KR20190069479A - 저분자화 PRP를 사용한 Hib 컨쥬게이트 백신의 제조방법 - Google Patents

저분자화 PRP를 사용한 Hib 컨쥬게이트 백신의 제조방법 Download PDF

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Abstract

보존 안정성이 뛰어난 PRP 컨쥬게이트의 조제방법과 Hib 컨쥬게이트 백신의 제조방법이 제공된다. 본 발명의 PRP 컨쥬게이트의 조제방법은 PRP와 캐리어 단백질의 결합반응을 실시하는데 있어서, 네이티브 PRP보다도 저분자화된 PRP를 사용하는 것에　의해, 조제 후의 PRP 컨쥬게이트로부터 PRP의 유리가 억제되는 것을 특징으로 한다. 본 조제방법에 의해 수득한 PRP 컨쥬게이트를 항원으로 하는 Hib 컨쥬게이트 백신에 대해서도 동일하게 보존 안정성이 뛰어나며, 또 충분한 면역원성을 유지하고 있다.

Description

저분자화 PRP를 사용한 Hib 컨쥬게이트 백신의 제조방법
본 발명은 폴리리보실리비톨포스페이트(PRP)와 캐리어 단백질을 결합반응에 의해 PRP 컨쥬게이트를 조제하는 방법, 및 헤모필러스ㆍ인풀루엔자균 b형(Hib) 컨쥬게이트 백신의 제조방법에 관한 것이다.
헤모필러스ㆍ인풀루엔자균은 통성 혐기성 그람 음성 구간균이고, 필라멘트상이나 구균상의 형태를 나타내는 「다형성」이라는 성질을 가지고, 아포나 편모를 가지지 않는다. 협막(capsule)의 유무에 의해 무협막주와 유협막주로 분류되고, 유협막주인 b형주(Hib)의 병원성이 특히 높은 것으로 알려진다. Hib 감염은 영유아에서의 수막염의 주요한 요인이고, 상기도에 정착한 Hib균이 혈중으로 침입하고, 균혈증으로부터 전신으로 확산되고, 수막염, 인두개염, 관절염 등의 전신 감염증을 야기한다.
Hib 감염의 방어에는 Hib의 협막 다당체인 PRP에 대한 항체가 유효하다는 것이 알려져 있지만, PRP 성분에만 의거하는 Hib 백신은 T세포 비의존성 때문에, 면역계가 미숙한 생후 18개월 미만의 영유아에 대해서는 효과 불충분이다. 그래서, PRP에 캐리어 단백질을 컨쥬게이트(결합)시켜서 T세포 의존성으로 한 컨쥬게이트 백신이 개발되어, 영유아에 대해서 사용되고 있다.
PRP 등의 다당류를 캐리어 단백질과 결합한 컨쥬게이트 백신은 공지이다. 특허문헌 1은 Hib와 당 단백질 컨쥬게이트의 제법 및 혼합 백신으로서의 사용에 대해서 개시하고 있고, 특허문헌 2는 올리고당 컨쥬게이트 백신의 개량된 제조방법에 대해서 개시하고 있다.
PRP의 생산방법도 공지이다. 특허문헌 3은 Hib주를 배지에서 배양 후, 상청액을 정제하고, PRP를 추출하는 방법을 개시하고 있다.
파상풍 톡소이드는 WHO 규격에 의해 1,000 LF/mg PN을 넘는 순도가 요구되고 있다. 세계 각국의 제조업자 34사 중 31사는 이 기준을 충족시키고 있고, 그 중 15사는 1,500 LF/mg PN을 넘는 순도를 달성하고 있다는 보고가 있다(비특허문헌 1). 또 유럽약전(EP: European Pharmacopoeia)의 Hib 컨쥬게이트 백신의 규격에서는 >1,500 LF/mg PN으로 되어 있다. 파상풍 톡소이드의 정제방법으로서는 황산 암모늄 침전이나 트리클로로아세트산 침전, 칼럼 크로마트그라피(겔여과 크로마토, 친화성 크로마토그래피), 염석, 투석 등이 사용되고 있다.
