CN111683678B - 包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含一种以上肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的多价免疫原性组合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型是如本文所定义的。在一些实施方式中，至少一种所述多糖蛋白缀合物通过包含非质子溶剂的缀合反应形成。在进一步的实施方式中，每种所述多糖蛋白缀合物通过包含非质子溶剂的缀合反应形成。还提供了用于在人类患者中诱导保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述患者施用本发明的所述多价免疫原性组合物。所述多价免疫原性组合物可用于提供针对肺炎链球菌感染和由肺炎链球菌引起的疾病的保护。本发明的组合物也可用作治疗方案的一部分，所述治疗方案已为接种了用于预防肺炎球菌疾病的多价疫苗的患者提供了补充保护。

Description

包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
不适用。
技术领域
本发明提供了具有不同多糖-蛋白质缀合物的多价免疫原性组合物。缀合物各自由从不同血清型的肺炎链球菌制备的荚膜多糖与载体蛋白(优选CRM197)缀合组成。该免疫原性组合物提供了针对肺炎球菌疾病的广泛覆盖。
背景技术
肺炎链球菌是革兰氏阳性细菌，是婴幼儿侵袭性细菌疾病(如肺炎\菌血症\脑膜炎和中耳炎)的最常见病因。肺炎球菌被赋予血清型特异性的化学连接的多糖包裹。有超过90种已知的肺炎球菌血清型，并且包膜是肺炎球菌的主要毒力决定因素，因为包膜不仅保护细菌内表面免受补体识别，而且其本身的免疫原性也较差。多糖是不依赖于T细胞的抗原，在大多数情况下，其不能被加工或呈递到MHC分子上与T细胞相互作用。但是，其能够通过另一种机制刺激免疫系统，该机制涉及B细胞表面受体的交联。
事实证明，已获许可多年的多价肺炎球菌多糖疫苗在预防成年人，尤其是老年人和高危人群的肺炎球菌疾病方面具有不可估量的价值。然而，婴幼儿对未缀合的肺炎球菌多糖反应较差。肺炎球菌缀合物疫苗沛儿于2000年2月首次在美国获得许可，其含有当时在婴幼儿中引起侵袭性肺炎球菌疾病的7种最常见的分离的血清型(4，6B，9V，14，18C，19F和23F)。在美国普遍使用后，由于中存在的血清型，儿童的侵袭性肺炎球菌疾病已显著减少。参见Centers for Disease Control and Prevention,MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005,54(36):893-7。但是，在世界某些地区，的血清型覆盖受限，并且在美国存在某些新兴血清型的证据(例如，19A等)。参见O'Brien等，2004,Am J Epidemiol 159:634-44；Whitney等，2003,N Engl J Med 348:1737-46；Kyaw等，2006,N Engl J Med 354:1455-63；Hicks等，2007,J Infect Dis 196:1346-54；Traore等，2009,Clin Infect Dis 48:S181-S189。
美国专利申请公开号US 2006/0228380描述了一种13价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物疫苗，其包含血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。中国专利申请公开号CN 101590224A描述了一种14价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物疫苗，其包含血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F。
其他PCV已覆盖PCV-15中包含的血清型7、10、11或13(美国专利公开号2011/0195086)，但是已经观察到一些血清型的免疫干扰(例如，GSK的PCV-11对血清型3的保护作用降低)以及辉瑞的PCV-13(13)对血清型6B的应答率降低。参见Prymula等，2006,Lancet 367:740-48和Kieninger等，Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent PneumococcalConjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers，在48th Annual ICAAC/ISDA 46th Annual Meeting上发表，Washington DC，10月25-28日，2008。
当前的多价肺炎球菌疫苗已经有效地减少了与疫苗中存在的那些血清型有关的肺炎球菌疾病的发病率。然而，表达疫苗中不存在的血清型的肺炎球菌的流行率正在增加。因此，需要另外的肺炎球菌疫苗组合物，其提供针对不同肺炎球菌血清型的组的保护并且可以提供针对目前可用的疫苗中不存在的肺炎球菌血清型的补充保护。
发明内容
本发明提供了包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的多价免疫原性组合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型是如本文所定义的。
在本发明的特定实施方式中，所述肺炎链球菌的血清型包括选自下组的一组血清型：
a)15A、16F、23A、23B、24F、31和35B；
b)15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20；和
c)3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20。
在本发明进一步的特定实施方式中，所述肺炎链球菌的血清型包括选自下组的一组血清型：
a)15A、16F、23A、23B、24F、31和35B；
b)15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A；和
c)3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A。
在本发明进一步的特定实施方式中，所述肺炎链球菌的血清型包括选自下组的一组血清型：
a)15A、16F、23A、23B、24F、31和35B；
b)15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20B；和
c)3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20B。
在一些实施方式中，在a)、b)或c)中列出的肺炎链球菌的一组血清型还包括：血清型6C、血清型6A或者血清型6A和6B。
在一些实施方式中，至少一种多糖蛋白缀合物通过包含非质子溶剂(例如，二甲基亚砜(DMSO))的缀合反应形成。在特定的实施方式中，每种多糖蛋白缀合物通过包含非质子溶剂的缀合反应形成。如本文中所示，与在水性条件下制备的相同缀合物相比，在多糖-蛋白缀合物的还原胺化过程中使用DMSO作为溶剂导致出人意料的优异稳定性和针对那些血清型增强的免疫原性。
还提供了用于在人类患者中诱导保护性免疫应答的方法，包括向患者施用本发明的多价免疫原性组合物。在本发明方法的一些实施方式中，患者此前已给予多价肺炎球菌疫苗。
本发明的多价免疫原性组合物可以作为不同的互补肺炎球菌疫苗的治疗方案的一部分。因此，本发明提供了一种在人类患者中诱导保护性免疫应答的方法，包括向患者施用本发明的多价免疫原性组合物，还包括以任何顺序向患者施用多价肺炎球菌疫苗。在特定实施方式中，多价肺炎球菌疫苗包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖。在其他实施方式中，多价肺炎球菌疫苗包含未缀合的荚膜多糖。
还提供了利用在非质子溶剂中的缀合反应制备血清型8肺炎链球菌多糖-蛋白缀合物的方法，其中所述缀合反应不使用氰基硼氢化物。
本发明还提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中选择的肺炎链球菌血清型提供了与其他选择的血清型的交叉反应性。
附图说明
图1描述了在50℃下在氧化氘(D2O)中肺炎链球菌血清型6C的荚膜多糖的600MHz一维1H NMR谱。标记由内标物(DMSO和DSS-d6)和残留水(HOD)引起的信号。用*标记的次要信号是由肺炎链球菌的细胞壁残留物(如C-多糖和/或肽聚糖)导致的。
图2描述了在50℃下在氧化氘(D2O)中肺炎链球菌血清型15A的荚膜多糖的600MHz一维1H NMR谱。标记由内标物(DMSO和DSS-d6)和残留水(HOD)引起的信号。用*标记的次要信号是由肺炎链球菌的细胞壁残留物(如C-多糖和/或肽聚糖)导致的。
图3描述了在50℃下在氧化氘(D2O)中肺炎链球菌血清型去-O-乙酰化15B的荚膜多糖的600MHz一维1H NMR谱。标记由内标物(DMSO和DSS-d6)和残留水(HOD)引起的信号。用*标记的次要信号是由肺炎链球菌的细胞壁残留物(如C-多糖和/或肽聚糖)导致的。
图4描述了在50℃下在氧化氘(D2O)中肺炎链球菌血清型35B的荚膜多糖的600MHz一维1H NMR谱。标记由内标物(DMSO和DSS-d6)和残留水(HOD)引起的信号。用*标记的次要信号是由肺炎链球菌的细胞壁残留物(如C-多糖和/或肽聚糖)导致的。
图5描述了用于对肺炎链球菌血清型6C进行血清型鉴定的1H NMR鉴定区域。标记来自每个单糖残基的重复单元的每个异头质子的信号位置。
图6描述了用于对肺炎链球菌血清型15A进行血清型鉴定的1H NMR鉴定区域。标记来自每个单糖残基的重复单元的每个异头质子的信号位置。
图7描述了用于对肺炎链球菌血清型去-O-乙酰化15B进行血清型鉴定的1H NMR鉴定区域。标记来自每个单糖残基的每个异头质子的信号位置。
图8描述了用于对肺炎链球菌血清型35B进行血清型鉴定的1H NMR鉴定区域。标记来自每个单糖残基的重复单元的每个异头质子的信号位置。
图9A-9C描述了来自肺炎链球菌血清型15B的天然荚膜多糖(图9A)、来自肺炎链球菌血清型15B的去-O-乙酰化荚膜多糖(图9B)和来自肺炎链球菌血清型15C的荚膜多糖(图9C)的600MHz一维1H NMR谱。在50℃下在氧化氘(D2O)中采集谱图。标记由内标物(DMSO和DSS-d6)和残留水(HOD)引起的信号。用*标记的信号是由肺炎链球菌的细胞壁残留物(如C-多糖和/或肽聚糖)导致的。
图10A-10C显示了来自肺炎链球菌血清型15B的天然荚膜多糖(图10A)、来自肺炎链球菌血清型15B的去-O-乙酰化荚膜多糖(图10B)和来自肺炎链球菌血清型15C的荚膜多糖(图10C)的600MHz一维1H NMR谱的异头区域。图10D-10F显示了来自肺炎链球菌血清型15B的天然荚膜多糖(图10D)、来自肺炎链球菌血清型15B的去-O-乙酰化荚膜多糖(图10E)和来自肺炎链球菌血清型15C的荚膜多糖(图10F)的O-乙酰化和N-乙酰化甲基信号的光谱区域。
图11显示了使用HPSEC-UV/MALS/RI测量的时间和温度(在4℃下长达12周-菱形，在25℃下长达4周-方块，在37℃下长达4周-三角)对PCV16(0.128mg/mL)或PCV21(0.084mg/mL或0.169mg/mL)制剂多糖浓度的影响(见实施例39)。
图12显示了水平旋转搅拌和温度(在4℃、25℃或37℃下1周)对在预充式注射器中分布的PCV16(0.128mg/mL)或PCV21(0.084mg/mL或0.169mg/mL)制剂多糖浓度的影响(见实施例39)。
图13显示了使用HPSEC-UV/MALS/RI测量的随着时间的推移和温度变化(在4℃、25℃或37℃下长达4周)PS的浓度对PCV16(0.128mg/mL)或PCV21(0.084mg/mL或0.169mg/mL)制剂平均分子量(Mw和Mn)的影响。
图14A和14B显示了使用本征蛋白荧光光谱(intrinsic protein fluorescencespectroscopy)在280nm的激发波长下测量的时间和温度(在4℃或37℃下长达1周)对肺炎球菌缀合物疫苗(PCV15或PCV16)稳定性的影响，所述疫苗使用在A)质子溶剂(PCV15均使用水性缀合配制)或B)非质子溶剂(PCV16均使用DMSO缀合以0.064mg/mL PnPs配制)中缀合的原料药制备(实施例40)。
图15显示了使用与CRM197缀合以及使用磷酸铝佐剂(APA)配制的肺炎链球菌单价血清型免疫的兔子的ELISA IgG抗体稀释效价(第2次给药后)。符号表示单个效价和误差线(error bar)表示几何平均效价(GMT)的95％置信区间(CI)。
图16显示了使用与CRM197缀合以及使用磷酸铝佐剂(APA)配制的肺炎链球菌单价血清型免疫的兔子的血清型特异性OPA稀释效价(第2次给药后)。符号表示单个效价和误差线表示几何平均效价(GMT)的95％置信区间(CI)。
图17提供了使用肺炎链球菌血清型15单价缀合物免疫的兔子的ELISA IgG抗体稀释效价(第2次给药后)。X轴表示免疫兔子使用的疫苗。使用虚线分隔了使用单独的肺炎球菌多糖作为包被抗原的三个独立的ELISA测定。符号表示单个效价和误差线表示几何平均效价(GMT)的95％置信区间(CI)。
图18显示了使用肺炎链球菌血清型15单价缀合物免疫的兔子的血清型特异性OPA稀释效价(免疫前、第1次给药后(PD1，混合的)和第2次给药后(PD2))。X轴表示免疫兔子使用的疫苗。使用虚线分隔了使用单独的肺炎链球菌细菌菌株的三个OPA测定。符号表示单个效价和误差线表示几何平均效价(GMT)的95％置信区间(CI)。
图19A提供了使用4、2、1、0.4、0.08或0.016μg/剂PCV21接种后在NZWR中(每组5只)的PD1抗体应答比较。符号表示PD1的几何平均效价(GMT)之比(2μg/剂的组与其他剂量组比较)和误差线表示95％置信区间(CI)。图19B提供了PCV21剂量比较PD1GMT之比(95％CI)，对应于图19A中GMT之比95％置信区间下限超过1.0的用浅灰色阴影表示和GMT之比95％置信区间上限小于1.0的用深灰色阴影表示。包括血清型15B的数据以评价交叉保护作用。
图20A提供了使用4、2、1、0.4、0.08或0.016μg/剂PCV21接种后在NZWR中(每组5只)的PD2抗体应答比较。符号表示PD2的GMT之比(2μg/剂的组与其他剂量组比较)和误差线表示95％CI。图20B提供了PCV21剂量比较PD2 GMT之比(95％置信区间)，对应于图20A中GMT之比95％置信区间下限超过1.0的用浅灰色阴影表示。包括血清型15B的数据以评价交叉保护作用。
图21A显示了使用PCV21(2μg/PnPs)免疫兔子的血清型特异性PD1 OPA稀释效价。符号表示单个效价和误差线表示几何平均效价(GMT)的95％置信区间(CI)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。图21B显示了使用PCV21(2μg/PnPs)免疫兔子的血清型特异性PD2 OPA稀释效价。符号表示单个效价和误差线表示几何平均效价(GMT)的95％置信区间(CI)，****p<0.0001。包括血清型15B的数据以评价交叉保护作用。
图22A-C显示了使用本征蛋白荧光光谱在280nm的激发波长下测量的时间和温度(即，在4℃下7天，在37℃下1天或在37℃下7天)对三种肺炎球菌缀合物疫苗(PCV1、PCV7或PCV14)稳定性的影响，所述疫苗使用在水性溶剂或DMSO溶剂中缀合的所有原料药制备。图22D显示了使用本征蛋白荧光光谱在280nm的激发波长下测量的时间和温度(即，在4℃或37℃下7天)对21价肺炎球菌缀合物疫苗(以0.084mg/mL PnPs的PCV21)稳定性的影响，所述疫苗使用在DMSO溶剂中缀合的所有原料药制备。
图23显示了通过纳米颗粒追踪分析(NTA)分析的温度(在4℃或37℃下7天)和在4℃下搅拌对六(6)种PCV21肺炎球菌缀合物疫苗制剂粒径分布的影响，所述制剂以0.084mg/mL PnPs使用PS-20(0％、0.025％、0.05％、0.1％、0.15％或0.2％；均为w/v PS-20)配制。
图24显示了如通过HPSEC/UV/MALS/RI测定所分析的温度(4℃和37℃)和搅拌对3种PCV21制剂平均分子量的影响。3种PCV21肺炎球菌缀合物疫苗制剂以0.084mg/mL PnPs使用不同浓度PS-20(0.05％、0.1％和0.15％w/v)配制。
图25显示了PCV21免疫小鼠被保护免受肺炎链球菌24F气管内攻击。
图26A-B显示了如通过ECL所确定的使用无佐剂或与APA配制的PCV21免疫的兔子的免疫前(混合)、PD1(混合)和PD2 IgG抗体稀释效价。误差线表示几何平均效价(GMT)的95％置信区间(CI)。包括血清型15B的数据以评价交叉保护作用。
图27A-C显示了如通过ECL所确定的使用无佐剂PCV8、无佐剂PCV16和PCV31与APA免疫的兔子的免疫前(混合)、PD1(混合)和PD2 IgG抗体稀释效价。误差线表示几何平均效价(GMT)的95％置信区间(CI)。包括血清型15B的数据以评价交叉保护作用。
图28显示了使用具有或不具有APA的PCV21接种后在NZWR中(每组5只)PD2 ECL抗体应答的比较。符号表示PD2 GMT之比，误差线表示95％CI。包括血清型15B的数据以评价交叉保护作用。
图29显示了使用PCV21、PCV8或PCV16接种后针对常规血清型和交叉保护的血清型15B在NZWR中(每组5只)PD2 ECL抗体应答的比较。符号表示PD2 ECL GMT之比，误差线表示95％CI。
图30显示了使用PCV21/APA或PCV31/APA接种后针对常规血清型和交叉保护的血清型15B在NZWR中(每组5只)PD2 ECL抗体应答的比较。符号表示PD2 ECL GMT之比，误差线表示95％CI。
图31A-D显示了使用PCV免疫的兔子的血清型特异性免疫前(混合)(A，B)和PD2(C，D)OPA稀释效价。误差线表示GMT的95％CI。将PCV21作为统计学比较的基准，*p<0.05。图A和图C中显示了在所有评价的PCV中8种常见血清型(6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B)和在PCV16、PCV21和PCV31中另外8种常见血清型(8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20B)的数据。图B和D显示了未包括在图A和图C中的另外16种血清型的数据。其中的五种也是PCV21和PCV31中常见的血清型(3、7F，19A，22F，33F)，十种血清型仅包含在PCV31中(1、4、5、6A、6B、9V、14、18C、19F、23F)。包括血清型15B的数据以评价交叉保护作用。
图32显示了针对使用PCV21免疫的成年恒河猴(n＝8)如通过ECL所确定的免疫前、PD1、PD2和PD3 IgG抗体稀释效价。误差线代表GMT的95％CI。包括血清型15B的数据以评价交叉保护作用。
图33显示了PCV21免疫的成年恒河猴(n＝8)免疫前、PD1(混合)和PD3 OPA稀释效价。误差线代表GMT的95％CI。包括血清型15B的数据以评价交叉保护作用。
图34显示了对于使用PCV21免疫的成年恒河猴，对PCV21疫苗中不包含的4种血清型的免疫前和PD3(第70天)OPA效价。
图35显示了使用具有或不具有APA的PCV21接种后在成年恒河猴中(每组5只)的PD1 ECL抗体应答的比较。符号表示PD1 ECL GMT之比(PCV21相比于PCV21/APA)，误差线代表95％CI。包括血清型15B的数据以评价交叉保护作用。
图36显示了与PCV15或沛儿13相比，使用PCV21接种后在成年恒河猴中(每组2-5只)血清型3、7F、19A、22F和33F的PD1 IgG抗体应答。符号表示PD1 ECL GMT之比，误差线代表95％CI。
图37显示了对于使用6A-CRM197(A)或6B-CRM197(B)单价制剂免疫的兔子，针对6A、6B和6C((免疫前和PD1，混合的)和PD2)的ELISA IgG抗体稀释效价。柱状图表示几何平均效价(GMT)和误差线表示GMT的95％置信区间(CI)。
图38显示了对于使用6A-CRM197(A)或6B-CRM197(B)单价制剂免疫的兔子，针对6A、6B和6C((免疫前和PD1，混合的)和PD2)的血清型特异性OPA稀释效价。柱状图表示几何平均效价(GMT)和误差线表示GMT的95％置信区间(CI)。
图39显示了对于使用20A-CRM197/APA(A)或PCV21(B)免疫兔子，针对20A和20B(免疫前(混合的)、PD1和PD2)的血清型特异性OPA稀释效价。柱状图表示几何平均效价(GMT)和误差线表示GMT的95％置信区间(CI)。
具体实施方式
本发明提供了包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的多价免疫原性组合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型是如本文所定义的。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包括选自下组的一组肺炎球菌血清型：(a)15A、16F、23A、23B、24F、31和35B；(b)15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20；和(c)3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物包括选自下组的一组肺炎球菌血清型：(a)15A、16F、23A、23B、24F、31和35B；(b)15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20B；和(c)3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20B。在其他实施方式中，所述免疫原性组合物包括选自下组的一组肺炎球菌血清型：(a)15A、16F、23A、23B、24F、31和35B；(b)15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A；和(c)3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A。在进一步的实施方式中，免疫原性组合物包含(i)血清型6A；(ii)血清型6A和6B；或(iii)血清型6C。在一个特定的实施方式中，本发明包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包括3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、24F、31、33F和35B。在检测的所有剂量下，发现所述组合物在兔子中具有免疫原性并且产生杀伤疫苗型细菌菌株的功能性抗体(实施例43)。在另一个特定的实施方式中，本发明包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包括3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20、6A、15A、15C、16F、23A、23B、24F、31和35B。在另一个特定的实施方式中，本发明包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包括3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20B、6A、15A、15C、16F、23A、23B、24F、31和35B。在另一个特定的实施方式中，本发明包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包括3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、15C、16F、23A、23B、24F、31和35B。
