TW201925458A - 包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白結合物之組合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於包含多於一種肺炎鏈球菌(S. pneumoniae )多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，其中該等結合物各包含肺炎鏈球菌血清型的多醣與載體蛋白結合。亦提供在人類患者中誘導保護性免疫反應之方法，其包括向該患者投與本發明多價免疫原性組合物。該等多價免疫原性組合物可用於提供針對肺炎鏈球菌感染及肺炎鏈球菌引起之疾病的保護。本發明組合物亦可用作治療方案之一部分，向已經接種指示用於預防肺炎球菌疾病之多價疫苗之患者提供補充保護。

Description

包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白結合物之組合物及其使用方法
本發明提供具有不同多醣-蛋白結合物之多價免疫原性組合物。各結合物均係由莢膜多醣組成，該莢膜多醣係由與載體蛋白(較佳CRM197)結合之不同血清型的肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )製得。該等免疫原性組合物提供針對肺炎球菌疾病之廣泛覆蓋。
肺炎鏈球菌係一種革蘭氏陽性細菌，且係嬰幼兒侵襲性細菌性疾病(諸如肺炎、菌血症、腦膜炎及中耳炎)之最常見原因。肺炎球菌(Pneumococcus)係經以化學方式連接之多醣包膜，該多醣賦予血清型特異性。存在超過90種之已知肺炎球菌血清型，而莢膜係肺炎球菌之主要毒力決定因素，因為莢膜不僅保護細菌之內表面免於補體，而且其本身之免疫原性不佳。多醣係T細胞無關抗原，且在大多數情況下，不能在MHC分子上加工或呈現以與T細胞相互作用。然而，其等可通過另一種機制刺激免疫系統，該機制涉及B細胞上之表面受體之交聯。
已證明多年來獲得許可之多價肺炎球菌多醣疫苗在預防成人(特定言之老年人及高危人群)之肺炎球菌疾病中具有價值。然而，嬰幼兒對未結合之肺炎球菌多醣的反應不佳。含有7種當時在幼兒及嬰兒中引起侵襲性肺炎球菌疾病之最常見分離血清型(4、6B、9V、14、18C、19F及23F)的肺炎球菌結合物疫苗Prevnar® 係首先於2000年2月在美國獲得許可。在美國普遍使用Prevnar® 後，由於Prevnar® 中存在血清型，幼兒之侵襲性肺炎球菌疾病顯著減少。參見Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005, 54(36):893-7。然而，Prevnar® 在世界某些地區之血清型覆蓋率存在局限性，且在美國存在某些新興血清型之證據(例如，19A及其他血清型)。參見O'Brien等人，2004,Am J Epidemiol 159:634-44；Whitney等人，2003,N Engl J Med 348:1737-46；Kyaw等人，2006,N Engl J Med 354:1455-63；Hicks等人，2007,J Infect Dis 196:1346-54；Traore等人，2009,Clin Infect Dis 48:S181-S189。
美國專利申請公開案號US 2006/0228380描述13價肺炎球菌多醣-蛋白結合物疫苗，其包括血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F。中國專利申請公開案號CN 101590224 A描述14價肺炎球菌多醣-蛋白結合物疫苗，其包括血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F及23F。
其他PCV已涵蓋PCV-15中包含之血清型7、10、11或13 (美國公開案號2011/0195086)，但已觀察到一些血清型之免疫干擾(例如在GSK之PCV-11中血清型3之保護作用較低)及在Pfizer之PCV-13 (PREVNAR® 13)中對血清型6B之反應率較低。參見Prymula等人，2006, Lancet 367:740-48及Kieninger等人，Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers，發表於2008年10月25日至28日第48屆ICAAC/ISDA第46屆Annual Meeting, Washington DC上。
目前之多價肺炎球菌疫苗已有效降低與彼等疫苗中所存在之血清型相關之肺炎球菌疾病的發病率。然而，目前可用疫苗中不存在之肺炎球菌表現血清型的盛行率在增加。因此，需要其他肺炎球菌疫苗組合物，其提供針對不同之肺炎球菌血清型組的保護，且可提供針對目前可用疫苗中不存在之肺炎球菌血清型的補充保護。
本發明提供包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型係如本文所定義。
在本發明之特定實施例中，該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由下列組成之群的一組血清型：
a) 15A、16F、23A、23B、24F、31及35B；
b) 15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20；及
c) 3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20。
在本發明之其他特定實施例中，該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由下列組成之群的一組血清型：
a) 15A、16F、23A、23B、24F、31及35B；
b) 15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A；及
c) 3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A。
在本發明之其他特定實施例中，該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由下列組成之群的一組血清型：
a) 15A、16F、23A、23B、24F、31及35B；
b) 15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20B；及
c) 3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20B。
在一些實施例中，a)、b)或c)中所列之肺炎鏈球菌血清型組進一步包含：血清型6C、血清型6A或血清型6A及6B。
在一些實施例中，該等多醣蛋白結合物中之至少一者係藉由包括非質子性溶劑(例如二甲基亞碸(DMSO))之結合反應來形成。在特定實施例中，該等多醣蛋白結合物中之各者均係藉由包括非質子性溶劑之結合反應來形成。如本文所示，相對於在水性條件下進行製備之相同結合物，在多醣-蛋白結合物之還原胺化期間使用DMSO作為溶劑導致出乎意料地優異之穩定性及增強之對彼等血清型的免疫原性。
亦提供在人類患者中誘導保護性免疫反應之方法，其包括向該患者投與本發明多價免疫原性組合物。在本發明方法之一些實施例中，患者先前經多價肺炎球菌疫苗治療。
本發明多價免疫原性組合物可用作使用不同互補肺炎球菌疫苗之治療方案的一部分。因此，本發明提供在人類患者中誘導保護性免疫反應之方法，其包括向該患者投與本發明多價免疫原性組合物，進一步包括以任何順序向該患者投與多價肺炎球菌疫苗。在特定實施例中，該多價肺炎球菌疫苗包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的多醣。在其他實施例中，該多價肺炎球菌疫苗包含未結合之莢膜多醣。
亦提供利用在非質子性溶劑中之結合反應來製備血清型8肺炎鏈球菌多醣-蛋白結合物之方法，其中該結合反應不使用氰基硼氫化物。
本發明亦提供包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中選擇肺炎鏈球菌血清型提供對其他選擇血清型的交叉反應性。
本發明提供包含肺炎球菌多醣-蛋白結合物之多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型係如本文所定義。在一些實施例中，該免疫原性組合物包含選自由下列組成之群的一組肺炎球菌血清型：(a) 15A、16F、23A、23B、24F、31及35B；(b) 15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20；及(c) 3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20。在一些實施例中，該免疫原性組合物包含選自由下列組成之群的一組肺炎球菌血清型：(a) 15A、16F、23A、23B、24F、31及35B；(b) 15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20B；及(c) 3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20B。在其他實施例中，該免疫原性組合物包含選自由下列組成之群的一組肺炎球菌血清型：(a) 15A、16F、23A、23B、24F、31及35B；(b) 15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A；及(c) 3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A。在其他實施例中，該免疫原性組合物包含(i)血清型6A；(ii)血清型6A及6B；或(iii)血清型6C。在特定實施例中，本發明包括多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括血清型3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、24F、31、33F及35B。發現該組合物在兔中具有免疫原性且產生在所有測試劑量下殺死疫苗型細菌菌株之功能性抗體(實例43)。在另一實施例中，本發明包括多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括血清型3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20、6A、15A、15C、16F、23A、23B、24F、31及35B。在另一實施例中，本發明包括多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括血清型3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20B、6A、15A、15C、16F、23A、23B、24F、31及35B。在另一實施例中，本發明包括多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括血清型3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20B、6A、15A、15C、16F、23A、23B、24F、31及35B。
本發明多價免疫原性組合物係適用於使患者對疫苗型肺炎鏈球菌血清型免疫，及作為使用不同互補肺炎球菌疫苗治療方案的一部分。因此，本發明提供在人類患者中誘導保護性免疫反應之方法，其包括向該患者投與本發明多價免疫原性組合物，且進一步包括以任何順序向該患者投與多價肺炎球菌疫苗。在其他實施例中，將本發明多價免疫原性組合物投與至先前已經不同之多價肺炎球菌疫苗免疫的患者。
在本發明實施例中，來自至少一種肺炎球菌血清型之結合物係在非質子性溶劑(諸如DMSO)中使用還原胺化進行製備。在其他實施例中，該多價免疫原性組合物包含肺炎球菌結合物，其各者均係在非質子性溶劑中使用還原胺化進行製備。本文顯示，包含各在非質子性溶劑中使用還原胺化製備之原料藥的PCV1、PCV7、PCV14、PCV16及PCV21 (如下文所定義)藥品對於醣類之解聚或化學降解係穩定的且對於藥品調配中之蛋白質聚集係穩定的(參見實例40及實例45)。DMSO溶劑之使用通過直接消耗載體蛋白表面上之離胺酸殘基來增強多醣與蛋白質之共價結合。增加之共價結合直接有益於增加包含在DMSO中結合之多醣抗原的多價免疫原性組合物之多醣蛋白結合物的穩定性。
I. 定義及縮寫
如在整個說明書及隨附申請專利範圍中所使用，使用以下縮寫：
APA 磷酸鋁佐劑
APC 抗原呈現細胞
CI 信賴區間
DMSO 二甲基亞碸
DS 多醣-蛋白原料藥
GMC 幾何平均濃度
GMT 幾何平均滴度
HPSEC 高效尺寸排阻層析
IM 肌內或經肌內
LOS 脂寡醣
LPS 脂多醣
MALS 多角度光散射
MBC 單價散裝結合物
MOPA 多種調理吞噬檢定
MW 分子量
NMWCO 標稱分子量截止
NZWR 紐西蘭白兔
OPA 調理吞噬檢定
PCV 肺炎球菌結合物疫苗
PD1 劑量1後
PD2 劑量2後
PnPs 肺炎球菌多醣
Ps 多醣
PS-20 山梨醇酯-20
RI 折射率
UV 紫外線
w/v 每體積重量
使得可更容易地理解本發明，下文具體定義特定技術及科學術語。除非本文件另有明確定義，否則本文中所用之所有其他技術及科學術語具有熟習本發明所屬技術領域之一般技術者通常所瞭解之含義。
如整個說明書及隨附申請專利範圍中所使用，除非上下文另有明確規定，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數個指示物。
除非上下文明確指出所指示可能性中之一者，否則提及「或」指示任一種或兩種可能性。在某些情況下，使用「及/或」來突出其中一種或兩種可能性。
當與結合(諸如還原胺化)一起使用時，術語「水性溶劑」或「水性條件」係指使用水作為結合反應之溶劑。除了不存在有機溶劑之外，水可包含緩衝劑及其他組分。
當與結合(諸如還原胺化)一起使用時，術語「非質子性溶劑」、「DMSO溶劑」或「DMSO條件」係指使用非質子性溶劑或非質子性溶劑之組合(或DMSO，如適用)作為結合反應之溶劑。非質子性溶劑可存在一些水，例如，至多1%、2%、5%、10%或20%。
當與本發明免疫原性組合物一起使用時，術語「包含」係指包含任何其他組分(諸如佐劑及賦形劑)，或添加一或多種未具體列舉之多醣-蛋白結合物。當與多價多醣-蛋白結合物混合物一起使用時，術語「由...組成」係指具有彼等特定肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物且不具有來自不同血清型之其他肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的混合物。「基本上由...組成(Consists essentially of/consist essentially of/consisting essentially of)」指示包含任何所述元素或元素組，且視情況包含與所述元素相似或不同性質之其他元素，其等不會實質性地改變指定劑量方案、方法或組合物之基本或新穎性質。
本發明組合物之「有效量」係指引發抗體所需之劑量，該抗體在後續攻毒期間顯著降低微生物(例如肺炎鏈球菌)感染之可能性或嚴重性。
如本文所用，片語「指示用於預防肺炎球菌疾病」意指疫苗或免疫原性組合物係經一或多個監管機構(諸如美國食品及藥物管理局(US Food and Drug Administration)批准用於預防由肺炎鏈球菌之任何血清型引起之一或多種疾病，包括但不限於：一般肺炎球菌疾病(pneumococcal disease generally)、肺炎球菌肺炎、肺炎球菌腦膜炎、肺炎球菌菌血症、由肺炎鏈球菌引起之侵襲性疾病、及由肺炎鏈球菌引起之中耳炎。
「多價肺炎球菌疫苗」為包含多於一種活性劑(例如，肺炎球菌莢膜多醣或肺炎球菌多醣蛋白結合物)之醫藥製劑，其提供對由多於一種肺炎鏈球菌血清型引起之疾病或病理狀況的主動免疫。
術語「多醣」意指包括通常用於免疫及細菌疫苗領域之任何抗原醣元素(或抗原單元)，包括但不限於「醣類」、「寡醣」、「多醣」、「脂醣」、「脂寡醣(LOS)」、「脂多醣(LPS)」、「糖基化物」、「糖結合物」等。
如本文所用，「PCV1」係指包含一種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之1價肺炎球菌結合物疫苗，該肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該肺炎鏈球菌血清型為3 (如實例38及45中所舉例說明)。在特定實施例中，該載體蛋白為CRM197。
如本文所用，「PCV7」係指包含七種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之7價肺炎球菌結合物疫苗，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型為：3、8、9N、11A、19A、15A、及10A。在特定實施例中，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物中之一或多者的載體蛋白為CRM197。在其他實施例中，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物中之各者的載體蛋白均為CRM197。
如本文所用，「PCV8」係指包含八種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之8價肺炎球菌結合物疫苗，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型為：6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、及35B。在特定實施例中，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物中之一或多者的載體蛋白為CRM197。在其他實施例中，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物中之各者的載體蛋白均為CRM197。
如本文所用，「PCV14」係指包含十四種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之14價肺炎球菌結合物疫苗，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型為：3、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、16F、17F、19A、20、22F及33F。在特定實施例中，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物中之一或多者的載體蛋白為CRM197。在其他實施例中，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物中之各者的載體蛋白均為CRM197。
如本文所用，「PCV15」係指包含十五種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之15價肺炎球菌結合物疫苗，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型為：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F。在特定實施例中，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物中之一或多者的載體蛋白為CRM197。在其他實施例中，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物中之各者的載體蛋白均為CRM197。
如本文所用，「PCV16」係指包含十六種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之16價肺炎球菌結合物疫苗，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型為：6C、8、9N、10A、11A、12F、15A、16F、17F、20A、23A、23B、24F、31、及35B，及以下血清群15血清型中之至少一者：15B、15C、或脫-O-乙醯化15B。在特定實施例中，該血清群15血清型為血清型15C或脫-O-乙醯化15B。如本文所示(參見下文實例3)，脫-O-乙醯化血清型15B肺炎球菌多醣等同於血清型15C肺炎球菌多醣並具有相同NMR譜。在特定實施例中，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物中之一或多者的載體蛋白為CRM197。在其他實施例中，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物中之各者的載體蛋白均為CRM197。
如本文所用，「PCV21」係指包含二十一種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之21價肺炎球菌結合物疫苗，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型為：3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、24F、31、33F及35B，及以下血清群15血清型中之至少一者：15B、15C或脫-O-乙醯化15B。在特定實施例中，該血清群15血清型為血清型15C或脫-O-乙醯化15B。在特定實施例中，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物中之一或多者的載體蛋白為CRM197。在其他實施例中，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物中之各者的載體蛋白均為CRM197。
2012年通過遺傳分析在血清群20內識別出肺炎鏈球菌血清型20A及20B (Calix, J.J.等人，J. Biol. Chem. (2012) 287(33): 27885-27894)。如Calix J.J.等人所討論，習知血清分型方法及市售抗體先前不能區分此等兩種血清型，且當前關於血清型20A及20B之血清分型成果的資訊有限。此外，尚未充分瞭解20A或20B在由血清群20引起之已識別疾病內的疾病盛行率。因此，一般技術者可以選擇在肺炎鏈球菌疫苗組合物中包含此等兩種血清型(20A及/或20B)中之任一者或兩者。亦可能含有一種血清型20多醣抗原之肺炎鏈球菌疫苗可交叉保護另一者(例如，包含肺炎鏈球菌血清型20A而非血清型20B之多醣蛋白結合物的疫苗可交叉保護肺炎鏈球菌血清型20B感染)。因此，如本文所用之「血清型20」可係指含有血清型20A及/或血清型20B之多醣蛋白結合物的組合物。
「含有CpG之核苷酸」、「含有CpG之寡核苷酸」、「CpG寡核苷酸」及類似術語係指長度為6至50個核苷酸之核苷酸分子，其含有未甲基化之CpG部分。參見，例如，Wang等人，2003,Vaccine 21:4297。含有CpG之寡核苷酸包括使用任何合成核苷間鍵結、修飾鹼基及/或修飾糖之修飾寡核苷酸。
如本文所定義，「佐劑」為用於增強本發明免疫原性組合物之免疫原性的物質。免疫佐劑可增強對在單獨投與時具有弱免疫原性之抗原的免疫反應，例如，誘導無或弱抗體滴度或細胞介導之免疫反應、增加抗原之抗體滴度、及/或降低在個體中有效達成免疫反應之抗原劑量。因此，佐劑係通常給予以增強免疫反應且係熟習此項技術者所熟知。
「患者」(在本文中可替代地稱為「個體」)係指能夠經肺炎鏈球菌感染之哺乳動物。在較佳實例中，該患者為人類。可預防性或治療性地治療患者。預防性治療提供足夠之保護性免疫力以降低肺炎球菌感染或其效應(例如肺炎球菌肺炎)之可能性或嚴重性。可進行治療性治療以降低肺炎鏈球菌感染或其臨床效應之嚴重性或預防其復發。如本文所述，可使用本發明多價免疫原性組合物進行預防性治療。可將本發明組合物投與至一般人群或彼等肺炎球菌感染風險增加之人，例如，老年人、或彼等與老年人生活或照顧老年人之人。
彼等「需要治療」之人包括彼等先前接觸或經肺炎鏈球菌感染之人、彼等先前針對肺炎鏈球菌進行疫苗接種之人、以及彼等易患感染之人或任何需要降低感染可能性之人，例如免疫力低下者、老年人、兒童、成人或健康個體。
「穩定」多價免疫原性組合物係在冷凍溫度(例如，2至8℃或4℃)下持續至少1個月、2個月、3個月、6個月、12個月及/或24個月未觀察到顯著變化之組合物。另外，「穩定」組合物包括在包括25℃及37℃之溫度下持續包括1個月、3個月、6個月、12個月及/或24個月之時期呈現所需特徵之組合物。典型可接受之穩定性標準如下：以下一或多者不超過約5%、約10%、約15%或約20%變化：(a)組合物中肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之數量平均分子量(Mn)，(b)組合物中肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之重量平均分子量(Mw)，(c)組合物中之總多醣濃度，(d)使用內源蛋白質質螢光光譜法在特定激發波長(例如，280奈米)下所量測之組合物的發射最大值，及(e)使用內源蛋白質螢光光譜法在特定激發波長下所量測之組合物的螢光強度。術語「穩定」亦可用於係指多價免疫原性組合物中之特定肺炎球菌結合物。在此用途中，該術語係指在特定溫度下經時呈現所需性質之結合物，且此等性質在所注視溫度下及時間內之變化不超過約5%、約10%、約15%或約20%。
II. 多價免疫原性組合物
本發明提供包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的多醣。下文描述本發明多價免疫原性組合物之不同態樣及實施例。
在一實施例(實施例E1)中，本發明提供包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括、由或基本上由下列組成：
(1) 15A，
(2) 16F，
(3) 一或多種血清群23血清型，選自：(a) 23A及23B，(b) 23A及23F，(c) 23B及23F，(d) 23A，(e) 23B，及(f) 23F，
(4) 24F，
(5) 31，及
(6) 35B。
在實施例E1之子實施例中，該等一或多種血清群23血清型為23A及23B (即，不存在其他血清群23血清型)。在實施例E1之又一子實施例中，該等一或多種血清群23血清型為23A及23F。在實施例E1之另一子實施例中，該等一或多種血清群23血清型為23B及23F。在實施例E1之又另一子實施例中，23A係唯一的血清群23血清型。在實施例E1之又一子實施例中，23B係唯一的血清群23血清型。在實施例E1之其他子實施例中，23F係唯一的血清群23血清型。
在第二實施例(實施例E2)中，本發明提供包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括實施例E1或實施例E1之任何子實施例中所述之血清型，且進一步包括血清型：(1) 6C，(2) 6A，或(3) 6A及6B。
在實施例E2之一子實施例中，該組合物包含血清型6C。在實施例E2之又一子實施例中，該組合物包含血清型6A及6B且不包含血清型6C。在實施例E2之另一子實施例中，該組合物包含血清型6A。
在第三實施例(實施例E3)中，本發明提供包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括實施例E1或實施例E1之任何子實施例、或實施例E2或實施例E2之任何子實施例中所述之血清型，且進一步包括血清型：
(1) 8，
(2) 9N，
(3) 11A
(4) 12F，
(5) 15B或15C，
(6) 17F，及
(7) 20A及/或20B。
在第四實施例(實施例E4)中，本發明提供包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括實施例E1至E3或其等之任何子實施例中所述之血清型，且進一步包括血清型：10A或39。
在第五實施例(實施例E5)中，本發明提供包含多種如上所述之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括、由或基本上由下列組成：8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、及35B。
在第六實施例(實施例E6)中，本發明提供包含多種如上所述之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括、由或基本上由下列組成：8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、及35B。
在第七實施例(實施例E7)中，本發明提供包含多種如上所述之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括、由或基本上由下列組成：8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、及35B。
在第八實施例(實施例E8)中，本發明提供包含多種如上所述之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括、由或基本上由下列組成：8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、及35B。
在第九實施例(實施例E9)中，本發明提供包含多種如上所述之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括實施例E1至E8 (或其等之任何子實施例)中所述之血清型，且進一步包括血清型：3、7F、及19A。
在第十實施例(實施例E10)中，本發明提供包含多種如上所述之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括實施例E1至E9 (或其等之任何子實施例)中所述之血清型，且進一步包括血清型22F。
在第十一實施例(實施例E11)中，本發明提供包含多種如上所述之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括實施例E1至E10 (或其等之任何子實施例)中所述之血清型，且進一步包括血清型33F。
在第十二實施例(實施例E12)中，本發明提供包含多種如上所述之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括、由或基本上由選自由下列組成之群的一組肺炎鏈球菌血清型組成：
(1) 15A、16F、23A、23B、24F、31、及35B，
(2) 15A、16F、23F、23B、24F、31、及35B，
(3) 15A、16F、23A、23F、24F、31、及35B，
(4) 15A、16F、23A、24F、31、及35B，
(5) 15A、16F、23A、24F、31、及35B，
(6) 15A、16F、23F、24F、31、及35B，
(7) 6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、及35B，
(8) 6C、15A、16F、23F、23B、24F、31、及35B，
(9) 6C、15A、16F、23A、23F、24F、31、及35B，
(10) 6C、15A、16F、23A、24F、31、及35B，
(11) 6C、15A、16F、23A、24F、31、及35B，
(12) 6C、15A、16F、23F、24F、31、及35B，
(13) 6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、及35B，
(14) 6A、15A、16F、23F、23B、24F、31、及35B，
(15) 6A、15A、16F、23A、23F、24F、31、及35B，
(16) 6A、15A、16F、23A、24F、31、及35B，
(17) 6A、15A、16F、23A、24F、31、及35B，
(18) 6A、15A、16F、23F、24F、31、及35B，
(19) 6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、及35B，
(20) 6A、6B、15A、16F、23F、23B、24F、31、及35B，
(21) 6A、6B、15A、16F、23A、23F、24F、31、及35B，
(22) 6A、6B、15A、16F、23A、24F、31、及35B，
(23) 6A、6B、15A、16F、23B、24F、31、及35B，及
(24) 6A、6B、15A、16F、23F、24F、31、及35B。
在第十三實施例(實施例E13)中，本發明提供包含多種如上所述之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括、由或基本上由選自由下列組成之群的一組肺炎鏈球菌血清型組成：
(1) 8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(2) 8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(3) 8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(4) 8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(5) 8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(6) 8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(7) 8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(8) 8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(9) 8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(10) 8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(11) 8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(12) 8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(13) 8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(14) 8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(15) 8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(16) 8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(17) 8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(18) 8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(19) 8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(20) 8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(21) 8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(22) 8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(23) 8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(24) 8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(25) 8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(26) 8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(27) 8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(28) 8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(29) 8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(30) 8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(31) 8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31及35B，及