다당류와 캐리어 단백질의 결합비에 관한 검토는 특허문헌 4에서 보고되고 있다. 특허문헌 4에 의하면, 다당류의 단백질에 대한 비가 1:0.3 내지 1:2인 것을 특징으로 하는 복합 백신에 대해서 개시되어 있다.
Hib 컨쥬게이트 백신의 면역원성을 평가하는 방법으로서는 랫트를 사용한 면역원성 시험이 알려져 있고, 항체가에 대해서는 ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay; 효소면역 측정법) 등에 의해 평가된다(비특허문헌 2∼4). 다른 것으로서는 마우스나 모르모트(비특허문헌 5), 원숭이(비특허문헌 6)를 사용한 평가가 알려져 있다.
PRP 컨쥬게이트로부터 PRP가 유리된 유리 PRP와, PRP에 대한 항체가에 대해서는, 역상관하는 것이 알려져 있으며, 유리 PRP가 상승하기 어려운 백신은 안정성, 유효성의 관점으로부터 중요하다는 것이 알려져 있다(비특허문헌 7)
길이가 다른 PRP를 사용해서 환원 아미노화법에 의해 Hib 컨쥬게이트를 조제하고, 면역원성 평가를 실시한 결과에 대해서는 비특허문헌 8에 보고되어 있다.
일본 공개특허 S62-30726 일본 공개특허공보 H6-340550 일본 공표특허공보 2015-522272 일본 공표특표공보 H11-507026 PCT공개 제93/15760호 미국특허 제4673574호 유럽공개 제161188호 유럽공개 제208375호 유럽공개 제477508호 미국특허 제4220717호 미국특허 제4459286호
Vaccine 14 (4) (1996) 313-320 The Journal of Infectious Diseases, 190, 1177-1182, 2004 The Journal of Infectious Diseases, 191, 58-64, 2005 Vaccine 24 (2006) 3505-3512 Vaccine 16 (1998) 1842-1849 Vaccine 19 (2001) 902-907 Vaccine 25 (2007) 194-200 Vaccine 33 (2015) 2646-2654 Infection and Immunity, 40 (1) 1983, 245-256 Biologicals 35 (2007) 235-245 Vaccine 32 (2014) 5650-5656 Vaccine 12 (8) (1994) 700-706 Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 21 (6) (2000) 1087-1091 Journal of Microbiology and Biotechnology (2003), 13 (3), 469-472
PRP 컨쥬게이트를 항원으로 한 Hib 컨쥬게이트 백신은 영유아에 대한 면역원성도 높고 유효하지만, 백신 보존 중에 캐리어 단백질로부터 PRP가 유리되는 것에 의한 보존 안정성의 저하가 과제가 되고 있다. 보다 안정된 Hib 컨쥬게이트 백신의 개발이 소망되고 있지만, 유리 PRP 함량의 상승을 억제하는 유효한 방법은 보고되지 않고 있다.
본 발명은 상기 사정을 고려하여 이루어진 것으로, 보존 안정성이 뛰어난 PRP 컨쥬게이트의 조제방법과 Hib 컨쥬게이트 백신의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 네이티브 PRP보다도 적당하게 저분자화한 PRP를 사용하는 것에　의해, 유리 PRP 함량의 상승이 억제된 안정한 PRP 컨쥬게이트의 조제방법을 찾아냈다. 또 본 발명자들은 PRP와 캐리어 단백질을 반응에 제공할 때의 중량비, 캐리어 단백질(특히 파상풍 톡소이드)의 순도, PRP 컨쥬게이트 조제 후의 보존 용액의 pH에 대해서 정력적으로 검토하는 것에　의해, 보다 안정된 Hib 컨쥬게이트 백신의 제조방법을 찾아냈다.
따라서 본 발명은 이하를 포함한다.
[1] 폴리리보실리비톨포스페이트(PRP)와 캐리어 단백질을 결합반응에 의해 PRP 컨쥬게이트를 조제하는 방법에 있어서, 네이티브 PRP보다도 저분자화된 PRP를 사용하는 것에　의해, 조제 후의 PRP 컨쥬게이트로부터 PRP의 유리가 억제되는 것을 특징으로 하는 조제방법.