本发明的多价免疫原性组合物可用于针对疫苗型的肺炎链球菌血清型对患者进行免疫，并且作为一种或多种不同的互补肺炎球菌疫苗治疗方案的一部分。因此，本发明提供了一种在人类患者中诱导保护性免疫应答的方法，包括向患者施用本发明的多价免疫原性组合物，还包括以任何顺序向患者施用多价肺炎球菌疫苗。在其他实施方式中，向此前已使用不同多价肺炎球菌疫苗免疫的患者施用本发明的多价免疫原性组合物。
在本发明的实施方式中，来自至少一种肺炎球菌血清型的缀合物是在非质子溶剂(如DMSO)中使用还原胺化制备的。在进一步的实施方式中，多价免疫原性组合物包含肺炎球菌缀合物，其分别使用在非质子溶剂中的还原胺化来制备。本文显示，包含分别在非质子溶剂中使用还原胺化制备的原料药的PCV1、PCV7、PCV14、PCV16和PCV21(定义如下)制剂针对碳水化合物解聚或化学降解是稳定的和针对药物产品制剂中的蛋白聚集是稳定的(见实施例40和实施例45)。DMSO溶剂的使用通过直接消耗载体蛋白表面上的赖氨酸残基来增强多糖与蛋白质的共价结合。增加的共价结合对增加包含在DMSO中缀合的多糖抗原的多价免疫原性组合物的多糖蛋白缀合物的稳定性具有直接获益。
I.定义和缩写
如在说明书通篇和所附权利要求中所使用的，应用下述缩写：
APA 磷酸铝佐剂
APC 抗原呈递细胞
CI 置信区间
DMSO 二甲基亚砜
DS 多糖-蛋白原料药
GMC 几何平均浓度
GMT 几何平均效价
HPSEC 高效体积排阻色谱
IM 肌内或肌肉内
LOS 脂寡糖
LPS 脂多糖
MALS 多角度光散射
MBC 单价缀合物原料
MOPA 多重调理吞噬作用测定法
MW 分子量
NMWCO 标称分子量截断值
NZWR 新西兰白兔
OPA 调理吞噬作用测定法
PCV 肺炎球菌缀合物疫苗
PD1 第1次给药后
PD2 第2次给药后
PnPs 肺炎球菌多糖
Ps 多糖
PS-20 聚山梨醇酯-20
RI 折射率
UV 紫外线
w/v 重量/体积
为了更容易理解本发明，下面具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文的其他地方特别定义，否则本文中使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。
如在说明书通篇和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数引用。
除非上下文清楚地指出了所指示的可能性之一，否则对“或”的引用表示一种或两种可能性。在一些情况下，将“和/或”用于强调一种或两种可能性。
术语“水性溶剂”或“水性条件”当与缀合(如还原胺化)一起使用时，是指使用水作为缀合反应的溶剂。除了不存在有机溶剂之外，水可以含有缓冲剂和其他组分。
术语“非质子溶剂”、“DMSO溶剂”或“DMSO条件”当与缀合(如还原胺化)一起使用时，指使用非质子溶剂或非质子溶剂的组合(或DMSO，如适用)作为缀合反应的溶剂。非质子溶剂可以存在一些水，例如至多1％、2％、5％、10％或20％。
术语“包含”当与本发明的免疫原性组合物一起使用时，是指包含任何其他组分，如佐剂和赋形剂，或添加一种或多种未具体列举的多糖-蛋白缀合物。当与多价多糖-蛋白缀合物混合物一起使用时，术语“由...组成”是指具有那些特定的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物而不是来自不同血清型的其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的混合物。“基本上由……组成(consists essentially of)”和诸如“基本上由……组成(consist essentiallyof)”和“基本上由……组成(consisting essentially of)”的变体表示包括任何所列举的要素或要素的组，以及任选地包括与所列举的要素具有相似或不同性质的其他要素，其不会实质上改变指定剂量方案、方法或组合物的基本或新颖性质。
本发明组合物的“有效量”指激发抗体的剂量，该剂量显著降低了在随后攻击期间微生物(例如，肺炎链球菌)感染的可能性或严重性。
如在本文中所使用的，短语“用于预防肺炎球菌疾病”指疫苗或免疫原性组合物经一个或多个监管机构(如美国食品和药物管理局)批准，用于预防由任何肺炎链球菌血清型引起的一种或多种疾病，其包括但不限于：一般的肺炎球菌病、肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌性脑膜炎、肺炎球菌性菌血症、由肺炎链球菌引起的浸润性疾病和由肺炎链球菌引起的中耳炎。
“多价肺炎球菌疫苗”是包含多于一种活性剂(例如，肺炎球菌荚膜多糖或肺炎球菌多糖蛋白缀合物)的药物制剂，该活性剂对由多于一种肺炎链球菌的血清型引起的疾病或病理状况提供活性免疫。
术语“多糖”意在包括通常用于免疫和细菌疫苗领域的任何抗原性糖要素(或抗原单元)，包括但不限于“糖类”、“寡糖”、“多糖”、“脂糖”、“脂寡糖(LOS)”、“脂多糖(LPS)”、“糖基化物”、“糖缀合物”等。
如在本文中所使用的，“PCV1”指1价肺炎球菌缀合物疫苗，其包含1种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型是3(如在实施例38和45中所示例的)。在特定的实施方式中，载体蛋白是CRM197。
如在本文中所使用的，“PCV7”指7价肺炎球菌缀合物疫苗，其包含7种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，每种缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型是：3、8、9N、11A、19A、15A和10A。在特定的实施方式中，一种或多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的载体蛋白是CRM197。在进一步的实施方式中，每种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的载体蛋白是CRM197。
如在本文中所使用的，“PCV8”指8价肺炎球菌缀合物疫苗，其包含8种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，每种缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型是：6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B。在特定的实施方式中，一种或多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的载体蛋白是CRM197。在进一步的实施方式中，每种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的载体蛋白是CRM197。
如在本文中所使用的，“PCV14”指14价肺炎球菌缀合物疫苗，其包含14种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，每种缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型是：3、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、16F、17F、19A、20、22F和33F。在特定的实施方式中，一种或多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的载体蛋白是CRM197。在进一步的实施方式中，每种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的载体蛋白是CRM197。
如在本文中所使用的，“PCV15”指15价肺炎球菌缀合物疫苗，其包含15种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，每种缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型是：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。在特定的实施方式中，一种或多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的载体蛋白是CRM197。在进一步的实施方式中，每种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的载体蛋白是CRM197。
如在本文中所使用的，“PCV16”指16价肺炎球菌缀合物疫苗，其包含16种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，每种缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型是：6C、8、9N、10A、11A、12F、15A、16F、17F、20A、23A、23B、24F、31和35B，以及下述血清组15的至少一种血清型：15B、15C或去-O-乙酰化-15B。在特定实施方式中，血清组15的血清型是血清型15C或去-O-乙酰化15B。如本文所示(见下文实施例3)，去O-乙酰化的血清型15B肺炎球菌多糖等同于血清型15C的肺炎球菌多糖，并具有相同的NMR光谱。在特定的实施方式中，一种或多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的载体蛋白是CRM197。在进一步的实施方式中，每种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的载体蛋白是CRM197。
如在本文中所使用的，“PCV21”指21价肺炎球菌缀合物疫苗，其包含21种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，每种缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型是：3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、24F、31、33F和35B，以及下述血清组15的至少一种血清型：15B、15C或去-O-乙酰化-15B。在特定实施方式中，血清组15的血清型是血清型15C或去-O-乙酰化15B。在特定的实施方式中，一种或多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的载体蛋白是CRM197。在进一步的实施方式中，每种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的载体蛋白是CRM197。
通过遗传分析于2012年在血清组20中鉴定出肺炎链球菌血清型20A和20B(Calix,J.J.等，J.Biol.Chem.(2012)287(33):27885-27894)。如Calix J.J.等人所讨论的那样，常规的血清分型方法和可商购的抗体以前不能区分这两种血清型，而且目前关于血清型20A和20B血清分型工作的信息有限。此外，对于由血清群20引起的已确定疾病中20A或20B的疾病患病率还没有很好的了解。这样，本领域的普通技术人员可以选择在肺炎链球菌疫苗组合物中包括这两种血清型(20A和/或20B)之一或这两者。含有一种血清型20多糖抗原的肺炎链球菌疫苗也有可能对另一种产生交叉保护(例如，包含肺炎链球菌血清型20A而不是血清型20B的多糖蛋白缀合物的疫苗可能对肺炎链球菌血清型20B产生交叉保护)。因而，如在本文中所使用的，“血清型20”可以指包含血清型20A和/或血清型20B的多糖蛋白缀合物的组合物。
“含CpG的核苷酸”、“含CpG的寡核苷酸”、“CpG寡核苷酸”和类似术语是指长度为6-50个核苷酸的核苷酸分子，其包含未甲基化的CpG部分。参见例如，Wang等，2003,Vaccine21:4297。含CpG的寡核苷酸包括使用任何合成的核苷间键、修饰的碱基和/或修饰的糖的修饰的寡核苷酸。
如本文所定义的，“佐剂”是用于增强本发明的免疫原性组合物的免疫原性的物质。免疫佐剂可以增强对单独施用时具有弱免疫原性的抗原的免疫应答，例如，诱导无或弱抗体滴度或细胞介导的免疫应答、增加对抗原的抗体效价、和/或降低在个体中有效实现免疫应答的抗原的剂量。因此，通常给予佐剂以增强免疫应答，并且其是本领域技术人员所熟知的。
“患者”(在本文中可替代地称为“受试者”)是指能够被肺炎链球菌感染的哺乳动物。在优选的实施方式中，患者是人。可以对患者进行预防或治疗。预防性治疗可提供足够的保护性免疫力，以降低肺炎球菌感染或其影响(例如，肺炎球菌性肺炎)的可能性或严重性。可以进行治疗性治疗以降低肺炎链球菌感染或其临床影响的严重程度或防止其复发。如本文所述，可以使用本发明的多价免疫原性组合物进行预防性治疗。本发明的组合物可以施用给普通人群或肺炎球菌感染风险增加的那些人，例如老年人，或者与老年人同住或照顾老年人的人。
“需要治疗”的人包括以前接触过肺炎链球菌或感染过肺炎链球菌的人，以前接种过肺炎链球菌的人，以及容易感染的人或需要降低感染可能性的任何人，例如免疫功能低下的人、老年人、儿童、成人或健康个体。
“稳定的”多价免疫原性组合物是在冷藏温度(例如，2-8℃或4℃)下观察至少至少1个月、2个月、3个月、6个月、12个月和/或24个月没有明显变化的组合物。另外，“稳定的”组合物包括在包括25℃和37℃的温度下包括1个月、3个月、6个月、12个月和/或24个月的一段时间表现出所需特征的组合物。典型的稳定性合格标准如下所示：下述一个或多个指标的变异性不超过约5％、约10％、约15％或约20％：(a)组合物中肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的数均分子量(Mn)，(b)组合物中肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的重均分子量(Mw)，(c)组合物中的总多糖浓度，(d)使用本征蛋白荧光光谱法在特定激发波长(例如，280纳米)下测量的组合物的发射最大值，和(e)使用本征蛋白荧光光谱法在特定激发波长下测量的组合物的荧光强度。术语“稳定的”也可以用于指多价免疫原性组合物中的特定肺炎球菌缀合物。在这样的用途中，该术语是指在特定温度下随时间表现出所需性质的缀合物，且这些性质随所示时间和温度的变化不超过约5％、约10％、约15％或约20％。
II.多价免疫原性组合物
本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖。下文描述了本发明的多价免疫原性组合物的不同方面和实施方式。
在一个实施方式(实施方式E1)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，每种包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包含下述、由下述组成或基本上由下述组成：
(1)15A，
(2)16F，
(3)选自下述的一种或多种血清组23的血清型：(a)23A和23B、(b)23A和23F、(c)23B和23F、(d)23A、(e)23B和(f)23F，
(4)24F，
(5)31，和
(6)35B。
在实施方式E1的一个子实施方式中，一种或多种血清组23的血清型是23A和23B(即，不存在其他血清组23的血清型)。在实施方式E1的一个进一步的子实施方式中，一种或多种血清组23的血清型是23A和23F。在实施方式E1的另一个子实施方式中，一种或多种血清组23的血清型是23B和23F。在实施方式E1的又一个子实施方式中，23A是唯一的血清组23的血清型。在实施方式E1的一个进一步的子实施方式中，23B是唯一的血清组23的血清型。在实施方式E1的又一个子实施方式中，23F是唯一的血清组23的血清型。
在第二个实施方式(实施方式E2)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包含实施方式E1中，或实施方式E1的任何子实施方式中所示的血清型，以及还包含血清型：(1)6C、(2)6A或(3)6A和6B。
在实施方式E2的一个子实施方式中，组合物包含血清型6C。在实施方式E2的一个进一步的子实施方式中，组合物包含血清型6A和6B，且不包含血清型6C。在实施方式E2的另一个子实施方式中，组合物包含血清型6A。
在第三个实施方式(实施方式E3)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包含实施方式E1中，或实施方式E1的任何子实施方式，或实施方式E2，或实施方式E2的任何子实施方式中所示的血清型，以及还包含血清型：
(1)8，
(2)9N，
(3)11A，
(4)12F，
(5)15B或15C，
(6)17F，和
(7)20A和/或20B。
在第四个实施方式(实施方式E4)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包含实施方式E1-E3的任一项，或其任何子实施方式中所示的血清型，以及还包含血清型：10A或39。
在第五个实施方式(实施方式E5)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含如上文所述的多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述肺炎链球菌的血清型包含下述、由下述组成或基本上由下述组成：8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B。
在第六个实施方式(实施方式E6)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含如上文所述的多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述肺炎链球菌的血清型包含下述、由下述组成或基本上由下述组成：8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B。
在第七个实施方式(实施方式E7)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含如上文所述的多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述肺炎链球菌的血清型包含下述、由下述组成或基本上由下述组成：8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B。
在第八个实施方式(实施方式E8)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含如上文所述的多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述肺炎链球菌的血清型包含下述、由下述组成或基本上由下述组成：8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B。
在第九个实施方式(实施方式E9)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含如上文所述的多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述肺炎链球菌的血清型包含实施方式E1-E8的任一项(或其任何子实施方式)中所示的血清型，以及还包含血清型：3、7F和19A。
在第十个实施方式(实施方式E10)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含如上文所述的多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述肺炎链球菌的血清型包含实施方式E1-E9的任一项(或其任何子实施方式)中所示的血清型，以及还包含血清型：22F。
在第十一个实施方式(实施方式E11)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含如上文所述的多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述肺炎链球菌的血清型包含实施方式E1-E10的任一项(或其任何子实施方式)中所示的血清型，以及还包含血清型：33F。
在第十二个实施方式(实施方式E12)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含如上文所述的多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述肺炎链球菌的血清型包含选自下组的一组肺炎链球菌血清型、由其组成或基本上由其组成：
(1)15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(2)15A、16F、23F、23B、24F、31和35B，
(3)15A、16F、23A、23F、24F、31和35B，
(4)15A、16F、23A、24F、31和35B，
(5)15A、16F、23B、24F、31和35B，
(6)15A、16F、23F、24F、31和35B，
(7)6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(8)6C、15A、16F、23F、23B、24F、31和35B，
(9)6C、15A、16F、23A、23F、24F、31和35B，
(10)6C、15A、16F、23A、24F、31和35B，
(11)6C、15A、16F、23B、24F、31和35B，
(12)6C、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(13)6A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(14)6A、15A、16F、23F、23B、24F、31和35B，
(15)6A、15A、16F、23A、23F、24F、31和35B，
(16)6A、15A、16F、23A、24F、31和35B，
(17)6A、15A、16F、23B、24F、31和35B，
(18)6A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(19)6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(20)6A、6B、15A、16F、23F、23B、24F、31和35B，
(21)6A、6B、15A、16F、23A、23F、24F、31和35B，
(22)6A、6B、15A、16F、23A、24F、31和35B，
(23)6A、6B、15A、16F、23B、24F、31和35B，和
(24)6A、6B、15A、16F、23F、24F、31和35B。
在第十三个实施方式(实施方式E13)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含如上文所述的多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述肺炎链球菌的血清型包含选自下组的一组肺炎链球菌血清型、由其组成或基本上由其组成：