(32) 8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31及35B。
第十三實施例(實施例E13)，進一步包括一組肺炎鏈球菌血清型，行(1)至(32)，其中各組中之血清型20A係替換成血清型20或血清型20B。
在第十四實施例(實施例E14)中，本發明提供包含多種如上所述之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括、由或基本上由選自實施例E13，行(17)至(32)中所述之任何血清型組的一組肺炎鏈球菌血清型組成，且進一步包括血清型23A及/或23B。
在第十五實施例(實施例E15)中，本發明提供包含多種如上所述之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括、由或基本上由選自由下列組成之群的一組肺炎鏈球菌血清型組成：
(1) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(2) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(3) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(4) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(5) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A 15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(6) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(7) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(8) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A 15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(9) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(10) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(11) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A 15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(12) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(13) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(14) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A 15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(15) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(16) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
(17) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(18) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(19) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(20) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(21) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(22) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(23) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(24) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(25) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(26) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(27) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(28) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(29) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(30) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(31) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(32) 3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31及35B，
(33) 3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20B，
(34) 3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A，
(35) 3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20B，
(36) 3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20B，
(37) 3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A，
(38) 3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20B，
(39) 3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20,
(40) 3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20,
(41) 3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20,
(42) 3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20,
(43) 3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20，及
(44) 3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20。
在第十六實施例(實施例E16)中，本發明提供包含多種如上所述之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括、由或基本上由選自實施例E15，行(17)至(32)中所述之任何血清型組的一組肺炎鏈球菌血清型組成，且進一步包括血清型23A及/或23B。
在第十七實施例(實施例E17)中，本發明提供包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由下列組成之群的一組血清型：
i. 6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，
ii. 6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A，及
iii. 3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A；
在實施例E17之子實施例中，該免疫原性組合物不包含任何其他肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物。
在第十八實施例(實施例E18)中，本發明提供包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物包含來自肺炎鏈球菌血清型6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B之莢膜多醣。在實施例E18之子實施例中，該免疫原性組合物不包含任何其他肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物。
在第十九實施例(實施例E19)中，本發明提供包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物包含來自肺炎鏈球菌血清型6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A之莢膜多醣。在實施例E19之子實施例中，該免疫原性組合物不包含任何其他肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物。
在第二十實施例(實施例E20)中，本發明提供包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物包含來自肺炎鏈球菌血清型3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A之莢膜多醣。在實施例E20之子實施例中，該免疫原性組合物不包含任何其他肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物。
在另一實施例中，本發明提供包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物包含來自肺炎鏈球菌血清型3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A之莢膜多醣。在此實施例(即，3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A)之子實施例中，該免疫原性組合物不包含任何其他肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物。
在另一實施例中，本發明提供包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物包含來自肺炎鏈球菌血清型3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20之莢膜多醣。在此實施例(即，3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20)之子實施例中，該免疫原性組合物不包含任何其他肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物。
在另一實施例中，本發明提供包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物包含來自肺炎鏈球菌血清型3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20B之莢膜多醣。在此實施例(即，3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20B)之子實施例中，該免疫原性組合物不包含任何其他肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物。
如本文所示(參見下文實例3)，脫-O-乙醯化血清型15B肺炎球菌多醣等同於血清型15C肺炎球菌多醣並具有相同NMR譜。如本文所述及揭示，脫-O-乙醯化血清型15B肺炎球菌多醣等同於血清型15C肺炎球菌多醣，且兩者每重複單元均可具有範圍在0至5%內、或範圍在0至4%內、或範圍在0至3%內、或範圍在0至2%內、或範圍在0至1%內、或範圍在0至0.5%內、或範圍在0至0.1%內之O-乙醯基含量，或無O-乙醯基含量。在Spencer B.L.等人之報告中，15C可略微經O-乙醯化(Spencer, B.L.等人，Clin. Vac. Immuno. (2017) 24(8): 1-13)。因此，在本文多價免疫原性組合物之任何實施例中，可使用脫-O-乙醯化血清型15B代替血清型15C。脫-O-乙醯化之方法係在此項技術中已知，例如如在Rajam等人，Clinical and Vaccine Immunology , 2007, 14(9):1223–1227中所述。
在任何本發明多價免疫原性組合物之特定實施例中，包括實施例E1至E20及其等之任何子實施例，該組合物進一步包含醫藥上可接受之載劑。
交叉反應性
在一實施例中，本發明提供包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型6C)的多醣，其中肺炎鏈球菌血清型6C提供針對肺炎鏈球菌血清型6A及6B之交叉保護。
在另一實施例中，本發明提供選自實施例E1至E20之包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型6C)的多醣，其中肺炎鏈球菌血清型6C提供針對肺炎鏈球菌血清型6A及6B之交叉保護。
在一實施例中，本發明提供包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型19A)的多醣，其中肺炎鏈球菌血清型19A提供針對肺炎鏈球菌血清型19F之交叉保護。
在另一實施例中，本發明提供選自實施例E1至E20之包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型19A)的多醣，其中肺炎鏈球菌血清型19A提供針對肺炎鏈球菌血清型19F之交叉保護。
在一實施例中，本發明提供包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型23A及/或23B)的多醣，其中肺炎鏈球菌血清型23A及/或23B提供針對肺炎鏈球菌血清型23F之交叉保護。
在另一實施例中，本發明提供選自實施例E1至E20之包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型23A及/或23B)的多醣，其中肺炎鏈球菌血清型23A及/或23B提供針對肺炎鏈球菌血清型23F之交叉保護。
在一實施例中，本發明提供包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型6A)的多醣，其中肺炎鏈球菌血清型6A提供針對肺炎鏈球菌血清型6B及/或6C之交叉保護。
在另一實施例中，本發明提供選自實施例E1至E20之包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型6A)的多醣，其中肺炎鏈球菌血清型6A提供針對肺炎鏈球菌血清型6B及/或6C之交叉保護。
在一實施例中，本發明提供包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型20A)的多醣，其中肺炎鏈球菌血清型20A提供針對肺炎鏈球菌血清型20B之交叉保護。
在另一實施例中，本發明提供選自實施例E1至E20之包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型20A)的多醣，其中肺炎鏈球菌血清型20A提供針對肺炎鏈球菌血清型20B之交叉保護。
在一實施例中，本發明提供包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型20B)的多醣，其中肺炎鏈球菌血清型20B提供針對肺炎鏈球菌血清型20A之交叉保護。
在另一實施例中，本發明提供選自實施例E1至E20之包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型20B)的多醣，其中肺炎鏈球菌血清型20B提供針對肺炎鏈球菌血清型20A之交叉保護。
在一實施例中，本發明提供包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型15C)的多醣，其中肺炎鏈球菌血清型15C提供針對肺炎鏈球菌血清型15B之交叉保護。
在另一實施例中，本發明提供選自實施例E1至E20之包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物的多價免疫原性組合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型(包括血清型15C)的多醣，其中肺炎鏈球菌血清型15C提供針對肺炎鏈球菌血清型15B之交叉保護。
載體蛋白
在本發明之特定實施例中，CRM197係用作載體蛋白。CRM197為具有以下胺基酸序列之白喉毒素的無毒變體(即，類毒素)：
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW
KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE
TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI
NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS
CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF
HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT
TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL
VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT
VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI
SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH
SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLF FEIKS (SEQ ID NO:1)
在一實施例中，CRM197係分離自在酪蛋白胺基酸及基於酵母萃取物之培養基中生長之白喉桿菌(Corynebacterium diphtheria )菌株C7 (β197)的培養物。在另一實施例中，CRM197係根據U.S. 5,614,382中所述之方法進行重組製備。通常，CRM197係通過超濾、硫酸銨沉澱及離子交換層析之組合進行純化。在一些實施例中，CRM197係使用Pfenex Expression Technology™ (Pfenex Inc., San Diego, CA)在螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens )中進行製備。
其他合適之載體蛋白包括另外滅活細菌毒素，諸如DT (白喉類毒素)或DT之片段B (DTFB)、TT (破傷風毒素)或TT之片段C、百日咳類毒素、霍亂類毒素(例如，如WO 2004/083251中所述)、大腸桿菌(E. coli ) LT、大腸桿菌ST、及來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )之外毒素A。亦可使用細菌外膜蛋白，諸如外膜複合物c (OMPC)、孔蛋白、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎球菌表面蛋白A (PspA；參見WO 02/091998)、肺炎球菌黏附素蛋白(PsaA)、來自A組或B組鏈球菌之C5a肽酶、或流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae )蛋白D、包括以某種方式(例如dPLY-GMBS (參見WO 04/081515)或dPLY-甲醛)解毒之層片的肺炎球菌肺炎球菌溶血素(Kuo等人，1995,Infect Immun 63; 2706-13)、PhtX (包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE及Pht蛋白之融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物(參見WO 01/98334及WO 03/54007))。其他蛋白質，諸如卵白蛋白、匙孔螺血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素之純化蛋白衍生物(PPD)、PorB (來自腦膜炎奈瑟氏菌(N. meningitidis ))、PD (流感嗜血桿菌蛋白D；參見例如EP 0 594 610 B)或其免疫功能等效物、合成肽(參見EP0378881及EP0427347)、熱休克蛋白(參見WO 93/17712及WO 94/03208)、百日咳蛋白(參見WO 98/58668及EP0471177)、細胞介素、淋巴因子、生長因子或激素(參見WO 91/01146)、包含來自各種病原體衍生抗原之多種人類CD4+ T細胞抗原決定基的人工蛋白(參見Falugi等人，2001, Eur J Immunol 31:3816-3824)(諸如N19蛋白(參見Baraldoi等人，2004,Infect Immun 72:4884-7))、鐵攝取蛋白(參見WO 01/72337)、艱難梭菌(C. difficile )之毒素A或B (參見WO 00/61761)、及鞭毛蛋白(參見Ben-Yedidia等人，1998,Immunol Lett 64:9)亦可用作載體蛋白。
可使用其他DT突變體作為載體蛋白，諸如CRM176 、CRM228 、CRM45 (Uchida等人，1973,J Biol Chem 218:3838-3844)；CRM9 、CRM45 、CRM102 、CRM103 及CRM107 以及Nicholls及Youle在Genetically Engineered Toxins , Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992中所述之其他突變；Glu-148缺失或突變成Asp、Gln或Ser及/或Ala 158缺失或突變成Gly以及在U.S. 4,709,017或U.S. 4,950,740中揭示之其他突變；Lys 516、Lys 526、Phe 530及/或Lys 534中至少一或多個殘基之突變及U.S. 5,917,017或美國專利號6,455,673中揭示之其他突變；或U.S. 5,843,711中揭示之片段。此類DT突變體亦可用於製備DTFB變體，其中該等變體包含含有抗原決定基區域之B片段。
在某些實施例中，該載體蛋白係選自由下列組成之群：外膜蛋白複合物(OMPC)、破傷風類毒素、白喉類毒素、蛋白D及CRM197。
在本發明之一些實施例中，第二載體可用於多價免疫原性組合物中之一或多種多醣蛋白結合物。該第二載體蛋白較佳為係無毒且無反應原性，且能夠以足夠之量及純度獲得之蛋白質。該第二載體蛋白亦與肺炎鏈球菌多醣結合或連接，以增強抗原之免疫原性。載體蛋白應適用於標準結合程序。在一實施例中，未與第一載體蛋白結合之各莢膜多醣與相同之第二載體蛋白結合(例如，各莢膜多醣分子係與單個載體蛋白結合)。在另一實施例中，該等未與第一載體蛋白結合之莢膜多醣係與兩種或更多種載體蛋白結合(例如，各莢膜多醣分子係與單個載體蛋白結合)。在此類實施例中，各相同血清型之莢膜多醣通常係與相同之載體蛋白結合。
在本發明實施例中，包括實施例E1至E20及其任何子實施例中之任一項，一或多種(在適用時包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21種)多醣血清型係與CRM197結合。在本發明之其他實施例中，包括實施例E1至E20及其任何子實施例中之任一項，各多醣血清型均係與CRM197結合。
本發明多醣-蛋白結合物之調配可使用技術公認之方法完成。例如，可將單獨肺炎球菌結合物與生理學上可接受之媒劑一起調配以製備組合物。此類媒劑之實例包括但不限於水、緩衝鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及右旋糖溶液。
在較佳實施例中，該疫苗組合物係在含有氯化鈉之L-組胺酸緩衝劑中進行調配。
在本發明之一些實施例中，該多價免疫原性組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物包含來自與載體蛋白及佐劑結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型係如本文所述。用於增強該組合物之有效性的合適佐劑包括但不限於：
(1)鋁鹽(明礬)，諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；
(2)水包油乳液調配物(含或不含其他特異性免疫刺激劑，諸如胞壁醯肽(下文定義)或細菌細胞壁成分)，諸如，例如，(a)MF59 (國際專利申請公開案號WO 90/14837)，含有5%角鯊烯、0.5%土溫(Tween)80及0.5% Span 85 (視情況含有不同量之MTP-PE)，使用諸如110Y型微射流均質機(Microfluidics, Newton, MA)之微射流均質機調配成次微米顆粒，(b) SAF，含有10%角鯊烯、0.4%吐溫80、5%經pluronic阻斷之聚合物L121、及thr-MDP，微流化成次微米乳液或渦旋產生更大粒度之乳液，(c) Ribi™佐劑系統(RAS)，(Corixa, Hamilton, MT)，含有2%角鯊烯、0.2%吐溫80、及選自由描述於美國專利號4,912,094中之3-O-脫醯基單磷醯基脂質A (MPL™)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁骨架(CWS)組成之群，較佳MPL+CWS (Detox™)的一或多種細菌細胞壁成分；(d) Montanide ISA；
(3)皂苷佐劑，可使用諸如Quil A或STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA)(參見，例如，美國專利號5,057,540)或由其產生之顆粒，諸如ISCOM (由膽固醇、皂苷、磷脂及兩親性蛋白質之組合所形成之免疫刺激複合物)及Iscomatrix® (具有與ISCOM基本相同之結構，但不含蛋白質)；
(4)細菌性脂多醣、合成脂質A類似物，諸如胺基烷基葡糖胺磷酸鹽化合物(AGP)或其衍生物或類似物，其可從Corixa獲得且係描述於美國專利號6,113,918中；一種此類AGP為2-[(R)-3-十四烷醯氧基十四烷醯胺基]乙基2-脫氧-4-O-膦醯基-3-O-[(R)-3-十四烷醯氧基十四烷醯]-2-[(R)-3-十四烷醯氧基十四烷醯胺基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，亦稱為529 (以前稱為RC529)，其係經調配呈水性形式或呈穩定乳液
(5)合成多核苷酸，諸如含有CpG組元之寡核苷酸(美國專利號6,207,646)；及
(6)細胞介素，諸如白細胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、干擾素(例如γ干擾素)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、共刺激分子B7-1及B7-2等；及
(7)補體，諸如補體成分C3d之三聚體。
在另一實施例中，該佐劑為2、3或更多種上述佐劑之混合物，例如，SBAS2 (亦含有3-脫醯基單磷醯基脂質A及QS21之水包油乳液)。
胞壁醯肽包括但不限於N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩胺醯胺(thr-MDP)、N-乙醯基-正丙醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(MTP-PE)等。
在某些實施例中，該佐劑為鋁鹽。該鋁鹽佐劑可為明礬沉澱疫苗或明礬吸附疫苗。鋁鹽佐劑係此項技術所熟知，且係描述於例如Harlow, E.及D. Lane (1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)及Nicklas, W. (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493)中。鋁鹽包括但不限於水合氧化鋁、水合氧化鋁、三水合氧化鋁(ATH)、水合鋁(aluminum hydrate)、三水合鋁(aluminum trihydrate)、鋁膠(alhydrogel)、Superfos、Amphogel、氫氧化鋁(III)、羥基磷酸鋁硫酸鹽、磷酸鋁佐劑(APA)、無定形氧化鋁、三水合氧化鋁或三羥基鋁。
APA係羥基磷酸鋁之水性懸浮液。APA係藉由以1:1之體積比摻合氯化鋁及磷酸鈉以使羥基磷酸鋁沉澱來製備。在摻合程序後，用高剪切混合器將物質之尺寸減小，以實現單分散粒度分佈。隨後將產物以生理鹽水透濾並進行蒸汽滅菌。
在某些實施例中，使用市售Al(OH)3 (例如，Denmark/Accurate Chemical及Scientific Co., Westbury, NY之Alhydrogel或Superfos)以50至200 μg蛋白質/mg氫氧化鋁之比率吸附蛋白質。在另一實施例中，蛋白質之吸附係取決於蛋白質之pI (等電pH)及培養基之pH。具有較低pI之蛋白質比具有較高pI之蛋白質更強地吸附至帶正電荷之鋁離子。鋁鹽可建立抗原貯庫，其在2至3週之時間內緩慢釋放，參與巨噬細胞之非特異性激活及補體激活，及/或刺激先天免疫機制(可能係通過刺激尿酸)。參見，例如，Lambrecht等人，2009, Curr Opin Immunol 21:23。
通常將單價散裝水性結合物摻合在一起並稀釋至目標4 μg/mL用於所有血清型，6B除外，其為稀釋至目標8 μg/mL。稀釋後，將批料過濾除菌，並在無菌條件下添加等體積之磷酸鋁佐劑，使最終鋁濃度為250 μg/mL。將經佐劑化調配之批料裝入至一次性0.5 mL/劑量小瓶中。
在某些實施例中，該佐劑為含CpG之核苷酸序列，例如，含CpG之寡核苷酸，特定言之，含CpG之寡脫氧核苷酸(CpG ODN)。在另一實施例中，該佐劑為ODN 1826，其可以從Coley Pharmaceutical Group獲得。
使用CpG寡核苷酸之方法係此項技術所熟知且係描述於例如Sur等人，1999, J Immunol. 162:6284-93；Verthelyi, 2006, Methods Mol Med. 127:139-58；及Yasuda等人，2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110中。
在替代實施例中，該免疫原性組合物包含多種如本文(例如在實施例E1至E20或其任何子實施例中之任一項)所述之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，且不包含佐劑。
調配物
本發明組合物可經調配呈單劑量小瓶、多劑量小瓶或預填充玻璃或塑膠注射器。
在另一實施例中，本發明組合物係經口投與，並因此調配成適於口服給藥之形式，即呈固體或液體製劑。固體口服調配物包括錠劑、膠囊、丸劑，顆粒劑、小丸劑等。液體口服調配物包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油等。
用於液體調配物之醫藥上可接受之載劑為水性或非水性溶液、懸浮液、乳液或油。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、及可注射之有機酯(諸如油酸乙酯)。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。油之實例為彼等動物、植物或合成來源之油，例如，花生油、大豆油、橄欖油、向日葵油、魚肝油、另一種海洋油、或來自牛奶或蛋之脂質。
該醫藥組合物可為等滲、低滲或高滲。然而通常較佳地，當投與用於輸注或注射之醫藥組合物時，其基本上為等滲。因此，為了儲存，醫藥組合物可較佳為等滲或高滲。若醫藥組合物為高滲用於儲存，則可在投與前將其稀釋成等滲溶液。
等滲劑可為離子等滲劑(諸如鹽)或非離子等滲劑(諸如碳水化合物)。離子等滲劑之實例包括但不限於NaCl、CaCl2 、KCl及MgCl2 。非離子等滲劑之實例包括但不限於甘露醇、山梨糖醇及甘油。
同樣較佳地，至少一種醫藥上可接受之添加劑為緩衝劑。出於某些目的，例如，當醫藥組合物係用於輸注或注射時，通常希望該組合物包含能夠將溶液緩衝至pH為4至10，諸如5至9，例如6至8之緩衝劑。
緩衝劑可(例如)選自由TRIS、乙酸鹽、麩胺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、甘胺酸鹽、組胺酸、甘胺酸、琥珀酸鹽及三乙醇胺緩衝劑組成之群。
特定言之，當醫藥調配物用於非經腸用途時，緩衝劑可選自用於非經腸用途之USP兼容緩衝劑。例如，緩衝劑可選自由下列組成之群：一元酸，諸如乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甘油酸及乳酸；二元酸，諸如烏頭酸、己二酸、抗壞血酸、碳酸、麩胺酸、蘋果酸、琥珀酸及酒石酸；多元酸，諸如檸檬酸及磷酸；及鹼，諸如胺、二乙醇胺、甘胺酸、三乙醇胺及TRIS。
非經腸媒劑(用於皮下、靜脈內、動脈內或肌內注射)包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer's)右旋糖、右旋糖及氯化鈉、乳酸化林格氏及固定油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充液、電解質補充液(諸如基於林格氏右旋糖之彼等)等。實例為無菌液體，諸如水及油，添加或不添加界面活性劑及其他醫藥上可接受之佐劑。通常，水、鹽水、水性右旋糖及相關糖溶液、二醇(諸如丙二醇或聚乙二醇)、聚山梨醇酯80 (PS-80)、聚山梨醇酯20 (PS-20)及泊洛沙姆(Poloxamer)188 (P188)係較佳液體載劑，特別適用於注射液。油之實例為彼等動物、植物或合成來源之油，例如，花生油、大豆油、橄欖油、向日葵油、魚肝油、另一種海洋油、或來自牛奶或蛋之脂質。
本發明調配物亦可包含界面活性劑。較佳界面活性劑包括但不限於：聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯界面活性劑(通常稱為吐溫)，尤其是PS-20及PS-80；環氧乙烷(EO)、環氧丙烷(PO)及/或環氧丁烷(BO)之共聚物，以商品名DOWFAX™出售，諸如線性EO/PO嵌段共聚物；可改變重複乙氧基(氧基-1,2-乙二基)基團之數量之辛苯聚醇，其中最關注辛苯聚醇-9 (Triton X-100，或第三辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，諸如磷脂醯膽鹼(卵磷脂)；壬基酚乙氧基化物，諸如Tergitol™ NP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇及油醇之聚氧乙烯脂肪醚(稱為Brij界面活性劑)，諸如三乙二醇單月桂醚(Brij 30)；及脫水山梨糖醇酯(通常稱為SPAN)，諸如脫水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)及脫水山梨糖醇單月桂酸酯。包含於乳液中之較佳界面活性劑為PS-80。
