体を含む多価ワクチンにより誘発されたＩｇＧアイソタイプ Ａｂ力価のＥＬＩＳＡ結果 予備力価 初回 １回追加 ２回追加 (０週) (４週) (６週) (１１週) 型６Ａ <50 <200 967 (6/6) 8,500 (6/6) R3=8.8(α<0.01) 型１４ <50 1,800 3,266 (3/6) 3,650 (4/6) 型１９Ｆ <50 <50 675 (4/6) 1,750 (6/6)型２３Ｆ <50 <50 <50 <50
【０１５５】
【表１４】 表XIV 鉱物佐薬Ａｌ(ＯＨ)3に吸収された肺炎連鎖球菌ＤＰ＝１０−１４莢膜オリゴ糖 類型６Ａ、１４、１９Ｆ、２３Ｆのグリコ結合体を含む多価ワクチンにより誘発 されたＩｇＧアイソタイプＡｂ力価のＥＬＩＳＡ結果 予備力価 初回 １回追加 ２回追加 (０週) (４週) (６週) (１０週) 型６Ａ <100 240 (5/5) 900 (5/5) 500 (5/5) R1>2.4 R2=3.8 (α<0.01) R2>9.0 型１４ <100 300 (5/5) 1,040 (5/5) 8,480 (5/5) R1>3.0 R2=3.5 (α<0.01) R3=8.2 (α<0.01) R2>10.4 R3>84.9 型１９Ｆ <100 <100 400 (1/5) 800 (1/5)型２３Ｆ <100 <100 <100 200 (1/5)
【０１５６】
【表１５】 表XV 鉱物佐薬Ａｌ(ＯＨ)3に吸収された肺炎連鎖球菌ＤＰ＝１０−１４莢膜オリゴ糖 類型６Ａ、１４、１９Ｆ、２３Ｆのグリコ結合体を含む多価ワクチンにより誘発 されたＩｇＧアイソタイプＡＢ力価*の表IVＥＬＩＳＡ結果 予備力価 初回 １回追加 ２回追加 (０週) (４週) (６週) (１１週) 型６Ａ <50(0/5) 4,800(5/5) 51,200(5/5) 130,000(5/5) R1>96.0 R2=10.7(α<0.01) R3=2.5 (α<0.01) R2>1,027 R3>2,600 型１４ <50(0/5) 360(5/5) 4,480(5/5) 19,800(5/5) R1>7.2 R2=12.4(α<0.01) R3=4.4 (α<0.01) R2>89.3 R3>396.0 型１９Ｆ <50(0/5) 2,080(5/5) 18,560(5/5) 35,200(5/5) R1>41.6 R2=9.0(α<0.01) R3=1.9 (α<0.01) R2>371.2 R3>704.0 型２３Ｆ <50(0/5) 880(5/5) 1,280(5/5) 11,880(5/5) R1>17.6 R2=1.5(α<0.01) R3=9.3 (α<0.01) R2>25.6 R3>237.6 * 反応背景の２倍のＡＢＳ価を示す最高血清希釈度の逆
数の幾何学的平均として表示されている力価。括弧内に
は動物数が報告されている（全注射に対する応答）
【０１５７】
【表１６】 表XVI 肺炎連鎖球菌−ＣＲＭ197グリコ結合体で免疫化された兎からの血清を用いるジ フテリア毒素の試験管内中和* 予備力価 初回 １回追加 ２回追加 (０週) (４週) (６週) (１０週) ＤＰ＝３−６オリゴＣＲＭ197 ： 可溶性 <1/10 <1/10 1.20 1/1,280 (0.03φ/ml) (2.05φ/ml) Al(OH)3ads <1/10 <1/10 1.20 1/1,280 (0.016φ/ml) (1.02φ/ml) (4.10φ/ml) ＤＰ＝１０−１４オリゴＣＲＭ197 ： 可溶性 <1/10 <1/10 <1/10 1/10 (0.016φ/ml) Al(OH)3ads <1/10 <1/10 1/40 1/80 (0.06φ/ml) (0.13φ/ml) * ジフテリア毒素に対する細胞の露呈後に3Ｈ−ロイシ
ン導入により推定されている、兎血清のプールが細胞の
５０％予防を示す希釈度の逆数として表示されている力
価。括弧内の数は対照としてのＦＤＡ対照抗血清により
測定された力価、μｇ／ｍｌ、を示している。
【０１５８】人間中で推定されるＭＰＬ：０.０１μｇ
／ｍｌ。 ６.８.グリコ結合体に対する免疫応答は単一特異性であ
りそして均質である 放射免疫検定（ＲＩＡ）および酵素結合されたイミュノ
ソルバント(immunosorbant)検定（ＥＬＩＳＡ）により
測定された抗体力価に関する表VIIおよびVIII中に記さ
れている結果の比較は、ＲＩＡ推定力価がＥＬＩＳＡ−
推定価より一貫して低いことを示している。この観察結
果は、抗−グリコ結合体抗血清の放射免疫拡散およびロ
ケット電気泳動に関して使用されたアガロースゲルの不