(1)8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(2)8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(3)8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(4)8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(5)8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(6)8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(7)8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(8)8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(9)8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(10)8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(11)8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(12)8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(13)8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(14)8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(15)8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(16)8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(17)8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(18)8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(19)8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(20)8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(21)8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(22)8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(23)8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(24)8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(25)8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(26)8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(27)8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(28)8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(29)8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(30)8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(31)8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31和35B，和
(32)8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31和35B。第十三个实施方式(实施方式E13)进一步包含第(1)至(32)行的一组肺炎链球菌血清型，其中在每组中的血清型20A被血清型20或血清型20B所替代。
在第十四个实施方式(实施方式E14)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含如上文所述的多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述肺炎链球菌的血清型包含选自实施方式E13的第(17)至(32)行中所示的任何一组血清型的一组肺炎链球菌血清型，由其组成或基本上由其组成，以及还包含血清型23A和/或23B。
在第十五个实施方式(实施方式E15)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含如上文所述的多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述肺炎链球菌的血清型包含选自下组的一组肺炎链球菌血清型、由其组成或基本上由其组成：
(1)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(2)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(3)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(4)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(5)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(6)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(7)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(8)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(9)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(10)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(11)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(12)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(13)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(14)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(15)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(16)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
(17)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(18)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(19)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(20)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6C、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(21)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(22)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(23)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(24)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(25)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(26)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15C、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(27)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(28)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(29)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(30)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(31)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、6B、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(32)3、7F、19A、22F、33F、8、9N、39、11A、12F、15B、17F、20A、6A、15A、16F、23F、24F、31和35B，
(33)3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20B，
(34)3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A，
(35)3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20B，
(36)3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20B，
(37)3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A，
(38)3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20B，
(39)3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20，
(40)3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20，
(41)3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20，
(42)3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20，
(43)3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20，和
(44)3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24B、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20。
在第十六个实施方式(实施方式E16)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含如上文所述的多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述肺炎链球菌的血清型包含选自实施方式E15的第(17)至(32)行中所示的任何一组血清型的一组肺炎链球菌血清型，由其组成或基本上由其组成，以及还包含血清型23A和/或23B。
在第十七个实施方式(实施方式E17)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包含选自下组的一组血清型：
i.6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，
ii.6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A，和
iii.3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A；在实施方式E17的子实施方式中，免疫原性组合物不包含任何其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物。
在第十八个实施方式(实施方式E18)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，所述缀合物包含来自肺炎链球菌血清型15A、16F、23A、23B、24F、31和35B的荚膜多糖。在实施方式E18的子实施方式中，免疫原性组合物不包含任何其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物。
在第十九个实施方式(实施方式E19)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，所述缀合物包含来自肺炎链球菌血清型6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A的荚膜多糖。在实施方式E19的子实施方式中，免疫原性组合物不包含任何其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物。
在第二十个实施方式(实施方式E20)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，所述缀合物包含来自肺炎链球菌血清型3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A的荚膜多糖。在实施方式E20的子实施方式中，免疫原性组合物不包含任何其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，所述缀合物包含来自肺炎链球菌血清型3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A的荚膜多糖。在该实施方式的子实施方式中(即，3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A)，免疫原性组合物不包含任何其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，所述缀合物包含来自肺炎链球菌血清型3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20的荚膜多糖。在该实施方式的子实施方式中(即，3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20)，免疫原性组合物不包含任何其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，所述缀合物包含来自肺炎链球菌血清型3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20B的荚膜多糖。在该实施方式的子实施方式中(即，3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20B)，免疫原性组合物不包含任何其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物。
如本文所示(见下文中的实施例3)，去-O-乙酰化血清型15B肺炎球菌多糖等同于血清型15C的肺炎球菌多糖，并且具有相同的NMR光谱。如本文所述和所公开的，去-O-乙酰化血清型5B肺炎球菌多糖等同于血清型15C的肺炎球菌多糖，并且每个重复单元的O-乙酰基含量都可以在0-5％范围内，或在0-4％范围内，或在0-3％范围内，或在0-2％范围内，或在0-1％范围内，或在0-0.5％范围内，或在0-0.1％范围内，或不含O-乙酰基。在SpencerB.L.等人的报告中，15C可以被轻微O-乙酰化(Spencer,B.L.等，Clin.Vac.Immuno.(2017)24(8):1-13)。因此，在本文的多价免疫原性组合物的任何实施方式中，可以使用去-O-乙酰化血清型15B代替血清型15C。去-O-乙酰化的方法是本领域公知的，例如，如在Rajam等，Clinical and Vaccine Immunology,2007,14(9):1223–1227中所描述的。
在任何本发明的多价免疫原性组合物的某些实施方式中，包括实施方式E1至E20及其任何子实施方式，组合物还包含药学上可接受的载体。
交叉反应性
在一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型6C)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型6C提供了针对肺炎链球菌的血清型6A和6B的交叉保护作用。
在另一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含选自实施方式E1至E20的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型6C)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型6C提供了针对肺炎链球菌的血清型6A和6B的交叉保护作用。
在一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型19A)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型19A提供了针对肺炎链球菌的血清型19F的交叉保护作用。
在另一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含选自实施方式E1至E20的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型19A)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型19A提供了针对肺炎链球菌的血清型19F的交叉保护作用。
在一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型23A和/或23B)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型23A和/或23B提供了针对肺炎链球菌的血清型23F的交叉保护作用。
在另一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含选自实施方式E1至E20的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型23A和/或23B)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型23A和/或23B提供了针对肺炎链球菌的血清型23F的交叉保护作用。
在一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型6A)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型6A提供了针对肺炎链球菌的血清型6B和/或6C的交叉保护作用。
在另一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含选自实施方式E1至E20的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型6A)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型6A提供了针对肺炎链球菌的血清型6B和/或6C的交叉保护作用。
在一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型20A)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型20A提供了针对肺炎链球菌的血清型20B的交叉保护作用。
在另一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含选自实施方式E1至E20的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型20A)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型20A提供了针对肺炎链球菌的血清型20B的交叉保护作用。
在一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型20B)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型20B提供了针对肺炎链球菌的血清型20A的交叉保护作用。
在另一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含选自实施方式E1至E20的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型20B)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型20B提供了针对肺炎链球菌的血清型20A的交叉保护作用。
在一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型15C)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型15C提供了针对肺炎链球菌的血清型15B的交叉保护作用。
在另一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含选自实施方式E1至E20的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型15C)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型15C提供了针对肺炎链球菌的血清型15B的交叉保护作用。
载体蛋白
在本发明的特定实施方式中，将CRM197作为载体蛋白。CRM197是具有下述氨基酸序列的白喉毒素的无毒性变体(即，类毒素)：
在一个实施方式中，CRM197是从在酪蛋白氨基酸和基于酵母提取物的培养基中生长的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7(β197)的培养物中分离得到的。在另一个实施方式中，CRM197依照美国专利号5,614,382中所述的方法重组制备。一般地，CRM197通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换层析的组合进行纯化。在一些实施方式中，CRM197使用Pfenex Expression TechnologyTM(Pfenex Inc.,San Diego,CA)在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中进行制备。