[2] 상기 [1]에서, PRP 컨쥬게이트의 조제 후, pH5.4∼6.3의 용액에서 보존하는 것을 포함하는 방법.
[3] 상기 [2]에서, pH5.4∼6.3의 용액에서 37℃, 4주간의 가혹시험에서의 유리 PRP 함량이 50% 미만인 방법.
[4] 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나에서, PRP의 저분자화 방법이 물리적 파쇄인 방법.
[5] 상기 [1] 내지 [3]의 어느 하나에서, PRP의 저분자화 방법이 산 또는 알칼리에 의한 가수분해인 방법.
[6] 상기 [1] 내지 [5]의 어느 하나에서, 저분자화한 PRP의 분자량이 80∼150kDa인 방법.
[7] 상기 [1] 내지 [6]의 어느 하나에서, PRP 컨쥬게이트를 조제하는 결합반응에 있어서, PRP와 캐리어 단백질이 중량비 2:1로부터 4:1로 반응에 제공되는방법.
[8] 상기 [7]에서, PRP와 캐리어 단백질이 중량비 4:1로 반응에 제공되는 방법.
[9] 상기 [1] 내지 [8]의 어느 하나에서, PRP 컨쥬게이트를 조제하는 결합반응 전에, 1-시아노-4-(디메틸아미노)피리딘 테트라플루오로보레이트(CDAP)를 사용해서 저분자화한 PRP를 활성화시키는 공정을 포함하는 방법.
[10] 상기 [1] 내지 [9]의 어느 하나에서, 캐리어 단백질이 파상풍 톡소이드인 방법.
[11] 상기 [10]에서, 파상풍 톡소이드의 순도가 2,500∼3,500 LF/mg PN인 방법.
[12] 상기 [11]에서, 파상풍 톡소이드의 순도가 2,900∼3,300 LF/mg PN인 방법.
[13] 상기 [1] 내지 [11]의 어느 하나에 기재된 방법을 포함하는, 헤모필러스ㆍ인풀루엔자균 b형균(Hib) 컨쥬게이트 백신의 제조방법.
[14] 상기 [13]에 기재된 제조방법에서 제조한 Hib 컨쥬게이트 백신의, 혼합 백신으로서의 용도.
[15] 상기 [13]에 기재된 제조방법에서 제조한 Hib 컨쥬게이트 백신의, 침강정제 백일해 디프테리아 파상풍불활화 폴리오 혼합 백신과의 5종 혼합 백신으로서의 용도.
본 발명에 의하면, 조제 후의 PRP 컨쥬게이트를 장기간 안정되게 보존하는 것이 가능하게 된다. 게다가, Hib 컨쥬게이트 백신을 충분한 면역원성을 유지한 상태로, 안정하게 보존하는 것이 가능하게 된다.
도 1은 본 발명의 1실시형태에 의해 조제한 PRP 컨쥬게이트를, 37℃에서 4주간 보존했을 때의 유리 PRP 함량(%)의 상승과 PRP 분자량의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 1실시형태에 의해 PRP 분자량을 바꾸어서 조제한 PRP 컨쥬게이트를 항원으로 하는 Hib 컨쥬게이트 백신을, 랫트에 1/25 SHD(Single Human Dose)와 1/50 SHD로 면역했을 때의 면역원성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 1실시형태에 의해 결합반응에 제공하는 PRP와 캐리어 단백질의 중량비를 바꾸어서 조제한 PRP 컨쥬게이트를 항원으로 하는 Hib 컨쥬게이트 백신을, 랫트에 1/25 SHD와 1/50 SHD로 면역했을 때의 면역원성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 1실시형태에 의해 결합반응에 제공하는 PRP와 캐리어 단백질의 중량비를 바꾸어서 조제한 PRP 컨쥬게이트를 항원으로 하는 Hib 컨쥬게이트 혼합 백신을, 랫트에 1/100 SHD와 1/500 SHD로 면역했을 때의 면역원성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 1실시형태에 의해 조제한 PRP 컨쥬게이트를 항원으로 하는 Hib 컨쥬게이트 혼합 백신을, 투여량을 바꾸어서 랫트에 3회 면역했을 때의 