存在と一緒になって、肺炎連鎖球菌オリゴ糖−ＣＲＭ
197に対する兎抗血清がオリゴ糖類を生成するために使
用されたそれぞれ精製された炭水化物重合体を沈澱させ
ることのできなかった高度に特異性のＩｇＧアイソタイ
プ抗体を含有していたことを証明している。
【０１５９】抗血清中の抗体の沈澱の不存在は、単一特
異性すなわち一定分子の抗原性レペルトイレ(repertoir
e)中の単一対掌体の抗体認識を示している（ベルゾフス
キー(Berzofsky)−シェフター(Schechter)、１９８１、
モレキュラー・イミュノロジー(Molecular Immunol.)、
１８：７５１−７６３）。抗原−抗体複合体の沈澱は、
結合された抗原および抗体分子の三次元分枝鎖網目構造
を生じる格子生成を必要とする。これを生じるために
は、１個より多い抗体が１個の抗原分子に同時に結合し
なければならないので抗原および抗体の両者の多価性が
必要である。従って、肺炎連鎖球菌オリゴ糖−ＣＲＭ
197に対する兎抗血清と均質な精製された高分子量莢膜
多糖の間で生じる観察可能な免疫沈澱は、抗血清が炭水
化物重合体に対して特異性である抗体を含有しているが
（ＥＬＩＳＡおよび抑制−ＥＬＩＳＡ分析により示され
ている）多糖の１回だけの測定（対掌体）に向いている
ことを強く示している。
【０１６０】免疫沈澱活性を示すことの他に、抗体の不
均質集団も下記の性質を一般的に有している：抗体応答
を誘発させるために使用される抗原の１個の対掌体は完
全抗原に対する抗体の全集団の結合を完全には抑制しな
いが、１個の対掌体に対する抗体結合だけを抑制して、
他の抗体は完全抗原上に存在している残りの対掌体とは
結合していないままであろう。抗体の集団をＥＬＩＳＡ
−抑制検定により不均質性に関して評価することができ
る。この検定では、抗体の集団が完全抗原と結合する能
力を例えば抗原の単離された対掌体の如き抗原／抗体結
合の抑制剤の存在下で測定することができる。標識の付
いた完全抗原に対する抗体の結合が濃度が増加している
標識の付いていない完全抗原の存在下で測定される時に
図式的に表すと、Ｓ状曲線が生じ、それを抗体／抗原結
合に関する標準的曲線として使用することができる。抗
体集団が不均質であるなら、抗体および完全抗原との間
の結合は１個の抗原性対掌体の添加により完全に抑制す
ることはできず、そして抗体／抗原結合の標準的曲線は
部分的に置換され（部分的に重複または部分的に平行に
され）、他の抗原／抗体相互反応は試験される対掌体が
有するものとは区別されて、優性である。逆に、抗原に
対する抗体の均質集団の結合は単離された対掌体の添加
により完全に抑制することができ、抗体の均質集団に関
する標準的なＳ状抗原／抗体結合曲線は集団の特異性に
相当する単離された対掌体の添加により生じた曲線によ
り重複または平行化されるであろう。
【０１６１】この方法で肺炎連鎖球菌グリコ結合体誘発
された兎ＩｇＧを試験することにより、抗体の均質集団
に対して予測されたものに対応する親和力様式が実験的
に観察された（図４）。肺炎連鎖球菌６Ａオリゴ糖（非
−結合形または結合形）は血清型６Ａ高分子量莢膜多糖
を用いて誘導されたものとほぼ平行な結合抑制Ｓ状曲線
を有していた。予期されたように、遊離（結合剤−活性
化された）または結合形の不均質（型１４）オリゴ糖は
型６Ａ抗原に対して特異性であるＩｇＧアイソタイプ集
団を抑制しなかった。
【０１６２】本発明の主なる特徴および態様は以下のと
おりである。
【０１６３】１．（ｉ）末端還元性基を有するオリゴ糖
をピリジンボランの存在下でジアミノエタンと、還元性
アミノ化が起きるような方法で反応させ、そして （ii）（ｉ）のアミノ化されたオリゴ糖生成物を、２個
の官能基を有しておりそれの一方が活性化されたオリゴ
糖の末端基と反応可能でありそして他方が担体蛋白質と
反応可能であるような分子と、反応させ、そして （iii）（ii）の活性化されたオリゴ糖生成物を該担体
蛋白質と、結合が起きるような方法で反応させる 工程からなる、オリゴ糖および担体蛋白質の共有結合体
の製造方法。
【０１６４】２．工程（ii）の２個の官能基を有する分
子がジエステルである、上記１の方法。
【０１６５】３．工程（ii）の２個の官能基を有する分
子がアジピン酸のジエステルまたは琥珀酸のジエステル
である、上記１の方法。
【０１６６】４．（ｉ）多糖を加水分解して、少なくと
も１個の末端還元性基を有するオリゴ糖類を製造し、そ
して （ii）該オリゴ糖類をピリジンボランの存在下でジアミ