其他合适的载体蛋白质包括另外的灭活细菌毒素如DT(白喉类毒素)或DT的片段B(DTFB)、TT(破伤风毒素)或TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素(例如，如WO 2004/083251中描述的)、大肠杆菌(E.coli)LT、大肠杆菌ST和来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的外毒素A。还可以使用细菌外膜蛋白质如外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌表面蛋白A(PspA；参见WO 02/091998)、肺炎球菌粘附素蛋白(PsaA)、来自A组或B组链球菌的C5a肽酶、或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D、肺炎球菌溶血素(Kuo等，1995,Infect Immun 63；2706-13)包括以某些形式解毒的ply，例如dPLY-GMBS(参见WO 04/081515)或dPLY-甲醛、PhtX包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE和Pht蛋白的融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物(参见WO 01/98334和WO 03/54007)。其他蛋白如卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、PorB(来自脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis))、PD(流感嗜血杆菌蛋白D；参见例如，EP 0 594610B)或其免疫功能等价物、合成肽(参见EP0378881和EP0427347)、热休克蛋白(参见WO93/17712和WO 94/03208)、百日咳蛋白质(参见WO 98/58668和EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(参见WO 91/01146)、包含来自多种病原体衍生抗原的多重人CD4+T细胞表位的人工蛋白质(参见Falugi等，2001,Eur J Immunol 31:3816-3824)，如N19蛋白(参见Baraldoi等，2004,Infect Immun 72:4884-7)，铁摄取蛋白质(参见WO 01/72337)、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B(参见WO 00/61761)、和鞭毛蛋白(参见Ben-Yedidia等，1998,Immunol Lett 64:9)也可以用作载体蛋白质。
可以使用其他DT突变体作为载体蛋白，如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等，1973,J Biol Chem 218:3838-3844)；CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107，以及由Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins,Ed:Frankel,Maecel Dekker Inc,1992中描述的其他突变；Glu-148至Asp、Gln或Ser和/或Ala 158至Gly的缺失或突变和公开于US 4,709,017或US 4,950,740中的其他突变；至少一个或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变和公开于US 5,917,017或美国专利号6,455,673中的其他突变；或公开于US 5,843,711中的片段。这样的DT突变体也可用于制备DTFB变体，其中包含B片段的变体包含表位区域。
在某些实施方式中，载体蛋白选自下组：外膜蛋白复合物(OMPC)、破伤风类毒素、白喉类毒素、蛋白D和CRM197。
在本发明的一些实施方式中，可以将第二载体用于多价免疫原性组合物中的一种或多种多糖蛋白缀合物。第二载体蛋白优选是无毒且无反应性并且可以足够量和纯度获得的蛋白。第二载体蛋白也与肺炎链球菌多糖缀合或结合以增强抗原的免疫原性。载体蛋白应符合标准的缀合程序。在一个实施方式中，未与第一载体蛋白缀合的每个荚膜多糖与相同的第二载体蛋白缀合(例如，每个荚膜多糖分子与单个载体蛋白缀合)。在另一个实施方式中，未与第一载体蛋白缀合的荚膜多糖与两个或多个载体蛋白缀合(每个荚膜多糖分子与单个载体蛋白缀合)。在此类实施方式中，相同血清型的每个荚膜多糖通常与相同的载体蛋白缀合。
在本发明的实施方式中，包括实施方式E1-E20的任一项及其任何子实施方式，一种或多种(包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21种，如适用)多糖血清型与CRM197缀合。在本发明进一步的实施方式中，包括实施方式E1-E20的任一项及其任何子实施方式，每种多糖血清型与CRM197缀合。
可以使用本领域公认的方法来完成本发明的多糖-蛋白质缀合物的配制。例如，可以使用生理学上可接受的载剂配制单个肺炎球菌缀合物以制备组合物。此类载剂的实例包括但不限于水、缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇)和右旋糖溶液。
在一个优选的实施方式中，疫苗组合物在含有氯化钠的L-组氨酸缓冲液中配制。
在本发明的一些实施方式中，多价免疫原性组合物包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物和佐剂，所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型是如本文所述的。增强组合物有效性的合适佐剂包括但不限于：
(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；
(2)水包油乳剂佐剂(含或不含其他特异性免疫刺激剂，如胞壁酰肽(下文定义的)细菌细胞壁组分)，如(a)MF59(国际专利申请公开号WO 90/14837)，含有5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85(任选地含有不同量的MTP-PE)，使用微射流机(microfluidizer)，如型号110Y微射流机(Microfluidics，Newton，MA)配制成亚微米颗粒，(b)SAF，含有10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普朗尼克嵌段聚合物L121、和thr-MDP，微射流成亚微米乳化液或涡旋以生成较大颗粒尺寸的乳剂，(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Corixa,Hamilton,MT)，含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，其来自美国专利号4,912,094中描述的3-O-脱酰化单磷酰脂质A(MPLTM)、海藻糖二霉菌酸(TDM)和细胞壁支架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；和(d)Montanide ISA；
(3)可以使用皂苷佐剂，如Quil A或STIMULONTMQS-21(Antigenics，Framingham，MA)(参见例如，美国专利号5,057,540)或由其生成的粒子，如ISCOM(通过胆固醇、皂苷、磷脂和两亲蛋白的组合形成的免疫刺激复合物)和(具有与ISCOM基本上相同的结构但不含蛋白)；
(4)细菌脂多糖、合成脂质A类似物，如氨基烷基葡糖胺磷酸盐化合物(AGP)或其衍生物或类似物，其可从Corixa获得，且在美国专利号6,113,918中描述；一种此类AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰]-2-[(R)-3--十四酰氧基十四酰氨基]-b-D-吡喃葡糖苷，其也称为529(以前称为RC529)，其配制为水溶液形式或稳定乳剂；
(5)合成多核苷酸，如含有一个或多个CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646)；和
(6)细胞因子，如白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、干扰素(例如，γ干扰素)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、共刺激分子B7-1和B7-2等；和
(7)补体，如补体成分C3d的三聚体。
在另一个实施方式中，佐剂是上述佐剂中的2、3种或更多种的混合物，例如SBAS2(还含有3-脱酰化单磷酰脂质A和QS21的水包油乳剂)。
胞壁酰肽包括但不限于N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。
在某些实施方式中，佐剂是铝盐。铝盐佐剂可以是明矾沉淀的疫苗或明矾吸附的疫苗。铝盐佐剂是本领域众所周知的，并且例如在Harlow,E.和D.Lane(1988；Antibodies:ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)和Nicklas,W.(1992；Aluminumsalts.Research in Immunology 143:489-493)中描述。铝盐包括但不限于水化氧化铝、水合氧化铝、三水合氧化铝(ATH)、铝的水合物、铝的三水合物、铝胶、Superfos、Amphogel、氢氧化铝(III)、羟基磷酸铝硫酸盐(磷酸铝佐剂(APA))、无定形氧化铝、三水合氧化铝或三羟基铝。
APA是羟基磷酸铝的水混悬液。APA通过将氯化铝和磷酸钠以1:1体积比掺和以沉淀羟基磷酸铝制备。在掺和过程后，用高剪切混合器使材料尺寸减小，以达到单分散粒径分布。随后将产物用生理盐水渗滤且蒸汽灭菌。
在某些实施方式中，商购可得的Al(OH)3(例如，Denmark/Accurate Chemical andScientific Co.，Westbury，NY的Alhydrogel或Superfos)用于以50-200μg蛋白/mg氢氧化铝的比吸附蛋白。在另一个实施方式中，蛋白的吸附依赖于蛋白的pI(等电点pH)和介质的pH。具有更低pI的蛋白比具有更高pI的蛋白质更强地吸附至带正电的铝离子。铝盐可以建立Ag贮库，其经过2-3周的时期缓慢释放，涉及巨噬细胞的非特异性激活和补体激活，和/或刺激先天性免疫机制(可能通过尿酸的刺激)。参见例如，Lambrecht等，2009,Curr OpinImmunol 21:23。
通常，将单价水性缀合物原料掺和在一起，且对于除了6B外的所有血清型都稀释至目标4μg/mL，所述6B将稀释至目标8μg/mL。一旦稀释，将该批料过滤灭菌，且加入等体积的磷酸铝佐剂至250μg/mL的目标最终铝浓度。佐剂化的(adjuvanted)、配制的批次将填充到一次性使用的0.5mL/剂量小瓶内。
在某些实施方式中，佐剂是含CpG核苷酸序列，例如含CpG寡核苷酸，特别是含CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。在另一个实施方式中，佐剂是ODN 1826，其可以从ColeyPharmaceutical Group获得。
关于使用CpG寡核苷酸的方法是本领域众所周知的，并且例如在Sur等，1999,JImmunol.162:6284-93；Verthelyi,2006,Methods Mol Med.127:139-58；和Yasuda等，2006,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.23:89-110。
在替代实施方式中，免疫原性组合物包含如本文所述的多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，例如，在实施方式E1-E20中任一项或其任何子实施方式，并且不包含佐剂。
制剂
本发明的组合物可以配制为单剂量小瓶、多剂量小瓶或预充式玻璃或塑料注射器。
在另一个实施方式中，本发明的组合物经口施用，并且因而以适合于经口施用的形式即作为固体或液体制备物进行配制。固体经口制剂包括片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、丸剂(pellet)等。液体经口制剂包括溶液、混悬液、分散体、乳剂、油等。
用于液体制剂的药学可接受的载体是水或非水溶液、混悬液、乳剂或油。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。油的例子包括动物、植物或合成起源的那些，例如花生油、大豆油、橄榄油、向日葵油、鱼肝油、另外的海洋油、或来自乳或蛋的脂肪。
药物组合物可以是等渗、低渗或高渗的。然而，在将其施用时，通常优选用于输注或注射的药物组合物是基本上等渗的。因此，为了贮存，药物组合物可以优选是等渗或高渗的。如果药物组合物为了贮存是高渗的，那么其可以在施用前稀释以变成等渗溶液。
等渗剂可以是离子等渗剂(如盐)或非离子等渗剂(如糖)。离子等渗剂的例子包括但不限于NaCl、CaCl2、KCl和MgCl2。非离子等渗剂的例子包括但不限于甘露醇、山梨糖醇和甘油。
还优选至少一种药学可接受的添加剂是缓冲剂。为了某些目的，例如，当药物组合物意欲用于输注或注射时，通常希望组合物包含缓冲液，其能够将溶液缓冲至在4至10范围中的pH，例如5至9，例如6至8。
缓冲液可以例如选自TRIS、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、甘氨酸盐、组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐和三乙醇胺缓冲液。
缓冲剂可以另外例如选自用于肠胃外使用的USP相容的缓冲液，特别是当药物制剂用于肠胃外使用时。例如，缓冲液可以选自一元酸例如乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甘油酸和乳酸；二元酸例如乌头酸、己二酸、抗坏血酸、碳酸、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸，多元酸例如柠檬酸和磷酸；和碱例如铵、二乙醇胺、甘氨酸、三乙醇胺和TRIS。
肠胃外载剂(用于皮下、静脉内、动脉内或肌内注射)包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格和不挥发性油。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂如基于林格氏右旋糖的那些等。实例是无菌液体例如水和油，添加或不添加表面活性剂和其他药学可接受的佐剂。一般而言，水、盐水、水性右旋糖和相关糖溶液、二醇例如丙二醇或聚乙二醇、聚山梨醇酯80(PS-80)、聚山梨醇酯20(PS-20)和泊洛沙姆188(P188)是优选液体载体，特别是用于可注射溶液。油的例子是动物、植物或合成起源的那些，例如花生油、大豆油、橄榄油、葵花油、鱼肝油、另外的海洋油、或来自乳或蛋的脂质。
本发明的制剂还可以含有表面活性剂。优选表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是PS-20和PS-80；在DOWFAXTM商品名称下销售的，环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，例如线性EO/PO嵌段共聚物；辛苯昔醇，其可以在重复乙氧基(氧基-l,2-乙二基(ethanediyl))基团数目中不同，其中辛苯昔醇-9(Triton X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)是特别有利的；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂例如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基酚乙氧基化物例如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，例如三甘醇单月桂基醚(Brij 30)；和脱水山梨糖醇酯(通常称为SPAN)，例如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。用于包含在乳剂中的优选表面活性剂是PS-80。
可以使用表面活性剂的混合物，例如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(PS-80)和辛苯昔醇例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)的组合也是合适的。另一种有用的组合包含laureth 9加上聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯昔醇。
表面活性剂的优选量(按重量计％)是：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(例如PS-80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(polyoxyethanol)(例如Triton X-100，或在Triton系列中的其他去垢剂)0.001至0.1％，特别是0.005至0.02％；聚氧乙烯醚(例如laureth 9)0.1至20％，优选0.1至10％，且特别是0.1至1％或约0.5％。
在某些实施方式中，组合物基本上由组氨酸(20mM)、盐水(150mM)和0.2％PS-20或0.04％PS-80(pH为5.8)和250μg/mL的APA(磷酸铝佐剂)组成。在模拟生产过程中以及在使用初级包装运输的过程中控制聚集的制剂中，在存在PS-20或PS-80的条件下，PS-20的范围可以是从0.005％至0.3％(w/v)。在另一个实施方式中，PS-20的范围可以是从0.025％至0.8％(w/v)。在另一个实施方式中，PS-20的范围可以是从0.05％至0.8％(w/v)。在另一个实施方式中，PS-20的范围可以是从0.05％至0.2％(w/v)。该方法包括在组氨酸、盐水和PS-20或PS-80中混合多达24种血清型的混合物，然后将这种混合的物质与APA和盐水混合，并添加或不添加抗菌防腐剂。
在特定实施方式中，多价免疫原性组合物包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中多糖蛋白缀合物中的肺炎链球菌的血清型包含本文所述的任何血清型组，并且进一步包含20-80mM组氨酸(pH 5.8)和150mM NaCl。在一些实施方式中，多价免疫原性组合物还包含0.2％至0.8％w/v聚山梨醇酯20。
表面活性剂的选择可能需要针对不同的制剂和原料药进行优化。对于含有15种或更多种血清型的多价疫苗，PS-20和P188是优选的。用于制备缀合物的化学方法的选择也会影响制剂的稳定性。特别地，当用于制备多价组合物中不同多糖蛋白缀合物的缀合反应同时包括水性溶剂和DMSO溶剂时，特定的表面活性剂体系在稳定性方面存在显著差异。单独使用聚山梨酯20或将泊洛沙姆188与多元醇结合使用时，都可以看到多糖蛋白缀合物的稳定性得到改善。
特定去垢剂如何保护生物治疗剂的确切机理知之甚少，无法事先预测。可能的稳定机制包括优先水合作用、优先排斥、生物治疗剂与表面之间的气/液界面竞争、表面张力和/或去垢剂与生物治疗剂直接缔合以掩盖疏水性团块，后者是聚集的种子。
泊洛沙姆也可以用于本发明的组合物中。泊洛沙姆是一种非离子型三嵌段共聚物，由聚氧丙烯(聚环氧丙烷)的中心疏水链与聚氧乙烯(聚环氧乙烷)的两个亲水链相连。泊洛沙姆也以商品名 闻名。由于聚合物嵌段的长度可以定制，因而存在很多性质略有不同的泊洛沙姆。对于通用名“泊洛沙姆”，这些共聚物通常以字母“P”(泊洛沙姆)命名，后接三位数字，前两位数字x 100表示聚氧丙烯核心的近似分子量，最后一位数字x10表示聚氧乙烯含量的百分比(例如，P407＝聚氧丙烯分子量为4,000g/mol，聚氧乙烯含量为70％的泊洛沙姆)。对于商品名，这些共聚物的编码以字母开头，以定义其在室温下的物理形式(L＝液体、P＝糊剂、F＝薄片(固体))，然后是两位或三位数。数字名称中的第一位数字(三位数字中的两位数字)乘以300表示疏水物的近似分子量；最后一位数字x 10表示聚氧乙烯含量的百分比(例如，L61＝聚氧丙烯分子量为1,800g/mol，聚氧乙烯含量为10％的)。参见美国专利号3740421。
具有下述通式的泊洛沙姆的实例：HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH，其中a和b嵌段具有以下值：
如在本文中所使用的，分子量范围是道尔顿(Da)或g/mol。
优选地，泊洛沙姆的分子量通常为1100至17,400Da，7,500至15,000Da，或7,500至10,000Da。泊洛沙姆可选自泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。泊洛沙姆在制剂中的终浓度为0.001％至5％重量/体积，或0.025％至1％重量/体积。在某些方面中，多元醇是丙二醇，且终浓度为1％至20％重量/体积。在某些方面中，多元醇是聚乙二醇400，且终浓度为1％至20％重量/体积。
用于本发明制剂的合适多元醇是聚合多元醇，特别是聚醚二醇，包括但不限于丙二醇和聚乙二醇、聚乙二醇单甲基醚。丙二醇的单体分子量范围为～425至～2,700。也可以获得分子量为～200至～35000的聚乙二醇和聚乙二醇单甲醚，包括但不限于PEG200、PEG300、PEG400、PEG1000、PEG MME 550、PEG MME 600、PEG MME 2000、PEG MME 3350和PEGMME4000。优选的聚乙二醇是聚乙二醇400。本发明制剂中多元醇的最终浓度可以为1％至20％重量/体积或6％至20％重量/体积。
制剂还包含pH缓冲盐水溶液。缓冲液可以例如选自Tris、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、甘氨酸盐、L-组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)和三乙醇胺缓冲液。缓冲液能够将溶液缓冲至pH为4至10、5.2至7.5或5.8至7.0的范围。在本发明的某些方面，缓冲液选自磷酸盐、琥珀酸盐、L-组氨酸、MES、MOPS、HEPES、乙酸盐或柠檬酸盐。缓冲液还可以例如选自肠胃外使用的USP兼容缓冲液，特别是当药物制剂用于肠胃外使用时。缓冲液的浓度范围将为从1mM至100mM。缓冲液的浓度范围将为从10mM至80mM。缓冲液的浓度范围将为从1mM至50mM或5mM至50mM。在某些方面中，缓冲液是终浓度5mM至50mM的组氨酸，或终浓度1mM至10mM的琥珀酸。在某些方面中，组氨酸的终浓度为20mM±2mM。
尽管盐溶液(即，含有NaCl的溶液)是优选的，但其他适合制剂的盐包括但不限于CaCl2、KCl和MgCl2及其组合。可以使用非离子等渗剂，包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇和甘油来代替盐。合适的盐范围包括但不限于25mM至500mM或40mM至170mM。在一个方面中，盐水是NaCl，任选地以20mM至170mM的浓度存在。
在一个优选的实施方式中，制剂包含L-组氨酸缓冲液和氯化钠。
在另一个实施方式中，药物组合物以控释系统递送。例如，试剂可以使用静脉内输注、透皮贴剂、脂质体或其他施用方式来施用。在另一个实施方式中，使用聚合物材料；例如在微球中或在植入物中。
将在每个疫苗剂量中缀合物的量选定为诱导免疫保护性应答且不具有显著不良效应的量。此量能够根据肺炎球菌血清型而改变。在通常情况下，对于基于多糖的缀合物，每个剂量将包含0.08至100g每种多糖。在本发明的一些实施方式中，每种多糖缀合物的剂量是从0.08至10g。在进一步的实施方式中，剂量是从1至5g、从0.4至4g、从0.4至3g、从0.4至2g或从0.4至1g。在一些实施方式中，一种或多种多糖缀合物的剂量是100、150、200、250、300、400、500或750ng，或者0.4、0.5、0.6,0.7,0.75,0.8,0.9,1,1.5,2,3,4,5,6,7,7.5,8,9,10,11,12,13,14,15,16,18,20,22,25,30,40,50,60,70,80,90,or 100g.