면역원성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 1실시형태에 의해 결합반응에 제공하는 PRP와 캐리어 단백질의 중량비를 바꾸어서 조제한 PRP 컨쥬게이트를 항원으로 하는 Hib 컨쥬게이트 혼합 백신을, 37℃에서 4주간 보존했을 때의 유리 PRP 함량(%)의 상승과 보존 용액 pH의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 1실시형태에 의해 결합반응에 제공하는 PRP와 캐리어 단백질의 중량비를 바꾸어서 조제한 PRP 컨쥬게이트를 항원으로 하는 Hib 컨쥬게이트 혼합 백신을, 10℃에서 45개월간 보존했을 때의 유리 PRP 함량(%)의 상승과 보존 용액 pH의 관계를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명이 호적한 실시형태에 대해서 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 실시형태에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시형태에 따른 PRP 컨쥬게이트의 조제방법은 PRP와 캐리어 단백질의 결합반응을 실시하는데 있어서, 네이티브 PRP보다도 저분자화된 PRP를 사용하는 것에　의해, 조제 후의 PRP 컨쥬게이트로부터 PRP의 유리가 억제되는 것을 특징으로 한다. 본 조제방법에 의해 수득한 PRP 컨쥬게이트를 항원으로 하는 Hib 컨쥬게이트 백신에 대해서도 동일하게 보존 안정성이 뛰어나며, 또 충분한 면역원성을 유지하고 있다.
PRP 컨쥬게이트는 공지의 결합 기술에 의해서 조제할 수 있다. 예를 들면 PRP를 티오에테르 결합을 통해서 결합할 수 있다. 이 결합 방법에서는 PRP를 1-시아노-4-(디메틸아미노)피리딘테트라플루오로보레이트(CDAP)로 활성화하는 것에　의해, 시안산 에스테르를 형성한다. 이렇게 해서 활성화된 PRP는 직접 또는 스페이서기를 통해서 캐리어 단백질의 아미노기와 결합할 수 있다. 바람직하게는, 시안산 에스테르를 헥산디아민과 결합하고, 티오에테르 결합의 형성을 동반하는 헤테로 라이게이션 화학반응에 의해 아미노 유도체화 다당과 캐리어 단백질을 컨쥬게이트 시킨다(특허문헌 5).
상기 이외에, 환원 아미노화 방법에 의해 컨쥬게이트를 조제할 수도 있다(특허문헌 6∼9). 또 다른 방법으로서, 아디프산 디하이드라지드(ADH)로 유도체화한 브롬화 시안(CNBr) 활성화 다당을, 카르보디이미드 축합으로 캐리어 단백질에 결합하는 방법을 들 수 있다(비특허문헌 9).
캐리어 단백질로서는 파상풍 톡소이드나 백일해 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 톡소이드의 유전자 돌연변이체인 CRM197, 비협막형 헤모필러스ㆍ인플루엔자 D항원, 수막염 그룹B의 외막 단백질(OMP) 등을 들 수 있다. PRP 컨쥬게이트에 전형적인 캐리어 단백질은 파상풍 톡소이드이다.
파상풍 톡소이드를 캐리어 단백질로서 사용하는 경우, 그 순도는 WHO 규격인 1,000 LF/mg PN 이상으로 사용한다. 본 발명의 방법에서는 파상풍 톡소이드의 순도는 더 높은 것이 좋고, 2,500∼3,500 LF/mg PN인 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 2,900∼3,300 LF/mg PN이다.
PRP를 저분자화하는 방법으로서는 고압 유화기에 의한 물리적 파쇄를 들 수 있다. 이 경우, 10,000∼30,000psi의 압력으로, 10분∼2시간에 걸쳐서 파쇄를 실시한다. 바람직하게는 20,000∼30,000psi의 압력으로 10분∼2시간, 더욱 바람직하게는 25,000∼30,000psi의 압력으로 10분∼2시간으로 파쇄를 실시한다.