ノエタンと、還元性アミノ化が起きるような方法で反応
させ、そして （iii）（ii）のアミノ化されたオリゴ糖生成物を、２
個の官能基を有しておりそれの一方が活性化されたオリ
ゴ糖の末端基と反応可能でありそして他方が担体蛋白質
と反応可能であるような分子と、反応させ、そして （iv）（iii）の活性化されたオリゴ糖生成物を該担体
蛋白質と、結合が起きるような方法で反応させる 工程からなる方法により製造された、オリゴ糖および担
体蛋白質の間の共有結合体。
【０１６７】５．工程（iii）の２個の官能基を有する
分子がジエステルである、上記４の共有複合体。
【０１６８】６．オリゴ糖が肺炎連鎖球菌莢膜多糖から
誘導される、上記１、２または３の方法。
【０１６９】７．担体蛋白質がＣＲＭ197である、上記
１、２、３または６の方法。
【０１７０】８．オリゴ糖が肺炎連鎖球菌莢膜多糖から
誘導される、請求項２に記載のオリゴ糖および担体蛋白
質の間の共有結合体。
【０１７１】９．オリゴ糖が型１、２、３、４、５、６
Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１
２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９
Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆからなる群か
ら選択された血清型を有する肺炎連鎖球菌から誘導され
る、上記８の共有複合体。
【０１７２】１０．上記１、２、３、６または７の方法
に従い製造されたワクチン。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はオリゴ糖−蛋白質結合体の合成用の一般
的工程を示している。
【図２】図２は結合工程における「特別仕様」スペーサ
ーの使用を示している。
【図３】図３はアジピン酸対琥珀酸誘導体スペーサーを
含有している活性化されたオリゴ糖類に対するＣＲＭ
197の結合の効果および結合反応の生成物のＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（銀染色）を示してい
る。
【図４】図４は肺炎連鎖球菌オリゴ糖６Ａ−ＣＲＭ197
結合体に対する兎のＩｇＧ応答および莢膜多糖類に対し
て誘発されたＩｇＧアイソタイプの親和性価の抑制−Ｅ
ＬＩＳＡ分析を示している。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年１１月２１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ｉ）末端還元性基を有するオリゴ糖を
    ピリジンボランの存在下でジアミノエタンと、還元性ア
    ミノ化が起きるような方法で反応させ、そして（ii）
    （ｉ）のアミノ化されたオリゴ糖生成物を、２個の官能
    基を有しておりそれの一方が活性化されたオリゴ糖の末
    端基と反応可能でありそして他方が担体蛋白質と反応可
    能であるような分子と、反応させ、そして（iii）（i
    i）の活性化されたオリゴ糖生成物を該担体蛋白質と、
    結合が起きるような方法で反応させる工程からなる、オ
    リゴ糖および担体蛋白質の共有結合体の製造方法。
  2. 【請求項２】 （ｉ）多糖を加水分解して、少なくとも
    １個の末端還元性基を有するオリゴ糖類を製造し、そし
    て（ii）該オリゴ糖類をピリジンボランの存在下でジア
    ミノエタンと、還元性アミノ化が起きるような方法で反
    応させ、そして（iii）（ii）のアミノ化されたオリゴ
    糖生成物を、２個の官能基を有しておりそれの一方が活
    性化されたオリゴ糖の末端基と反応可能でありそして他
    方が担体蛋白質と反応可能であるような分子と、反応さ
    せ、そして（iv）（iii）の活性化されたオリゴ糖生成
    物を該担体蛋白質と、結合が起きるような方法で反応さ
    せる工程からなる方法により製造された、オリゴ糖およ
    び担体蛋白質の間の共有結合体。
  3. 【請求項３】 オリゴ糖が肺炎連鎖球菌莢膜多糖から誘
    導される、請求項２に記載のオリゴ糖および担体蛋白質
    の間の共有結合体。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の方法に従い製造された
    ワクチン。
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