在本发明组合物的一些实施方式中，所有多糖缀合物在组合物中以相同的量存在。在进一步的实施方式中，多糖缀合物在组合物中以不同的量存在(即，至少一种多糖缀合物以不同于组合物中一种或多种其他多糖缀合物的量存在)。
可以通过标准研究确定特定疫苗的最佳成分量，这些标准研究包括在受试者中观察适当的免疫应答。例如，在另一个实施方式中，通过从动物研究到人数据的外推确定人免疫接种的剂量。在另一个实施方式中，剂量是根据经验确定的。
在一个实施方式中，铝盐的剂量是10、15、20、25、30、50、70、100、125、150、200、300、500或700μg，或者1、1.2、1.5、2、3、5mg或更高。在又一个实施方式中，上述铝盐的剂量是每μg重组蛋白。
本发明的组合物还可以包含一种或多种肺炎链球菌蛋白。适于纳入的肺炎链球菌蛋白的实例包括在国际专利申请公开号WO 02/083855和WO 02/053761中鉴定的那些。
在某些实施方式中，通过本领域技术人员公知的一种或多种方法(如肠胃外、透粘膜、透皮、肌内、静脉内、皮内、鼻内、皮下、腹膜内)向受试者施用本发明的组合物，并据此配制。在一个实施方式中，本发明的组合物通过液体制剂的表皮注射、肌内注射、静脉内、动脉内、皮下注射或内呼吸道粘膜注射施用。用于注射的液体制剂包括溶液剂等。
III.制备方法
可以通过本领域技术人员已知的标准技术来制备来自肺炎链球菌的荚膜多糖。例如，可以从细菌中分离多糖，并且可以通过已知方法将多糖尺寸调节到一定程度(参见例如，欧洲专利号EP497524和EP497525)；并且优选通过使用均质器或化学水解完成的微流化。在一个实施方式中，每种肺炎球菌多糖血清型在基于大豆的培养基中生长。然后通过标准步骤(包括离心、沉淀和超滤)纯化各种多糖。参见例如，美国专利申请公开号2008/0286838和美国专利号5,847,112。可以使用诸如机械或化学尺寸调节的技术对多糖进行尺寸调节，以降低粘度和/或改善缀合产物的过滤性。可以使用乙酸进行化学水解。机械尺寸调节可使用高压均质剪切进行。
可以将纯化的多糖化学活化以使得多糖能够与载体蛋白反应。纯化的多糖可以连接至接头。一旦被活化或连接到接头，每个荚膜多糖分别与载体蛋白缀合以形成糖缀合物。多糖缀合物可以通过已知的偶联技术制备。
可以将多糖偶联至接头以形成多糖-接头中间体，其中接头的自由末端为酯基。因此，接头是其中至少一个末端是酯基的接头。选择另一个末端，以使其可以与多糖反应形成多糖-接头中间体。
可以使用多糖中的伯胺基团将多糖偶联至接头。在这种情况下，接头通常在两个末端都具有酯基。这允许通过亲核酰基取代使酯基之一与多糖中的伯胺基反应来进行偶联。该反应产生多糖-接头中间体，其中多糖通过酰胺键偶联至接头。因此，接头是双官能接头，其提供用于与多糖中的伯胺基反应的第一酯基和用于与载体分子中的伯胺基反应的第二酯基。典型的接头是己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯(SIDEA)。
偶联还可以间接发生，即在偶联至接头之前通过用于衍生多糖的另外的接头进行。
在多糖的还原末端使用羰基将多糖偶联至另外的接头。该偶联包括两个步骤：(a1)使羰基与另外的接头反应；和(a2)使另外的接头的自由末端与接头反应。在这些实施方式中，另外的接头通常在两个末端均具有伯胺基，从而允许步骤(a1)通过还原胺化使伯胺基之一与多糖中的羰基反应而进行。使用与多糖中的羰基反应的伯胺基。酰肼或羟氨基是合适的。相同的伯胺基通常存在于另外的接头的两个末端。该反应产生多糖-另外接头中间体，其中多糖通过C-N键与另外的接头偶联。
可以使用多糖中的不同基团，特别是羧基，将多糖偶联至另外的接头。该偶联包括两个步骤：(a1)使基团与另外的接头反应；和(a2)使另外的接头的自由末端与接头反应。在这种情况下，所述另外的接头通常在两个末端均具有伯胺基，从而允许步骤(a1)通过EDAC活化使所述伯胺基之一与多糖中的羧基反应而进行。使用与多糖中的EDAC活化的羧基反应的伯胺基。酰肼基是合适的。相同的伯胺基通常存在于另外的接头的两个末端。该反应产生多糖-另外的接头中间体，其中多糖通过酰胺键与另外的接头偶联。
在一个实施方式中，多糖的化学活化和随后通过还原胺化与载体蛋白的缀合可以通过美国专利号4,365,170、4,673,574和4,902,506，美国专利申请公开号2006/0228380、2007/184072、2007/0231340和2007/0184071，和国际专利申请公开号WO2006/110381，WO2008/079653和WO2008/143709中所描述的方法实现。化学反应可以包括通过与将末端羟基氧化成醛的任何氧化剂如高碘酸盐(包括高碘酸钠、高碘酸钾或高碘酸)反应来活化肺炎球菌多糖。反应导致碳水化合物的邻羟基的随机氧化裂解，形成反应性醛基。
通过直接胺化还原胺化至蛋白质的赖氨酰基来偶联至载体蛋白。例如，通过在镍的存在下使活化多糖和载体蛋白的混合物与还原剂例如氰基硼氢化钠反应进行缀合。缀合反应可以在水溶液或二甲基亚砜(DMSO)的存在下进行。参见例如，US2015/0231270、US2011/0195086以及EP 0471177B1。然后通过加入强还原剂(例如硼氢化钠)将未反应的醛封端。
还原胺化涉及两个步骤，(1)多糖的氧化以形成反应性醛，(2)还原在活化多糖与载体蛋白之间形成的亚胺(席夫碱)以形成稳定的胺共轭键。在氧化之前，任选地将多糖尺寸减小。可以采用机械方法(例如，均质化)或化学水解。可以使用乙酸进行化学水解。氧化步骤可涉及与高碘酸盐反应。为了本发明的目的，术语“高碘酸盐”包括高碘酸盐和高碘酸；该术语还包括偏高碘酸盐(metaperiodate)(IO4 -)和原高碘酸盐(orthoperiodate)(IO6 -)，并且包括高碘酸盐的各种盐(例如，高碘酸钠和高碘酸钾)。在一个实施方式中，在偏高碘酸盐的存在下，优选在高碘酸钠(NaIO4)的存在下，氧化荚膜多糖。在另一个实施方式中，在原高碘酸盐存在下，优选在高碘酸存在下，氧化荚膜多糖。
在一个实施方式中，氧化剂是稳定的硝酰基或硝基氧(nitroxide)自由基化合物，例如哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物，在氧化剂存在下选择性氧化伯羟基(如在WO2014/097099中所述的)。在所述反应中，在催化循环中，实际的氧化剂是N-氧代铵盐。在一个方面中，所述稳定的硝酰基或硝基氧自由基化合物是哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物。在一个方面中，所述稳定的硝酰基或硝基氧自由基化合物带有TEMPO(2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基)或PROXYL(2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷基氧基)部分。在一个方面中，所述稳定的硝酰基自由基化合物是TEMPO或其衍生物。在一个方面中，所述氧化剂是带有N-卤代部分的分子。在一个方面中，所述氧化剂选自N-氯琥珀酰亚胺、N-溴琥珀酰亚胺、N-碘琥珀酰亚胺、二氯异氰尿酸、1,3,5-三氯-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮、二溴异氰尿酸、1,3,5-三溴-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮、二碘异氰尿酸和1,3,5-三碘-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮。优选地，所述氧化剂是N-氯代琥珀酰亚胺。
在某些方面中，氧化剂是2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)游离自由基和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)作为助氧化剂(如在WO2014/097099中所述)。因此，在一个方面中，来自肺炎链球菌的糖缀合物可通过包括以下步骤的方法获得：a)使糖与2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)在水性溶剂中反应产生活化的糖；和b)使活化的糖与包含一个或多个胺基的载体蛋白反应(所述方法下文称为“TEMPO/NCS-还原胺化”)。
任选地，通过添加淬灭剂来淬灭氧化反应。淬灭剂可以选自邻二醇、1,2-氨基醇、氨基酸、谷胱甘肽、亚硫酸盐、硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐、亚磷酸盐、次磷酸盐或亚磷酸(如甘油、乙二醇、丙-1,2-二醇、丁-1,2二醇或丁-2,3-二醇、抗坏血酸)。
在某些实施方式中，本发明提供了一种利用在非质子溶剂中的缀合反应制备血清型8肺炎链球菌多糖-蛋白缀合物的方法，其中所述缀合反应不使用氰基硼氢化物。在进一步的实施方式中，缀合反应是席夫碱还原或者还原胺化。在进一步的实施方式中，蛋白是破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197。在又一个进一步的实施方式中，蛋白是CRM197。在进一步的实施方式中，缀合反应是还原胺化。在进一步的实施方式中，还原胺化在二甲基亚砜(DMSO)中进行。
在一些实施方式中，缀合前氧化多糖的分子量在30kDa至1,000kDa之间。分子量可以通过体积排阻色谱法(SEC)结合多角度光散射检测器(MALS)和折射率检测器(RI)来计算。在一些实施方式中，多糖的分子量在50kDa至300kDa之间。在一些实施方式中，多糖的分子量在50kDa至1,000kDa之间。在其他实施方式中，多糖的分子量在70kDa至900kDa之间。在其他实施方式中，多糖的分子量在100kDa至800kDa之间。在其他实施方式中，多糖的分子量在200kDa至600kDa之间。在进一步的实施方式中，多糖的分子量是100kDa至1,000kDa；100kDa至900kDa；100kDa至800kDa；100kDa至700kDa；100kDa至600kDa；100kDa至500kDa；100kDa至400kDa；100kDa至300kDa；150kDa至1,000kDa；150kDa至900kDa；150kDa至800kDa；150kDa至700kDa；150kDa至600kDa；150kDa至500kDa；150kDa至400kDa；150kDa至300kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至900kDa；200kDa至800kDa；200kDa至700kDa；200kDa至600kDa；200kDa至500kDa；200kDa至400kDa；200kDa至300；250kDa至1,000kDa；250kDa至900kDa；250kDa至800kDa；250kDa至700kDa；250kDa至600kDa；250kDa至500kDa；250kDa至400kDa；250kDa至350kDa；300kDa至1,000kDa；300kDa至900kDa；300kDa至800kDa；300kDa至700kDa；300kDa至600kDa；300kDa至500kDa；300kDa至400kDa；400kDa至1,000kDa；400kDa至900kDa；400kDa至800kDa；400kDa至700kDa；400kDa至600kDa；500kDa至600kDa.
还原胺化的缀合过程的第二步是使用还原剂还原活化多糖和载体蛋白之间的亚胺(席夫碱)键以形成稳定的共轭键(所谓的还原胺化)。合适的还原剂包括氰基硼氢化物(如氰基硼氢化钠)或硼氢化钠。在一个实施方式中，还原剂是氰基硼氢化钠。
在某些实施方式中，还原胺化反应在非质子溶剂(或非质子溶剂的混合物)中进行。在一个实施方式中，还原反应在DMSO(二甲基亚砜)或DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中进行。如果冻干，则可以使用DMSO或DMF溶剂重构活化多糖和载体蛋白。在一个实施方式中，非质子溶剂是DMSO。
在还原反应结束时，缀合物中可能残留有未反应的醛基，可以使用合适的封端剂将其封端。在一个实施方式中，该封端剂是硼氢化钠(NaBH4)。合适的替代物包括在Bronsted或路易斯酸存在下的三乙酰氧基硼氢化钠或硼氢化钠或硼氢化锌，胺硼烷，例如吡啶硼烷，2-吡啶啉硼烷，2,6-二硼烷-甲醇，二甲胺-硼烷，t-BuMe’PrN-BH3，苄胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)或硼氢化物交换树脂。缀合后(还原反应和任选地加帽)，可以通过本领域技术人员已知的多种技术纯化糖缀合物(相对于多糖-蛋白质缀合物的量富集)。这些技术包括透析、浓缩/渗滤操作、切向流过滤、沉淀/洗脱、柱色谱(离子交换色谱、多峰离子交换色谱、DEAE或疏水性相互作用色谱)和深度过滤。在一个实施方式中，糖缀合物通过渗滤或离子交换色谱或体积排阻色谱纯化。
在非质子溶剂中使用还原胺化制备的糖缀合物通常用于多价肺炎球菌缀合物疫苗中。因此，在某些实施方式中，对于不是所有血清型都在非质子溶剂中制备的多价组合物，其余血清型的还原反应是在水性溶剂中进行(例如，选自PBS(磷酸盐缓冲盐水)、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、Bis-tris，ADA(N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸)、PIPES(哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸))、MOPSO(3-吗啉代-2-羟基丙烷磺酸)、BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、DIPSO(3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙烷-1-磺酸)、MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)、HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-羟基丙磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双(2-羟基-3-丙烷磺酸))、TEA(三乙醇胺)、EPPS(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸酸)、N-二甘氨酸，pH在6.0和8.5、7.0和8.0或7.0和7.5之间)。
能够在非质子溶剂中使用还原胺化制备的肺炎链球菌荚膜多糖-蛋白缀合物包括但不限于血清型：3、6A、6B、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、23F、24F、31、33F、35B和39。能够在非质子溶剂中使用还原胺化制备的肺炎链球菌荚膜多糖-蛋白缀合物包括但不限于血清型：3、6A、6B、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、19A、20、22F、23A、23B、23F、24F、31、33F、35B和39。能够在非质子溶剂中使用还原胺化制备的肺炎链球菌荚膜多糖-蛋白缀合物包括但不限于血清型：3、6A、6B、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、19A、20B、22F、23A、23B、23F、24F、31、33F、35B和39。多糖可以以寡糖形式使用。通过将纯化的多糖片段化(例如，通过水解)方便地形成这些寡糖，通常将其纯化为所需尺寸的片段。
在某些实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化制备一种或多种下述血清型的肺炎球菌多糖-蛋白缀合物：3、6A、6B、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、23F、24F、31、33F、35B和39。在某些实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化制备一种或多种下述血清型的肺炎球菌多糖-蛋白缀合物：3、6A、6B、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、19A、20、22F、23A、23B、23F、24F、31、33F、35B和39。在某些实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化制备一种或多种下述血清型的肺炎球菌多糖-蛋白缀合物：3、6A、6B、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、19A、20B、22F、23A、23B、23F、24F、31、33F、35B和39。在某些实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化制备在多价免疫原性组合物中的每种血清型。在某些实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化将在多价组合物中的一种或多种血清型的多糖缀合，和在水性溶剂中使用还原胺化将一种或多种血清型的多糖缀合。在某些实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化将在多价组合物中的两种或更多种血清型的多糖缀合。在其他实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化将在多价组合物中的三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、十一种或更多种、十二种或更多种、十三种或更多种、十四种或更多种、十五种或更多种、十六种或更多种、十七种或更多种、十八种或更多种、十九种或更多种、二十种或更多种或者二十一种或更多种血清型的多糖缀合。在某些实施方式中，使用可以在非质子溶剂或水性溶剂中的其他化学方法，将在多价组合物中的一种或多种血清型的多糖缀合。
因此，本发明涉及一种多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，每种缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型是如本文所述的(即，在第II节“多价免疫原性组合物”中)，其中来自一种或多种多糖蛋白缀合物的多糖与载体蛋白缀合的缀合反应在非质子溶剂中进行。在某些实施方式中，在多价组合物中至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％的血清型是在非质子溶剂中制备的。其余血清型使用其他化学方法和/或在水性溶剂中制备。
已确定相对于在水性条件下制备的相同缀合物，在多糖-蛋白质缀合物的还原胺化过程中使用DMSO作为溶剂可导致这些血清型出乎意料的优异稳定性和增强的免疫原性(参见美国专利申请系列号62/463,216和62/555,444)。如本文中所示(参见实施例40)，在缀合反应的还原胺化过程中，与利用使用由质子(即，水性)溶剂制备的原料药的疫苗相比，包含使用在非质子溶剂(例如，DMSO)中的还原胺化制备的本发明的肺炎球菌缀合物的药物制剂具有优异的物理和化学稳定性。因此，在一些实施方式中，在多价组合物中的所有肺炎球菌多糖缀合物均在非质子溶剂中制备。
在本发明的某些实施方式中，在组合物中的总多糖浓度是从约0.02至约0.175mg/mL。在本发明的某些实施方式中，在组合物中的总多糖浓度是从约0.03至约0.175mg/mL。在本发明的某些实施方式中，在组合物中的总多糖浓度是从约0.04至约0.175mg/mL。在其他实施方式中，在组合物中的总多糖浓度是从约0.065至约0.085mg/mL、约0.070至约0.080mg/mL、约0.065至约0.080mg/mL、约0.070至约0.085mg/mL、约0.110至约0.128mg/mL、约0.110至约0.175mg/mL、约0.10至约0.175mg/mL、约0.110至约0.170mg/mL、约0.115至约0.15mg/mL、约0.110至约0.15mg/mL、约0.110至约0.125mg/mL、约0.150至约0.170mg/mL、约0.150至约0.165mg/mL、约0.140至约0.170mg/mL、约0.130至约0.170mg/mL、约0.150至约0.175mg/mL、约0.070至约0.170mg/mL、约0.065至约0.175mg/mL或约0.065至约0.180mg/mL。
在本发明的实施方式中，其中在多价免疫原性组合物中的一种或多种或全部多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的，在组合物中的总多糖浓度在37℃下稳定4周或以上、在25℃下稳定4周或以上、在4℃下稳定12周或以上。
在本发明的某些实施方式中，其中在多价免疫原性组合物中的一种或多种或全部多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的，在组合物中全部肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的重均分子量(Mw)(组合物中所有缀合物的平均值)是从约3,500至约4,700kDa、从约3,500至约4,600kDa、从约3,500至约4,500kDa、从约3,500至约4,400kDa、从约3,500至约4,300kDa、从约3,500至约4,200kDa、从约3,600至约4,700kDa、从约3,600至约4,600kDa、从约3,600至约4,500kDa、从约3,600至约4,400kDa、从约3,600至约4,300kDa、从约3,600至约4,200kDa、从约3,700至约4,700kDa、从约3,700至约4,600kDa、从约3,700至约4,500kDa、从约3,700至约4,400kDa、从约3,700至约4,300kDa、从约3,700至约4,200kDa、从约3,800至约4,700kDa、从约3,800至约4,600kDa、从约3,800至约4,500kDa、从约3,800至约4,400kDa、从约3,800至约4,300kDa、从约3,800至约4,200kDa、从约3,900至约4,700kDa、从约3,900至约4,600kDa、从约3,900至约4,500kDa、从约3,900至约4,400kDa、从约3,900至约4,300kDa或从约3,900至约4,200kDa。