PRP를 저분자화하는 방법으로서는, 산, 산화제나 알칼리를 사용한 가수분해를 사용할 수도 있다. 산, 산화제로서는 염산, 황산, 과요오드산 나트륨 등을 들 수 있고, 알칼리로서는 수산화 나트륨, 탄산 수소나트륨 등을 들 수 있다.
저분자화 하지 않는 네이티브 PRP의 분자량은 250∼400kDa 정도이기 때문에, 저분자화된 PRP의 분자량은 250kDa 미만이 된다. 본 발명에서는 80∼150kDa인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 80∼100kDa이다.
분자량의 측정은 비특허문헌 10이나 비특허문헌 11에 기재되어 있는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography; 고속 액체 크로마토그래피) 장치를 사용한 방법으로 실시한다. 이 경우, 교정 곡선은 풀루란 등을 사용해서 작성하고, 피크 정점의 분자량을 풀루란 등의 환산값으로 해서 산출할 수 있다. 혹은 MALS(Multi Angle LightS cattering; 다각도 광산란 검출기)를 사용한 방법으로 절대 분자량을 산출할 수도 있다. 기타, 분자량의 측정이 가능한 방법이라면 어떤 방법을 사용할 수도 있다.
저분자화한 PRP를 사용함으로써, PRP 컨쥬게이트의 보존 안정성이 향상하는 작용 메커니즘에 대해서는, (1) 저분자화 PRP 컨쥬게이트의 경우, 캐리어 단백질과 결합하고 있는 PRP의 길이가 짧기 때문에, 가수분해에 의해 PRP가 절단되어도, 유리하는 PRP의 총량이 적어지는 것, (2) PRP가 저분자화하고 있는 것으로, 컨쥬게이트의 사이에 존재하고 있는 PRP는 절단되기 어려운 것, 의 2가지가 추측된다. 단, 입체 구조 상의 제약도 있어, 단순하게 너무 저분자화되어도 안정성은 개선되지 않고, 짧으면 좋다는 것도 아니다.
본 발명의 1실시형태에 있어서, 캐리어 단백질에 대한 과잉의 항체응답을 회피하기 위해서, 또 캐리어 단백질의 사용량을 감소시켜서 캐리어 단백질당의 백신 생산성을 높이기 위해서, PRP와 캐리어 단백질은 중량비 2:1로부터 4:1의 범위로 결합반응에 제공된다. 더 바람직한 중량비는 4:1이다.
PRP 컨쥬게이트 보존 용액의 pH는 5.0∼6.6이 바람직하고, 더 바람직하게는pH 5.4∼6.3이다. pH 조정은 염산이나 아세트산 등의 산, 수산화 나트륨, 탄산 수소나트륨 등의 알칼리액으로 조정할 수도 있고, 완충액을 사용하는 것도 가능하다. 보존 용액은 전술한 pH의 범위를 유지할 수 있는 조성이라면, 인산 완충용액, 아세트산 완충용액, MES 완충용액일 수도 있고, 숙신산 완충용액 등의 다른 완충용액이더라도 상관없다.
유리 PRP 함량의 측정은 비특허문헌 12∼14 등에 기재된 방법으로 실시할 수 있다. 안정성을 검토할 때의 장기 보존시험의 온도조건은, 5±3℃ 혹은 동결을 피해서 10℃ 이하에서 실시한다. 혹은, 보다 고온조건 하에서 안정성을 가속적으로 평가해도 상관없다.
본 발명에 의한 방법으로 제작한 Hib 컨쥬게이트 백신의 면역원성은 랫트나 원숭이 등의 동물에 면역하고, 항PRP 항체가를 측정하는 것에 의해서 산출한다. 항체가는 ELISA 등에 의해 측정한다. 혹은, 비특허문헌 11에 나타나 있는 것 같은 보체와 Hib균을 사용하는 혈청 살균 항체(SBA; Serum Bactericidal antibody) 시험으로 평가를 실시할 수도 있다. 항체가와 SBA가는 일정 정도 상관하는 것이 비특허문헌 11에 기재와 같이 알려져 있기 때문에, ELISA에 의한 항체가로 평가를 실시할 수도 있다.