可使用界面活性劑之混合物，例如，PS-80/Span 85混合物。聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯(諸如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(PS-80))與辛苯聚醇(諸如第三辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100))之組合亦係合適的。另一種適用之組合包括月桂醇聚醚(laureth) 9加聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯及/或辛苯聚醇。
界面活性劑之較佳量(重量%)為：聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯(諸如PS-80) 0.01至1%，特定言之約0.1%；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(諸如Triton X-100，或Triton系列中之其他清潔劑) 0.001至0.1%，特定言之0.005至0.02%；聚氧乙烯醚(諸如月桂醇聚醚9) 0.1至20%，較佳0.1至10%，特定言之0.1至1%或約0.5%。
在某些實施例中，該組合物基本上由組胺酸(20mM)、鹽水(150mM)及0.2% PS-20或0.04% PS-80在pH 5.8下與250 μg/mL APA (磷酸鋁佐劑)組成。PS-20可介於0.005%至0.3% (w/v)，調配物中PS-20或PS-80之存在控制在模擬製造期間及在使用初級包裝之運輸中的聚集。在另一實施例中，PS-20可介於0.025%至0.8% (w/v)。在另一實施例中，PS-20可介於0.05%至0.8% (w/v)。在另一實施例中，PS-20可介於0.05%至0.2% (w/v)。程序由組合至多24種血清型含於組胺酸、鹽水及PS-20或PS-80之摻合物，隨後將此經摻合之物質與APA及鹽水在存在或不存在抗菌防腐劑下組合組成。
在特定實施例中，該多價免疫原性組合物包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的多醣，其中該等多醣蛋白結合物中之肺炎鏈球菌血清型包括本文所述血清型組中之任一組，且進一步包括20至80 mM組胺酸pH 5.8及150 mM NaCl。在一些實施例中，該多價免疫原性組合物進一步包含0.2%至0.8% w/v聚山梨醇酯20。
界面活性劑之選擇可能需要針對不同藥品及原料藥進行優化。對於具有15或更多種血清型之多價疫苗而言，PS-20及P188係較佳的。用於製備結合物之化學的選擇亦可在調配物之穩定化中起重要作用。特定言之，當用於製備多價組合物中之不同多醣蛋白結合物的結合反應同時包括水性溶劑及DMSO溶劑時，特定界面活性劑系統提供穩定性之顯著差異。單獨使用聚山梨醇酯20或使用泊洛沙姆188與多元醇組合時觀察到多醣蛋白結合物之穩定性提高。
特定清潔劑如何保護生物治療劑之確切機制尚不清楚，且無法預先預測。可能的穩定機制包括優先水合、優先排除、生物治療劑與界面之間之氣/液界面競爭、表面張力、及/或清潔劑與生物治療劑之直接結合，以掩蓋充作聚集種子之疏水性貼片。
泊洛沙姆亦可用於本發明組合物中。泊洛沙姆為非離子三嵌段共聚物，其由側接聚氧乙烯(聚(環氧乙烷))之兩個親水鏈之聚氧丙烯(聚(環氧丙烷))中心疏水鏈組成。泊洛沙姆亦係以商品名Pluronic® 而為人所知。因為可定制聚合物嵌段之長度，所以存在許多具有略微不同性質之不同泊洛沙姆。對於通用術語「泊洛沙姆」而言，此等共聚物通常以字母「P」(對應泊洛沙姆)後跟三位數字進行命名，前兩位數字x 100給出聚氧丙烯核心之近似分子量，最後一位數字x 10給出聚氧乙烯含量百分比(例如，P407 = 聚氧丙烯分子量為4,000 g/mol且聚氧乙烯含量為70%之泊洛沙姆)。對於Pluronic® 商品名而言，此等共聚物之編碼係以字母開頭，以定義其在室溫下之物理形式(L = 液體，P = 糊劑，F = 薄片(固體))，其後接著兩位或三位數字。數字標記中之第一位數字(三位數字中的兩個數字)乘以300指示疏水物之近似分子量；最後一位數字x 10給出聚氧乙烯含量百分比(例如，L61 = 聚氧丙烯分子量為1,800 g/mol，聚氧乙烯含量為10%之Pluronic® )。參見美國專利號3740421。
泊洛沙姆之實例具有通式：HO(C2 H4 O)a (C3 H6 O)b (C2 H4 O)a H，其中a及b嵌段具有以下值：
如本文所用，分子量單位為道耳頓(Da)或g/mol。
較佳地，泊洛沙姆通常具有1100至17,400Da、7,500至15,000Da、或7,500至10,000Da之分子量。泊洛沙姆可選自泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。調配物中泊洛沙姆之最終濃度為0.001%至5%重量/體積，或0.025%至1%重量/體積。在某些態樣中，多元醇為丙二醇，且其最終濃度為1%至20%重量/體積。在某些態樣中，多元醇為聚乙二醇400，且其最終濃度為1%至20%重量/體積。
適用於本發明調配物之多元醇為聚合多元醇，特定言之聚醚二醇，包括(但不限於)丙二醇及聚乙二醇、聚乙二醇單甲醚。丙二醇之可用單體分子量範圍為約425至約2700。聚乙二醇及聚乙二醇單甲醚之可用分子量範圍為約200至約35000，包括但不限於PEG200、PEG300、PEG400、PEG1000、PEG MME 550、PEG MME 600、PEG MME 2000、PEG MME 3350及PEG MME 4000。較佳聚乙二醇為聚乙二醇400。本發明調配物中多元醇之最終濃度可為1%至20%重量/體積或6%至20%重量/體積。
該調配物亦含有pH緩衝鹽水溶液。緩衝劑可(例如)選自由以下組成之群：TRIS、乙酸鹽、麩胺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、甘胺酸鹽、組胺酸、甘胺酸、琥珀酸鹽、HEPES (4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS (3-(N-嗎啉代)丙磺酸)、MES (2-(N -嗎啉代)乙磺酸)及三乙醇胺緩衝劑。緩衝劑能夠將溶液緩衝至pH範圍為4至10、5.2至7.5、或5.8至7.0。在本發明之某些態樣中，緩衝劑係選自由磷酸鹽、琥珀酸鹽、組胺酸、MES、MOPS、HEPES、乙酸鹽或檸檬酸鹽組成之群。特定言之，當醫藥調配物用於非經腸用途時，緩衝劑可另外(例如)選自用於非經腸用途之USP兼容緩衝劑。緩衝劑之濃度介於1 mM至100 mM。緩衝劑之濃度介於10 mM至80 mM。緩衝劑之濃度介於1 mM至50 mM或5 mM至50 mM。在某些態樣中，緩衝劑為最終濃度為5 mM至50 mM之組胺酸，或最終濃度為1 mM至10 mM之琥珀酸鹽。在一些實施例中，組胺酸之最終濃度為20 mM ± 2 mM。
雖然鹽水溶液(即含NaCl之溶液)係較佳的，但適用於調配之其他鹽包括但不限於CaCl2 、KCl及MgCl2 及其組合。可使用非離子等滲劑代替鹽，包括但不限於蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇及甘油。合適鹽範圍包括但不限於25 mM至500 mM或40 mM至170 mM。在一態樣中，鹽為NaCl，視情況以20 mM至170 mM之濃度存在。
在較佳實施例中，該等調配物包含含有氯化鈉之L-組胺酸緩衝劑。
在另一實施例中，該醫藥組合物係在控釋系統中遞送。例如，藥劑可使用靜脈內輸注、經皮貼片、脂質體或其他投與方式投與。在另一實施例中，使用聚合物物質；例如在微球中或植入物中。
結合物於各疫苗劑量中之量選擇為誘導免疫保護反應而無顯著不利影響之量。該量可根據肺炎球菌血清型而變化。通常，對於基於多醣之結合物而言，各劑量將包含0.08至100 μg之各多醣。在本發明之一些實施例中，各多醣結合物之劑量為0.08至10 μg。在其他實施例中，劑量為1至5 μg、0.4至4 μg、0.4至3 μg、0.4至2 μg或0.4至1 μg。在一些實施例中，一或多種多醣結合物之劑量為100、150、200、250、300、400、500、或750 ng或0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、30、40、50、60、70、80、90、或100 μg。
在本發明組合物之一些實施例中，所有多醣結合物係以相同的量存在於組合物中。在其他實施例中，該等多醣結合物係以不同的量存在於組合物中(即，至少一種多醣結合物係以不同於組合物中之一或多種其他多醣結合物的量存在)。
特定疫苗之組分之最佳量可藉由涉及觀察個體中之適當免疫反應的標準研究確定。例如，在另一實施例中，用於人類疫苗接種之劑量係藉由從動物研究外推至人類數據來確定。在另一實施例中，劑量係根據經驗進行確定。
在一實施例中，鋁鹽之劑量為10、15、20、25、30、50、70、100、125、150、200、300、500、或700 μg、或1、1.2、1.5、2、3、5 mg或更多。在又另一實施例中，上述明礬鹽之劑量為每μg重組蛋白質。
本發明組合物亦可包含一或多種來自肺炎鏈球菌之蛋白質。適於包含之肺炎鏈球菌蛋白的實例包括在國際專利申請公開案號WO 02/083855及WO 02/053761中識別之彼等。
在某些實施例中，本發明組合物係藉由熟習此項技術者已知之一或多種方法(諸如非經腸、經黏膜、經皮、肌內、靜脈內、皮內、鼻內、皮下、腹膜內、及相應調配)投與至個體。在一實施例中，本發明組合物係經由液體製劑之表皮注射、肌內注射、靜脈內、動脈內、皮下注射或呼吸道內黏膜注射來投與。用於注射之液體調配物包括溶液等。
III. 製備方法
來自肺炎鏈球菌之莢膜多醣可藉由熟習此項技術者已知之標準技術進行製備。例如，多醣可從細菌中分離，並可藉由已知方法將尺寸調整至某一程度(參見，例如，歐洲專利案號EP497524及EP497525)；且較佳藉由使用均質機或藉由化學水解完成微流化。在一實施例中，各肺炎球菌多醣血清型係在基於大豆之培養基中生長。隨後通過標準步驟純化單一多醣，包括離心、沉澱及超濾。參見，例如，美國專利申請公開案號2008/0286838及美國專利案號5,847,112。使用諸如機械或化學尺寸加工之技術可調整多醣之尺寸以降低多醣樣品之黏度及/或改良結合產物之過濾性。化學水解可使用乙酸進行。機械尺寸加工可使用高壓均質化剪切進行。
經純化之多醣可以化學方式活化以使該等醣能夠與載體蛋白反應。經純化之多醣可與連接子連接。一旦被激活或連接至連接子，各莢膜多醣將分別與載體蛋白結合以形成糖結合物。多醣結合物可藉由已知之偶聯技術進行製備。
多醣可與連接子偶聯以形成多醣-連接子中間體，其中該連接子之游離末端為酯基。因此，該連接子為其中至少一個末端為酯基之連接子。另一末端係經選擇使得其可與多醣反應形成多醣-連接體中間體。
多醣可使用多醣中之一級胺基團與連接子偶聯。在此情況下，連接子通常在兩個末端均具有酯基。此允許藉由親核醯基取代使酯基中之一者與多醣中之一級胺基反應來進行偶聯。該反應產生多醣-連接子中間體，其中該多醣係經由醯胺鍵與該連接子偶聯。因此，該連接子為雙功能連接子，其提供用於與多醣中之一級胺基團反應的第一酯基團及用於與載體分子中之一級胺基團反應的第二酯基團。典型之連接子為己二酸N-羥基琥珀醯亞胺二酯(SIDEA)。
偶聯亦可間接進行，即使用用於在與連接子偶聯之前衍生多醣的另外連接子進行。
多醣係使用多醣還原末端上之羰基與該另外連接子偶聯。此偶聯包括兩個步驟：(a1)使羰基與該另外連接子反應；(a2)使該另外連接子之游離末端與連接子反應。在此等實施例中，該另外連接子通常在兩個末端均具有一級胺基團，藉此允許藉由還原胺化使一級胺基團中之一者與多醣中之羰基反應來進行步驟(a1)。使用一級胺基團與多醣中之羰基反應。醯肼基或羥基胺基係合適的。相同之一級胺基團通常係同時存在於該另外連接子的兩個末端上。該反應產生多醣-另外連接子中間體，其中該多醣經由C-N鍵與該另外連接子偶聯。
該多醣可使用多醣中之不同基團(特定言之羧基)與該另外連接子偶聯。此偶聯包括兩個步驟：(a1)使該基團與該另外連接子反應；(a2)使該另外連接子之游離末端與連接子反應。在此等情況下，該另外連接子通常在兩個末端均具有一級胺基團，藉此允許藉由EDAC活化使一級胺基團中之一者與多醣中之羧基反應來進行步驟(a1)。使用一級胺基團與多醣中之EDAC活化羰基反應。醯肼基係合適的。相同之一級胺基團通常係同時存在於該另外連接子的兩個末端上。該反應產生多醣-另外連接子中間體，其中該多醣係經由醯胺鍵與該另外連接子偶聯。
在一實施例中，多醣之化學活化及後續藉由還原胺化與載體蛋白結合可藉由美國專利案號4,365,170、4,673,574及4,902,506、美國專利申請公開案號2006/0228380、2007/184072、2007/0231340及2007/ 0184071、及WO2006/110381、WO2008/079653及WO2008/143709中所述之方法來實現。該化學可包括藉由與將末端羥基氧化成醛之任何氧化劑(諸如過碘酸鹽(包括過碘酸鈉、過碘酸鉀或過碘酸))反應來活化肺炎球菌多醣。該反應導致碳水化合物之鄰位羥基的隨機氧化裂解，其中形成反應性醛基。
與載體蛋白偶聯係藉由經由直接胺化成蛋白質之離胺醯基的還原胺化來完成。例如，結合可藉由使活化多醣及載體蛋白之混合物與還原劑(諸如氰基硼氫化鈉)在鎳存在下反應來進行。結合反應可在水溶液下或在DMSO存在下進行。參見例如US2015/0231270、US2011/0195086及EP 0471 177 B1。隨後藉由添加強還原劑(諸如硼氫化鈉)將未反應之醛封端。
還原胺化涉及兩個步驟，(1)氧化多醣以形成反應性醛，(2)還原在活化多醣與載體蛋白之間形成之亞胺(希夫鹼(Schiff base))以形成穩定之胺結合鍵。在氧化之前，視情況減小多醣之尺寸。可採用機械方法(例如均質化)或化學水解。化學水解可使用乙酸進行。氧化步驟可涉及與過碘酸鹽反應。出於本發明目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸；該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO4 - )及原過碘酸鹽(IO6 - )，且包括過碘酸鹽之各種鹽(例如，過碘酸鈉及過碘酸鉀)。在一實施例中，該莢膜多醣係在偏過碘酸鹽存在下，較佳在過碘酸鈉(NaIO4 )存在下進行氧化。在另一實施例中，該莢膜多醣係在原過碘酸鹽存在下，較佳在過碘酸存在下進行氧化。
在一實施例中，氧化劑為穩定硝醯基或氮氧化物自由基化合物，諸如哌啶-N-氧基或吡咯啶-N-氧基化合物，在氧化劑存在下選擇性氧化一級羥基(如WO 2014/097099中所述)。在該反應中，實際氧化劑為催化循環中之N-氧代銨鹽。在一態樣中，該穩定硝醯基或氮氧化物自由基化合物為哌啶-N-氧基或吡咯啶-N-氧基化合物。在一態樣中，該穩定硝醯基或氮氧化物自由基化合物帶有TEMPO (2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基)或PROXYL (2,2,5,5-四甲基-1-吡咯啶氧基)部分。在一態樣中，該穩定硝醯自由基化合物為TEMPO或其衍生物。在一態樣中，該氧化劑為帶有N-鹵素部分之分子。在一態樣中，該氧化劑係選自由N-氯代琥珀醯亞胺、N-溴代琥珀醯亞胺、N-碘代琥珀醯亞胺、二氯異氰尿酸、1,3,5-三氯-1,3,5-三氮雜環己烷-2,4,6-三酮、二溴異氰尿酸、1,3,5-三溴-1,3,5-三氮雜環庚烷-2,4,6-三酮、二碘異氰尿酸及1,3,5-三碘-1,3,5-三氮雜環庚烷-2,4,6-三酮組成之群。較佳地，該氧化劑為N-氯代琥珀醯亞胺。
在某些態樣中，該氧化劑為2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)自由基且N-氯代琥珀醯亞胺(NCS)作為共氧化劑(如WO 2014/097099中所述)。因此，在一態樣中，來自肺炎鏈球菌之糖結合物可藉由包括以下步驟之方法來獲得：a)使醣與2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)及N-氯代琥珀醯亞胺(NCS)在水性溶劑中反應以生成活化醣；b)使該活化醣與包含一或多個胺基之載體蛋白反應(該方法此後稱為「TEMPO/NCS-還原胺化」)。
視情況地，氧化反應係藉由添加淬滅劑來淬滅。該淬滅劑可選自鄰位二醇、1-胺基醇、2-胺基醇、胺基酸、穀胱甘肽、亞硫酸鹽、硫酸氫鹽、連二亞硫酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽、亞磷酸鹽、次磷酸鹽或亞磷酸(諸如甘油、乙二醇、丙-1,2-二醇、丁-1,2-二醇或丁-2,3-二醇、抗壞血酸)。
在某些實施例中，本發明提供利用在非質子性溶劑中之結合反應來製備血清型8肺炎鏈球菌多醣-蛋白結合物之方法，其中該結合反應不使用氰基硼氫化物。在其他實施例中，該結合反應為希夫鹼還原或還原胺化。在其他實施例中，該蛋白質為破傷風類毒素、白喉類毒素或CRM197。在其他實施例中，該蛋白質為CRM197。在其他實施例中，該結合反應為還原胺化。在其他實施例中，該還原胺化係在二甲基亞碸(DMSO)中進行。
在一些實施例中，結合前之氧化多醣具有30 kDa至1,000 kDa之分子量。分子量可藉由尺寸排阻層析(SEC)與多角度光散射偵檢器(MALS)及折射率偵檢器(RI)之組合來計算。在一些實施例中，該多醣具有50 kDa至300 kDa之分子量。在一些實施例中，該多醣具有50 kDa至1,000 kDa之分子量。在其他實施例中，該多醣具有70 kDa至900 kDa之分子量。在其他實施例中，該多醣具有100 kDa至800 kDa之分子量。在其他實施例中，該多醣具有200 kDa至600 kDa之分子量。在其他實施例中，該多醣具有100 kDa至1,000 kDa；100 kDa至900 kDa；100 kDa至800 kDa；100 kDa至700 kDa；100 kDa至600 kDa；100 kDa至500 kDa；100 kDa至400 kDa；100 kDa至300 kDa；150 kDa至1,000 kDa；150 kDa至900 kDa；150 kDa至800 kDa；150 kDa至700 kDa；150 kDa至600 kDa；150 kDa至500 kDa；150 kDa至400 kDa；150 kDa至300 kDa；200 kDa至1,000 kDa；200 kDa至900 kDa；200 kDa至800 kDa；200 kDa至700 kDa；200 kDa至600 kDa；200 kDa至500 kDa；200 kDa至400 kDa；200 kDa至300；250 kDa至1,000 kDa；250 kDa至900 kDa；250 kDa至800 kDa；250 kDa至700 kDa；250 kDa至600 kDa；250 kDa至500 kDa；250 kDa至400 kDa；250 kDa至350 kDa；300 kDa至1,000 kDa；300 kDa至900 kDa；300 kDa至800 kDa；300 kDa至700 kDa；300 kDa至600 kDa；300 kDa至500 kDa；300 kDa至400 kDa；400 kDa至1,000 kDa；400 kDa至900 kDa；400 kDa至800 kDa；400 kDa至700 kDa；400 kDa至600 kDa；500 kDa至600 kDa之分子量。
結合過程之第二步驟為使用還原劑還原活化多醣與載體蛋白之間之亞胺(希夫鹼)鍵以形成穩定之結合鍵(所謂的還原胺化)。適合之還原劑包括氰基硼氫化物(諸如氰基硼氫化鈉或硼氫化鈉)。在一實例中，該還原劑為氰基硼氫化鈉。
在某些實施例中，該還原胺化反應係在非質子性溶劑(或非質子性溶劑之混合物)中進行。在一實施例中，該還原反應係在DMSO或DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中進行。若凍乾，則該DMSO或DMF溶劑可用於重建該活化多醣及載體蛋白。在一實施例中，該非質子性溶劑為DMSO。
在還原反應結束時，可能存在殘留在結合物中之未反應醛基，其可藉由使用合適封端劑進行封端。在一實例中，此封端劑為硼氫化鈉(NaBH4 )。合適替代物包括三乙醯氧基硼氫化鈉或在布忍斯特(Bronsted)酸或路易斯酸存在下之硼氫化鈉或硼氫化鋅、胺硼烷(諸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMe'PrN-BH3 、芐胺-BH3 或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB))或硼氫化物交換樹脂。在結合(還原反應及視情況封端)之後，糖結合物可藉由熟習此項技術者已知之各種技術純化(針對多醣-蛋白結合物之含量進行富集)。此等技術包括透析、濃縮/透濾操作、切向流過濾、沉澱/洗脫、管柱層析(離子交換層析、多峰離子交換層析、DEAE或疏水相互作用層析)及深層過濾。在一實施例中，糖結合物係藉由滲透或離子交換層析或尺寸排阻層析加以純化。
在非質子性溶劑中使用還原胺化製得之糖結合物通常係用於多價肺炎球菌結合物疫苗中。因此，在某些實施例中，對於其中並非所有血清型均在非質子性溶劑中製備之多價組合物而言，剩餘血清型之還原反應係在水性溶劑(例如，選自pH值在6.0與8.5之間、7.0與8.0之間、或7.0與7.5之間之PBS (磷酸鹽緩衝鹽水)、MES (2-(N -嗎啉代)乙磺酸)、HEPES (4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、Bis-tris、ADA (N-(2-乙醯胺基)亞胺基二乙酸)、PIPES (哌嗪-N,N'-雙(2-乙磺酸))、MOPSO (3-嗎啉代-2-羥基丙磺酸)、BES (N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙磺酸)、MOPS (3-(N-嗎啉代)丙磺酸)、DIPSO (3-雙(2-羥乙基)胺基-2-羥基丙烷-1-磺酸)、MOBS (4-(N-嗎啉代)丁磺酸)、HEPPSO (N-(2-羥乙基)哌嗪-N-(2-羥基丙磺酸))、POPSO (哌嗪-1,4-雙(2-羥基-3-丙磺酸))、TEA (三乙醇胺)、EPPS (4-(2-羥乙基)哌嗪-1-丙磺酸)、二羥乙甘胺酸(Bicine))中進行。
可在非質子性溶劑中使用還原胺化製備之肺炎鏈球菌莢膜多醣-蛋白結合物包括但不限於血清型：3、6A、6B、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、23F、24F、31、33F、35B、及39。可在非質子性溶劑中使用還原胺化製備之肺炎鏈球菌莢膜多醣-蛋白結合物包括但不限於血清型：3、6A、6B、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、19A、20、22F、23A、23B、23F、24F、31、33F、35B、及39。可在非質子性溶劑中使用還原胺化製備之肺炎鏈球菌莢膜多醣-蛋白結合物包括但不限於血清型：3、6A、6B、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、19A、20B、22F、23A、23B、23F、24F、31、33F、35B、及39。該等多醣可呈寡醣之形式進行使用。此等係藉由純化多醣之片段化(例如，藉由水解)而方便地形成，其後通常接著對所需尺寸之片段進行純化。
在某些實施例中，血清型3、6A、6B、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、23F、24F、31、33F、35B、及39中之一或多者的肺炎球菌多醣-蛋白結合物係在非質子性溶劑中使用還原胺化進行製備。在某些實施例中，血清型3、6A、6B、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、19A、20、22F、23A、23B、23F、24F、31、33F、35B、及39中之一或多者的肺炎球菌多醣-蛋白結合物係在非質子性溶劑中使用還原胺化進行製備。在某些實施例中，血清型3、6A、6B、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、19A、20B、22F、23A、23B、23F、24F、31、33F、35B、及39中之一或多者的肺炎球菌多醣-蛋白結合物係在非質子性溶劑中使用還原胺化進行製備。在某些實施例中，該多價免疫原性組合物中之各血清型均係在非質子性溶劑中使用還原胺化進行製備。在某些實施例中，多價組合物中之一或多種血清型的多醣係在非質子性溶劑中使用還原胺化進行結合，且一或多種血清型之多醣係在水性溶劑中使用還原胺化進行結合。在某些實施例中，多價組合物中之兩種或更多種血清型的多醣係在非質子性溶劑中使用還原胺化進行結合。在其他實施例中，多價組合物中之三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種、十種或更多種、十一種或更多種、十二種或更多種、十三種或更多種、十四種或更多種、十五種或更多種、十六種或更多種、十七種或更多種、十八種或更多種、十九種或更多種、二十種或更多種、或二十一種或更多種血清型的多醣係在非質子性溶劑中使用還原胺化進行結合。在某些實施例中，來自多價組合物中之一或多種血清型的多醣係使用可在非質子性溶劑中或在水性溶劑中之其他化學反應進行結合。
因此，本發明係關於包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之多價免疫原性組合物，該等肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該等肺炎鏈球菌血清型係如本文(即，在章節II，「多價免疫原性組合物」中)所述，其中來自一或多種多醣蛋白結合物之多醣與載體蛋白結合之結合反應係在非質子性溶劑中進行。在某些實施例中，多價組合物中至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100%之血清型係在非質子性溶劑中進行製備。剩餘血清型係使用替代化學及/或在水性溶劑中進行製備。
經測定，相對於在水性條件下進行製備之相同結合物，在多醣-蛋白結合物之還原胺化期間使用DMSO作為溶劑導致出乎意料地優異之穩定性及增強之對彼等血清型的免疫原性(參見美國申請案號62/463,216及62/555,444)。如本文所示(參見實例40)，與採用在結合過程中之還原胺化期間使用質子(即水性)溶劑製得之原料藥的疫苗相比，含有在非質子性溶劑(例如DMSO)中使用還原胺化製得之本發明肺炎球菌結合物的藥品調配物導致優異之物理及化學穩定性。因此，在一些實施例中，該多價組合物中之所有肺炎球菌多醣結合物均係在非質子性溶劑中進行製備。
在本發明之某些實施例中，該組合物中之總多醣濃度為約0.02至約0.175 mg/mL。在本發明之某些實施例中，該組合物中之總多醣濃度為約0.03至約0.175 mg/mL。在本發明之某些實施例中，該組合物中之總多醣濃度為約0.04至約0.175 mg/mL。在其他實施例中，該組合物中之總多醣濃度為約0.065至約0.085 mg/mL、約0.070至約0.080 mg/mL、約0.065至約0.080 mg/mL、約0.070至約0.085 mg/mL、約0.110至約0.128 mg/mL、約0.110至約0.175 mg/mL、約0.10至約0.175 mg/mL、約0.110至約0.170 mg/mL、約0.115至約0.15 mg/mL、約0.110至約0.15 mg/mL、約0.110至約0.125 mg/mL、約0.150至約0.170 mg/mL、約0.150至約0.165 mg/mL、約0.140至約0.170 mg/mL、約0.130至約0.170 mg/mL、約0.150至約0.175 mg/mL、約0.070至約0.170 mg/mL、約0.065至約0.175 mg/mL、或約0.065至約0.180 mg/mL。
在其中該多價免疫原性組合物中之一或多種或全部多醣-蛋白結合物係在非質子性溶劑中進行製備的本發明實施例中，該組合物中之總多醣濃度係在37℃下穩定4週或更久、在25℃下4週或更久、在4℃下12週或更久。
在其中該多價免疫原性組合物中之一或多種或全部多醣-蛋白結合物係在非質子性溶劑中進行製備的本發明某些實施例中，該組合物中所有肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之重量平均分子量(Mw)(組合物中所有結合物之平均值)為約3,500至約4,700 kDa、約3,500至約4,600 kDa、約3,500至約4,500 kDa、約3,500至約4,400 kDa、約3,500至約4,300 kDa、約3,500至約4,200 kDa、約3,600至約4,700 kDa、約3,600至約4,600 kDa、約3,600至約4,500 kDa、約3,600至約4,400 kDa、約3,600至約4,300 kDa、約3,600至約4,200 kDa、約3,700至約4,700 kDa、約3,700至約4,600 kDa、約3,700至約4,500 kDa、約3,700至約4,400 kDa、約3,700至約4,300 kDa、約3,700至約4,200 kDa、約3,800至約4,700 kDa、約3,800至約4,600 kDa、約3,800至約4,500 kDa、約3,800至約4,400 kDa、約3,800至約4,300 kDa、約3,800至約4,200 kDa、約3,900至約4,700 kDa、約3,900至約4,600 kDa、約3,900至約4,500 kDa、約3,900至約4,400 kDa、約3,900至約4,300 kDa、或約3,900至約4,200 kDa。
在其中該多價免疫原性組合物中多醣-蛋白結合物係在非質子性溶劑中進行製備的本發明某些實施例中，該組合物中各肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之Mw (單一血清型)為約1,000至約10,000 kDa、約1,500至約5,500 kDa、約1,500至約5,600 kDa、約1,500至約5,700 kDa、約1,500至約5,800 kDa、約1,500至約5,900 kDa、約1,500至約6,000 kDa、約1,000至約5,500 kDa、約1,000至約5,000 kDa、約1,000至約4,000 kDa、約1,000至約4,500 kDa、約1,000至約4,000 kDa、或約1,000至約3,500 kDa。在其他實施例中，該組合物中之來自單一血清型之結合物的Mw為約1,000 kDa、約1,100 kDa、約1,200 kDa、約1,300 kDa、約1,400 kDa、約1,500 kDa、約1,600 kDa、約1,700 kDa、約1,800 kDa、約1,900 kDa、約2,000 kDa、約2,100 kDa、約2,200 kDa、約2,300 kDa、約2,400 kDa、約2,500 kDa、約2,600 kDa、約2,700 kDa、約2,800 kDa、約2,900 kDa、約3,000 kDa、約3,100 kDa、約3,200 kDa、約3,300 kDa、約3,400 kDa、約3,500 kDa、約3,600 kDa、約3,700 kDa、約3,800 kDa、約3,900 kDa、約4,000 kDa、約4,100 kDa、約4,200 kDa、約4,300 kDa、約4,400 kDa、約4,500 kDa、約4,600 kDa、約4,700 kDa、約4,800 kDa、約4,900 kDa、約5,000 kDa、約5,100 kDa、約5,200 kDa、約5,300 kDa、約5,400 kDa、或約5,500 kDa。
在本發明之某些實施例中，該多價免疫原性組合物中之多醣-蛋白結合物係在非質子性溶劑中進行製備。含有較高百分比之在非質子性溶劑中與載體蛋白結合(與在質子性溶劑中進行製備相反)之肺炎鏈球菌多醣的組合物可係較佳的。在某些實施例中，在非質子性溶劑中製得之肺炎鏈球菌血清型特異性結合物的百分比(藉由將在非質子性溶劑中製得之多醣血清型的數量除以多醣血清型之總數來計算，其中總數包括彼等在非質子性溶劑或質子性溶劑中製得之血清型)可大於50%、或大於60%、或大於70%、或大於80%、或大於90%或為100%。
在本發明之某些實施例中，該組合物中之血清型3多醣-蛋白結合物係在非質子性溶劑中進行製備，且該結合物之Mw為約1,000至約5,000 kDa、或約1,000至約4,000 kDa、或約1,000至約3,000 kDa、或約1,000至約2,500 kDa、或約1,000至約2,000 kDa。
在其中該多價免疫原性組合物中之一或多種或全部多醣-蛋白結合物係在非質子性溶劑中進行製備的本發明某些實施例中，該組合物中肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之數量平均分子量(Mn)(組合物中所有結合物之平均值)為約900至約3,000 kDa、約1,000至約3,000 kDa、約1,000至約2,500 kDa、約1,500至約2,500 kDa、約1,800至約2,500 kDa、約1,900至約2,500 kDa、或約2,000至約2,500 kDa。
在其中該多價免疫原性組合物中之一或多種或全部多醣-蛋白結合物係在非質子性溶劑中進行製備的本發明某些實施例中，該組合物中各肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之Mn (單一血清型)為約700至約7,000 kDa、約1,000至約6,000 kDa、約1,000至約5,000 kDa、約1,000至約4,000 kDa、約1,000至約3,000 kDa、約900至約5,500 kDa、約900至約5,000 kDa、約900至約4,500 kDa、約900至約4,000 kDa、約900至約3,500 kDa、或約900至約3,000 kDa。
在本發明實施例中，該組合物中肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之Mw及/或Mn係在37℃下穩定4週或更久、在25℃下4週或更久、及/或在4℃下12週或更久。
在本發明實施例中，多醣濃度、Mw及/或Mn係使用HPSEC UV/MALS/RI進行測定。
在其中該多價免疫原性組合物中之一或多種或全部多醣-蛋白結合物係在非質子性溶劑中進行製備的本發明一些實施例中，使用內源蛋白質螢光光譜法以280奈米(nm)激發波長進行量測之組合物的發射最大值為約335 nm至約342 nm。在一些實施例中，發射最大值保持在約335 nm至約342 nm且螢光強度在37℃下穩定至少1週。在一些實施例中，發射最大值保持在約335 nm至約342 nm，且螢光強度在37℃下穩定1週。
在一些實施例中，該多價組合物中之所有肺炎球菌多醣結合物均係在DMSO中使用還原胺化進行製備。在某些子實施例中，包含全部使用DMSO製得之多醣結合物的多價組合物不包含佐劑。
不受任何理論之束縛，對在DMSO中製得之糖結合物所觀察到之增強免疫原性的一種可能機制包括在載體蛋白表面上之碳水化合物(莢膜多醣)與離胺酸殘基之間的連接數量增加，此將導致在蛋白質與多醣之間的另外附接點，以賦予肽碳水化合物鍵之穩定性及抗化學解聚或分解。參見，例如，Hsieh, Characterization of Saccharide-CRM197 Conjugate Vaccines in Brown F, Corbel M, Griffiths E (編): Physico-Chemical Procedures for the Characterization of Vaccines. Dev. Biol. Basel, Karger, 2000，第103卷，第93至104頁。於在DMSO溶劑中結合期間產生之增加的多醣-蛋白連接之另外益處可係將肽-碳水化合物成功呈現至T細胞之另外機會。應瞭解，由於人類群體中之遺傳變異性導致加載或與結合至碳水化合物抗原之特定肽序列締合的能力及靈敏度不同，使得載體蛋白上之另外附接點將允許增加抗原在抗原呈現細胞(APC)之表面成功呈現的機會，以允許對另外T細胞非依賴性抗原之T細胞依賴性反應。藉由在DMSO溶劑中結合所觀察到之增強免疫原性的另一種可能機制可係由於CRM197在有機溶劑中之變性，其曝露用於多醣連接之另外離胺酸，從而增加糖肽在APC表面上呈現用於對不同肽抗原決定基之T細胞依賴性反應的機會。參見Avci等人，2011, Nature Medicine 17: 1602-1610。