在本发明的某些实施方式中，其中在多价免疫原性组合物中的多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的，在组合物中的每种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的Mw(针对单一血清型)是从约1,000至约10,000kDa、从约1,500至约5,500kDa、从约1,500至约5,600kDa、从约1,500至约5,700kDa、从约1,500至约5,800kDa、从约1,500至约5,900kDa、从约1,500至约6,000kDa、从约1,000至约5,500kDa、从约1,000至约5,000kDa、从约1,000至约4,000kDa、从约1,000至约4,500kDa、从约1,000至约4,000kDa或从约1,000至约3,500kDa。在其他实施方式中，组合物中来自单一血清型的缀合物的Mw是约1,000kDa、约1,100kDa、约1,200kDa、约1,300kDa、约1,400kDa、约1,500kDa、约1,600kDa、约1,700kDa、约1,800kDa、约1,900kDa、约2,000kDa、约2,100kDa、约2,200kDa、约2,300kDa、约2,400kDa、约2,500kDa、约2,600kDa、约2,700kDa、约2,800kDa、约2,900kDa、约3,000kDa、约3,100kDa、约3,200kDa、约3,300kDa、约3,400kDa、约3,500kDa、约3,600kDa、约3,700kDa、约3,800kDa、约3,900kDa、约4,000kDa、约4,100kDa、约4,200kDa、约4,300kDa、约4,400kDa、约4,500kDa、约4,600kDa、约4,700kDa、约4,800kDa、约4,900kDa、约5,000kDa、约5,100kDa、约5,200kDa、约5,300kDa、约5,400kDa或约5,500kDa。
在本发明的某些实施方式中，在多价免疫原性组合物中的多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的。在非质子溶剂中(与在质子溶剂中制备的相反)，含有与载体蛋白缀合的更高百分比的肺炎链球菌多糖的组合物可能是优选的。在某些实施方式中，在非质子溶剂中制备的肺炎链球菌血清型特异性缀合物的百分比(由在非质子溶剂中制备的多糖血清型的数量除以多糖血清型的总数计算得出，其中总数包括在非质子溶剂或质子溶剂中制备的那些)可以大于50％、或大于60％、或大于70％、或大于80％、或大于90％或者是100％。
在本发明的某些实施方式中，在组合物中的血清型3多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的，且所述缀合物的Mw是从约1,000至约5,000kDa、1,000至约4,000kDa、或从约1,000至约3,000kDa、、或从约1,000至约2,500kDa、或从约1,000至约2,000kDa。
在本发明的某些实施方式中，在多价免疫原性组合物中的一种或多种或全部多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的，在组合物中肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的数均分子量(Mn)(组合物中所有缀合物的平均值)是从约900至约3,000kDa、从约1,000至约3,000kDa、从约1,000至约2,500kDa、从约1,500至约2,500kDa、从约1,800至约2,500kDa、从约1,900至约2,500kDa或从约2,000至约2,500kDa。
在本发明的某些实施方式中，在多价免疫原性组合物中的一种或多种或全部多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的，在组合物中的每种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的Mn(针对单一血清型)是从约700至约7,000kDa、从约1,000至约6,000kDa、从约1,000至约5,000kDa、从约1,000至约4,000kDa、从约1,000至约3,000kDa、从约900至约5,500kDa、从约900至约5,000kDa、从约900至约4,500kDa、从约900至约4,000kDa、从约900至约3,500kDa或从约900至约3,000kDa。
在本发明的实施方式中，在组合物中肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的Mw和/或Mn在37℃下稳定4周或以上、在25℃下稳定4周或以上和/或在4℃下稳定12周或以上。
在本发明的实施方式中，使用HPSEC UV/MALS/RI确定多糖浓度、Mw和/或Mn。
在本发明的一些实施方式中，在多价免疫原性组合物中的一种或多种或全部多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的，使用本征蛋白荧光光谱法在280纳米(nm)的激发波长下测量的组合物的最大发射从约335nm至约342nm。在一些实施方式中，在37℃下放置至少1周，最大发射保持在从约335nm至约342nm，且荧光强度是稳定的。在一些实施方式中，在37℃下放置1周，最大发射保持在从约335nm至约342nm，且荧光强度是稳定的。
在一些实施方式中，在DMSO中使用还原胺化制备在多价组合物中的所有肺炎球菌多糖缀合物。在某些子实施方式中，包含均使用DMSO制备的多糖缀合物的多价组合物不包含佐剂。
不希望受到任何理论的束缚，使用在DMSO中制备的糖缀合物观察到免疫原性增强的一种可能的机制包括碳水化合物(荚膜多糖)与载体蛋白表面上赖氨酸残基之间的键数量增加，这将导致蛋白与多糖之间产生附加的连接点，以赋予稳定性并抵抗肽碳水化合物键的化学解聚或破坏。参见例如，Hsieh,Characterization of Saccharide-CRM197Conjugate Vaccines in Brown F,Corbel M,Griffiths E(eds):Physico-ChemicalProcedures for the Characterization of Vaccines.Dev.Biol.Basel,Karger,2000,vol 103,pp.93-104。在DMSO溶剂中的缀合过程中产生增加的多糖-蛋白键的另一个益处是能够为成功地将肽-碳水化合物呈递给T细胞提供更多机会。能够意识到的是，由于在人群中的遗传变异性导致与碳水化合物抗原缀合的特定肽序列的装载或结合的能力和敏感性的变化，载体蛋白上附加的连接点将增加抗原呈递细胞(APC)表面上成功进行抗原呈递的机会，从而能够对原本不依赖于T细胞的抗原产生T细胞依赖性应答。通过在DMSO溶剂中缀合观察到免疫原性增强的另一种可能的机制可能是由于CRM197在有机溶剂中变性，这暴露了用于多糖连接的其他赖氨酸，使得在APC表面上糖肽呈递的机会增加，从而对不同肽表位产生T细胞依赖性应答。参见Avci等，2011,Nature Medicine 17:1602-1610。
在缀合物中产生变性的CRM197的有机溶剂中缀合的另一个益处是能够减少针对天然CRM197表位的抗体的免疫干扰。在DMSO溶剂中的缀合过程中产生的增加的多糖-蛋白连接的另一个益处是能够形成较大尺寸的多糖蛋白缀合物，从而增强免疫原性。据信本发明的组合物在激发人应答方面提供了显著的优势。
在某些实施方式中，缀合反应通过还原胺化进行，其中使用镍可提高缀合反应的效率，并有助于去除游离氰化物。已知过渡金属可与氰化物形成稳定的络合物，并且已知可以改善蛋白氨基和甲醛与与氰基硼氢化钠的还原甲基化(S Gidley等，Biochem J.1982,203:331-334；Jentoft等，Anal Biochem.1980,106:186-190)。通过络合残留的抑制性氰化物，镍的添加会增加缀合过程中蛋白的消耗，并导致形成更大的、可能更具免疫原性的缀合物。
氰基硼氢化钠试剂批次中起始氰化物含量的差异也会导致缀合性能不一致，从而导致可变的产品属性(如缀合物尺寸和缀合物Ps与CRM197的比率)。镍的添加通过络合氰化物减少了缀合不一致，消除了氰基硼氢化钠批次之间的差异。
适宜的替代化学方法包括用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸酯(CDAP)活化糖以形成氰酸酯。因此，活化的糖可以直接或通过间隔子(接头)基团与载体蛋白上的氨基偶联。例如，间隔子可以是胱胺或半胱胺，以得到硫醇化的多糖，其可以通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如，使用GMBS)或卤代乙酰化的载体蛋白(例如，使用碘乙酰亚胺(例如，盐酸碘乙乙酰胺)或N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯或SIAB、或SIA或SBAP))反应后获得的硫醚键与载体偶联。优选地，将氰酸酯(任选地通过CDAP化学方法制得)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联，并且使用碳二亚胺(例如，EDAC或EDC)化学方法经由蛋白载体上的羧基将氨基衍生的糖缀合至载体蛋白。在国际专利申请公开号WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/29094；以及Chu等,1983,Infect.Immunity 40:245-256中描述了这样的缀合物。
其他适宜的技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降硼烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。在国际专利申请公开号WO 98/42721中描述了许多。缀合可以涉及羰基接头，其可以通过糖的游离羟基与CDI反应形成(参见Bethell等，1979,J.Biol.Chem.254:2572-4；Hearn等，1981,J.Chromatogr.218:509-18)，然后与蛋白反应形成氨基甲酸酯键。这可能涉及将端基还原为伯羟基，任选地伯羟基的保护/脱保护，伯羟基与CDI反应形成CDI氨基甲酸酯中间体并将CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白上的氨基偶联。
荚膜多糖与载体蛋白缀合后，通过多种技术中的一种或多种纯化多糖-蛋白缀合物(相对于多糖-蛋白缀合物的量富集)。这些技术的实例是本领域技术人员熟知的，并且包括浓缩/渗滤操作、超滤、沉淀/洗脱、柱色谱和深度过滤。参见例如，美国专利号6,146,902。
在将单个糖缀合纯化后，将其复合以配制本发明的免疫原性组合物。将通过单独的方法和原料制备的这些肺炎球菌缀合物配制成单剂量制剂。
表征本发明的糖缀合物的一种替代方法是通过载体蛋白(例如，CRM197)中变得与糖缀合的赖氨酸残基的数目，其可以表征为一系列缀合的赖氨酸(缀合度)。由于与多糖的共价键合，对载体蛋白进行赖氨酸修饰的证据可以使用本领域技术人员已知的常规方法通过氨基酸分析获得。与用于产生缀合物材料的载体蛋白起始材料相比，缀合导致回收的赖氨酸残基数量减少。在一个优选的实施方式中，本发明的糖缀合物的缀合度为2至15之间、2至13之间、2至10之间、2至8之间、2至6之间、2至5之间、2至4之间、3至15之间、3至13之间、3至10之间、3至8之间、3至6之间、3至5之间、3至4之间、5至15之间、5至10之间、8至15之间、8至12之间、10至15之间或10至12之间。在一个实施方式中，本发明糖缀合物的缀合度为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。在一个优选的实施方式中，本发明糖缀合物的缀合度为4至7之间。在一些此类实施方式中，载体蛋白是CRM197。
本发明的糖缀合物还可以通过糖与载体蛋白的比率(Ps:Pr)(重量/重量)来表征。在一些实施方式中，组合物的糖缀合物中多糖与载体蛋白的比率(w/w)为0.5至3.0之间(例如，约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9或约3.0)。在其他实施方式中，糖与载体蛋白的比率(w/w)为0.5至2.5之间、0.5至1.5之间、0.8至2.5之间、0.5至1.0之间、1.0至1.5之间、1.0至2.0之间、0.8至2.4之间、0.8至2.3之间、0.8至2.2之间、0.8至2.1之间、0.8至2.0之间、0.8至1.9之间、0.8至1.8之间、0.8至1.7之间、0.8至1.6之间、0.8至1.5之间、0.8至1.4之间、0.8至1.3之间、0.9至2.4之间、0.9至2.3之间、0.9至2.2之间、0.9至2.1之间、0.9至2.0之间、0.9至1.9之间、0.9至1.8之间、0.9至1.7之间、0.9至1.6之间、0.9至1.5之间、0.9至1.4之间、0.9至1.3之间、0.9至1.2之间、1.0至2.4之间、1.0至2.3之间、1.0至2.2之间、1.0至2.1之间、1.0至2.0之间、1.0至1.9之间、1.0至1.8之间、1.0至1.7之间、1.0至1.6之间、1.0至1.5之间、1.0至1.4之间、1.0至1.3之间或1.0至1.2之间。在进一步的实施方式中，糖与载体蛋白的比率(w/w)为0.8至1.2之间。在一些此类实施方式中，载体蛋白是CRM197。本发明的糖缀合物和免疫原性组合物可包含未与载体蛋白共价缀合但仍存在于糖缀合物组合物中的游离糖。游离糖可以与糖缀合物非共价关联(即，非共价结合，吸附或捕获于其中或与之捕获)。
在特定的实施方式中，对于血清型15A缀合物，糖与载体蛋白的比率(w/w)为从约1.0至约2.0、从约1.25至约1.75或从约1.3至约1.7。在其他实施方式中，对于血清型15A，糖与载体蛋白的比率(w/w)为约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8。
在特定的实施方式中，对于血清型15C缀合，糖与载体蛋白的比率(w/w)为从约1.0至约2.0、从约1.25至约1.75或从约1.3至约1.7。在其他实施方式中，对于血清型15C，糖与载体蛋白的比率(w/w)为约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8。
在特定的实施方式中，对于血清型33F缀合物，糖与载体蛋白的比率(w/w)为从约1.0至约2.0、从约1.25至约1.75或从约1.3至约1.7。在其他实施方式中，对于血清型33F，糖与载体蛋白的比率(w/w)为约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8。
在特定的实施方式中，对于血清型35B缀合物，糖与载体蛋白的比率(w/w)为从约1.25至约2.25、从约1.25至约2.0或从约1.3至约1.8。在其他实施方式中，对于血清型35B，糖与载体蛋白的比率(w/w)为约1.2、1.3、1.3、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0。
在特定的实施方式中，对于血清型24F缀合物，糖与载体蛋白的比率(w/w)为从约0.5至约1.5、从约0.75至约1.25或从约0.8至约1.0。在其他实施方式中，对于血清型24F，糖与载体蛋白的比率(w/w)为约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0。
在一个优选的实施方式中，与多糖总量相比，糖缀合物包含少于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％的游离多糖。在一个优选的实施方式中，与多糖总量相比，糖缀合物包含少于约25％的游离多糖。在一个优选的实施方式中，与多糖总量相比，糖缀合物包含少于约20％的游离多糖。在一个优选的实施方式中，与多糖总量相比，糖缀合物包含少于约15％的游离多糖。
IV.使用方法
本发明的实施方式还包括一种或多种本文所述的多价免疫原性组合物(i)用于，(ii)作为药物或组合物用于，或者(iii)制备药物用于：(a)疗法(例如，人体的)；(b)药物；(c)抑制肺炎链球菌感染；(d)诱导针对肺炎链球菌的免疫应答或保护性免疫应答；(e)预防肺炎链球菌感染；(f)防止肺炎链球菌感染复发；(g)减少与肺炎链球菌感染有关的病理症状的进展、发病或严重程度，包括预防相关的并发症，如脑损伤、听力丧失和癫痫发作；(h)降低肺炎链球菌感染的可能性，或(i)治疗、预防或延迟一种或多种肺炎球菌疾病的发作、严重程度或进展，包括但不限于：肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌菌血症、肺炎球菌性脑膜炎、中耳炎和鼻窦炎。在这些用途中，本发明的多价肺炎球菌多糖-缀合物组合物可以任选地与一种或多种佐剂联用，或不使用佐剂。
因此，本发明提供了用于预防性治疗(即，保护)肺炎链球菌感染或肺炎链球菌疾病的方法，包括向需要治疗的患者施用一种或多种本发明的多价免疫原性肺炎球菌多糖-蛋白缀合物组合物。
本发明的组合物和制剂可以用于保护或治疗易于感染(例如，肺炎球菌感染)的人，通过经全身性或粘膜途径施用本发明组合物的方式。
在一个实施方式中，本发明提供了一种诱导对肺炎链球菌的免疫应答的方法，包括向患者施用免疫学有效量的本发明的多价免疫原性组合物。在另一个实施方式中，本发明提供了一种针对肺炎球菌感染接种人的方法，包括向人施用免疫学有效量的本发明的多价免疫原性组合物的步骤。
因此，在一个方面中，本发明提供了一种用于(1)在人类患者中诱导免疫应答，(2)在人类患者中诱导保护性免疫应答，(3)针对肺炎链球菌感染免疫接种人类患者，或(4)在人类患者中降低肺炎链球菌感染的可能性的方法，所述方法包括向患者施用本发明的多价免疫原性组合物(即，本文所述的任何多价免疫原性组合物，如在第II节标题“多价免疫原性组合物”中所述的多价免疫原性组合物，如上所述)。
在一个实施方式中，本发明提供了一种在18岁及以上成人中预防肺炎球菌性肺炎和侵袭性疾病的方法。在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于预防由24种肺炎链球菌菌株(3、6A、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、19A、20A、20B、22F、23A、23B、24F、31、33F和35B)引起的肺炎球菌性肺炎和侵袭性疾病的方法。
在上述方法的一个实施方式中，组合物包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包含一组血清型：3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A。在上述方法的一个实施方式中，组合物包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包含一组血清型：3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20。在上述方法的一个实施方式中，组合物包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包含一组血清型：3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20B。在上述方法的另一个实施方式中，组合物还包含血清型6A或6C的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物。
已经发现，包含血清型6A的肺炎球菌缀合物疫苗可以提供针对血清型6C的一些交叉保护作用(Cooper等，Vaccine 29(2011)7207-7211)。因此，在上述方法的一些实施方式中，本发明还提供了不包含血清型6C，但取而代之包含血清型6A或血清型6A和6B的多价免疫原性组合物的用途。在其他实施方式中，免疫原性组合物包含血清型6A、6B和6C的肺炎球菌缀合物。在上述方法的特定实施方式中，肺炎链球菌的血清型包含选自下组的一组血清型：
I-a)3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A；
I-b)3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A；
I-c)3、7F、19A、22F、33F、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A；和
I-d)3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A。
在上文所述血清型组(I-a至I-d)的特定实施方式中，血清型20或20B可以替代血清型20A。
在上文所述方法进一步的实施方式中，肺炎链球菌的血清型包含选自下组的一组血清型：
II-a)15A、16F、23A、23B、24F、31和35B；
II-b)6A、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B；