본 발명에 의한 방법으로 제조한 Hib 컨쥬게이트 백신은 면역 간섭을 일으키기 어렵기 때문에, 다른 항원과의 혼합 백신으로 할 수도 있다. 예를 들면, 침강정제 백일해 디프테리아 파상풍 불활화 폴리오 혼합 백신과의 혼합 백신 등을 들 수 있다.
본 발명에 의한 방법으로 제조한 Hib 컨쥬게이트 백신은 애주번트와 함께 사용해도 된다. 제형은 액상 제제일 수도 있고, 동결건조제제일 수도 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것들의 실시예에 전혀 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
저분자화 PRP의 제작
특허문헌 10이나 11 등에 기재된 종래 방법에 따라서, NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)를 첨가한 BHI(Brain Heart Broth) 배지에서, Hib를 8∼14시간, 37℃에서 배양하고, 상청액을 에탄올 침전에 의해 정제하는 것에 의해 풀루란 환산량으로 피크 정점 분자량이 250∼400kDa의 정제 PRP를 얻었다. 정제 PRP를 포함하는 프로세스액을 고압 유화기(Microfluidics사)로 10,000psi, 20,000psi, 30,000psi의 각 압력으로 15∼20회 처리하고, PRP를 물리적으로 파쇄하는 것에 의해 저분자화했다. 수득된 저분자화 PRP를 분자 사이즈 분석하고, 피크 정점 분자량이 각각 155kDa, 108kDa, 81kDa인 것을 확인했다.
실시예 2
PRP 컨쥬게이트의 조제
수득된 각 저분자화 PRP의 2∼12㎎/㎖를, 100㎎/㎖ 농도의 CDAP PRP에 대한 중량비가 0.2∼2.0이 되는 조건으로 반응시키고, 추가로 0.5M의 ADH와 2시간 반응시켰다. 그 후에 투석을 실시해서 미반응물을 제거함으로써 활성화 PRP를 얻었다. 활성화 PRP와 2,900∼3,300LF/mg PN의 순도의 파상풍 톡소이드(TT) 원액(화학및혈청요법연구소)을, 1:1, 2:1, 4:1의 중량비로 축합제인 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드)와 함께 각각 반응시켰다. 농도에 따라서 40분에서 4시간 반응하고, 그 후 투석함으로써, PRP/TT비가 0.48, 0.77, 1.0의 PRP 컨쥬게이트를 얻었다.
실시예 3
PRP 컨쥬게이트의 보존 안정성 평가
제작한 PRP 컨쥬게이트(인산 완충용액, pH 6.8)의 보존 안정성을, 37℃의 가혹시험으로 평가했다. 보존 개시 시, 2주 후 및 4주 후에서의 유리 PRP 함량(%)을 비특허문헌 13에 기재된 DOC 처리 후, 비특허문헌 10에 기재된 리보오스 시험을 사용해서 측정했다. 그 결과를 도 1에 나타낸다. 저분자화하지 않은 네이티브 PRP나 155kDa의 PRP에 비해서 보다 저분자화된 108kDa나 81kDa의 PRP쪽이, 유리 PRP 함량의 상승을 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
실시예 4
PRP 컨쥬게이트 보존용액의 pH 검토
pH가 6.0, 6.3, 6.6, 7.0인 인산 완충액을 조제하고, PRP 컨쥬게이트(저분자화 후 PRP 분자량 142kDa)의 보존용액의 pH에 의한 영향을 37℃의 가혹조건으로 평가했다. 보존 개시 시, 2주 후 및 4주 후에서의 유리 PRP 함량(%)을 실시예 3과 동일한 방법을 사용해서 측정한 결과, pH 6∼7의 범위에 있어서 pH가 낮을 수록, 유리 PRP 함량의 상승을 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다(표 1).