在有機溶劑中結合在結合物中產生變性CRM197之又另一益處可係降低針對天然CRM197抗原決定基之抗體的免疫干擾。於在DMSO溶劑中結合期間產生之增加的多醣-蛋白連接之又一益處可係形成更大尺寸之多醣蛋白結合物，導致增強之免疫原性。據信，本發明組合物在引發人類反應方面提供顯著優點。
在某些實施例中，結合反應係藉由還原胺化來進行，其中鎳用於更高結合反應效率並有助於游離氰化物之移除。已知過渡金屬與氰化物形成穩定複合物，且已知過渡金屬與氰基硼氫化鈉改良蛋白質胺基及甲醛之還原性甲基化(S Gidley等人，Biochem J. 1982, 203: 331-334；Jentoft等人，Anal Biochem. 1980, 106: 186-190)。藉由複合殘留之抑制性氰化物，鎳之添加增加結合期間蛋白質之消耗，並導致形成更大、可能更具免疫原性之結合物。
氰基硼氫化鈉試劑批次中起始氰化物水平之差異亦導致不一致之結合性能，此導致可變之產物屬性，諸如結合物尺寸及結合物Ps-對-CRM197比率。鎳之添加藉由複合氰化物減少結合不一致，消除氰基硼氫化鈉批次之差異。
合適替代化學方法包括用1-氰基-4-二甲胺基吡啶鎓四氟硼酸鹽(CDAP)活化醣以形成氰酸酯。該經活化之醣可因此直接或經由間隔基(連接子)基團與載體蛋白上之胺基偶聯。例如，該間隔基可為胱胺或半胱胺以產生硫醇化多醣，其可經由在與經馬來醯亞胺活化之載體蛋白(例如使用GMBS)或經鹵代乙醯化之載體蛋白(例如使用碘乙醯亞胺[例如乙基碘乙醯亞胺HCl]或N-琥珀醯亞胺基溴乙酸酯或SIAB、或SIA、或SBAP)反應後獲得之硫醚鍵與載體偶聯。較佳地，氰酸酯(視情況藉由CDAP化學進行製備)係與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶聯，且該胺基衍生醣係使用碳二醯亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上之羧基與載體蛋白結合。此類結合物係描述於國際專利申請公開案號WO 93/15760、WO 95/08348及WO 96/29094；及Chu等人，1983, Infect. Immunity 40:245-256中。
其他合適技術使用碳二醯亞胺、醯肼、活性酯、降冰片烷(norborane)、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多係描述於國際專利申請公開案號WO 98/42721中。結合可涉及羰基連接子，其可藉由醣之游離羥基與CDI之反應(參見Bethell等人，1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4；Hearn等人，1981, J. Chromatogr. 218:509-18)且接著與蛋白質反應以形成胺基甲酸酯鍵來形成。此可涉及將變旋異構末端還原成一級羥基，該一級羥基之可選保護/脫去保護，該一級羥基與CDI反應形成CDI胺基甲酸酯中間體，及將該CDI胺基甲酸酯中間體與蛋白質上之胺基偶聯。
在莢膜多醣與載體蛋白結合後，該等多醣-蛋白結合物係藉由多種技術中之一或多者進行純化(針對多醣-蛋白結合物之含量進行富集)。此等技術之實例為熟習此項技術者所熟知，且包括濃縮/透濾操作、超濾、沉澱/洗脫、管柱層析及深層過濾。參見，例如，美國專利案號6,146,902。
在純化個別糖結合物後，將其等混合以調配本發明免疫原性組合物。此等肺炎球菌結合物係藉由單獨之方法進行製備並散裝調配成單一劑量調配物。
表徵本發明糖結合物之替代方法為藉由載體蛋白(例如CRM197)中與醣結合之離胺酸殘基之數量，其可表徵為一系列經結合之離胺酸(結合度)。歸因於與多醣之共價連接，載體蛋白之離胺酸修飾的證據可藉由使用熟習此項技術者已知之常規方法進行胺基酸分析來獲得。與用於產生結合物物質之載體蛋白起始物質相比，結合導致所回收之離胺酸殘基數量減少。在一較佳實施例中，本發明糖結合物之結合度係在2與15之間、在2與13之間、在2與10之間、在2與8之間、在2與6之間、在2與5之間、在2與4之間、在3與15之間、在3與13之間、在3與10之間、在3與8之間、在3與6之間、在3與5之間、在3與4之間、在5與15之間、在5與10之間、在8與15之間、在8與12之間、在10與15之間或在10與12之間。在一實施例中，本發明糖結合物之結合度為約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14或約15。在一較佳實施例中，本發明糖結合物之結合度係在4與7之間。在一些此等實施例中，該載體蛋白為CRM197。
本發明組合物之糖結合物的特徵亦在於醣與載體蛋白(Ps:Pr)之比率(重量/重量)。在一些實施例中，該組合物中糖結合物之多醣與載體蛋白之比率(w/w)係在0.5與3.0之間(例如，約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1 、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、或約3.0)。在其他實施例中，該醣與載體蛋白之比率(w/w)係在0.5與2.5之間、在0.5與1.5之間、在0.8與2.5之間、在0.5與1.0之間、在1.0與1.5之間、在1.0與2.0之間、在0.8與2.4之間、在0.8與2.3之間、在0.8與2.2之間、在0.8與2.1之間、在0.8與2.0之間、在0.8與1.9之間、在0.8與1.8之間、在0.8與1.7之間、在0.8與1.6之間、在0.8與1.5之間、在0.8與1.4之間、在0.8與1.3之間、在0.9與2.4之間、在0.9與2.3之間、在0.9與2.2之間、在0.9與2.1之間、在0.9與2.0之間、在0.9與1.9之間、在0.9與1.8之間、在0.9與1.7之間、在0.9與1.6之間、在0.9與1.5之間、在0.9與1.4之間、在0.9與1.3之間、在0.9與1.2之間、在1.0與2.4之間、在1.0與2.3之間、在1.0與2.2之間、在1.0與2.1之間、在1.0與2.0之間、在1.0與1.9之間、在1.0與1.8之間、在1.0與1.7之間、在1.0與1.6之間、在1.0與1.5之間、在1.0與1.4之間、在1.0與1.3之間或在1.0與1.2之間。在其他實施例中，該醣與載體蛋白之比率(w/w)係在0.8與1.2之間。在一些此等實施例中，該載體蛋白為CRM197。本發明之糖結合物及免疫原性組合物可含有游離醣，其不與載體蛋白共價結合，但仍存在於糖結合物組合物中。游離醣可與糖結合物非共價結合(即，非共價結合、吸附或包埋在其中或與之結合)。
在特定實施例中，血清型15A結合物之醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.0至約2.0、約1.25至約1.75、或約1.3至約1.7。在其他實施例中，血清型15A之醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、或1.8。
在特定實施例中，血清型15C結合物之醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.0至約2.0、約1.25至約1.75、或約1.3至約1.7。在其他實施例中，血清型15C之醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、或1.8。
在特定實施例中，血清型33F結合物之醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.0至約2.0、約1.25至約1.75、或約1.3至約1.7。在其他實施例中，血清型33F之醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、或1.8。
在特定實施例中，血清型35B結合物之醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.25至約2.25、約1.25至約2.0、或約1.3至約1.8。在其他實施例中，血清型33B之醣與載體蛋白之比率(w/w)為約1.2、1.3、1.3、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、或2.0。
在特定實施例中，血清型24F結合物之醣與載體蛋白之比率(w/w)為約0.5至約1.5、約0.75至約1.25、或約0.8至約1.0。在其他實施例中，血清型24F之醣與載體蛋白之比率(w/w)為約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0。
在一較佳實施例中，與多醣之總量相比，該糖結合物包含少於約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%或15%之游離多醣。在一較佳實施例中，與多醣之總量相比，該糖結合物包含少於約25%之游離多醣。在一較佳實施例中，與多醣之總量相比，該糖結合物包含少於約20%之游離多醣。在一較佳實施例中，與多醣之總量相比，該糖結合物包含少於約15%之游離多醣。
IV. 使用方法
本發明實施例亦包括一或多種本文所述多價免疫原性組合物，其(i)用於以下用途，(ii)用作用於以下用途之藥物或組合物，或(iii)用於製備用於以下用途之藥物：(a)(例如，人體)療法；(b)藥物；(c)抑制肺炎鏈球菌感染；(d)誘導針對肺炎鏈球菌之免疫反應或保護性免疫反應；(e)預防肺炎鏈球菌感染；(f)預防肺炎鏈球菌感染之復發；(g)減少與肺炎鏈球菌感染相關之病理症狀的進展、發作或嚴重程度，包括預防相關併發症，諸如腦損傷、聽力喪失及癲癇發作，(h)減少肺炎鏈球菌感染之可能性，或(i)治療、預防或延遲肺炎球菌疾病之發作、嚴重程度或進展，該等疾病包括但不限於：肺炎球菌肺炎、肺炎球菌菌血症、肺炎球菌腦膜炎、中耳炎及鼻竇炎。在此等用途中，本發明多價肺炎球菌多醣-結合物組合物可視情況與一或多種佐劑組合使用，或不與佐劑組合使用。
因此，本發明提供預防性治療(即，預防)肺炎鏈球菌感染或肺炎球菌疾病之方法，其包括向需要治療之患者投與一或多種本發明多價免疫原性肺炎球菌多醣-蛋白結合物組合物。
本發明組合物及調配物可藉由經由全身或黏膜途徑投與本發明組合物而用於保護或治療易感染(例如肺炎球菌感染)之人類。
在一實施例中，本發明提供誘導針對肺炎鏈球菌之免疫反應的方法，其包括向患者投與免疫有效量之本發明多價免疫原性組合物。在另一實施例中，本發明提供針對肺炎球菌感染對人類進行疫苗接種之方法，其包括向該人類投與免疫有效量之本發明多價免疫原性組合物的步驟。
因此，在一態樣中，本發明提供一種用於(1)在人類患者中誘導免疫反應，(2)在人類患者中誘導保護性免疫反應，(3)針對肺炎鏈球菌感染對人類患者進行疫苗接種，或(4)降低人類患者中肺炎鏈球菌感染之可能性之方法，該方法包括向該患者投與本發明多價免疫原性組合物(即本文所述之任何多價免疫原性組合物，諸如上文標題為「多價免疫原性組合物」之章節II中所述之多價免疫原性組合物)。
在一個實施例中，本發明提供一種預防18歲及以上成人之肺炎球菌肺炎及侵襲性疾病的方法。在另一實施例中，本發明提供一種預防24種肺炎鏈球菌菌株(3、6A、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15 A、15B、15C、16F、17F、19A、20A、20B、22F、23A、23B、24F、31、33F、及35B)引起之肺炎球菌肺炎及侵襲性疾病的方法。
在上述方法之一個實施例中，該組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物各包含肺炎鏈球菌血清型的多醣與載體蛋白結合，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括血清型組：3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A。在上述方法之一個實施例中，該組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物各包含肺炎鏈球菌血清型的多醣與載體蛋白結合，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括血清型組：3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35 B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20。在上述方法之一個實施例中，該組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物各包含肺炎鏈球菌血清型的多醣與載體蛋白結合，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括血清型組：3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20B。在上述方法之另一實施例中，該組合物進一步包含血清型6A或6C之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物。
已顯示，包含血清型6A之肺炎球菌結合物疫苗可提供一些針對血清型6C之交叉保護(Cooper等人，Vaccine 29 (2011) 7207– 7211)。因此，在上述方法之一些實施例中，本發明亦提供多價免疫原性組合物之用途，該多價免疫原性組合物不包含血清型6C，而包含血清型6A或血清型6A及6B。在其他實施例中，該免疫原性組合物包含血清型6A、6B及6C之肺炎球菌結合物。在上述方法之特定實施例中，該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由下列組成之群的一組血清型：
I-a) 3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A；
I-b) 3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A；
I-c) 3、7F、19A、22F、33F、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F及20A；及
I-d) 3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A。
在上述血清型組(I-a至I-d)之特定實施例中，血清型20或20B可代替血清型20A。
在上述方法之其他實施例中，該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由下列組成之群的一組血清型：
II-a) 15A、16F、23A、23B、24F、31及35B；
II-b) 6A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B；
II-c) 6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B；
II-d) 6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B；
II-e) 15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A；
II-f) 6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A；
II-g) 6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A；及
II-h) 6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A。
在上述血清型組(II-e至IIh)之特定實施例中，血清型20或20B可代替血清型20A。
在上述方法之其他實施例中，該等肺炎鏈球菌血清型包括如實施例I-a)、II-a)或II-e)中任一項所述之一組血清型且進一步包括血清型6A、6B及6C。
同樣已顯示，包含血清型10A之肺炎球菌結合物疫苗可提供一些針對血清型39之交叉保護(參見WO 2017/ 085586)。因此，在上述方法之一些實施例中，本發明亦提供多價免疫原性組合物之用途，該多價免疫原性組合物不包含血清型10A，而是包含血清型39。在其他實施例中，該免疫原性組合物包含血清型10A及39之肺炎球菌結合物。在上述方法之特定實施例中，該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由下列組成之群的一組血清型：
III-a) 3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、及20A；
III-b) 3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、及20A；
III-c) 3、7F、19A、22F、33F、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、及20A；
III-d) 3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、及20A；
III-e) 15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、及20A；
III-f) 6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、及20A；
III-g) 6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、及20A；及
III-h) 6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、及20A。
在上述血清型組(II-a至III-h)之特定實施例中，血清型20或20B可代替血清型20A。
在上述方法之其他實施例中，該等肺炎鏈球菌血清型包括如實施例III-a)至III-h)中任一項所述之一組血清型且進一步包括血清型10。
同樣已顯示，包含與載體蛋白共價連接之肺炎鏈球菌血清型15B莢膜多醣的免疫原性結合物可提供一些針對血清型15C及/或血清型15A之交叉保護(參見WO 2015/110942)。因此，在上述方法之一些實施例中，本發明亦提供多價免疫原性組合物之用途，該多價免疫原性組合物不包含血清型15C (或脫-O-乙醯化15B)，而是包含血清型15B (即血清型15B多醣係未經脫-O-乙醯化)。在其他實施例中，該免疫原性組合物包含血清型15B及15C (或脫-O-乙醯化15B)之肺炎球菌結合物。在上述方法之特定實施例中，該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由下列組成之群的一組血清型：
IV-a) 3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20A；
IV-b) 3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20A；
IV-c) 3、7F、19A、22F、33F、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20A；
IV-d) 3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20A；
IV-e) 15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20A；
IV-f) 6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20A；
IV-g) 6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20A；及
IV-h) 6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20A。
在上述血清型組(IVa至IVh)之特定實施例中，血清型20或20B可代替血清型20A。
在上述方法之其他實施例中，該等肺炎鏈球菌血清型包括如實施例IV-a)至IV-h)中任一項所述之一組血清型且進一步包括血清型15C (及/或脫-O-乙醯化15B)。
本發明組合物係適用於在先前接受過多價肺炎球菌疫苗之患者中提供針對肺炎鏈球菌之補充保護的方法。在此用途中，本發明組合物可提供針對患者先前未進行疫苗接種之特定肺炎鏈球菌血清型的保護，可提供針對患者先前已進行疫苗接種之肺炎鏈球菌血清型的另外保護，或者可提供同時針對患者先前未進行疫苗接種之肺炎鏈球菌血清型及先前已進行疫苗接種之肺炎鏈球菌血清型的保護。
因此，本發明提供在患者中針對肺炎鏈球菌誘導免疫反應、疫苗接種、或誘導保護性免疫反應之方法，其包括向該患者投與多價免疫原性組合物，該組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該多醣蛋白結合物包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該患者先前已針對肺炎鏈球菌進行疫苗接種。在本發明此態樣之實施例中，該多價免疫原性組合物可為任何本文所述多價免疫原性組合物。在本發明方法之特定實施例中，該多價免疫原性組合物係投與至先前經多價肺炎球菌疫苗治療之患者。該多價免疫原性疫苗可為指示用於預防由多於一種肺炎鏈球菌血清型引起之肺炎球菌疾病的任何疫苗。
在上述方法之特定實施例中，該患者係先前經多價肺炎球菌疫苗治療，該多價肺炎球菌疫苗係指示用於預防由選自由下列組成之群之肺炎鏈球菌血清型引起的肺炎球菌疾病：
a) 4、6B、9V、14、18C、19F及23F；
b) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、及19A；
c) 1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F；
d) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F、及33F；
e) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20；及
f) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F、33F、8、10A、11A、12F及15B。
在上述方法之特定實施例中，該多價肺炎球菌疫苗包含肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20A之莢膜多醣。在上述方法之特定實施例中，該多價肺炎球菌疫苗包含肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20之莢膜多醣。在上述方法之特定實施例中，該多價肺炎球菌疫苗包含肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20B之莢膜多醣。
在上述方法之特定實施例中，該多價肺炎球菌疫苗包含多種多醣蛋白結合物，其中該等多醣蛋白結合物包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的多醣。在其他實施例中，該多價肺炎球菌疫苗包含多種未與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌莢膜多醣。
在上述方法之其他實施例中，該患者先前經PREVNAR® 13 (肺炎球菌13價結合物疫苗[Diphtheria CRM197 Protein], Pfizer, Inc., Philadelphia, PA, USA)治療。
在上述方法之其他實施例中，該患者先前經PNEUMOVAX® 23 (肺炎球菌多價疫苗，Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA)治療。
在上述方法之其他實施例中，該患者先前經SYNFLORIX™ (肺炎球菌多醣結合物疫苗(吸附型)，GlaxoSmithKline Biologicals s.a., Rixensart, Belgium)治療。
在上述方法之實施例中，本發明多價免疫原性組合物係根據醫學專業人員(例如醫生)提供之治療方案，在患者接受多價肺炎球菌疫苗後之任何時間投與至該患者。在特定實施例中，本發明多價免疫原性組合物係在患者接受多價肺炎球菌疫苗後1個月至5年，或者，在該患者接受該多價肺炎球菌疫苗後1個月至1年、1個月至2年、1個月至3年、1個月至4年、1個月至6個月、2個月至6個月、2個月至1年、1年至5年、6個月至5年、6個月至4年、6個月至3年、6個月至2年、6個月至1年、1年至4年、1年至3年、或1年至2年投與至該患者。在其他實施例中，該多價免疫原性組合物係在該患者接受該多價肺炎球菌疫苗後約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約1年、約1.25年、約1.5年、約1.75年、約2年、約2.25年、約2.5年、約2.75年、約3年、約3.25年、約3.5年、約3.75年、約4年、約4.25年、約4.5年、約4.75年、或約5年投與至該患者。
在其他實施例中，本發明提供一種方法，用於(1)在人類患者中誘導免疫反應，(2)在人類患者中誘導保護性免疫反應，(3)針對肺炎鏈球菌感染對人類患者進行疫苗接種，或(4)降低人類患者中肺炎鏈球菌感染之可能性，該方法包括以任何順序向該患者投與本發明多價免疫原性組合物及投與多價肺炎球菌疫苗。該多價肺炎球菌疫苗可為指示用於預防由多於一種肺炎鏈球菌血清型引起之肺炎球菌疾病的任何疫苗。
在上述方法之特定實施例中，該患者係經本發明多價免疫原性組合物及多價肺炎球菌疫苗治療，該多價肺炎球菌疫苗係指示用於預防由選自由下列組成之群之肺炎鏈球菌血清型引起的肺炎球菌疾病：
a) 4、6B、9V、14、18C、19F及23F；
b) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、及19A；
c) 1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F；
d) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F、及33F；
e) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20；及
f) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F、33F、8、10A、11A、12F及15B。
在上述方法之特定實施例中，該多價肺炎球菌疫苗包含肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20A之莢膜多醣。
在上述方法之特定實施例中，該多價肺炎球菌疫苗包含多種多醣蛋白結合物，其中該等多醣蛋白結合物包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的多醣。在其他實施例中，該多價肺炎球菌疫苗包含多種未與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌莢膜多醣。
在上述方法之其他實施例中，該患者係以任何順序經本發明多價免疫原性組合物治療及經PREVNAR® 13 (肺炎球菌13價結合物疫苗[Diphtheria CRM197 Protein], Pfizer, Inc., Philadelphia, PA, USA)治療。在一實施例中，首先向患者投與PREVNAR® 13，並隨後向該患者投與本發明多價免疫原性組合物。在替代實施例中，首先向患者投與本發明多價免疫原性組合物，並隨後投與PREVNAR® 13。
在上述方法之其他實施例中，該患者係以任何順序經本發明多價免疫原性組合物治療及經PNEUMOVAX® 23 (肺炎球菌多價疫苗，Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA)治療。在一實施例中，首先向患者投與PNEUMOVAX ® 23，並隨後向該患者投與本發明多價免疫原性組合物。在替代實施例中，首先向患者投與本發明多價免疫原性組合物，並隨後投與PNEUMOVAX ® 23。
在上述方法之其他實施例中，該患者係以任何順序經本發明多價免疫原性組合物治療及經SYNFLORIX™ (肺炎球菌多醣結合物疫苗(吸附型)，GlaxoSmithKline Biologicals s.a., Rixensart, Belgium)治療。在一實施例中，首先向患者投與SYNFLORIX™，並隨後向該患者投與本發明多價免疫原性組合物。在替代實施例中，首先向患者投與本發明多價免疫原性組合物，並隨後投與SYNFLORIX™。
在上述方法之一些實施例中，該多價免疫原性組合物及該多價肺炎球菌疫苗係同時投與。如本文所用，「同時投與」不限於兩種組合物在同一時間點進行給藥，而是包括以任何順序一個接一個地進行投與。在一些實施例中，該多價免疫原性組合物及該多價肺炎球菌疫苗係經由肌內或皮下投與至分開之解剖部位(例如，兩個不同臂)而投與。
在上述方法之一些實施例中，投與本發明多價免疫原性組合物與多價肺炎球菌疫苗之間的時間量為約4週至約1年。在替代實施例中，該時間量為約1個月至約5年。
在一實施例中，首先向患者投與該多價肺炎球菌疫苗，並隨後投與本發明多價免疫原性組合物。在替代實施例中，首先向患者投與本發明多價免疫原性組合物，並隨後投與該多價肺炎球菌疫苗。
亦提供一種在患者中針對肺炎鏈球菌誘導免疫反應、疫苗接種或誘導保護性免疫反應之方法，其包括：
(1) 向該患者投與多價免疫原性組合物，該組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等多醣蛋白結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，
(2) 等待度過預定時間量，及
(3) 向該患者投與多價肺炎球菌疫苗。
在此方法中，該多價免疫原性組合物可包含本文所述肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之任何組合，且該多價肺炎球菌疫苗可為指示用於預防由多於一種肺炎鏈球菌血清型引起之疾病的任何疫苗。
本發明亦提供一種在患者中針對肺炎鏈球菌誘導免疫反應、疫苗接種或誘導保護性免疫反應之方法，其包括：
(1) 向該患者投與多價肺炎球菌疫苗，
(2) 等待度過預定時間量，及
(3) 向該患者投與多價免疫原性組合物，該組合物包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等多醣蛋白結合物中之各者均包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣。
在此方法中，該多價免疫原性組合物可包含本文所述肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之任何組合，且該多價肺炎球菌疫苗可為指示用於預防由多於一種肺炎鏈球菌血清型引起之疾病的任何疫苗。
在上述方法之一些實施例中，該多價肺炎球菌疫苗包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等多醣蛋白結合物包含來自與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣。在替代實施例中，該多價肺炎球菌疫苗包含未與載體蛋白結合之肺炎鏈球菌莢膜多醣。
在本發明方法(即任何本文所述方法)之任何實施例，該方法可進一步包括向該患者投與一或多種另外劑量之本發明多價免疫原性組合物。在此等方法中，該患者可能在接受前述本發明多價免疫原性組合物之第一劑量之前已接受過多價肺炎球菌疫苗，或者可能在接受本發明多價免疫原性組合物之前未針對肺炎鏈球菌進行疫苗接種。因此，在一實施例中，向已接受指示用於預防由肺炎鏈球菌引起之肺炎球菌疾病之多價肺炎球菌疫苗的患者投與兩個或更多個劑量之本發明多價免疫原性組合物。在替代實施例中，向先前未經指示用於預防肺炎球菌疾病之任何疫苗治療的患者投與兩個或更多個劑量之本發明多價免疫原性組合物。
在上述方法之實施例中，該等兩個或更多個劑量為相同之本發明多價免疫原性組合物。在替代實施例中，該等兩個或更多個劑量為不同之本發明多價免疫原性組合物。
在此等方法中任一種之特定實施例中，向該患者投與兩個、三個或四個劑量之本發明多價免疫原性組合物。在特定實施例中，該患者係免疫力低下(例如，在幹細胞移植後之免疫抑制方案中)且劑量數量為三個。
在一些實施例中，投與本發明多價免疫原性組合物之各劑量之間的時間量為約4週至約1年。在替代實施例中，投與本發明多價免疫原性組合物之各劑量之間的時間量為約1個月至約5年。
在本發明方法中任一種之實施例中，待經本發明組合物治療之患者為人類。在某些實施例中，該人類患者為嬰兒(約12至24個月)或幼兒(約2至5歲)。本發明組合物亦適用於年齡較大之兒童、青少年及成人(例如，年齡18至45歲、年齡18至50歲、年齡18至55歲、年齡18至60歲或18至65歲)。在本發明方法中任一種之其他實施例中，該患者為約2至約18歲。在本發明方法中任一種之其他實施例中，該患者為約18歲或更大。
在本發明方法之其他實施例中，該人類患者為老年人。在本發明方法中任一種之一些實施例中，該患者為約50歲或更大。在本發明方法中任一種之一些實施例中，該患者為約55歲或更大。在本發明方法中任一種之一些實施例中，該患者為約60歲或更大。在本發明方法中任一種之其他實施例中，該患者為約65歲或更大。在本發明方法中任一種之其他實施例中，該患者為約70歲或更大。
在本發明方法中任一種之一些實施例中，待經本發明免疫原性組合物治療之患者係免疫力低下。
在本發明方法中任一種之一些實施例中，該多價免疫原性組合物係與抗流感疫苗同時投與。在某些實施例中，該流感疫苗為「高級流感疫苗」，一種用於老年人(例如， 65歲及更大之人)之高劑量流感疫苗。
本發明提供一種在患者中針對肺炎球菌感染誘導保護性免疫反應之方法，其包括向該患者投與免疫有效量之任何本文所述多價免疫原性肺炎球菌多醣-蛋白結合物組合物的步驟。特定疫苗(即多價免疫原性組合物)之組分之最佳量可藉由涉及觀察個體中之適當免疫反應的標準研究確定。例如，在另一實施例中，用於人類疫苗接種之劑量係藉由從動物研究外推至人類數據來確定。在另一實施例中，劑量係根據經驗進行確定。
本發明方法可用於預防及/或減少由微生物(例如，肺炎鏈球菌)引起之原發性臨床症候群，包括侵襲性感染(腦膜炎、肺炎及菌血症)及非侵入性感染(急性中耳炎及鼻竇炎)兩者。
本發明組合物之投與可包括以下一或多種：經由肌內、腹膜內、皮內或皮下途徑注射；或經由黏膜投與至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。在一實施例中，鼻內投與係用於治療肺炎或中耳炎(因為可更有效地預防肺炎球菌之鼻咽攜帶，從而在其早期階段減弱感染)。在特定實施例中，本發明組合物係經由肌內或皮下投與而投與至患者。
出於描述及揭示可能與本發明結合使用之方法及物質的目的，本文提及之所有公開案係以引用之方式併入。
藉由參考附圖描述本發明之不同實施例，應理解，本發明不限於彼等精確實施例，且熟習此項技術者可在其中實現各種改變及修改而不脫離如隨附申請專利範圍中所定義之本發明範圍或精神。
以下實例說明但不限制本發明。
實例1
肺炎鏈球菌莢膜多醣之製備
此項技術熟知培養肺炎球菌之方法。參見，例如，Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52。此項技術亦熟知製備肺炎球菌莢膜多醣之方法。參見，例如，歐洲專利案號EP 0 497 524 B1。下文所述方法一般遵循歐洲專利案號EP 0 497 524 B1中所述之方法，且一般適用於所有肺炎球菌血清型。