II-c)6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B；
II-d)6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B；
II-e)15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A；
II-f)6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A；
II-g)6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A；和
II-h)6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A。
在上文所述血清型组(II-e至IIh)的特定实施方式中，血清型20或20B可以替代血清型20A。
在上文所述方法进一步的实施方式中，肺炎链球菌的血清型包含实施方式I-a)、II-a)或II-e)中任一项所示的一组血清型，以及还包含血清型6A、6B和6C。
还已发现，包含血清型10A的肺炎球菌缀合物疫苗可以针对血清型39提供一些交叉保护作用(参见WO 2017/085586)。因此，在上述方法的一些实施方式中，本发明还提供了不包含血清型10A，但取而代之的是包含血清型39的多价免疫原性组合物的用途。在其他实施方式中，免疫原性组合物包含肺炎球菌血清型10A和39的缀合物。在上述方法的特定实施方式中，肺炎链球菌的血清型包含选自下组的一组的血清型：
III-a)3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F和20A；
III-b)3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F和20A；
III-c)3、7F、19A、22F、33F、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F和20A；
III-d)3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F和20A；
III-e)15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F和20A；
III-f)6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F和20A；
III-g)6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F和20A；和
III-h)6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、39、11A、12F、15C、17F和20A。在上文所述血清型组(II-a至III-h)的特定实施方式中，血清型20或20B可以替代血清型20A。
在上文所述方法进一步的实施方式中，肺炎链球菌的血清型包含实施方式III-a)至III-h)中任一项所示的一组血清型，以及还包含血清型10A。
还已发现，包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖的免疫原性缀合物可以针对血清型15C和/或血清型15A提供一些交叉保护作用(参见WO 2015/110942)。因此，在上述方法的一些实施方式中，本发明还提供了不包含血清型15C(或去-O-乙酰化15B)，但取而代之的是包含血清型15B(即，未被去-O-乙酰化的血清型15B多糖)的多价免疫原性组合物的用途。在其他实施方式中，免疫原性组合物包含肺炎链球菌血清型15B和15C(或去-O-乙酰化15B)的缀合物。在上述方法的特定实施方式中，肺炎链球菌的血清型包含选自下组的一组的血清型：
IV-a)3、7F、19A、22F、33F、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20A；
IV-b)3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20A；
IV-c)3、7F、19A、22F、33F、6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20A；
IV-d)3、7F、19A、22F、33F、6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20A；
IV-e)15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20A；
IV-f)6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20A；
IV-g)6A、6B、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20A；和
IV-h)6C、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20A。
在上述血清型组(IVa至IVh)的特定实施方式中，血清型20或20B可以替代血清型20A。
在上述方法进一步的实施方式中，肺炎链球菌的血清型包含实施方式IV-a)至IV-h)中任一项所示的一组血清型，以及还包含血清型15C(和/或去-O-乙酰化15B)。
本发明的组合物可用于在此前已接受多价肺炎球菌疫苗的患者中提供针对肺炎链球菌的补充保护的方法。在这种用途中，本发明的组合物可以提供针对患者先前未接种过的特定肺炎链球菌血清型的保护，可以提供针对患者先前已经接种过的肺炎链球菌血清型的附加保护，或者可以提供针对患者先前未接种过的肺炎链球菌血清型和患者先前已接种过的肺炎链球菌血清型两者的保护。
因此，本发明提供了在患者中诱导针对肺炎链球菌的免疫应答、接种疫苗或诱导保护性免疫应答的方法，所述方法包括向患者施用多价免疫原性组合物，所述组合物包含多价肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述多糖蛋白缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述患者此前已针对肺炎链球菌进行过免疫接种。在本发明这一方面的实施方式中，多价免疫原性组合物可以是本文所述的任何多价免疫原性组合物。在本发明方法的特定实施方式中，向此前已使用多价肺炎球菌疫苗治疗的患者施用多价免疫原性组合物。多价免疫原性疫苗可以是用于预防由一种以上肺炎链球菌的血清型引起的肺炎球菌疾病的任何疫苗。
在上述方法的特定实施方式中，患者此前已使用多价肺炎球菌疫苗进行了治疗，所述疫苗适用于预防由选自下组的肺炎链球菌血清型引起的肺炎球菌疾病：
a)4、6B、9V、14、18C、19F和23F；
b)4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F和19A；
c)1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F；
d)4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F和33F；
e)4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20；和
f)4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F、33F、8、10A、11A、12F和15B。
在上述方法的特定实施方式中，多价肺炎球菌疫苗包含下述肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20A。在上述方法的特定实施方式中，多价肺炎球菌疫苗包含下述肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20。在上述方法的特定实施方式中，多价肺炎球菌疫苗包含下述肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20B。
在上述方法的特定实施方式中，多价肺炎球菌疫苗包含多种多糖蛋白缀合物，其中所述多糖蛋白缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖。在其他实施方式中，多价肺炎球菌疫苗包含不与载体蛋白缀合的多种肺炎链球菌荚膜多糖。
在上述方法的其他实施方式中，患者此前已使用13(肺炎球菌13价缀合物疫苗[白喉CRM197蛋白],Pfizer,Inc.,Philadelphia,PA,USA)治疗。
在上述方法进一步的实施方式中，患者此前已使用23(多价肺炎球菌疫苗，Merck&Co.,Inc.,Kenilworth,NJ,USA)治疗。
在上述方法另外进一步的实施方式中，患者此前已使用SYNFLORIXTM(肺炎球菌多糖缀合物疫苗(吸附的)，GlaxoSmithKline Biologicals s.a.,Rixensart,Belgium)治疗。
在上述方法的实施方式中，根据由医学专业人员(例如，医师)提供的治疗方案，在患者接受多价肺炎球菌疫苗之后的任何时间，向患者施用本发明的多价免疫原性组合物。在特定实施方式中，在患者已接受多价肺炎球菌疫苗后从1个月至5年向患者施用本发明的多价免疫原性组合物，或者从1个月至1年、从1个月至2年、从1个月至3年、从1个月至4年、从1个月至6个月、从2个月至6个月、从2个月至1年、从1年至5年、从6个月至5年、从6个月至4年、从6个月至3年、从6个月至2年、从6个月至1年、从1年至4年、从1年至3年或从1年至2年。在进一步的实施方式中，在患者已接受多价肺炎球菌疫苗后约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约1年、约1.25年、约1.5年、约1.75年、约2年、约2.25年、约2.5年、约2.75年、约3年、约3.25年、约3.5年、约3.75年、约4年、约4.25年、约4.5年、约4.75年或约5年向患者施用多价免疫原性组合物。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种用于(1)在人类患者中诱导免疫应答，(2)在人类患者中诱导保护性免疫应答，(3)针对肺炎链球菌感染向人类患者免疫接种，或(4)在人类患者中降低肺炎链球菌感染的可能性的方法，所述方法包括以任何顺序向患者施用本发明的多价免疫原性组合物和施用多价肺炎球菌疫苗。多价肺炎球菌疫苗可以是用于预防由一种以上肺炎链球菌的血清型引起的肺炎球菌疾病的任何疫苗。
在上述方法的特定实施方式中，使用本发明的多价免疫原性组合物和多价肺炎球菌疫苗对患者进行治疗，所述疫苗用于预防由选自下组的肺炎链球菌血清型引起的肺炎球菌疾病：
a)4、6B、9V、14、18C、19F和23F；
b)4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F和19A；
c)1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F；
d)4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F和33F；
e)4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20；和
f)4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F、33F、8、10A、11A、12F和15B。
在上述方法的特定实施方式中，多价肺炎球菌疫苗包含下述肺炎链球菌血清型的荚膜多糖：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20A。
在上述方法的特定实施方式中，多价肺炎球菌疫苗包含多种多糖蛋白缀合物，其中所述多糖蛋白缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖。在其他实施方式中，多价肺炎球菌疫苗包含不与载体蛋白缀合的多种肺炎链球菌荚膜多糖。
在上述方法的其他实施方式中，以任何顺序，使用本发明的多价免疫原性组合物和使用13(肺炎球菌13价缀合物疫苗[白喉CRM197蛋白],Pfizer,Inc.,Philadelphia,PA,USA)对患者进行治疗。在一个实施方式中，先向患者施用13，再向患者施用本发明的多价免疫原性组合物。在替代实施方式中，先向患者施用本发明的多价免疫原性组合物，再施用13。
在上述方法进一步的实施方式中，以任何顺序，使用本发明的多价免疫原性组合物和使用23(多价肺炎球菌疫苗，Merck&Co.,Inc.,Kenilworth,NJ,USA)对患者进行治疗。在一个实施方式中，先向患者施用23，再向患者施用本发明的多价免疫原性组合物。在替代实施方式中，先向患者施用本发明的多价免疫原性组合物，再施用23。
在上述方法另外进一步的实施方式中，以任何顺序，使用本发明的多价免疫原性组合物和使用使用SYNFLORIXTM(肺炎球菌多糖缀合物疫苗(吸附的)，GlaxoSmithKlineBiologicals s.a.,Rixensart,Belgium)对患者进行治疗。在一个实施方式中，先向患者施用SYNFLORIXTM，再向患者施用本发明的多价免疫原性组合物。在替代实施方式中，先向患者施用本发明的多价免疫原性组合物，再向施用SYNFLORIXTM。
在上述方法的一些实施方式中，多价免疫原性组合物和多价肺炎球菌疫苗是并行(concurrently)施用的。如在本文中所使用的，“并行施用”不限于两种组合物同时施用，还包括以任何顺序一个接一个地施用。在一些实施方式中，多价免疫原性组合物和多价肺炎球菌疫苗通过肌内或皮下施用向不同解剖部位(例如，两个不同手臂)施用。
在上述方法的一些实施方式中，本发明的多价免疫原性组合物和多价肺炎球菌疫苗的施用之间的时间量是从约4周至约1年。在替代实施方式中，时间量是从约1个月至约5年。
在一个实施方式中，先向患者施用多价肺炎球菌疫苗，再施用本发明的多价免疫原性组合物。在替代实施方式中，先向患者施用本发明的多价免疫原性组合物，再施用多价肺炎球菌疫苗。
还提供了一种在患者中针对肺炎链球菌诱导免疫应答、免疫接种或诱导保护性免疫应答的方法，包括：
(1)向患者施用多价免疫原性组合物，所述组合物包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述多糖蛋白缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，
(2)等待过去预定的时间量，和
(3)向患者施用多价肺炎球菌疫苗。在这种方法中，多价免疫原性组合物可以包含本文所示的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的任何组合，和多价肺炎球菌疫苗可以是用于预防由一种以上肺炎链球菌的血清型引起的疾病的任何疫苗。
本发明还提供了一种在患者中针对肺炎链球菌诱导免疫应答、免疫接种或诱导保护性免疫应答的方法，包括：
(1)向患者施用多价肺炎球菌疫苗，
(2)等待过去预定的时间量，和
(3)向患者施用多价免疫原性组合物，所述组合物包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述多糖蛋白缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖。
在这种方法中，多价免疫原性组合物可以包含本文所示的肺炎链球菌多糖蛋白的任何组合，和多价肺炎球菌疫苗可以是用于预防由一种以上肺炎链球菌的血清型引起的疾病的任何疫苗。
在上述方法的一些实施方式中，多价肺炎球菌疫苗包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述多糖蛋白缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖。在替代实施方式中，多价肺炎球菌疫苗包含不与载体蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜多糖。
在本发明方法的任何实施方式中(即，本文所述的任何方法)，该方法还可以包括向患者施用一个或多个其他剂量的本发明的多价免疫原性组合物。在这种方法中，在接受第一剂本发明的多价免疫原性组合物之前，患者可以已接受多价肺炎球菌疫苗(如上文所述)，或者在接受本发明的多价免疫原性组合物之前患者可以未针对肺炎链球菌进行过免疫接种。因此，在一个实施方式中，向已接受过用于预防由肺炎链球菌引起的肺炎球菌疾病的多价肺炎球菌疫苗的患者施用两剂或更多剂本发明的多价免疫原性组合物。在替代实施方式中，向此前未使用过用于预防肺炎球菌疾病的任何疫苗进行治疗的患者施用两剂或更多剂本发明的多价免疫原性组合物。
在上述方法的实施方式中，两剂或更多剂是相同的本发明的多价免疫原性组合物。在替代实施方式中，两剂或更多剂是不同的本发明的多价免疫原性组合物。
在任何这些方法的特定实施方式中，向患者施用两剂、三剂或四剂本发明的多价免疫原性组合物。在特定实施方式中，患者是免疫功能低下的(例如，在干细胞移植后采用免疫抑制方案)且剂量数是三剂。
在一些实施方式中，每剂本发明的多价免疫原性组合物的施用之间的时间量是从约4周至约1年。在替代实施方式中，每剂本发明的多价免疫原性组合物的施用之间的时间量是从约1个月至约5年。
在本发明任何方法的实施方式中，使用一种或多种本发明的组合物治疗的患者是人。在某些实施方式中，人患者是学步儿童(约12至24个月)或幼儿(约2至5岁)。本发明的组合物也适用于年龄较大的儿童、青少年和成人(例如18至45岁、18至50岁、18至55岁、18至60岁或18至65岁)。在本发明任何方法的其他实施方式中，患者的年龄是约2岁至约18岁。在本发明任何方法进一步的实施方式中，患者的年龄是18岁或以上。
在本发明方法进一步的实施方式中，人类患者是老年人。在本发明任何方法的一些实施方式中，患者的年龄是50岁或以上。在本发明任何方法的一些实施方式中，患者的年龄是55岁或以上。在本发明任何方法的一些实施方式中，患者的年龄是60岁或以上。在本发明任何方法另外进一步的实施方式中，患者的年龄是65岁或以上。在本发明任何方法的其他实施方式中，患者的年龄是70岁或以上。
在本发明任何方法的一些实施方式中，使用本发明免疫原性组合物治疗的患者是免疫功能低下的。
在本发明任何方法的一些实施方式中，多价免疫原性组合物与流感疫苗随附(concomitantly)施用。在某些实施方式中，流感疫苗是“高级流感疫苗”，是针对老年人(例如，年龄在65岁或以上的人)的高剂量流感疫苗。
本发明提供了一种在患者中针对肺炎球菌感染诱导保护性免疫应答的方法，包括向患者施用免疫学有效量的任何本文所述的多价免疫原性肺炎球菌多糖-蛋白缀合物组合物的步骤。可以通过标准研究确定特定疫苗(即，多价免疫原性组合物)的最佳成分量，这些标准研究包括在受试者中观察适当的免疫应答。例如，在另一个实施方式中，通过从动物研究到人数据的外推确定人免疫接种的剂量。在另一个实施方式中，剂量是根据经验确定的。
本发明的方法可用于预防和/或减少由微生物(例如，肺炎链球菌)引起的原发性临床综合征，包括侵入性感染(脑膜炎、肺炎和菌血症)和非侵入性感染(急性中耳炎和鼻窦炎)。
本发明组合物的施用可以包括以下一种或多种：通过肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或通过粘膜施用至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。在一个实施方式中，鼻内施用可用于治疗肺炎或中耳炎(因为可以更有效地预防肺炎球菌的鼻咽运输，因而可以在早期减轻感染)。在特定的实施方式中，通过肌内或皮下施用向患者施用本发明的组合物。
为了描述和公开可能与本发明结合使用的方法和材料，本文提及的所有出版物均通过引用并入本文。
已经参考附图描述了本发明的不同实施方式，应当理解，本发明不限于那些精确的实施方式，并且在不背离所附权利要求书中所限定的本发明的范围或精神的情况下，本领域技术人员可以在其中进行各种改变和修改。
下列实施例说明但不限制本发明。
实施例
实施例1
肺炎链球菌荚膜多糖的制备
培养肺炎球菌的方法是本领域众所周知的。参见例如Chase，1967，Methods ofImmunology and Immunochemistry 1:52。制备肺炎球菌荚膜多糖的方法也是本领域众所周知的。参见例如欧洲专利号EP 0 497 524 B1。下文所述的方法通常遵循欧洲专利号EP 0497 524 B1中所述的方法，并且通常适用于所有肺炎球菌血清型。
血清型6C、23B和31的肺炎球菌菌株的分离株(isolate)从美国疾病预防与控制中心(Atlanta,GA)获得。血清型3、8、10A、11A、12F、15B、22F和33F的菌株从宾夕法尼亚大学获得(Robert Austrian博士)。血清型17F和19A的菌株从FDA生物制品办公室获得(JohnRobbins博士)。血清型7F从从纽约州立大学下州医学中心获得(Gerald Schiffman博士)。上面未列出的肺炎球菌血清型分离株从美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(Manassas,VA)获得。如果需要，可以使用特定的抗血清根据Quelling反应区分亚型。参见例如，美国专利号5,847,112。通过在琼脂平板上分两个阶段连续铺板来进一步克隆分离所获得的分离株，琼脂平板由无动物成分的培养基组成，所述培养基含有大豆蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖而不含血红素(hemin)。对于血清型7F，所使用的琼脂平板还含有血红素。使用含有大豆蛋白胨、酵母提取物、HEPES、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸钾、葡萄糖和甘油的无动物成分培养基在液体培养中进一步扩增每种血清型的克隆分离株以制备预主细胞库(pre-master cell bank)。