Figure pct00001
실시예 5
Hib 컨쥬게이트 백신의 면역원성 평가
1그룹 5마리의 SD 랫트(암컷, 5주령)의 등 부위에 PRP 컨쥬게이트(PRP 분자량: Native, 155kDa, 108kDa, 88kDa와 PRP의 분자량을 바꾼 것, 또는, PRP와 캐리어 단백질의 중량비를 바꾸어서 실시예 2에서 조제한 것)을 항원으로 하는 Hib 컨쥬게이트 백신을, 0.5㎖ 피하 접종하고, 4주 후에 2회째의 접종을 실시했다. 2회째의 접종으로부터 2주 후에 채혈을 실시하고, 자가 조제한 ELISA에 의해 항체가를 측정했다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타낸다. 기존의 Hib 컨쥬게이트 백신(Sanofi Pasteur사, 「액트힙(ActHIB) (상표명)」)에 비해서 동등 이상의 항PRP 항체가가 수득되고 있음을 확인했다.
실시예 6
PRP 컨쥬게이트를 포함하는 혼합 백신의 조제, 및 면역원성 평가
DTP-IPV4종 혼합 백신(침강정제 백일해 디프테리아 파상풍 불활성 폴리오(Sabin strain) 혼합 백신; 화학및혈청요법연구소, 「Quattrovac(상표명)」) 또는 침강정제 백일해 디프테리아 파상풍 혼합 백신(화학및혈청요법소)에 불활성 폴리오 바이러스(IPV; Salk주)를 첨가한 것에, PRP 컨쥬게이트를 첨가하는 것으로 5종의 혼합 백신을 조제했다.
1그룹 5마리의 SD 랫트(암컷, 5주령)의 등 부위에 PRP 컨쥬게이트(PRP 분자량: Native, 155, 108, 88kDa와 PRP 분자량을 바꾼 것, 또는 PRP와 캐리어 단백질의 중량비를 바꾸어서 실시예 2에서 조제한 것)을 항원으로 하는 Hib 컨쥬게이트 백신을 0.5㎖ 피하 접종하고, 4주 후에 2회째의 접종을 실시했다. 2회째의 접종으로부터 2주 후에 채혈을 실시하고, 자가 조제한 ELISA에 의해 항체가를 측정했다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. PRP와 캐리어 단백의 중량비를 4:1로 반응시킨 PRP 컨쥬게이트를 사용한 5종 혼합 백신의 100분의 1 Single Human Dose(1/100SHD)만 조금 낮은 항PRP 항체가를 나타냈지만, 그 이외는 기존의 Hib 컨쥬게이트 백신(Sanofi Pasteur, 「액트힙(ActHIB) (상표명)」)을 사용한 5종 혼합 백신과 동등 이상의 항PRP 항체가를 나타냈다. 중량비 4:1의 반응조건은 1/500SHD 조건으로 액트힙(ActHIB) (상표명)보다도 높은 항체가를 나타냈다.
조제한 5종 혼합 백신의 면역원성을, 1그룹 10마리의 랫트(Wister, 메스, 8주령)의 등 부위에 3주 간격으로 3회 피하투여하고, 접종 3주 후에 채혈을 실시하고, 자가 조제한 ELISA에 의해 항체가를 측정했다. 결과를 도 5에 나타낸다. 5종 혼합 백신의 용량을 바꾸고, 기존의 Hib 컨쥬게이트 백신(Sanofi Pasteur, 「액트힙(ActHIB) (상표명)」)과 혼합한 5종 혼합 백신과 비교한 바, 3회 접종 후에서는, 기존의 Hib 컨쥬게이트 백신에서는 10㎍의 값이 가장 높았던 것에 대해, 본 발명의 Hib 컨쥬게이트 백신에서는 2㎍의 값이 가장 높고, 더 적은 용량으로 동등한 면역원성을 수득된다고 추측되었다.
실시예 7
PRP 컨쥬게이트 원액의 안정성 평가
Hib원액의 농도와 pH를 바꾸어서 37℃에서 1주간 가온하고, PRP 컨쥬게이트 원액의 안정성 평가를 실시했다. 결과를 표 2에 나타낸다. 원액의 보관 조건으로서는 고농도 쪽이 보다 안정적이었다. 고농도 조건 하에서도 pH는 6.8보다도 6.0쪽이 안정적이었다.