針對血清型6C、23B及31之肺炎球菌菌株之分離物係獲自疾病控制及預防中心(Centers for Disease Control and Prevention，Atlanta，GA)。血清型3、8、10A、11A、12F、15B、22F、及33F之菌株係獲自賓夕法尼亞大學(University of Pennsylvania，Dr. Robert Austrian)。血清型17F及19A之菌株係獲自FDA生物製劑辦公室(FDA Office of Biologics，Dr. John Robbins)。血清型7F係獲自紐約州立大學下州醫學中心(State University of New York，Downstate Medical Center，Dr. Gerald Schiffman)。上文未列出之肺炎球菌血清型的分離物係獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA)。需要時，使用特異性抗血清在腫脹反應之基礎上區分亞型。參見，例如，美國專利案號5,847,112。藉由在由含有大豆蛋白腖、酵母萃取物及葡萄糖不含氯化血紅素之無動物成分培養基組成之瓊脂板上於兩個階段中連續接種加以進一步選殖分離所獲得之分離物。對於血清型7F而言，所用瓊脂板亦含有氯化血紅素。使用含有大豆蛋白腖、酵母萃取物、HEPES、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸鉀、葡萄糖及甘油之無動物成分培養基在液體培養中進一步擴增各血清型之選殖分離物，以製備預主細胞庫。
各血清型之肺炎球菌多醣的產生由細胞擴增及分批生產發酵且接著在下游純化之前進行化學滅活組成。使用含有預先滅菌之含有大豆蛋白腖或大豆蛋白腖超濾液、酵母萃取物或酵母萃取物超濾液、HEPES、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸鉀及葡萄糖的無動物成分生長培養基之搖瓶或培養瓶擴增來自各血清型之解凍細胞庫小瓶。細胞擴增培養物係在密封之搖瓶或瓶中生長，以使隨溫度及攪拌控制之氣體交換最小化。對於血清型3、7F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、19A、20、22F、及33F而言，使用含有相同培養基之發酵罐擴增解凍細胞庫小瓶。在此等血清型之細胞擴增期間，控制溫度、pH、壓力及攪拌。由於未使用注氣，因此亦控制氣流覆蓋。在達成特定培養密度後，如藉由在600 nm下之光密度所量測，將一部分細胞擴增培養物轉移至含有預先滅菌之含有大豆蛋白腖或大豆蛋白腖超濾液、酵母萃取物或酵母萃取物超濾液、氯化鈉、磷酸鉀及葡萄糖之無動物成分生長培養基的生產發酵罐中。控制溫度、pH、壓力及攪拌。由於未使用注氣，因此亦控制氣流覆蓋。
當葡萄糖幾乎耗盡時，經由添加化學滅活劑苯酚終止分批發酵。添加純苯酚至最終濃度為0.8至1.2%以使細胞失活並從細胞壁釋放莢膜多醣。在發酵罐內之特定時間內發生初次滅活，其中溫度及攪拌繼續受到控制。在初次滅活後，將批料轉移至另一容器中，其中使批料在受控溫度及攪拌下保持另外特定時間以完全滅活。此係藉由微生物平板培養技術或藉由驗證苯酚濃度及指定時間進行確認。隨後純化經滅活培養液。
實例2
肺炎球菌多醣之純化
肺炎球菌多醣之純化程序由若干次離心、深層過濾、濃縮/透濾操作及沉澱步驟組成。除非另有說明，否則所有步驟均在室溫下進行。
用陽離子聚合物(諸如BPA-1000、TRETOLITE® (Baker Hughes Inc., Houston, TX)、Spectrum 8160、聚(乙烯亞胺)及Millipore pDADMAC)使來自肺炎鏈球菌發酵罐培養物之滅活培養液絮凝。陽離子聚合物與雜質蛋白質、核酸及細胞碎片結合。在絮凝步驟及老化期後，經由離心及多個深層過濾步驟移除絮凝之固體。濃縮澄清培養液並使用100 kDa至500 kDa MWCO (分子量截斷)過濾器透濾。透濾係使用Tris、MgCl2 緩衝劑及磷酸鈉緩衝劑完成。透濾移除殘留核酸及蛋白質。
藉由用變性醇及/或異丙醇使含於乙酸鈉及苯酚中之多醣再沉澱來完成其他雜質之移除。在苯酚沉澱步驟期間，將含於磷酸鈉鹽水緩衝劑及苯酚(液化酚或固體酚)中之乙酸鈉加料至經透濾之滯留物中。隨後在兩個階段中進行多醣之醇分餾。在第一階段中，將低百分比醇添加至該製劑中以使細胞碎片及其他非所欲雜質沉澱，而粗多醣保留於溶液中。經由離心且接著深層過濾步驟來移除雜質。隨後藉由向批料中添加另外異丙醇或變性醇從溶液中回收多醣。藉由離心回收沉澱之多醣沉澱物，研磨並乾燥成粉末並在-70℃下冷凍儲存。
實例3
藉由NMR試驗分析某些肺炎球菌血清型之結構同一性
藉由將多醣粉末以5 mg粉末/mL溶液溶解於含有0.01%二甲基亞碸(DMSO)及0.01% 2,2-二甲基-2-矽雜戊烷-5-磺酸鹽-d6 鈉鹽(DSS-d6 )之氧化氘(D2 O)中來製備用於NMR分析之樣品。DMSO為用於定量分析之內標物，而DSS-d6 係用於將化學位移標度設定為0 ppm。在50℃下獲得一維質子NMR數據集，並隨後將包含變旋異構共振之光譜的一部分作為x、y坐標選擇性地寫入至ASCII文件，以供使用Microsoft Excel工作簿進行分析。隨後將Y坐標(即，光譜圖譜)與參考數據庫中之莢膜細菌多醣的光譜圖譜進行比較。以相似之方式對各血清型之選定製劑產生參考圖譜，之後將其指定為參考批次。對來自樣品及參考光譜之y值進行成對比較，以產生相關係數(ρx,y )作為光譜之間相似性之量度。將ρ值≥0.95之任何參考光譜作為多醣結構之正識別。
圖1至4提供來自肺炎鏈球菌血清型6C、15A、脫-O-乙醯化15B及35B之莢膜多醣的600 MHz一維1 H NMR光譜。用於肺炎鏈球菌血清型6C、15A、脫-O-乙醯化15B及35B之血清型識別的1 H NMR同一性區域係分別在圖5至8中提供。
來自肺炎鏈球菌血清型脫 -O- 乙醯化 15B 及 15C 之莢膜多醣的結構
使用PCV21在紐西蘭白兔中進行免疫原性研究(參見下文實例43)。在此等研究中，在多價組合物中使用脫-O-乙醯化多醣血清型15B代替血清型15C。進行NMR研究以證實脫-O-乙醯化15B多醣等同於血清型15C多醣。
莢膜多醣血清型之間之結構差異表現為NMR譜中之化學位移差異。變旋異構區(約4.4 ppm至6.0 ppm)對多醣之重複單元中的每個結構特徵而言均係敏感的。立體化學、單醣組成、O-乙醯化及糖苷鍵之差異影響變旋異構信號之化學位移，使得譜圖之此區域對於各血清型而言均係唯一的。對於脫-O-乙醯化血清型15B多醣而言，完整的1 H NMR光譜係與血清型15C多醣的1 H NMR光譜相同，此指示兩種多醣之重複單元係由相同單醣取代基及糖苷鍵連接位點組成(參見圖9B至9C及10B至10C)。亦清楚地顯示，脫-O-乙醯化步驟移除15B多醣中存在之O-乙酸酯基團，及基本上沒有觀察到剩餘O-乙酸酯基團(參見圖10A至10F)。
實例4
使用DMSO結合製備血清型3結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於二甲基亞碸(DMSO)中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在380巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.25莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。在22℃下進行氧化反應12小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以2 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為10% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為1.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.3。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合1小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1.6小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料，並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表1.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型3結合物的屬性
實例5
使用DMSO結合製備血清型6C用於結合物單價研究
將多醣溶解，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。濃縮經過濾之溶解多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.10莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為2.2 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.4。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合15小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育3小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料，並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。


表2.自DMSO結合製得之用於單價研究之血清型6C結合物的屬性
實例6
使用DMSO結合製備血清型6C結合物用於多價研究
將多醣溶解，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。濃縮經過濾之溶解多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.10莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為1.9 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.4。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合15小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育3小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料，並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表3.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型6C結合物的屬性
使用DMSO結合製備血清型6A結合物用於單價研究
將多醣溶解，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在200巴/5次。濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.10莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為1.5 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.4。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合15小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育3小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表3a.自DMSO結合製得之用於單價研究之血清型6A結合物的屬性
實例7
使用DMSO結合製備血清型7F結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在150巴/7次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.24莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。在4℃下進行氧化反應4小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為2.6 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合4小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育3小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表4.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型7F結合物的屬性
實例8
使用DMSO結合製備血清型8結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在600巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.18莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行4小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為4.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。混合後，在22℃下進行結合反應2小時。未在結合反應中添加氰基硼氫化鈉，因為觀察到氰基硼氫化鈉之添加可在血清型8之結合反應期間導致不可逆沉澱。從反應中省略氰基硼氫化鈉避免沉澱，而不顯著影響結合物屬性。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表5.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型8結合物的屬性
實例9
使用DMSO結合製備血清型9N結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在250巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.16莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行4小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為3.25 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合1小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表6.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型9N結合物的屬性
實例10
使用DMSO結合製備血清型10A結合物用於單價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在200巴/5次，其後接著600巴/5次，以達成目標分子量。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.15莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為5.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為2.0。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合4小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表7.自DMSO結合製得之用於單價研究之血清型10A結合物的屬性
實例11
使用DMSO結合製備血清型10A結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在600巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.16莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為4.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.75。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合4小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表8.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型10A結合物的屬性
實例12
使用DMSO結合製備血清型11A結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。藉由添加乙酸至200 mM進行酸水解，在92℃下培育75分鐘，隨後藉由添加冷磷酸鉀pH 7緩衝劑至400 mM進行中和來使溶解之多醣尺寸減小。
濃縮尺寸減小之多醣並使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.13莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之含有25 mM氯化鈉的DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為3.5 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合4小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表9.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型11A結合物的屬性
實例13
使用DMSO結合製備血清型12F結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。藉由添加乙酸至200 mM進行酸水解，在90℃下培育45分鐘，隨後藉由添加冷磷酸鉀pH 7緩衝劑至400 mM進行中和來使溶解之多醣尺寸減小。
濃縮尺寸減小之多醣並使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.26莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之含有25 mM氯化鈉的DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為3.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合4小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育3小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。


表10.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型12F結合物的屬性
實例14
使用DMSO結合製備血清型15A結合物用於單價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在200巴/5次通過。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜對水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使多醣尺寸減小因活化而最小化。由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。添加偏過碘酸鈉為1.75莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行20小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之含有25 mM氯化鈉的DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為6.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為2.0。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合2.5小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表11.自DMSO結合製得之用於單價研究之血清型15A結合物的屬性
實例15
使用水性結合製備血清型15A結合物用於15A/B/C交叉保護研究
將多醣溶解，減小尺寸，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。隨後在水性反應混合物中使用氯化鎳將經純化之CRM197與經活化之多醣結合，並在最終0.2微米過濾之前藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜多醣粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在200巴/5次，以達成目標分子量。隨後濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.45莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元。在22℃下進行氧化反應20小時。使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾。超濾係在2至8℃下進行。藉由將經超濾之產物調節至22℃及pH 5來實現進一步活化。添加100 mM偏過碘酸鈉溶液進行活化，其中裝料為2.0莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。在22℃下進行氧化反應20小時。使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將第二活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
將氧化多醣溶液與水及1.5 M磷酸鉀pH 6.0混合。所選緩衝劑pH係用於在結合反應期間改良經活化之多醣的穩定性。對通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197進行0.2微米過濾並以0.6之多醣對CRM197質量比與經緩衝之多醣溶液合併。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。多醣及磷酸鹽濃度分別為9.75 g/L及100 mM。選擇多醣濃度以控制所得結合物之尺寸。使用100 mM氯化鎳溶液將氯化鎳添加至約2 mM。添加氰基硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)。在10℃下進行結合148小時以最大化多醣及蛋白質之消耗。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後，將批料稀釋至多醣濃度為約3.0 g/L，冷卻至2至8℃，並進行1.2微米過濾。在2至8℃下使用100 kDa NMWCO切向流超濾膜將批料以100 mM磷酸鉀pH 7.0透濾。隨後將在滯留物中回收之批料稀釋至約2.0 g多醣/L，並藉由添加1.2 M碳酸氫鈉，pH 9.4來調節pH。添加硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)。隨後添加1.5 M磷酸鉀，pH 6.0。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM L-組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0透濾。將聚山梨醇酯20添加至滯留物批料中至濃度為0.05% (w/v)，隨後對批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)。
使用另外10 mM L-組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0緩衝劑，含0.03% (w/v)聚山梨醇酯20將批料調節至多醣濃度為1.0 g/L。將批料分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表12.自水性結合製得之用於15A/B/C交叉保護研究之血清型15A結合物的屬性
實例16
使用DMSO結合製備血清型15A結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在200巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為1.75莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行20小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於預加熱至34℃之等體積DMSO中。向多醣溶液中外添加氯化鈉至濃度為50 mM。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為5.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為2.0。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在34℃下進行結合2小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表13.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型15A結合物的屬性
實例17
使用DMSO結合製備血清型15B結合物用於15A/B/C交叉保護研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在300巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.20莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行4小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為3.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為2.0。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合5小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表14.自水性結合製得之用於15A/B/C交叉保護研究之血清型15B結合物的屬性
實例18
使用DMSO結合製備血清型15C結合物用於單價研究及15A/B/C交叉保護研究
將衍生自肺炎鏈球菌血清型15B之多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行溫和的鹼水解以釋放O-乙醯基，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小 、 鹼水解及氧化
將經純化之血清型15B肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在300巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
將多醣溶液加熱至60℃並添加碳酸氫鈉pH 9緩衝劑至最終濃度為50 mM。在60℃下將批料在混合下培育13小時以釋放O-乙醯基。添加磷酸鉀pH 6緩衝劑至最終濃度為136 mM以中和pH並將溶液冷卻至環境溫度。隨後濃縮溶液並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.20莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為3.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為2.0。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合4小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表15.自DMSO結合製得之用於單價研究及15A/B/C交叉保護研究之血清型15C結合物的屬性
實例19
使用DMSO結合製備血清型15C結合物用於多價研究
將衍生自肺炎鏈球菌血清型15B之多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行溫和的鹼水解以釋放O-乙醯基，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小 、 鹼水解及氧化
將經純化之血清型15B肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在300巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
將多醣溶液加熱至60℃並添加碳酸氫鈉pH 9緩衝劑至最終濃度為50 mM。在60℃下將批料在混合下培育13小時以釋放O-乙醯基。添加磷酸鉀pH 6緩衝劑至最終濃度為136 mM以中和pH並將溶液冷卻至環境溫度。隨後濃縮溶液並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.20莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為3.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.75。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合8小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表16.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型15C結合物的屬性
實例20
使用水性結合製備血清型16F結合物用於單價研究
將多醣溶解，減小尺寸，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。隨後在水性反應混合物中使用氯化鎳將經純化之CRM197與經活化之多醣結合，並在最終0.2微米過濾之前藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜多醣粉末溶解於水中，並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在200巴/5次，接著500巴/5次，以達成目標分子量。濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.15莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
將氧化多醣溶液與水及1.5 M磷酸鉀pH 7.0混合。所選緩衝劑pH係用於在結合反應期間改良經活化之多醣的穩定性。對通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197進行0.2微米過濾並以0.7之多醣對CRM197質量比與經緩衝之多醣溶液合併。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。多醣及磷酸鹽濃度分別為7.5 g/L及100 mM。選擇多醣濃度以控制所得結合物之尺寸。隨後對溶液進行0.2微米過濾。使用100 mM氯化鎳溶液將氯化鎳添加至約2 mM。添加氰基硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)。在22℃下進行結合122小時以最大化多醣及蛋白質之消耗。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後，將批料稀釋至多醣濃度為約3.0 g/L，冷卻至2至8℃，並進行1.2微米過濾。在2至8℃下使用100 kDa NMWCO切向流超濾膜將批料以100 mM磷酸鉀pH 7.0透濾。隨後將在滯留物中回收之批料稀釋至約2.0 g多醣/L，並藉由添加1.2 M碳酸氫鈉，pH 9.4來調節pH。添加硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)。隨後添加1.5 M磷酸鉀pH 6.0。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM L-組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0透濾。將聚山梨醇酯20添加至滯留物批料中至濃度為0.05% (w/v)，隨後對批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)。
使用另外10 mM L-組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0緩衝劑，含0.03% (w/v)聚山梨醇酯20將批料調節至多醣濃度為1.0 g/L。將批料分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表17.自水性結合製得之用於單價研究之血清型6A結合物的屬性
實例21
使用DMSO結合製備血清型16F結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在1000巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.15莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。向多醣溶液中外添加氯化鈉至濃度為50 mM。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為2.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合2小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表18.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型16F結合物的屬性
實例22
使用DMSO結合製備血清型17F結合物用於單價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在200巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.11莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。向多醣溶液中外添加氯化鈉至濃度為50 mM。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為2.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合2小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表19.自DMSO結合製得之用於單價研究之血清型17F結合物的屬性
實例23
使用DMSO結合製備血清型17F結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在200巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.11莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。向多醣溶液中外添加氯化鈉至濃度為20 mM。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為2.1 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合2小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表20.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型17F結合物的屬性
實例24
使用DMSO結合製備血清型19A結合物用於多價研究
將多醣溶解，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。濃縮多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉的量為0.26莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行20小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為3.8 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.33。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合1.5小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育3小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kDa NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表21.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型19A結合物的屬性
實例25
使用DMSO結合製備血清型20A結合物用於單價研究
將先前確定為血清型20A (Calix等人，Biochemical, Genetic, and Serological Characterization of Two Capsule Subtypes amongStreptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains,J. Biol. Chem . 287(33): 27885–27894, (2012))之多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在200巴/5次通過。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜對水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使多醣尺寸減小因活化而最小化。由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。以0.11莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元添加偏過碘酸鈉，以達成多醣活化之目標量(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜，將活化產物對10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著對水透濾。超濾係在2至8℃進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜，將如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197對2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝液透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為2.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃進行結合6小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表22.自DMSO結合製得之用於單價研究之血清型20A結合物的屬性
實例26
使用DMSO結合製備血清型20A結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在220巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。以0.16莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元添加偏過碘酸鈉，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。向多醣溶液中外添加氯化鈉至濃度為20 mM。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為1.4 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合4小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表23.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型20A結合物的屬性
實例27
使用DMSO結合製備血清型22F結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在400巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。以0.12莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元添加偏過碘酸鈉，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為1.8 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合1小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表24.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型22F結合物的屬性
實例28
使用DMSO結合製備血清型23A結合物用於單價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。藉由添加乙酸至200 mM進行酸水解，在90℃下培育1.5小時，隨後藉由添加冷磷酸鉀pH 7緩衝劑至400 mM進行中和來使溶解之多醣尺寸減小。
濃縮尺寸減小之多醣並使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉為0.20莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。向多醣溶液中外添加氯化鈉至濃度為50 mM。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為3.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合2小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育3小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。


表25.自DMSO結合製得之用於單價研究之血清型23A結合物的屬性
實例29
使用DMSO結合製備血清型23A結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。藉由添加乙酸至200 mM進行酸水解，在90℃下培育1.5小時，隨後藉由添加冷磷酸鉀pH 7緩衝劑至400 mM進行中和來使溶解之多醣尺寸減小。
濃縮尺寸減小之多醣並使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉為0.20莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為3.5 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合2小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表26.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型23A結合物的屬性
實例30
使用DMSO結合製備血清型23B結合物用於單價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在400巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。以0.10莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元添加偏過碘酸鈉，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。向多醣溶液中外添加氯化鈉至最終濃度為50 mM。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為5.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合2小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表27.自DMSO結合製得之用於單價研究之血清型23B結合物的屬性
實例31
使用DMSO結合製備血清型23B結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在400巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。以0.13莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元添加偏過碘酸鈉，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為5.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣比CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合4小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表28.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型23B結合物的屬性
實例32
使用DMSO結合製備血清型24F結合物用於單價及多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。藉由添加乙酸至200 mM進行酸水解，在92℃下培育50分鐘，隨後藉由添加冷磷酸鉀pH 7緩衝劑至400 mM進行中和來使溶解之多醣尺寸減小。
濃縮尺寸減小之多醣並使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉為0.18莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以2 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為10% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。向多醣溶液中外添加氯化鈉至最終濃度為50 mM。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為1.5 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合2小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表29.自DMSO結合製得之用於單價及多價研究之血清型24F結合物的屬性
實例33
使用DMSO結合製備血清型31結合物用於單價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。藉由添加乙酸至200 mM進行酸水解，在90℃下培育30分鐘，隨後藉由添加冷磷酸鉀pH 7緩衝劑至400 mM進行中和來使溶解之多醣尺寸減小。
濃縮尺寸減小之多醣並使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉為0.16莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為4.0 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合1小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。


表30.自DMSO結合製得之用於單價研究之血清型31結合物的屬性
實例34
使用DMSO結合製備血清型31結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在400巴/5次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。以0.12莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元添加偏過碘酸鈉，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。向多醣溶液中外添加氯化鈉至最終濃度為50 mM。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為3.5 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合1小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表31.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型31結合物的屬性
實例35
使用DMSO結合製備血清型33F結合物用於多價研究
將多醣溶解，尺寸加工至目標分子量，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣尺寸減小及氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。將溶解之多醣均質化以降低Ps之分子量。將均質化壓力及通過均質機之次數控制在350巴/4次。
濃縮尺寸減小之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。以0.12莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元添加偏過碘酸鈉，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197物質各自再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為1.8 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為1.75。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。添加氰基硼氫化鈉(1莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下進行結合4小時。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表32.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型33F結合物的屬性
實例36
使用DMSO結合製備血清型35B結合物用於單價研究
將多醣溶解，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。濃縮溶解之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉為0.05莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps及CRM197各自再溶解於等體積之含有25 mM氯化鈉的DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為10 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為4.0。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。在22℃下進行結合2.5小時。在結合培育期間，在兩個尖峰上添加硼氫化鈉(0.025莫耳/莫耳多醣重複單元)。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在22℃下培育1.5小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表33.自DMSO結合製得之用於單價研究之血清型35B結合物的屬性
實例37
使用DMSO結合製備血清型35B結合物用於多價研究
將多醣溶解，進行化學活化並藉由超濾進行緩衝劑交換。將經活化之多醣及經純化之CRM197分別凍乾並再溶解於DMSO中。隨後將再溶解之多醣及CRM197溶液合併並如下所述進行結合。在最終0.2微米過濾之前，藉由超濾純化所得結合物。控制每個步驟中之若干個程序參數，諸如pH、溫度、濃度及時間，以產生具有所需屬性之結合物。
多醣氧化
將經純化之肺炎球菌莢膜Ps粉末溶解於水中並進行0.45微米過濾。濃縮溶解之多醣並使用10 kDa NMWCO切向流超濾膜以水透濾。
隨後用乙酸鈉緩衝劑將多醣溶液調節至22℃及pH 5，以使歸因於活化之多醣尺寸減小最小化。藉由添加100 mM偏過碘酸鈉溶液開始多醣活化。所添加之偏過碘酸鈉為0.05莫耳偏過碘酸鈉/莫耳多醣重複單元，以達成目標多醣活化水平(莫耳醛/莫耳多醣重複單元)。氧化反應在22℃下進行2小時。
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將活化產物以10 mM磷酸鉀pH 6.4透濾，接著以水透濾。超濾係在2至8℃下進行。
多醣與 CRM197 結合
使用5 kDa NMWCO切向流超濾膜將通過如前所述(WO 2012/173876 A1)在螢光假單胞菌中表現所獲得之純化CRM197以2 mM磷酸鹽pH 7.2緩衝劑透濾，並進行0.2微米過濾。
調配經活化之多醣，以6 mg Ps/mL凍乾，蔗糖濃度為5% w/v。調配CRM197，以6 mg Pr/mL凍乾，蔗糖濃度為1% w/v。
將經調配之Ps及CRM197溶液各自凍乾。將經凍乾之Ps再溶解於含有50 mM氯化鈉之DMSO中。將經凍乾之CRM197再溶解於等體積之DMSO中。將多醣及CRM197溶液摻合以達成多醣濃度為5.25 g Ps/L及多醣對CRM197質量比為3.5。選擇質量比以控制所得結合物中的多醣對CRM197比率。在34℃下進行結合3小時。在結合培育期間，在三個尖峰上添加硼氫化鈉(0.0375莫耳/莫耳多醣重複單元)。
用硼氫化鈉還原
在結合反應後添加硼氫化鈉(2莫耳/莫耳多醣重複單元)，並在34℃下培育1小時。將批料在約4℃下稀釋至150 mM氯化鈉中，含約0.025% (w/v)聚山梨醇酯20。隨後添加磷酸鉀緩衝劑以中和pH。濃縮批料並在約4℃下使用30 kD NMWCO切向流超濾膜以150 mM氯化鈉、25 mM磷酸鉀pH 7透濾。
最終過濾及產品儲存
隨後濃縮批料並在4℃下使用300 kDa NMWCO切向流超濾膜以10 mM組胺酸含於150 mM氯化鈉pH 7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20透濾。
對滯留物批料進行0.2微米過濾(使用0.5微米預濾器)，隨後使用另外10 mM組胺酸含於150mM氯化鈉pH7.0，含0.015% (w/v)聚山梨醇酯20進行稀釋，分配成等分試樣並在≤ -60℃下冷凍。
表34.自DMSO結合製得之用於多價研究之血清型35B結合物的屬性
一些水性結合方法係未針對實例38至51中之所有血清型進行描述。對於本文未描述之彼等水性結合方法，類似方法可見於WO2018/156491。
實例38
肺炎球菌結合物疫苗之調配物
使用如上文實例中所述之不同化學方法製備的單一肺炎球菌多醣-蛋白結合物係用於調配分別稱為PCV1、PCV7、PCV8、PCV14、PCV15、PCV16、PCV21及PCV31之1價、7價、8價、14價、15價、16價、21價及31價肺炎球菌結合物疫苗。
PCV1疫苗藥品調配物含有血清型3，在質子性(水性)溶劑或非質子性(DMSO)溶劑中使用還原胺化進行結合並在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150 mM NaCl及0.1% (w/v) PS-20中進行調配，達成目標最終濃度為84 μg/mL (w/v)肺炎球菌多醣(PnPs)含於疫苗。
PCV7疫苗藥品調配物含有血清型3、8、9N、10A、11A、15A及19A，在質子性(水性)溶劑或非質子性(例如DMSO)溶劑中使用還原胺化進行結合並在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150 mM NaCl及0.1% (w/v) PS-20中進行調配。PCV7中之各多醣-蛋白結合物均係在12 μg/mL (w/v)肺炎球菌多醣(PnPs)下進行調配，達成目標最終濃度為84 μg/mL PnPs含於疫苗。
PCV8疫苗藥品含有血清型6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，在非質子性溶劑(例如DMSO)中使用還原胺化進行結合並在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150 mM NaCl及0.2% (w/v)PS-20中進行調配。PCV8中之各多醣-蛋白結合物均係在4 μg/mL (w/v)肺炎球菌多醣(PnPs)下進行調配，達成目標最終濃度為32 μg/mL PnPs含於疫苗。
PCV14疫苗藥品含有血清型3、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、16F、17F、19A、20A、22F及33F，在質子性(水性)溶劑或非質子性(例如DMSO)溶劑中使用還原胺化進行結合並在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150 mM NaCl及0.1% (w/v)PS-20中進行調配。PCV14中之各多醣-蛋白結合物均係在6 μg/mL (w/v)肺炎球菌多醣(PnPs)下進行調配，達成目標最終濃度為84 μg/mL PnPs含於疫苗。
PCV15疫苗藥品含有血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F，在質子性(水性)溶劑中進行結合並在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150 mM NaCl及0.2% (w/v)PS-20中進行調配。各多醣-蛋白結合物均係在4 μg/mL (w/v)肺炎球菌多醣(PnPs)下進行調配，6B除外，其係在8 μg/mL下進行調配，達成目標最終濃度為64 μg/mL PnPs含於疫苗。
PCV16疫苗藥品含有血清型6C、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、20A、23A、23B、24F、31、及35B，在非質子性溶劑(例如DMSO)中使用還原胺化進行結合並在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150 mM NaCl及0.2% (w/v)PS-20中進行調配。各多醣-蛋白結合物均係在4 μg/mL (w/v)或8 μg/mL (w/v)肺炎球菌多醣(PnPs)下進行調配，達成目標最終濃度為64 μg/mL或128 μg/mL PnPs含於疫苗。
PCV21疫苗藥品含有血清型3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、24F、31、33F及35B，在非質子性溶劑(例如DMSO)中使用還原胺化進行結合並在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150 mM NaCl及多種濃度之PS-20中進行調配。各多醣-蛋白結合物均係在4 μg/mL (w/v)或8 μg/mL (w/v)肺炎球菌多醣(PnPs)下進行調配，達成目標最終濃度為84 μg/mL或168 μg/mL PnPs含於疫苗。在一些實例中，PCV21係使用呈磷酸鋁形式之250 μg[Al]/mL進行調配。
PCV31疫苗藥品含有血清型1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20A、22F、23A、23B、23F、24F、31、33F及35B，在質子性溶劑(水性)或非質子性溶劑(例如DMSO)中使用還原胺化進行結合並在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150 mM NaCl及0.2% PS-20中進行調配。各多醣-蛋白結合物均係在4 μg/mL (w/v)肺炎球菌多醣(PnPs)下進行調配，6B除外，其係在8 μg/mL PnPs下進行調配，達成目標最終濃度為128 μg/mL PnPs含於疫苗。在一些實例中，PCV31係使用呈磷酸鋁形式之250 μg[Al]/mL進行調配。
另外單價PCV藥品調配物係使用肺炎球菌多醣-蛋白結合物血清型6A、6B、6C、10A、15A、15B、15C、16F、17F、20A、23A、23B、24F、31或35B製備。其他細節係描述於針對此等調配物之具體實例中。
為製備PCV藥品調配物，基於批料體積及散裝多醣濃度計算獲得肺炎球菌多醣(亦稱為PnPs)之指示最終濃度(w/v)所需之散裝結合物的所需體積。
調配方法由以1X至4X之PnPs摻合物含於10至80 mM組胺酸、0.0至0.8% (w/v) PS-20、及150 mM氯化鈉，pH 5.8之最終濃度的結合物散裝摻合製備組成。
製備組胺酸pH 5.8、PS-20 (若使用)及150 mM氯化鈉溶液並將其添加至調配容器中。將冷凍保存之單一肺炎球菌多醣-蛋白結合物在2至8℃下解凍，並隨後添加至調配容器中。在將多醣-蛋白結合物添加至調配緩衝液(結合物摻合物)期間，使用磁力攪拌棒或磁力葉輪混合容器以確保均質性。在完成所有添加並攪拌溶液後，使結合物摻合物通過滅菌過濾器並收集於含有或不含磷酸鋁佐劑之容器中。在一些情況下，用150 mM氯化鈉追蹤滅菌過濾器以將批料調整至目標濃度。
將調配物填充至塑膠注射器、玻璃注射器或小瓶中。
實例39
肺炎球菌結合物疫苗之穩定性評估
將PCV16 (128 μg/mL PnPs)或兩種PCV21肺炎球菌結合物疫苗藥品(84 μg/mL或168 μg/mL PnPs)填充於注射器或小瓶中。經由在非質子性溶劑(例如DMSO)中進行還原胺化來製備多醣蛋白結合物，並在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150 mM NaCl及0.2% (w/v)PS-20中進行調配。將此等藥品在25℃或37℃下放置至多四週，及在4℃下放置至多十二週。在一些情況下，在4℃、25℃或37℃下儲存1週後將注射器置於水平旋轉平台上並振盪至多18小時。進行此操作以模擬可能伴隨藥品生產及分銷之運輸及處理應力。為評估PCV16或PCV21藥品之穩定性，使用HPSEC UV/MALS/RI。將使用兩個Shodex管柱(803及806)之高效尺寸排阻層析(HPSEC)與紫外線(UV)多角度光散射(MALS)及折射率(RI)偵檢串聯耦合，以量測PCV藥品調配物在儲存期間之濃度及莫耳質量。計算峰上各時間間隔之濃度，並隨後在所有時間間隔下積分，以得到最終濃度值。光散射係與分析物之分子量及濃度的乘積成正比。根據偵檢器信號計算各間隔之莫耳質量或分子量。跨峰之所有間隔計算加權平均(Mw)或數量平均(Mn)分子量，並報告為平均分子量。
儲存可導致結合物疫苗之蛋白質及/或碳水化合物受損。具有磷酸二酯主鏈鍵或多醣重複單元中之其他不穩定性之碳水化合物抗原在延長時間及溫度之儲存下可易於通過水解而解聚。此外，用於結合物疫苗中之載體蛋白或碳水化合物可在儲存及物理應力下易於聚集。
如圖11所示，PCV16及PCV21藥品在25℃及37℃下穩定4週，及在4℃下至多12週，不論多醣濃度。此外，在熱應力後之水平攪拌下，顯示PCV16及PCV21藥品係穩定的。在此等熱及物理應力下未觀察到因對容器側面之非特異性吸附的抗原量損失。另外，未觀察到藥品的聚集，該聚集在估計疫苗總劑量時可影響其在管柱上之性能(例如與管柱不可逆結合或不能進入/離開解析管柱)(圖12)。
使用HPSEC UV/MALS/RI以量測多醣-蛋白結合物之分子量。若藥品中之多醣-蛋白結合物降解或解聚，則分子量之降低將係明顯的，且若發生藥品之聚集，則將發生分子量之增加。此量測提供關於疫苗藥品或中間體之品質的另外表徵。如圖13所示，包含各在非質子性溶劑(例如DMSO)中使用還原胺化製備之原料藥的PCV16及PCV21藥品對於醣類之解聚或化學降解係穩定的且對於藥品調配中之蛋白質之聚集係穩定的。此指示使用在非質子性溶劑(諸如DMSO)中使用還原胺化製得之多醣蛋白結合物的PCV16及PCV21藥品在升高之溫度及物理應力下係穩定的。該等調配物在量及品質兩個方面均表現出優異穩定性。該調配物未因對容器側面或其他表面之非特異性吸附而損失總劑量，且該調配物無降解或聚集，如疫苗藥品之穩定分子量(重量平均分子量(Mw)及數量平均分子量(Mn))所示。
實例40
結合化學對肺炎球菌結合物疫苗之穩定性的影響
使用如上文實例中所述之不同化學方法製備的單一肺炎球菌多醣-蛋白結合物係用於調配呈64 μg/mL之15價及16價肺炎球菌結合物疫苗(稱為PCV15及PCV16)。PCV15疫苗藥品含有血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F，在質子性溶劑(全部為水性)中使用還原胺化進行結合並在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150 mM NaCl及0.2% (w/v) PS-20中進行調配(參見實例38)。PCV16藥品含有血清型6C、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、20A、23A、23B、24F、31、及35B，在非質子性溶劑(例如全部為DMSO)中使用還原胺化進行結合並在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150 mM NaCl及0.2% (w/v) PS-20中進行調配(參見實例38)。各多醣-蛋白結合物均係在4 μg/mL (w/v)肺炎球菌多醣(PnPs)下進行調配，PCV15中之6B除外，其係在8 μg/mL下進行調配，最終濃度為64 μg/mL PnPs含於各疫苗。
將經疫苗填充之容器置於4℃或37℃下至多1週。使用內源蛋白質螢光光譜法(IPFS)評估與肺炎球菌多醣結合之載體蛋白CRM197在PCV15或PCV16組合物中在4℃及37℃下儲存至多1週之穩定性。使用Jasco FP-6500螢光光譜儀在環境室溫下在1 cm路徑長度之石英透光管中收集未稀釋樣品之螢光發射光譜(Em 290-400 nm)。使用280 nm之激發波長，掃描速度為100 nm/分鐘，且激發及發射帶通為3 nm。
如圖14所示，與採用在結合過程(全部為水性結合)中之還原胺化期間使用質子性溶劑製得之原料藥的疫苗相比，含有在非質子性溶劑(例如全部為DMSO)中使用還原胺化製得之原料藥的藥品調配物導致優異之物理及化學穩定性。在37℃下至少16小時，以64 μg/mL PnPs在用於結合過程之質子性溶劑(全部為水性)中使用還原胺化製得之PCV15藥品的螢光強度降低，且疫苗之發射最大值從332 nm位移至338 nm。以64 μg/mL PnPs採用在非質子性溶劑(例如全部為DMSO)中使用還原胺化化學製得之原料藥的PCV16疫苗藥品未顯示螢光強度或最大發射波長338 nm之變化。應理解，從IPFS量測獲得之所得信號強度及發射最大值係歸因於多價複合藥品中單一原料藥之集體穩定性。吾人已顯示，採用在非質子性溶劑中製得之所有原料藥的疫苗藥品係穩定的，而採用在質子性溶劑中製得之所有原料藥的疫苗藥品係不穩定的。
不受任何特定理論之束縛，此穩定性可係歸因於在DMSO中之結合導致載體蛋白之展開及變性。與變性載體蛋白之結合將使構型在結合後鎖定在變性狀態。若如此，本研究亦表明，在本文所評估之應力研究中，最終構型係穩定的。因此，較佳使用具有主要用非質子性溶劑製得之結合物的疫苗，以提供一致且穩定之疫苗藥品。
若疫苗藥品組合物包含在結合過程中使用不同還原胺化溶劑(水性或DMSO)之原料藥、糖結合物或多醣蛋白結合物的混合物，則從藥品調配物測得之平均發射最大值或強度將由於在332 nm下之各水性多醣蛋白結合物發射及在338 nm下之各非水性多醣蛋白結合物發射的貢獻進行加權。在多價藥品調配物中不使用在非質子性溶劑中使用還原胺化製得之所有多醣蛋白結合物的此類混合物在升高溫度時，預期將在強度或發射最大值方面發生變化。因此，較佳使用具有主要用非質子性溶劑製得之結合物的疫苗，以提供一致且穩定之疫苗藥品。
實例41
所選血清型之編譯單價兔免疫原性研究
在第0天及第14天(交替側)使用0.25 ml或0.5 mL (僅15C)之各自單價結合物疫苗對成年紐西蘭白兔(NZWR，n=3隻/組)進行肌內(IM)免疫。在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150mM NaCl及0.2% (w/v)PS-20及實例38中所述之調配方法中調配之單價肺炎球菌疫苗係如下進行給藥：(1)每次免疫使用1 μg PnPs (6C、10A、15A、16F、17F、20A、23A、23B、24F、31或35B，各與CRM197結合)與62.5 μg磷酸鋁佐劑(APA)，或(2)每次免疫使用2 μg PnPs (15C- CRM197)與125 μg APA。在研究開始前(免疫前)及第14天(劑量1後，PD1)及第28天(劑量2後，PD2)收集血清。至少每天由訓練有素之動物護理人員觀察NZWR是否有任何疾病或痛苦之跡象。NZWR中之疫苗調配物被認為係安全的且係耐受性良好，因為未注意到疫苗相關之不良事件。所有動物實驗均嚴格按照國家衛生研究院(National Institutes of Health)之實驗動物護理及使用指南(Guide for Care and Use of Laboratory Animals)中之建議進行。NZWR實驗方案係由Merck & Co., Inc. (Kenilworth, NJ)及Covance (Denver, PA)之機構動物護理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committees)批准。