Figure pct00002
실시예 8
PRP 컨쥬게이트를 포함하는 혼합 백신의 pH의 안정성에 대한 영향 평가
혼합 백신의 pH가 5.0, 5.4, 5.7, 6.0이 되도록 완충액을 첨가하고, 대상 검체를 37℃의 가혹조건에서 4주간 가온한 후, 유리 PRP를 측정했다. 결과를 표 3에 나타낸다. 혼합 백신의 pH는 6.0, 5.7, 5.4인 것이 좋고, pH 5.0은 불안정하게 되는 결과였다. 또, 혼합 백신 중의 Hib 이외의 항원의 면역원성에 대한 영향도 확인했지만, pH의 영향은 인정되지 않았다.
Figure pct00003
혼합 백신의 pH를 6.0 또는 6.8로 하고, 37℃, 4주 가온했을 경우, 10℃에서 45개월간 보존한 후, 유리 PRP를 측정했다. 결과를 도 6, 도 7에 나타냈다. 본 발명의 1실시형태에 의해 조제한 PRP 컨쥬게이트를 항원으로 하는 Hib 컨쥬게이트 혼합 백신에 있어서 pH 6.8보다도 pH 6.0으로 조정하는 것이 보다 안정적이었다. 37℃에서 2주일 가온한 결과는 10℃에서 12개월간 보존한 유리 PRP의 값에 가깝고, 37℃에서 4주간 가온한 결과는 10℃에서 45개월간 보존한 유리 PRP의 값에 가까웠다. 도 6, 도 7에서 37℃로 가온 했을 경우와 10℃에서 보존했을 경우의 모두에 있어서 동일한 경향이 확인되었다.
(산업상의 이용가능성)
본 발명에 의한 조제방법은 Hib 컨쥬게이트 백신의 제조 및 Hib 컨쥬게이트 백신을 포함하는 혼합 백신의 제조에 있어서 이용 가능하다.

Claims (15)

  1. 폴리리보실리비톨포스페이트(PRP)와 캐리어 단백질을 결합반응에 의해 PRP 컨쥬게이트를 조제하는 방법에 있어서,
    네이티브 PRP보다도 저분자화된 PRP를 사용하는 것에　의해, 조제 후의 PRP 컨쥬게이트로부터 PRP의 유리가 억제되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1 항에 있어서, PRP 컨쥬게이트의 조제 후, pH 5.4∼6.3의 용액에서 보존하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제2 항에 있어서, pH 5.4∼6.3의 용액에서 37℃, 4주간의 가혹시험에서의 유리 PRP 함량이 50% 미만인 방법.
  4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, PRP의 저분자화 방법이 물리적 파쇄인 방법.
  5. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, PRP의 저분자화 방법이 산 또는 알칼리에 의한 가수분해인 방법.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 저분자화한 PRP의 분자량이 80∼150kDa인 방법.
  7. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, PRP 컨쥬게이트를 조제하는 결합반응에 있어서, PRP와 캐리어 단백질이 중량비 2:1에서 4:1로 반응에 제공되는 방법.
  8. 제7 항에 있어서, PRP와 캐리어 단백질이 중량비 4:1로 반응에 제공되는 방법.
  9. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, PRP 컨쥬게이트를 조제하는 결합반응 전에, 1-시아노-4-(디메틸아미노)피리딘테트라플루오로보레이트(CDAP)를 사용해서 저분자화한 PRP를 활성화시키는 공정을 포함하는 방법.
  10. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 캐리어 단백질이 파상풍 톡소이드인 방법.
  11. 제10 항에 있어서, 파상풍 톡소이드의 순도가 2,500∼3,500 LF/mg PN인 방법.
  12. 제11 항에 있어서, 파상풍 톡소이드의 순도가 2,900∼3,300 LF/mg PN인 방법.
  13. 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 포함하는 헤모필러스ㆍ인플루엔자 b형균(Hib) 컨쥬게이트 백신의 제조방법.
  14. 제13 항에 기재된 제조방법으로 제조한 Hib 컨쥬게이트 백신의, 혼합 백신으로서의 용도.
  15. 제13 항에 기재된 제조방법으로 제조한 Hib 컨쥬게이트 백신의, 침강정제 백일해 디프테리아 파상풍 불활화 폴리오 혼합 백신과의 5종 혼합 백신으로서의 용도.
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