在ELISA檢定中測試NZWR血清以使用1至2 mg/mL之各自PnPs塗覆濃度評估IgG免疫原性。使用Opsotiter® 3軟體基於在阿拉巴馬大學(University of Alabama)伯明翰分校之細菌呼吸病原體參考實驗室線上可獲得之先前所述方案通過調理吞噬檢定(OPA)測定功能性抗體(UAB研究基金會，Caro-Aguilar等人，Immunogenicity differences of a 15-valent pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (PCV15) based on vaccine dose, route of immunization and mouse strain.Vaccine 35(6):865-72 (2017)；Burton等人Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies.Clin Vaccine Immunol 13(9):1004-9 (2006))。
發現所有單價肺炎球菌結合物疫苗在兔中均具有免疫原性(圖15)並產生殺死相應細菌菌株之功能性抗體(圖16)。
實例42
對血清型15A、15B、15C之交叉保護的評估
用15A- CRM197/APA、15B- CRM197/APA或15C- CRM197/APA使兔免疫以評估各血清型之間之交叉反應性。
在第0天及第14天(交替側)使用0.5 ml之各自單價結合物疫苗對成年紐西蘭白兔(NZWR，n=3隻/組)進行肌內(IM)免疫。在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150mM NaCl及0.2% (w/v)PS-20及實例38中所述之調配方法中調配之單價肺炎球菌結合物疫苗係每次免疫以2 μg PnPs (15A、15B或15C，各與CRM197結合)與125 μg APA進行給藥。在研究開始前(免疫前)及第14天(劑量1後，PD1)及第28天(劑量2後，PD2)收集血清。至少每天由訓練有素之動物護理人員觀察NZWR是否有任何疾病或痛苦之跡象。NZWR中之疫苗調配物被認為係安全的且係耐受性良好，因為未注意到疫苗相關之不良事件。所有動物實驗均嚴格按照國家衛生研究院之實驗動物護理及使用指南中之建議進行。NZWR實驗方案係由Merck & Co., Inc及Covance (Denver, PA)之機構動物護理及使用委員會批准。
在ELISA檢定中測試NZWR血清以使用1至2 mg/mL之各自PnPs塗覆濃度評估IgG免疫原性。使用Opsotiter® 3軟體基於在阿拉巴馬大學(University of Alabama)伯明翰分校之細菌呼吸病原體參考實驗室線上可獲得之先前所述方案通過OPA測定功能性抗體(UAB研究基金會(Caro-Aguilar等人，2017；Burton等人，2006))。
發現血清型15之所有三種單價肺炎球菌結合物疫苗在兔中均具有免疫原性(圖17)並產生殺死相應細菌菌株之功能性抗體(圖18)。另外，經血清群15單價肺炎球菌結合物疫苗免疫之兔分別具有與同源及異源多醣及細菌菌株相當之PD2 IgG及OPA滴度。經15A-CRM197/APA、15B-CRM197/APA或15C-CRM197/APA免疫之兔全部對各肺炎球菌多醣(15A、15B、15C)具有交叉反應性(圖17)。使用通過單向ANOVA及Tukey多重比較試驗(P值=0.354)所分析之劑量2後(PD2)對數轉化IgG數據，血清群15中之IgG滴度無顯著差異。此外，經15A-CRM197/APA、15B-CRM197/APA或15C-CRM197/APA免疫之兔全部對各肺炎鏈球菌細菌菌株(15A、15B、15C)具有交叉反應性，因為所有兔超免疫血清均具有針對所評估之各菌株的功能性抗體並殺死細菌(圖18)。類似地，使用通過單向ANOVA及Tukey多重比較試驗(P值=0.054)所分析之劑量2後(PD2)對數轉化OPA數據，血清群15中之OPA滴度無顯著差異。
實例43
PCV21在紐西蘭白兔中之免疫原性
在第0天及第14天(交替側)使用0.1至0.5 ml之肺炎球菌結合物疫苗對成年紐西蘭白兔(NZWR，n=5/組)進行肌內(IM)免疫。在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150 mM NaCl及0.2% (w/v) PS-20及實例38中所述之調配方法中調配的PCV21肺炎球菌疫苗係每次免疫以4、2、1、0.4、0.08或0.016 μg PnPs (3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、24F、31、33F或35B，各與CRM197結合)進行給藥。在研究開始前(免疫前)及第14天(劑量1後，PD1)及第28天(劑量2後，PD2)收集血清。至少每天由訓練有素之動物護理人員觀察NZWR是否有任何疾病或痛苦之跡象。NZWR中之疫苗調配物被認為係安全的且係耐受性良好，因為未注意到疫苗相關之不良事件。所有動物實驗均嚴格按照國家衛生研究院之實驗動物護理及使用指南中之建議進行。NZWR實驗方案係由Merck & Co., Inc及Covance (Denver, PA)之機構動物護理及使用委員會批准。
使用多重電化學發光(ECL)檢定評估NZWR血清之IgG免疫原性。基於Marchese等人所述之人類檢定(Optimization and validation of a multiplex, electrochemiluminescence-based detection assay for the quantitation of immunoglobulin G serotype-specific antipneumococcal antibodies in human serum.Clin Vaccine Immunol . 16(3): 387-96 (2009))，使用MesoScale Discovery (MesoScale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD之一個部門)所開發之技術(其利用在電化學刺激時發光之SULFO-TAG™標籤)，發展此檢定用於兔血清。使用經SULFO-TAG™標記之抗兔IgG作為測試NZWR血清樣品之二級抗體。使用Opsotiter® 3軟體基於在阿拉巴馬大學(University of Alabama)伯明翰分校之細菌呼吸病原體參考實驗室線上可獲得之先前所述方案通過多重調理吞噬檢定(MOPA)測定功能性抗體(UAB研究基金會，前述Caro-Aguilar等人，2017；前述Burton等人，2006)。
發現PCV21肺炎球菌結合物疫苗在兔中具有免疫原性(圖19A、19B、20A及20B)並產生在所有測試劑量下殺死疫苗型細菌菌株之功能性抗體(圖21A及21B)。
對於以4、2、1及0.4 μg PnPs給藥之PCV21，觀察到相當之PD1免疫原性，24F除外，其在2 μg劑量下具有與4或1 μg劑量相比更高之免疫原性，以及15A、15B及15C除外，其等在0.4 μg劑量下具有與2 μg劑量相比更高之免疫原性(圖19A及19B)。因此，在較高PnPs劑量(0.4至4 μg/PnPs)下，沒有太多疫苗劑量反應。在0.08及0.016 μg PnPs疫苗劑量下觀察到較低免疫原性，因為與2 μg疫苗劑量相比，許多血清型顯著更低。
對於以4、2、1及0.4 μg PnPs給藥之PCV21，觀察到相當之PD2免疫原性(圖20A及20B)。
一般而言，對於以4、2、1及0.4 μg PnPs給藥之PCV21，觀察到相當之PD2 MOPA滴度，其中MOPA滴度在0.08及0.016 μg PnPs疫苗劑量下趨於更低，儘管許多未達到統計學有效性(數據未顯示)。選擇以2 μg PnPs劑量給藥之PCV21作為MOPA之代表性數據集。具體而言，與免疫前兔血清相比，經2 μg劑量之PCV21免疫的兔對所有血清型(血清型3除外)具有顯著更高之PD1 MOPA滴度(圖21A)。應注意，來自此研究之兔免疫前血清對血清型16F、31及35B具有更高之背景滴度。與免疫前兔血清相比，經2 μg劑量之PCV21免疫的兔對所有血清型具有顯著更高之PD2 MOPA滴度(圖21B)。藉由單向ANOVA及Dunnett試驗分析對數轉化數據以確定有效性。
實例44
物質及方法
游離多醣試驗
藉由首先使用脫氧膽酸鹽(DOC)及鹽酸使游離蛋白質及結合物沉澱來量測結合物樣品中之游離多醣(未與CRM197結合之多醣)。隨後濾出沉澱物並藉由HPSEC/UV/MALS/RI分析濾液之游離多醣濃度。將游離多醣計算為藉由HPSEC/UV/MALS/RI所量測之總多醣百分比。
游離蛋白質試驗
藉由毛細管電泳以膠束電動層析(MEKC)模式分離結合物樣品中之游離多醣、多醣-CRM197結合物及游離CRM197。簡而言之，將樣品與含有25 mM硼酸鹽、100 mM SDS pH 9.3之MEKC運行緩衝液混合，並在預處理之裸熔融矽石毛細管中分離。在200 nm下監測分離，用CRM197標準曲線量化游離CRM197。將游離蛋白質結果報告為由HPSEC/UV/MALS/RI程序所測定之總蛋白質含量的百分比。
使用 HPSEC/UV/MALS/RI 檢定分析結合物 之 分子量及濃度
藉由高效尺寸排阻層析(HPSEC)注射及分離結合物樣品。用紫外線(UV)、多角度光散射(MALS)及折射率(RI)偵檢器串聯完成偵檢。使用消光係數從UV280計算蛋白質濃度。使用dn/dc因子從RI信號(由蛋白質及多醣兩者貢獻)解迴旋多醣濃度，dn/dc因子為溶液折射率之變化，其中溶質濃度之變化以mL/g報告。藉由Astra軟體(Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA)使用所量測之濃度及整個樣品峰之光散射資訊，計算樣品之平均分子量。對於多分散分子，存在多種形式之分子量平均值。例如，數量平均分子量Mn、重量平均分子量Mw及z平均分子量Mz (Molecules, 2015, 20, 10313-10341)。除非另有說明，否則分子量為重量平均分子量。
測定結合蛋白中之離胺酸消耗量，作為多醣與載體蛋白之間之共價連接數的量度
使用Waters AccQ-Tag胺基酸分析(AAA)來量測結合物樣品中之結合程度。在Eldex工作站中使用氣相酸水解水解樣品，以將載體蛋白分解成其組分胺基酸。使用6-胺基喹啉基-N-羥基琥珀醯亞胺基胺基甲酸酯(AQC)衍生該等游離胺基酸。隨後使用UPLC在C18管柱上進行UV偵檢分析所衍生之樣品。使用除離胺酸之外之代表性胺基酸來獲得平均蛋白質濃度。藉由結合物中離胺酸之平均量測量與起始蛋白中離胺酸之預期量之間的差異來確定結合期間之離胺酸消耗(即離胺酸損失)。
實例45
結合過程對肺炎球菌結合物疫苗之穩定性的影響
使用如上文實例中所述之不同還原胺化溶劑(水性或DMSO)製得的單一肺炎球菌多醣-蛋白結合物係用於調配呈84 μg/mL之1價、7價、14價及21價肺炎球菌結合物疫苗藥品(稱為PCV1、PCV7、PCV14及PCV21)。
將經藥品疫苗填充之容器置於4℃或37℃下至多7天。使用內源蛋白質螢光光譜法(IPFS)評估與肺炎球菌多醣結合之載體蛋白CRM197在PCV1、PCV7、PCV14或PCV21組合物中在4℃及37℃下儲存至多之穩定性。使用Jasco FP-6500螢光光譜儀在環境室溫下在1 cm路徑長度之石英透光管中收集未稀釋樣品之螢光發射光譜(Em 290-400 nm)。使用280 nm之激發波長，掃描速度為100 nm/分鐘，且激發及發射帶通為3 nm。
如圖22 A至C所示，與採用在結合過程(質子)中之還原胺化期間使用水性溶劑製得之所有多醣-蛋白結合物的疫苗相比，含有在非質子性溶劑(例如DMSO)中使用還原胺化製得之所有多醣-蛋白結合物的藥品調配物導致優異之物理及化學穩定性。在37℃下至少16小時，使用以84 μg/mL PnPs在水性溶劑中使用還原胺化製備之所有多醣-蛋白結合物製得之PCV1、PCV7及PCV14藥品的螢光強度降低，且疫苗之發射最大值從332 nm位移至338 nm。以84 μg/mL PnPs採用在非質子性溶劑(例如DMSO)中使用還原胺化化學製得之原料藥的PCV1、PCV7及PCV14疫苗藥品未顯示螢光強度或在338 nm下最大發射波長之變化。此外，亦研究PCV21藥品。其係如實例38中所述在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150 mM NaCl及0.1% (w/v) PS-20中進行調配，含有在非質子性溶劑(例如DMSO)中使用還原胺化製得之多醣-蛋白結合物。該研究顯示在37℃下儲存後之優異物理及化學穩定性。PCV21未顯示螢光強度或發射最大值338 nm之變化(圖22D)。
應理解，從IPFS (實例40)量測獲得之所得信號強度及發射最大值係歸因於多價複合藥品中之單一多醣-蛋白結合物之集體穩定性。吾人已顯示，採用在非質子性溶劑中製得之所有多醣-蛋白結合物的疫苗藥品係穩定的，而採用在質子性溶劑中製得之所有原料藥的疫苗藥品係在應力條件下不穩定。若疫苗藥品組合物包含使用質子及非質子結合過程兩者之多醣-蛋白結合物的混合物，則從藥品測得之平均發射最大值或強度將由於在332 nm下之各質子多醣-蛋白結合物發射及在338 nm下之各非質子多醣-蛋白結合物發射的貢獻進行加權。在此類混合物在升高溫度時因存在使用質子結合過程製得之多醣蛋白結合物，而預期將在強度或發射最大值方面發生加權變化。
如圖23所示，為評估以0.084 mg/mL PnPs製得之PCV21藥品的穩定性，使用奈米顆粒追蹤分析(NTA)。該技術在奈米顆粒群通過布朗運動移動時收集直接追蹤其等之視訊，以外推粒度及濃度。1級，635 nm雷射聚焦80 微米紅色雷射束通過液體樣品，照射顆粒作為快速漫射之光點。CCD相機記錄每秒30幀視訊，以追蹤各單一經照亮顆粒隨時間之移動。系統軟體從視訊中識別各單一顆粒之中心，並追蹤獨立穿過的距離以確定均方位移。對每幀中之樣本群內的每個顆粒同時執行此追蹤，直至分析完畢從整個視訊收集之原始數據。藉由同時量測每個追蹤之單一顆粒的均方位移，其擴散係數(Dt)及球面等效流體動力學半徑(rh)係藉由應用Stokes-Einstein方程來確定。隨後，軟體將此累積數據表示為粒度及濃度分佈。收集關於粒度及濃度之原始數據資訊，以及關於單一顆粒之強度或亮度之原始數據資訊。總之，將數據擬合並單一地繪製成相對於粒度之顆粒強度及相對於粒度之顆粒濃度，並隨後在三維等高線圖上比較所有顆粒群之粒度、濃度及強度。
包含載體蛋白及多醣抗原之結合物疫苗可在10至1000 nm粒度範圍內一起或分別易於聚集，從而使NTA成為評估及量化聚集現象之合適穩定性指示技術。將藥品曝露於4℃及37℃1週後，對於含有0.025% w/v、0.05% w/v、0.1% w/v、0.15% w/v及0.2% w/v PS20濃度之PS-20之調配物，藉由NTA未觀察到藥品之顯著聚集(如圖23所示)。然而，在4℃下對調配物攪拌6小時後，缺乏聚山梨醇酯20之調配物在減輕攪拌誘導之藥物聚集方面係無效的，如藉由NTA所提供之D90粒度增加、粒度分佈變寬及顆粒強度增加所證明。因此，較佳將聚山梨醇酯20保持在0.025至0.2%或更高水平(w/v)，以在常規製造、儲存、運輸及處理期間穩定藥品。
如實例39中所述，使用HPSEC UV/MALS/RI來量測21價(PCV21)多醣-蛋白結合物藥品之分子量，21價(PCV21)多醣-蛋白結合物藥品在20 mM L-組胺酸pH 5.8、150mM NaCl及 0至0.2% (w/v) PS-20及實例38中所述之調配方法中進行調配。將調配物置於4℃或37℃下至多一週。在一些情況下，在4℃或37℃下儲存1週後將注射器置於水平旋轉平台上並振盪至多6小時。進行此操作以模擬可能伴隨藥品生產及分銷之運輸及處理應力。若藥品中之多醣-蛋白結合物降解或解聚，則分子量之降低將係明顯的，且若發生藥品調配物之聚集，則將發生分子量之增加。此量測提供關於疫苗藥品或多醣-蛋白結合物之品質隨PS-20濃度變化的另外表徵。如圖24所示，包含各在非質子性溶劑(例如DMSO)中使用還原胺化製備之所有原料藥的PCV21藥品調配物對於醣類之解聚或化學降解係穩定的且對於藥品調配中在0.05%與0.15% PS-20之間因熱處理的蛋白質聚集係穩定的。總之，此指示當使用0.025%至0.2%或更高水平之PS-20調配時，PCV21藥品在升高之溫度及物理應力下係穩定的。
實例46
PCV21保護小鼠免受攻毒
在第0天、第14天及第28天，用0.1至0.5 mL 21價肺炎球菌結合物疫苗(PCV21)對年輕雌性瑞士韋伯斯特(Swiss Webster)小鼠(6至8週齡，n=10隻/組)進行腹膜內(IP)免疫。PCV21肺炎球菌疫苗係每次免疫以4、2、0.4、0.08或0.016 μg PnPs (3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、24F、31、33F及35B，各與CRM197結合)進行給藥。至少每天由訓練有素之動物護理人員觀察小鼠是否有任何疾病或痛苦之跡象。小鼠中之疫苗調配物被認為係安全的且係耐受性良好，因為未注意到疫苗相關之不良事件。在第52天，用肺炎鏈球菌血清型24F氣管內攻毒小鼠。將肺炎鏈球菌之指數期培養物離心，洗滌，並懸浮於無菌PBS中。在攻毒前用異氟烷麻醉小鼠。將105 cfu肺炎鏈球菌含於0.1 mL PBS置於小鼠的咽喉中，藉由其門牙直立懸掛。藉由向外輕輕拉動舌頭並覆蓋鼻孔來誘導細菌吸入。若體重減輕超過起始體重之20%，則每天稱重小鼠並實施安樂死。在24小時、48小時及72小時收集血液以評估菌血症。至少每天兩次由訓練有素之動物護理人員觀察小鼠是否有任何疾病或痛苦之跡象。所有動物實驗均嚴格按照國家衛生研究院之實驗動物護理及使用指南中之建議進行。小鼠實驗方案係由Merck & Co., Inc之機構動物護理及使用委員會批准。
使用多重電化學發光(ECL)檢定評估小鼠血清之IgG免疫原性。基於Marchese等人,Clin Vaccine Immunol. (2009) 16(3):387-96所述之人類檢定，使用MesoScale Discovery (MesoScale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD之一個部門)所開發之技術(其利用在電化學刺激時發光之SULFO-TAG™標籤)，發展此檢定用於小鼠血清。使用經SULFO-TAG™標記之抗小鼠IgG作為測試小鼠血清樣品之二級抗體。基於先前在www.vaccine.uab.edu所述之方案及阿拉巴馬大學(UAB)研究基金會擁有並獲得許可之Opsotiter® 3軟體通過多重調理吞噬檢定(MOPA)測定功能性抗體(參見，Caro-Aguilar I.等人，Vaccine (2017) 35(6):865-72及Burton R.L.及Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004-9)。
PCV21免疫在瑞士韋伯斯特小鼠中針對疫苗中之所有血清型產生抗體滴度(數據未顯示)。PCV21亦在Balb/c及CD1小鼠中具有免疫原性(數據未顯示)。亦保護經PCV21免疫之瑞士韋伯斯特小鼠免受肺炎鏈球菌血清型24F攻毒(圖25)。Mantel Cox對數秩檢驗指示，與未處理組相比，所有經PCV21免疫之組均顯著免受攻毒(P＜0.05)。同樣地，經PCV21免疫之小鼠組幾乎沒有菌血症，其與未處理組相比顯著更少(數據未顯示)。
實例47
兔中之PCV免疫原性及功能性抗體
在第0天及第14天(交替側)使用0.1 mL之PCV對成年紐西蘭白兔(NZWR，n=5隻/組)進行肌內(IM)免疫。PCV係每次免疫每種血清型以0.4 μg PnPs含呈磷酸鋁佐劑(APA)形式之25 μg [Al]進行給藥。在PCV31之情況下，血清型6B之給藥濃度係每次免疫加倍至0.8 μg PnPs。PCV21 (如實例38中所述)包含來自各與CRM197結合之血清型3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、24F、31、33F及35B的純化多醣。無佐劑或與呈磷酸鋁或APA形式之250 μg [Al]/mL一起調配製備各多醣-蛋白結合物，以評價佐劑(PCV21/APA)之作用。亦調配低價PCV (如實例38中所述)以包含8種新穎ST (PCV8：6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B，各與CRM197結合，無佐劑)，16種ST不包含於任何經許可之PCV(PCV16：6C、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、20、23A、23B、24F、31及35B，各與CRM197結合，無佐劑)或PCV31 (1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20A、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B，各與CRM197結合，與呈磷酸鋁的形式250μg[Al] / mL一起調配)中以評估隨疫苗效價增加之載體抑制(PCV31/APA)。各疫苗使用以4 μg/mL (w/v)肺炎球菌多醣(PnPs)調配之多醣蛋白結合物，6B除外，其係以8 μg/mL (w/v)肺炎球菌多醣(PnPs)調配於PCV31或PCV31/APA中。各疫苗中肺炎球菌多醣(PnPs)之最終濃度為128 μg/mL PnPs含於PCV31，84 μg/mL PnPs含於PCV21，64 μg/mL含於PCV16及32 μg/mL含於PCV8。
在研究開始前(免疫前)及第14天(PD1)及第28天(PD2)收集血清。至少每天由訓練有素之動物護理人員觀察NZWR是否有任何疾病或痛苦之跡象。NZWR中之疫苗調配物被認為係安全的且係耐受性良好，因為未注意到疫苗相關之不良事件。所有動物實驗均嚴格按照國家衛生研究院之實驗動物護理及使用指南中之建議進行。NZWR實驗方案係由Merck & Co., Inc及Covance (Denver, PA)之機構動物護理及使用委員會批准。
使用多重電化學發光(ECL)檢定評估兔血清之IgG免疫原性。基於Marchese等人,Clin Vaccine Immunol. (2009) 16(3):387-96所述之人類檢定，使用MesoScale Discovery (MesoScale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD之一個部門)所開發之技術(其利用在電化學刺激時發光之SULFO-TAG™標籤)，發展此檢定用於兔血清。使用經SULFO-TAG™標記之抗兔IgG作為測試NZWR血清樣品之二級抗體。基於先前在www.vaccine.uab.edu所述之方案及阿拉巴馬大學(UAB)研究基金會擁有並獲得許可之Opsotiter® 3軟體通過多重調理吞噬檢定(MOPA)測定功能性抗體(參見，Caro-Aguilar I.等人，Vaccine (2017) 35(6):865-72及Burton R.L.及Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004-9)。
測試兔血清作為免疫前及PD1之庫，並在多重電化學發光檢定中單獨測試PD2以確定抗體滴度。在用疫苗免疫後，PCV在兔中產生針對所有血清型之抗體滴度(數據未顯示)。血清型15B多醣不包含於PCV16、PCV21或PCV31中，然而在經PCV16、PCV21及PCV31免疫後觀察到血清型15B之抗體滴度。
當與含有APA之PCV21相比時，不含佐劑之PCV21具有相當或顯著更高之免疫原性(血清型3、7F、10A、19A、23A及23B)(圖26A至B及圖28)，表明疫苗中包含APA在兔中沒有另外免疫原性益處。
載體誘導之抗原決定性抑制係指干擾針對與相同載體蛋白(諸如CRM197)偶聯之抗原(諸如莢膜多醣)的抗體反應。干擾被認為係由於對有限數量之載體特異性引發輔助性T細胞的競爭而產生。因此，對莢膜多醣之反應可能會降低。Pfizer已觀察到，隨著疫苗效價從7價增加至13價，共有血清型之疫苗免疫原性降低[Comparison of IgG antibody GMC of Prevnar (7 valent) vs Prevnar13. (PCV13綜合報告，第29頁，表9)]。因此，吾人試圖研究低價PCV與PCV21相比之免疫原性(圖27A至C)。對於8種共有血清型，PCV8 (8種新穎血清型)具有與PCV21相當之免疫原性(圖29)。對於16種共有血清型中之15種，PCV16 (PCV21減去來自PCV15之5種重疊血清型)具有與PCV21相當之免疫原性(圖29)。血清型31在PCV16中具有更高免疫原性(圖29)。總體而言，NZWR中沒有PCV21之載體抑制的主要趨勢。對於21種共有血清型中之12種，PCV31/APA具有與PCV21/APA相當之免疫原性。10種血清型(6C、7F、9N、12F、15A、15B (PCV21中不含)、15C、17F、19A及23A)在PCV31中具有更高免疫原性，範圍在2.9倍與11倍之間(圖30)。總體而言，NZWR中沒有PCV31之載體抑制的主要趨勢。
發現PCV在兔中具有免疫原性並產生殺死疫苗型細菌菌株之功能性抗體。在多重調理吞噬檢定(MOPA)中測試兔血清以確定功能性抗體滴度。與PCV21/APA、PCV8及PCV16相比，PCV21具有相當或更高之PD2 OPA滴度(圖31)。藉由單向ANOVA及Dunnett試驗分析對數轉化數據以確定顯著性。與PCV8相比，PCV21對血清型16F具有顯著更高之OPA滴度，且與PCV21/APA相比，PCV21對血清型12F、23A及19A具有顯著更高之OPA滴度。與PCV21相比，PCV31對血清型23A具有顯著更高之OPA滴度。
實例48
成年恆河獼猴中之PCV21免疫原性
亦在成年恆河獼猴免疫原性模型中評估PCV21。在第0、28及56天，用PCV21對恆河獼猴進行肌內免疫。PCV21係每次免疫以0.25 mL體積之1 μg PnPs (3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、24F、31、33F及35B，各與CRM197結合)進行給藥。在研究開始前(免疫前，第0天)及第14 (PD1)、28、42 (PD2)、56、70 (PD3)及84天收集血清。
使用多重電化學發光(ECL)檢定評估恆河獼猴血清之IgG免疫原性。基於Marchese等人及Skinner等人(Marchese R.D.等人，Clin. Vaccine Immunol. (2009) 16(3):387-96 and Skinner, J.M. et al.,Vaccine (2011) 29(48):8870-8876)所述之人類檢定，使用MesoScale Discovery (MesoScale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD之一個部門)所開發之技術(其利用在電化學刺激時發光之SULFO-TAG™標籤)，發展此檢定用於恆河獼猴血清。使用經SULFO-TAG™標記之抗人類IgG作為測試小鼠血清樣品之二級抗體。基於先前在www.vaccine.uab.edu所述之方案及阿拉巴馬大學(UAB)研究基金會擁有並獲得許可之Opsotiter® 3軟體通過多重調理吞噬檢定(MOPA)測定功能性抗體(參見，Caro-Aguilar I.等人，Vaccine (2017) 35(6):865-72及Burton R.L.及Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004-9)。
發現PCV21在成年猴中具有免疫原性並產生在所有測試時間點殺死疫苗型細菌菌株之功能性抗體(圖32及33)。亦應注意，含有多醣結合物15A-CRM197及15C-CRM197之PCV21亦提供與15B之交叉反應性，如ECL中所證明。PCV21在猴中用一劑疫苗具有免疫原性(圖32)。大多數血清型在PD1達到其最大滴度，ST 6C、12F及24F除外，其等受益於另外免疫。與先前在嬰兒恆河獼猴中之PCV研究相比，成年恆河獼猴具有更高之預先存在抗體滴度。當測試MOPA中之血清樣品時，預先存在抗體滴度係最明顯，此使得確定調理吞噬滴度變得困難。所有研究時間點在MOPA中作為合併或單一樣品進行測試，但為了更容易觀察，僅顯示免疫前、PD1及PD3 (圖33)，因為PD1與PD3之間之OPA滴度沒有太大差異。
評估經PCV21免疫之成年恆河獼猴血清對其他肺炎鏈球菌細菌之交叉保護(圖34)。經PCV21免疫之恆河獼猴血清與血清型6A，6B及23F而非19F具有交叉保護。對6A及6B之交叉保護可能係由於用多醣結合物6C-CRM197作為多價PCV21之一部分進行免疫。類似地，用多醣結合物23A-CRM197及23B-CRM197作為多價PCV的一部分進行免疫導致對血清型23F之交叉保護。用PCV21 (包括多醣結合物19A-CRM197)免疫不提供對19F之交叉保護。
實例49
成年恆河獼猴中之PCV21免疫原性-佐劑及載體抑制之評估
另一項猴研究包括評估含有及不含APA之PCV21以及比較共有血清型免疫原性以評估載體抑制。在研究之第0天，用半人類劑量之疫苗對成年恆河獼猴(n=5隻/組)進行肌內免疫。PCV21係每次免疫以0.25 mL體積之1 μg PnPs (3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20、22F、23A、23B、24F、31、33F及35B，各與CRM197結合)進行給藥。一組包括PCV21，使用呈磷酸鋁形式之62.5 μg [Al]作為佐劑。另一組包括每次免疫以0.25 mL體積之1 μg PnPs (1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F，各與CRM197結合，其中6B以2 μg進行給藥)進行給藥並用呈磷酸鋁形式之62.5 μg [Al]作為佐劑的PCV15。另一組包括每次免疫以0.25 mL體積之1.1 μg PnPs (1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F，各與CRM197結合，其中6B以2.2 μg進行給藥)進行給藥的Prevnar13® (PCV13)。在研究開始前(免疫前，第0天)及第28天收集血清。
發現PCV21在成年猴中具有免疫原性並產生殺死疫苗型細菌菌株之功能性抗體。與含有APA之PCV21相比，不含佐劑之PCV21具有相當或顯著更高之免疫原性(血清型15A及15B)(圖35)。PCV21不包含血清型15B。
將經PCV21免疫之猴與經PCV15及Prevnar13免疫之猴進行比較。PCV21及PCV15具有5種共有血清型(3、7F、19A、22F、33F)；彼等5種血清型之免疫原性在經PCV21或PCV15免疫之猴之間沒有差異(圖36)。PCV21及Prevnar13具有3種共有血清型(3、7F、19A)；對於血清型7F及19A，免疫原性沒有差異。與PCV21相比，經Prevnar13免疫之猴對於血清型3具有更低之抗體滴度(圖36)。此發現與PCV15人類臨床數據一致，顯示血清型3在Merck之PCV15疫苗中具有更高免疫原性。總之，此等結果表明，與Prevnar13或PCV15相比，在經PCV21免疫之成年恆河獼猴中未觀察到載體抑制。
實例50
血清型6A、6B及6C交叉反應性-單價研究
單價藥品係使用肺炎球菌多醣6A-CRM197結合物或肺炎球菌多醣6B-CRM197結合物進行製備，並在20 mM組胺酸pH 5.8及150 mM氯化鈉及0.1% w/v聚山梨醇酯-20 (PS-20)中進行調配，兩種血清型之目標總多醣濃度為4.0 μg/mL。該等結合物係藉由將CRM197蛋白單獨結合至肺炎球菌多醣(PnPs)類型(-6A或-6B)來製備。基於批量體積及單一散裝多醣濃度之濃度計算獲得單一血清型之目標濃度所需的散裝結合物之所需體積。將單一結合物添加至組胺酸、氯化鈉及PS-20之溶液中以產生2X結合物摻合物。使用磁力攪拌棒將含有2X結合物摻合物之調配物容器混合，並無菌過濾至另一容器中。隨後用鹽水稀釋經無菌過濾之2X摻合物，以達到所需之目標總多醣及賦形劑濃度。隨後將調配物填充至小瓶中並在2至8℃下儲存。
用6A-CRM197或6B-CRM197對兔進行免疫以評估血清群6內之交叉反應性。在第0天及第14天(交替側)使用0.25 ml之各自單價結合物疫苗對成年紐西蘭白兔(NZWR，n=3隻/組)進行肌內(IM)免疫。使用實例38中所述之調配方法於20 mM L-組胺酸pH 5.8、150mM NaCl及0.1% (w/v) PS-20中調配之單價肺炎球菌結合物疫苗係以1 μg PnPs (6A或6B，各與CRM197結合)進行給藥。在研究開始前(免疫前)及第14天(劑量1後，PD1)及第28天(劑量2後，PD2)收集血清。至少每天由訓練有素之動物護理人員觀察NZWR是否有任何疾病或痛苦之跡象。NZWR中之疫苗調配物被認為係安全的且係耐受性良好，因為未注意到疫苗相關之不良事件。所有動物實驗均嚴格按照國家衛生研究院之實驗動物護理及使用指南中之建議進行。NZWR實驗方案係由Merck & Co., Inc及Covance (Denver, PA)之機構動物護理及使用委員會批准。
在ELISA檢定中測試NZWR血清以使用2 μg/mL之各自PnPs塗覆濃度評估IgG免疫原性。基於先前在www.vaccine.uab.edu所述之方案及UAB研究基金會擁有並獲得許可之Opsotiter® 3軟體通過調理吞噬檢定(OPA)測定功能性抗體(參見，Caro-Aguilar I.等人，Vaccine (2017) 35(6):865-72及Burton R.L.及Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004-9)。
發現6A-CRM197及6B-CRM197在兔中均具有免疫原性(圖37)並產生殺死相應細菌菌株之功能性抗體(圖38)。另外，經血清群6單價肺炎球菌結合物疫苗免疫之兔分別具有與同源及異源多醣及細菌菌株相當之PD2 IgG及OPA滴度。經6A-CRM197或6B-CRM197免疫之兔對各肺炎球菌多醣(PnPs 6A、PnPs 6B及PnPs 6C)均具有交叉反應性(圖37)。使用藉由單向ANOVA所分析之劑量2後(PD2)對數轉化IgG數據，血清群6中之IgG滴度無顯著差異。此外，經6A-CRM197或6B-CRM197免疫之兔對各肺炎鏈球菌細菌菌株(6A、6B、6C)均具有交叉反應性，因為所有兔超免疫血清均具有針對所評估之各菌株的功能性抗體並殺死細菌(圖38)。同樣地，使用藉由單向ANOVA所分析之劑量2後(PD2)對數轉化OPA數據，血清群6中之OPA滴度無顯著差異。
實例51
血清型20A及20B交叉反應性-單價研究
單價藥品係使用肺炎球菌多醣20A-CRM197結合物製備，並以4.0 μg/mL在20 mM組胺酸pH 5.8及150 mM氯化鈉及0.2% w/v聚山梨醇酯-20 (PS-20)中進行調配。與呈磷酸鋁形式作為佐劑之250.0 μg [Al]/mL一起製備調配物(20A-CRM197/APA)。藉由將CRM197蛋白單獨結合至肺炎球菌多醣(PnPs)類型20來製備結合物。基於批量體積及單一散裝多醣濃度之濃度計算獲得單一血清型之目標濃度所需的散裝結合物之所需體積。將單一結合物添加至組胺酸、氯化鈉及PS-20之溶液中以產生16.0 µg/mL之4X結合物摻合物。使用磁力攪拌棒將含有結合物摻合物之調配物容器混合，並無菌過濾至另一容器中。隨後將經無菌過濾之4X摻合物添加至含有磷酸鋁佐劑之另一容器中，以達到所需目標總多醣、賦形劑及佐劑濃度。隨後將調配物填充至玻璃小瓶中並在2至8℃下儲存。
用20A-CRM197/APA或PCV21對兔進行免疫以評估血清群20內之交叉反應性。在第0天及第14天(交替側)使用肺炎球菌結合物疫苗對成年紐西蘭白兔(NZWR，n=3隻/組)進行肌內(IM)免疫。如上所述進行調配之單價肺炎球菌結合物疫苗係以0.25 ml之1 μg PnPs進行給藥(ST20A與CRM197結合並使用呈磷酸鋁形式之62.5 μg [Al]作為佐劑)，使用實例38中所述之調配方法於20 mM L-組胺酸pH 5.8、150mM NaCl及0.2% (w/v) PS-20中調配的PCV21多價肺炎球菌結合物疫苗(84 μg/mL PnPs)係以0.1 ml之0.4 μg PnPs進行給藥(血清型3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20、22F、23A、23B、24F、31、33F及35B，各與CRM197結合)。在研究開始前(免疫前)及第14天(劑量1後，PD1)及第28天(劑量2後，PD2)收集血清。至少每天由訓練有素之動物護理人員觀察NZWR是否有任何疾病或痛苦之跡象。NZWR中之疫苗調配物被認為係安全的且係耐受性良好，因為未注意到疫苗相關之不良事件。所有動物實驗均嚴格按照國家衛生研究院之實驗動物護理及使用指南中之建議進行。NZWR實驗方案係由Merck & Co., Inc及Covance (Denver, PA)之機構動物護理及使用委員會批准。
基於先前在www.vaccine.uab.edu所述之方案及UAB研究基金會擁有並獲得許可之Opsotiter® 3軟體在調理吞噬檢定(OPA)中測試NZWR血清以評估功能性抗體(參見，Caro-Aguilar I.等人，Vaccine (2017) 35(6):865-72及Burton R.L.及Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004-9)。
經單價20A-CRM197/APA及多價PCV21疫苗免疫之兔產生功能性抗體，其殺死肺炎鏈球菌血清型20A及20B兩者(圖39)。此表明血清型20A及20B具有結構相似性，導致血清群內之交叉反應性。
圖1描繪在50℃下在氧化氘(D2 O)中來自肺炎鏈球菌血清型6C之莢膜多醣的600 MHz一維1 H NMR光譜。標記由內標物(DMSO及DSS-d 6 )及殘餘水(HOD)產生之信號。由*標記之次要信號係歸因於肺炎鏈球菌細胞壁殘餘物，諸如C-多醣及/或肽聚醣。
圖2描繪在50℃下在氧化氘(D2 O)中來自肺炎鏈球菌血清型15A之莢膜多醣的600 MHz一維1 H NMR光譜。標記由內標物(DMSO及DSS-d 6 )及殘餘水(HOD)產生之信號。由*標記之次要信號係歸因於肺炎鏈球菌細胞壁殘餘物，諸如C-多醣及/或肽聚醣。
圖3描繪在50℃下在氧化氘(D2 O)中來自肺炎鏈球菌血清型脫-O-乙醯化15B之莢膜多醣的600 MHz一維1 H NMR光譜。標記由內標物(DMSO及DSS-d 6 )及殘餘水(HOD)產生之信號。由*標記之次要信號係歸因於肺炎鏈球菌細胞壁殘餘物，諸如C-多醣及/或肽聚醣。
圖4描繪在50℃下在D2 O中來自肺炎鏈球菌血清型35B之莢膜多醣的600 MHz一維1 H NMR光譜。標記由內標物(DMSO及DSS-d 6 )及殘餘水(HOD)產生之信號。由*標記之次要信號係歸因於肺炎鏈球菌細胞壁殘餘物，諸如C-多醣及/或肽聚醣。
圖5描繪適用於肺炎鏈球菌血清型6C之血清型識別的1 H NMR同一性區域。標記來自各單醣殘基之重複單元的各變旋異構質子之信號位置。
圖6描繪適用於肺炎鏈球菌血清型15A之血清型識別的1 H NMR同一性區域。標記來自各單醣殘基之重複單元的各變旋異構質子之信號位置。
圖7描繪適用於肺炎鏈球菌血清型脫-O-乙醯化15B之血清型識別的1 H NMR同一性區域。標記來自各單醣殘基之各變旋異構質子的信號位置。
圖8描繪適用於肺炎鏈球菌血清型35B之血清型識別的1 H NMR同一性區域。標記來自各單醣殘基之重複單元的各變旋異構質子之信號位置。
圖9A至9C描繪來自肺炎鏈球菌血清型15B之天然莢膜多醣(圖9A)，來自肺炎鏈球菌血清型15B之脫-O-乙醯化莢膜多醣(圖9B)及來自肺炎鏈球菌血清型15C之莢膜多醣(圖9C)的600 MHz一維1 H NMR光譜。光譜係在50℃下在氧化氘(D2 O)中獲得。標記由內標物(DMSO及DSS-d6)及殘餘水(HOD)產生之信號。由*標記之信號係歸因於肺炎鏈球菌細胞壁殘餘物，諸如C-多醣及/或肽聚醣。
圖10A至10C顯示來自肺炎鏈球菌血清型15B之天然莢膜多醣(圖10A)，來自肺炎鏈球菌血清型15B之脫-O-乙醯化莢膜多醣(圖10B)及來自肺炎鏈球菌血清型15C之莢膜多醣(圖10C)之600 MHz一維1 H NMR光譜的變旋異構區域。圖10D至10F顯示光譜區域，其中O-乙醯基及N-乙醯基甲基信號係來自肺炎鏈球菌血清型15B之天然莢膜多醣(圖10D)，來自肺炎鏈球菌血清型15B之脫-O-乙醯化莢膜多醣(圖10E)及來自肺炎鏈球菌血清型15C之莢膜多醣(圖10F)。
圖11顯示時間及溫度(在4℃下至多12週-菱形，在25℃下至多4週-方形，在37℃下至多4週-三角形)對PCV16 (0.128 mg/mL)或PCV21 (0.084 mg/mL或0.169 mg/mL)藥品之多醣濃度的影響，使用HPSEC-UV/MALS/RI (參見實例39)。
圖12顯示水平旋轉攪拌及溫度(在4℃、25℃或37℃下1週)對分配於預先填充之注射器中的PCV16 (0.128 mg/mL)或PCV21 (0.084 mg/mL或0.169 mg/mL)藥品之多醣濃度的影響(參見實例39)。
圖13顯示隨時間及溫度(在4℃、25℃或37℃下至多4週)之PS濃度對PCV16 (0.128 mg/mL)或PCV21 (0.084 mg/mL或0.169 mg/mL)藥品之平均分子量(Mw及Mn)的影響，使用HPSEC-UV/MALS/RI。
圖14A及14B顯示時間及溫度(在4℃或37℃下至多1週)對藉由在A)質子性溶劑(PCV15使用所有水性結合進行調配)或B)非質子性溶劑(PCV16使用所有DMSO結合以0.064 mg/mL PnPs進行調配)中結合原料藥來製備之肺炎球菌結合物疫苗(PCV15或PCV16)之穩定性的影響，使用內源蛋白質螢光光譜法，激發波長為280 nm (實例40)。
圖15顯示經與CRM197結合並與磷酸鋁佐劑(APA)一起調配之肺炎鏈球菌單價血清型免疫之兔的ELISA IgG抗體稀釋滴度(劑量2後)。符號指示單個滴度且誤差條表示幾何平均滴度(GMT)之95%信賴區間(CI)。
圖16提供經與CRM197結合並與磷酸鋁佐劑(APA)一起調配之肺炎鏈球菌單價血清型免疫之兔的血清型特異性OPA稀釋滴度(劑量2後)。符號指示單個滴度且誤差條表示幾何平均滴度(GMT)之95%信賴區間(CI)。
圖17提供經肺炎鏈球菌血清型15單價結合物免疫之兔的ELISA IgG抗體稀釋滴度(劑量2後)。X軸指示用於使兔免疫之疫苗。虛線分隔使用單獨肺炎球菌多醣作為包衣抗原之三個單獨ELISA檢定。符號指示單個滴度且誤差條表示幾何平均滴度(GMT)之95%信賴區間(CI)。
圖18顯示經肺炎鏈球菌血清型15單價結合物免疫之兔的血清型特異性OPA稀釋滴度(免疫前，劑量1後 (PD1，合併)及劑量2後 (PD2))。X軸指示用於使兔免疫之疫苗。虛線分隔使用單獨肺炎鏈球菌細菌菌株之三個OPA檢定。符號指示單個滴度且誤差條表示幾何平均滴度(GMT)之95%信賴區間(CI)。
圖19A提供經4、2、1、0.4、0.08或0.016 μg/劑量之PCV21接種後NZWR (每組5隻)中PD1抗體反應之比較。符號指示PD1幾何平均滴度(GMT)比率(2 μg/劑量組對其他劑量組)，其中誤差條表示95%信賴區間(CI)。圖19B提供對應於圖19A之PCV21劑量比較PD1 GMT比率(95% CI)，95%信賴下界超過1.0之GMT比率為淺灰陰影及95%信賴上界小於1.0之GMT比率為深灰陰影。包括血清型15B數據以評估交叉保護。
圖20A提供經4、2、1、0.4、0.08或0.016 μg/劑量之PCV21接種後NZWR (每組5隻)中PD2抗體反應之比較。符號指示PD2 GMT比率(2 μg/劑量組對其他劑量組)，其中誤差條表示95% CI。圖20B提供對應於圖20A之PCV21劑量比較PD2 GMT比率(95%信賴區間)， 95%信賴下界超過1.0之GMT比率為淺灰陰影。包括血清型15B數據以評估交叉保護。
圖21A顯示經PCV21 (2 μg/PnPs)免疫之兔的血清型特異性PD1 OPA稀釋滴度。符號指示單個滴度且誤差條表示幾何平均滴度(GMT)之95%信賴區間(CI)。* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001，**** p＜0.0001。圖21B顯示經PCV21 (2μg/PnPs)免疫之兔的血清型特異性PD2 OPA稀釋滴度。符號指示單個滴度且誤差條表示幾何平均滴度(GMT)之95%信賴區間(CI)，**** p＜0.0001。包括血清型15B數據以評估交叉保護。
圖22A至C顯示時間及溫度(即在4℃下7天，在37℃下1天或在37℃下7天)對藉由在水性溶劑或DMSO溶劑中結合所有原料藥來製備之三種肺炎球菌結合物疫苗(PCV1、PCV7及PCV14)之穩定性的影響，使用內源蛋白質螢光光譜法，激發波長為280 nm。圖22D顯示時間及溫度(即在4℃或37℃下7天)對藉由在DMSO溶劑中結合所有原料藥來製備之21價肺炎球菌結合物疫苗(PCV21，0.084 mg/mL PnPs)之穩定性的影響，使用內源蛋白質螢光光譜法，激發波長為280 nm。
圖23顯示溫度(在4℃或37℃下7天)及4℃下之攪拌對與PS-20 (0%、0.025%、0.05%、0.1%、0.15%或0.2%；全部為w/v PS-20)以0.084 mg/mL PnPs一起調配之六(6)種PCV21肺炎球菌結合物疫苗藥品之粒度分佈(如藉由奈米顆粒追蹤分析(NTA)所分析)的影響。
圖24顯示溫度(4℃及37℃)及攪拌對三種PCV21藥品之平均分子量的影響，如藉由HPSEC/UV/MALS/RI檢定所分析。三種PCV21肺炎球菌結合物疫苗藥品係以0.084 mg/mL PnPs與不同濃度之PS-20 (0.05%、0.1%及0.15% w/v)一起調配。
圖25顯示PCV21免疫小鼠免受肺炎鏈球菌24F氣管內攻毒。
圖26A至B顯示經無佐劑或與APA一起調配之PCV21免疫之兔的前(合併)、PD1 (合併)及PD2 IgG抗體稀釋滴度，如藉由ECL所測定。誤差條表示幾何平均滴度(GMT)之95%信賴區間(CI)。包括血清型15B數據以評估交叉保護。
圖27A至C顯示經無佐劑PCV8、無佐劑PCV16、及含APA之PCV31免疫之兔的前(合併)、PD1 (合併)及PD2 IgG抗體稀釋滴度，如藉由ECL所測定。誤差條表示幾何平均滴度(GMT)之95%信賴區間(CI)。包括血清型15B數據以評估交叉保護。
圖28顯示經PCV21 (含或不含APA)接種後NZWR (每組5隻)中PD2 ECL抗體反應之比較。符號指示PD2 GMT比率，其中誤差條表示95% CI。包括血清型15B數據以評估交叉保護。
圖29顯示經PCV21、PCV8或PCV16接種後常見血清型及交叉保護血清型15B之NZWR (每組5隻)中PD2 ECL抗體反應的比較。符號指示PD2 ECL GMT比率，其中誤差條表示95% CI。
圖30顯示經PCV21/APA或PCV31/APA接種後常見血清型及交叉保護血清型15B之NZWR (每組5隻)中PD2 ECL抗體反應的比較。符號指示PD2 ECL GMT比率，其中誤差條表示95% CI。
圖31A至D顯示經PCV免疫之兔的血清型特異性前(合併)(A，B)及PD2 (C，D) OPA稀釋滴度。誤差條表示GMT之95% CI。將PCV21用作統計學比較之基準，* p＜0.05。圖A及C顯示所有評估PCV中之8種常見血清型(6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B)及PCV16、PCV21及PCV31中之其他8種常見血清型(8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20B)的數據。圖B及D顯示圖A及C中未包括之其他16種血清型的數據。其中五種亦係PCV21及PCV31中之常見血清型(3、7F、19A、22F、33F)，十種血清型僅包含於PCV31中(1、4、5、6A、6B、9V、14、18C、19F、23F)。包括血清型15B數據以評估交叉保護。
圖32顯示經PCV21免疫之成年恆河獼猴(n=8)之前、PD1、PD2及PD3 IgG抗體稀釋滴度，如藉由ECL所測定。誤差條表示GMT之95% CI。包括血清型15B數據以評估交叉保護。
圖33顯示經PCV21免疫之成年恆河獼猴(n=8)之免疫前、PD1 (合併)及PD3 OPA稀釋滴度。誤差條表示GMT之95% CI。包括血清型15B數據以評估交叉保護。
圖34顯用於經PCV21免疫之成年恆河獼猴的PCV21疫苗中未包含之四種血清型的前及PD3 (第70天) OPA滴度。
圖35顯示經PCV21 (含或不含APA)接種後成年恆河獼猴(每組5隻)中PD1 ECL抗體反應之比較。符號指示PD1 ECL GMT比率(PCV21對PCV21/APA)，其中誤差條表示95% CI。包括血清型15B數據以評估交叉保護。
圖36顯示與PCV15或Prevnar13相比，經PCV21接種後成年恆河獼猴(每組2至5隻)對血清型3、7F、19A、22F及33F之PD1 IgG抗體反應。符號指示PD1 ECL GMT比率，其中誤差條表示95% CI。
圖37A至B顯示經6A-CRM197 (A)或6B-CRM197 (B)單價藥品免疫之兔之針對6A、6B及6C ((免疫前及PD1，合併)及PD2)的ELISA IgG抗體稀釋滴度。條形指示幾何平均滴度(GMT)，且誤差條表示GMT之95%信賴區間(CI)。
圖38A至B顯示經6A-CRM197 (A)或6B-CRM197 (B)單價藥品免疫之兔之針對6A、6B及6C ((免疫前及PD1，合併)及PD2)的血清型特異性OPA稀釋滴度。條形指示幾何平均滴度(GMT)，且誤差條表示GMT之95%信賴區間(CI)。
圖39A至B顯示經20A-CRM197/APA (A)或PCV21 (B)免疫之兔之針對20A及20B (免疫前(合併)，PD1及PD2)的血清型特異性OPA稀釋度。條形指示幾何平均滴度(GMT)，且誤差條表示GMT之95%信賴區間(CI)。

Claims (93)

  1. 一種多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物各包含肺炎鏈球菌血清型的多醣與載體蛋白結合，其中該等多醣蛋白結合物中之該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由下列組成之群的一組血清型： a) 15A、16F、23A、23B、24F、31及35B； b) 15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20；及 c) 3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20。
  2. 如請求項1之多價免疫原性組合物，其中在a)、b)或c)中所列之該等肺炎鏈球菌血清型組進一步包含： (i) 血清型6C， (ii) 血清型6A，或 (iii) 血清型6A及6B。
  3. 如請求項1之多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由下列組成之群的一組血清型： a) 6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20； b) 6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20；及 c) 6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20 其中組a)至c)中之血清型20可視情況替換成血清型20A或血清型20B。
  4. 如請求項1之多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由下列組成之群的一組血清型： a) 3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； b) 3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A；及 c) 3、7F、19A、22F、33F、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A。
  5. 如請求項1之多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A組成之群的血清型。
  6. 如請求項1之多價免疫原性組合物，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A組成之群的血清型。
  7. 如請求項1至6中任一項之多價免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物不包含任何其他肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物。
  8. 如請求項1至7中任一項之多價免疫原性組合物，其中該等多醣蛋白結合物中之至少一者係藉由包括非質子性溶劑之結合反應形成。
  9. 如請求項1至8中任一項之多價免疫原性組合物，其中該等多醣蛋白結合物各藉由包括非質子性溶劑之結合反應形成。
  10. 如請求項1至9之多價免疫原性組合物，其中該組合物中之總多醣濃度為約0.02至約0.175 mg/mL
  11. 如請求項1至10中任一項之多價免疫原性組合物，其中該組合物中之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之重量平均分子量(Mw)為約1,000至約6,000 kDa。
  12. 如請求項1至11中任一項之多價免疫原性組合物，其中該組合物中之肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物之數量平均分子量(Mn)為約500至約4,000 kDa。
  13. 如請求項1至12中任一項之多價免疫原性組合物，其中該組合物係在37℃穩定多達4週。
  14. 如請求項1至12中任一項之多價免疫原性組合物，其中該組合物係在4℃穩定多達12週。
  15. 如請求項13或14之多價免疫原性組合物，其中穩定性係使用HPSEC UV/MALS/RI測定。
  16. 如請求項1至15中任一項之多價免疫原性組合物，其中使用內源蛋白質螢光光譜法以280奈米(nm)激發波長量測之該組合物的發射最大值為約335 nm至約342 nm。
  17. 如請求項16之多價免疫原性組合物，其中該發射最大值保持在約335 nm至約342 nm，且該螢光強度係在37℃穩定至少1週。
  18. 如請求項8至17中任一項之多價免疫原性組合物，其中該非質子性溶劑為二甲基亞碸(DMSO)。
  19. 如請求項8或9之多價免疫原性組合物，其中該結合反應為還原胺化。
  20. 如請求項1至19中任一項之多價免疫原性組合物，其中該載體蛋白係選自由外膜蛋白複合物(OMPC)、破傷風類毒素、白喉類毒素、蛋白D及CRM197組成之群。
  21. 如請求項1至20中任一項之多價免疫原性組合物，其中該載體蛋白為CRM197。
  22. 如請求項1至21中任一項之多價免疫原性組合物，其中該組合物進一步包含佐劑。
  23. 如請求項1至21中任一項之多價免疫原性組合物，其中該組合物不包含佐劑。
  24. 如請求項1至23中任一項之多價免疫原性組合物，其進一步包含10至80 mM組胺酸pH 5.8及150 mM NaCl。
  25. 如請求項24之多價免疫原性組合物，其進一步包含0.025%至0.8% w/v聚山梨醇酯20。
  26. 一種多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物各包含肺炎鏈球菌血清型的多醣與CRM197結合，其中該等多醣蛋白結合物中之該等肺炎鏈球菌血清型由選自由下列組成之群的一組血清型組成： a) 15A、16F、23A、23B、24F、31及35B； b) 6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B； c) 6A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B； d) 6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B； e) 15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； f) 6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； g) 6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； h) 6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； i) 3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； j) 3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； k) 3、7F、19A、22F、33F、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A；及 l) 3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； 其中組e)至1)中之血清型20A可視情況替換成血清型20或血清型20B；其中該等多醣蛋白結合物各藉由包括非質子性溶劑之結合反應形成，且其中該組合物不包含佐劑。
  27. 如請求項26之多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物各包含肺炎鏈球菌血清型的多醣與CRM197結合，其中該等多醣蛋白結合物中之該等肺炎鏈球菌血清型由選自3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A之血清型組成；其中血清型20A可視情況替換成血清型20或血清型20B；其中該等多醣蛋白結合物各藉由包括非質子性溶劑之結合反應形成，且其中該組合物不包含佐劑。
  28. 如請求項26之多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物各包含肺炎鏈球菌血清型的多醣與CRM197結合，其中該等多醣蛋白結合物中之該等肺炎鏈球菌血清型由選自3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A之血清型組成；其中血清型20A可視情況替換成血清型20或血清型20B；其中該等多醣蛋白結合物各藉由包括非質子性溶劑之結合反應形成，且其中該組合物不包含佐劑。
  29. 一種如請求項1至28中任一項之多價免疫原性組合物的用途，其用於製備用於人類患者中誘導保護性免疫反應之藥劑。
  30. 如請求項29之用途，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由下列組成之群的一組血清型： a) 3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； b) 3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； c) 3、7F、19A、22F、33F、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A；及 d) 3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； 其中組a)至d)中之血清型20A可視情況替換成血清型20或血清型20B。
  31. 如請求項29之用途，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括選自由下列組成之群的一組血清型： a) 15A、16F、23A、23B、24F、31及35B； b) 6A、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B； c) 6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B； d) 6C、15A、16F、23A、23B、24F、31及35B； e) 15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； f) 6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； g) 6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A；及 h) 6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； 其中組e)至h)中之血清型20A可視情況替換成血清型20或血清型20B。
  32. 如請求項30之用途，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括選自3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A之血清型。
  33. 如請求項30之用途，其中該等肺炎鏈球菌血清型包括選自3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A之血清型。
  34. 如請求項29至33中任一項之用途，其中該患者係先前經多價肺炎球菌疫苗治療。
  35. 如請求項34之用途，其中該多價肺炎球菌疫苗係指示用於預防選自由下列組成之群之血清型引起的肺炎球菌疾病： a) 4、6B、9V、14、18C、19F及23F； b) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F及19A； c) 1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F； d) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F、及33F； e) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20； f) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F、33F、8、10A、11A、12F及15B；及 g) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、6C、7F、19A、22F、33F、8、10A、11A、12F及15B。
  36. 如請求項34或35之用途，其中該多價肺炎球菌疫苗包含多種多醣蛋白結合物，其中該等多醣蛋白結合物包含肺炎鏈球菌血清型的多醣與載體蛋白結合。
  37. 如請求項31至36中任一項之用途，其中該藥劑係用於與一或多種另外劑量之多價免疫原性組合物投與至患者。
  38. 如請求項37之用途，其中劑量之間之時間量為約4週至約1年。
  39. 如請求項37或請求項38之用途，其中該藥劑係用於與兩種另外劑量投與至患者且該患者係免疫力低下(immunocompromised)。
  40. 如請求項31至33中任一項之用途，其中該藥劑係用於與多價肺炎球菌疫苗組合以任何順序投與至患者，其中該多價免疫原性組合物及該多價肺炎球菌疫苗不相同。
  41. 如請求項40之用途，其中該多價肺炎球菌疫苗係指示用於預防選自由下列組成之群之肺炎鏈球菌血清型引起的肺炎球菌疾病： a) 4、6B、9V、14、18C、19F及23F； b) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F及19A； c) 1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F； d) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F、及33F； e) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、及20； f) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F、33F、8、10A、11A、12F及15B；及 g) 4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、6C、7F、19A、22F、33F、8、10A、11A、12F及15B。
  42. 如請求項41之用途，其中該多價肺炎球菌疫苗係包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物各包含肺炎鏈球菌血清型的多醣與載體蛋白結合。
  43. 如請求項40至42中任一項之用途，其中該藥劑係用於與該多價肺炎球菌疫苗同時投與。
  44. 如請求項40至42中任一項之用途，其中投與該藥劑與該多價肺炎球菌疫苗之間之時間量為約4週至約1年。
  45. 如請求項40至42或44中任一項之用途，其中該藥劑係用於該多價肺炎球菌疫苗前投與。
  46. 如請求項40至42或44中任一項之用途，其中該藥劑係用於該多價肺炎球菌疫苗後投與。
  47. 如請求項31至46中任一項之用途，其中該患者為50歲或更大。
  48. 如請求項31至46中任一項之用途，其中該患者係在2歲與18歲之間。
  49. 如請求項31至46中任一項之用途，其中該患者為18歲或更大。
  50. 如請求項31至46中任一項之用途，其中該患者為65歲或更大。
  51. 如請求項31至50中任一項之用途，其中該患者係免疫力低下。
  52. 如請求項31至51中任一項之用途，其中該藥劑係用於藉由皮下或肌內注射投與。
  53. 如請求項31至52中任一項之用途，其中該藥劑係用於與抗流感疫苗伴隨投與。
  54. 一種製備血清型8肺炎鏈球菌多醣-蛋白結合物之方法，其利用在非質子性溶劑中之結合反應，其中該結合反應不使用氰基硼氫化物。
  55. 如請求項54之方法，其中該結合反應為希夫(Schiff)鹼還原或還原胺化。
  56. 如請求項54及55之方法，其中該蛋白質為破傷風類毒素、白喉類毒素或CRM197。
  57. 如請求項56之方法，其中該蛋白質為CRM197。
  58. 如請求項54至57中任一項之方法，其中該結合反應為還原胺化。
  59. 如請求項54至58中任一項之方法，其中該還原胺化係在二甲基亞碸(DMSO)中進行。
  60. 一種如請求項1至28中任一項之多價免疫原性組合物的用途，其用於製備用於人類患者中誘導保護性免疫反應之藥劑，其中各血清型之多醣劑量為約0.4至約4 μg。
  61. 一種多價免疫原性組合物，其包含肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物各包含肺炎鏈球菌血清型的多醣與載體蛋白結合，且其中該等多醣蛋白結合物包括選自由下列組成之群之肺炎鏈球菌血清型的多醣： I) 3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20； II) 3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A； III)3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20B； IV)3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20； V) 3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A；及 VI)3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20B。
  62. 如請求項61之多價免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物不包含具有任何其他肺炎鏈球菌血清型之多醣的多醣蛋白結合物。
  63. 如請求項61或62中任一項之多價免疫原性組合物，其中該等多醣蛋白結合物中之至少一者係藉由包括非質子性溶劑之結合反應形成。
  64. 如請求項61至63中任一項之多價免疫原性組合物，其中該等多醣蛋白結合物各藉由包括非質子性溶劑之結合反應形成。
  65. 如請求項63至64中任一項之多價免疫原性組合物，其中該非質子性溶劑為二甲基亞碸(DMSO)。
  66. 如請求項61至65中任一項之多價免疫原性組合物，其中該載體蛋白係選自由外膜蛋白複合物(OMPC)、破傷風類毒素、白喉類毒素、蛋白D及CRM197組成之群。
  67. 如請求項61至66中任一項之多價免疫原性組合物，其中該載體蛋白為CRM197。
  68. 如請求項61至67中任一項之多價免疫原性組合物，其中該組合物進一步包含佐劑。
  69. 如請求項61至67中任一項之多價免疫原性組合物，其中該組合物不包含佐劑。
  70. 一種如請求項61至69中任一項之多價免疫原性組合物的用途，其用於製備用於人類患者中誘導保護性免疫反應之藥劑。
  71. 如請求項70之用途，其中該患者係先前經多價肺炎球菌疫苗治療。
  72. 如請求項70至71中任一項之用途，其中該藥劑係用於與一或多種另外劑量之多價免疫原性組合物投與至患者。
  73. 如請求項70至72中任一項之用途，其中劑量之間之時間量為約4週至約1年。
  74. 如請求項70至73中任一項之用途，其中該藥劑係用於與兩種另外劑量投與至患者且該患者係免疫力低下。
  75. 如請求項70至74中任一項之用途，其中該藥劑係用於與多價肺炎球菌疫苗組合以任何順序投與至患者，其中該多價免疫原性組合物及該多價肺炎球菌疫苗係不相同。
  76. 如請求項75之用途，其中該多價肺炎球菌疫苗係包含多種肺炎鏈球菌多醣蛋白結合物，其中該等結合物各包含肺炎鏈球菌血清型的多醣與載體蛋白結合。
  77. 如請求項75至76中任一項之用途，其中該藥劑係用於與該多價肺炎球菌疫苗同時投與。
  78. 如請求項75至77中任一項之用途，其中投與該藥劑與該多價肺炎球菌疫苗之間之時間量為約4週至約1年。
  79. 如請求項75至78中任一項之用途，其中該藥劑係用於該多價肺炎球菌疫苗前投與。
  80. 如請求項75至78中任一項之用途，其中該藥劑係用於該多價肺炎球菌疫苗後投與。
  81. 如請求項70至80中任一項之用途，其中該患者為50歲或更大。
  82. 如請求項70至81中任一項之用途，其中該患者係在2歲與18歲之間。
  83. 如請求項70至82中任一項之用途，其中該患者為18歲或更大。
  84. 如請求項70至83中任一項之用途，其中該患者為65歲或更大。
  85. 如請求項70至84中任一項之用途，其中該患者係免疫力低下。
  86. 如請求項70至85中任一項之用途，其中該藥劑係用於藉由皮下或肌內注射投與。
  87. 如請求項70至86中任一項之用途，其中該藥劑係用於與抗流感疫苗伴隨投與。
  88. 一種如請求項62之多價免疫原性組合物的用途，其用於製備用於預防18歲及以上成人之肺炎球菌肺炎及侵襲性疾病的藥劑。
  89. 一種如請求項62之多價免疫原性組合物的用途，其用於製備用於預防24種肺炎鏈球菌菌株(3、6A、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、19A、20A、20B、22F、23A、23B、24F、31、33F、及35B)引起之肺炎球菌肺炎及侵襲性疾病的藥劑。
  90. 一種多價免疫原性組合物，其包含21種不同多醣蛋白結合物，其中該等結合物各包含肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣與載體蛋白結合，其中該多醣係製備自肺炎鏈球菌血清型3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、及20A，且其中該載體蛋白為CRM197。
  91. 如請求項90之多價免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物不包含任何其他肺炎鏈球菌血清型製得之多醣蛋白結合物。
  92. 如請求項90之多價免疫原性組合物，其中該等多醣蛋白結合物各藉由包括非質子性溶劑之結合反應形成，其中該非質子性溶劑為二甲基亞碸(DMSO)。
  93. 如請求項90之多價免疫原性組合物，其中該組合物不包含佐劑。
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