每种血清型的肺炎球菌多糖的产生由细胞扩增和分批生产发酵组成，然后在下游纯化前进行化学灭活。使用装有预先消毒的无动物成分的生长培养基的摇瓶或培养瓶扩增来自各种血清型的解冻的细胞库小瓶，所述培养基含有大豆蛋白胨或大豆蛋白胨超滤液，酵母提取物或酵母提取物超滤液，HEPES，氯化钠，碳酸氢钠，磷酸钾和葡萄糖。细胞扩增培养物在密封的摇瓶或培养瓶中生长，以在温度和搅拌控制下最小化气体交换。对于血清型3、7F、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、19A、20、22F和33F，用含有相同培养基的发酵罐将解冻的细胞库小瓶扩增。在这些血清型的细胞扩增过程中，控制温度、pH、压力和搅拌。气流覆盖也得到控制，因为不使用鼓泡(sparging)。在达到指定的培养密度后(通过600nm的光密度测量)，将一部分细胞扩增培养物转移至含有预先灭菌的无动物成分的生长培养基的生产发酵罐中，所述培养基含有大豆蛋白胨或大豆蛋白胨超滤液，酵母提取物或酵母提取物超滤液，氯化钠，磷酸钾和葡萄糖。控制温度、pH、压力和搅拌。气流覆盖也得到控制，因为不使用鼓泡。
当葡萄糖几乎耗尽时，通过添加化学灭活剂苯酚终止分批发酵。加入纯苯酚至终浓度为0.8-1.2％，以灭活细胞并从细胞壁释放荚膜多糖。初级(primary)灭活发生在发酵罐中指定的时间内，其中继续控制温度和搅拌。在初级灭活后，将批料转移到另一个容器中，其中在受控的温度和搅拌下持续另外的指定时间以完全灭活。这可以通过微生物铺板技术或通过验证苯酚浓度和指定的时间来确认。然后纯化灭活的培养基(broth)。
实施例2
肺炎球菌多糖的纯化
肺炎球菌多糖的纯化由多次离心、深度过滤、浓缩/渗滤操作和沉淀步骤组成。除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。
用阳离子聚合物(如BPA-1000、(Baker Hughes Inc.,Houston,TX)、Spectrum 8160、聚(乙烯亚胺)和Millipore pDADMAC)将来自肺炎链球菌的发酵罐培养物的灭活培养基絮凝。阳离子聚合物与杂质蛋白、核酸和细胞碎片结合。在絮凝步骤和老化阶段之后，通过离心和多次深度过滤步骤除去絮凝的固体。浓缩澄清的培养基，并使用100kDa至500kDa MWCO(分子量截留值)过滤器进行渗滤。渗滤是使用Tris，MgCl2缓冲液和磷酸钠缓冲液完成的。渗滤去除了残留的核酸和蛋白质。
通过用变性的醇和/或异丙醇使醋酸钠和苯酚中的多糖再沉淀，可以进一步去除杂质。在苯酚沉淀步骤中，将磷酸钠盐水缓冲液中的醋酸钠和苯酚(液化酚或固体酚)装入渗滤过的渗余物(retentate)中。然后分两个阶段进行多糖的酒精分馏。在第一阶段中，将低百分比的乙醇添加到制剂中，以沉淀细胞碎片和其他不需要的杂质，而粗多糖保留在溶液中。经由离心和之后的深度过滤步骤除去杂质。然后通过向批料中添加另外的异丙醇或变性醇从溶液中回收多糖。通过离心回收沉淀的多糖沉淀，将其研磨并干燥为粉末，并在-70℃下冷冻保存。
实施例3
通过NMR检测的某些肺炎球菌血清型的结构鉴定(identity)分析
通过将多糖粉末以5mg粉末/mL的溶液溶解在含有0.01％二甲基亚砜(DMSO)和0.01％2,2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸-d6钠盐(DSS-d6)的氧化氘(D2O)中来制备NMR分析样品。DMSO是用于定量分析的内标物，而DSS-d6用于将化学位移标度设置为0ppm。在50℃下获取一维质子NMR数据集，然后将包含异头(anomeric)共振的一部分光谱选择性地以x，y坐标写入ASCII文件，以便使用Microsoft Excel工作簿进行分析。然后，在参考数据库中将Y坐标(即，光谱图谱)与荚膜细菌多糖的光谱图谱进行比较。参考图谱以类似的方式在每种血清型的选定制剂上生成，此后称为参考批次。对样本和参考光谱的y值进行配对比较，以产生相关系数(ρx,y)作为光谱之间相似度的量度。任何参考光谱≥0.95的ρ值均被视为多糖结构的阳性鉴定。
图1-4分别提供了来自肺炎链球菌血清型6C、15A、去O-乙酰化15B和35B的荚膜多糖的600MHz一维1H NMR谱。在图5-8中分别提供了用于鉴定肺炎链球菌血清型6C、15A、去-O-乙酰化15B和35B血清型的1H NMR鉴定区域。
肺炎链球菌血清型去O-乙酰化15B和15C的荚膜多糖的结构
在新西兰白兔中使用PCV21进行了免疫原性研究(见下文的实施例43)。在这些研究中，在多价组合物中使用去-O-乙酰化多糖血清型15B替代血清型15C。进行NMR研究以证实去-O-乙酰化15B多糖等同于血清型15C多糖。
荚膜多糖血清型之间的结构差异显示为NMR光谱中的化学位移差异。异头区域(约4.4ppm至6.0ppm)对多糖重复单元中的每个结构特征均敏感。立体化学、单糖组成、O-乙酰化和糖苷键的差异会影响异头信号的化学位移，从而使每种血清型的这个光谱区域都保持独特。对于去O-乙酰化血清型15B多糖，完整的1H NMR光谱与血清型15C多糖的1H NMR光谱相同，表明两种多糖的重复单元均由相同单糖取代基和糖苷键位点组成(见图9B-9C和10B-10C)。还清楚地表明，去-O-乙酰化步骤除去了存在于15B多糖中的O-乙酸酯基团，并且基本上没有观察到剩余的O-乙酸酯基团(见图10A-10F)。
实施例4
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型3缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在二甲基亚砜(DMSO)中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为380bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.25摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行12小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以2mg Ps/mL、蔗糖浓度为10％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到1.0g Ps/L的多糖浓度和1.3的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行1小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1.6小时。将该批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表1：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型3缀合物的属性
实施例5
使用DMSO缀合制备用于单价研究的血清型6C缀合物
将多糖溶解，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将经过滤的溶解的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.1摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到2.2g Ps/L的多糖浓度和1.4的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行15小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育3小时。将该批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表2：来自DMSO缀合的用于单价研究的血清型6C缀合物的属性
实施例6
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型6C缀合物
将多糖溶解，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将经过滤的溶解的多糖浓缩并使用10k Da NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.10摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到1.9g Ps/L的多糖浓度和1.4的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行15小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育3小时。将该批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表3：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型6C缀合物的属性
使用DMSO缀合制备用于单价研究的血清型6A缀合物
将多糖溶解，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为200bar/通过5次。将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.10摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到1.5g Ps/L的多糖浓度和1.4的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行15小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育3小时。将该批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表3a：来自DMSO缀合的用于单价研究的血清型6A缀合物的属性
实施例7
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型7F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为150bar/通过7次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.24摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在4℃下进行4小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到2.6g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行4小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育3小时。将该批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表4：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型7F缀合物的属性
实施例8
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型8缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为600bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.18摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行4小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到4.0g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。共混后，在22℃下缀合反应进行2小时。未向缀合反应中添加氰基硼氢化钠，因为已观察到氰基硼氢化钠的添加可能在血清型8的缀合反应过程中导致不可逆的沉淀。从反应中省略氰基硼氢化钠可避免沉淀，而不会显著影响缀合物的属性。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。将该批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表5：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型8缀合物的属性
实施例9
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型9N缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为250bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.16摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行4小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到3.25g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行1小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。将该批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表6：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型9N缀合物的属性
实施例10
使用DMSO缀合制备用于单价研究的血清型10A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为200bar/通过5次，随后控制为600bar/通过5次，以达到目标分子量。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.15摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到5.0g Ps/L的多糖浓度和2.0的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行4小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。将该批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤(使用0.5微米预滤器)，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表7：来自DMSO缀合的用于单价研究的血清型10A缀合物的属性
实施例11
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型10A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为600bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.16摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到4.0g Ps/L的多糖浓度和1.75的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行4小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。将该批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤(使用0.5微米预滤器)，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表8：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型10A缀合物的属性
实施例12
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型11A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。通过将乙酸添加至200mM，通过酸水解减小溶解的多糖尺寸，在92℃下孵育75分钟，然后通过添加冷的磷酸钾pH 7缓冲液至400mM进行中和。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.13摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别再溶解在等体积的含25mM氯化钠的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到3.5g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行4小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。将该批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤(使用0.5微米预滤器)，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表9：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型11A缀合物的属性
实施例13
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型12F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。通过将乙酸添加至200mM，通过酸水解减小溶解的多糖尺寸，在90℃下孵育45分钟，然后通过添加冷的磷酸钾pH 7缓冲液至400mM进行中和。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.26摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别再溶解在等体积的含25mM氯化钠的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到3.0g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行4小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育3小时。将该批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表10：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型12F缀合物的属性
实施例14
使用DMSO缀合制备用于单价研究的血清型15A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为200bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元1.75摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行20小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别再溶解在等体积的含25mM氯化钠的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到6.0g Ps/L的多糖浓度和2.0的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行2.5小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。将该批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤(使用0.5微米预滤器)，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表11：来自DMSO缀合的用于单价研究的血清型15A缀合物的属性
实施例15
使用水性缀合制备用于15A/B/C交叉保护研究的血清型15A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。然后在水性反应混合物中使用氯化镍将纯化的CRM197与活化的多糖缀合，并在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为200bar/通过5次，以达到目标分子量。将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.45摩尔偏高碘酸钠。氧化反应在22℃下进行20小时。将活化产物用使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。通过将超滤产物调节至22℃和pH 5以实现进一步的活化。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液进行活化，每摩尔多糖重复单元加入2.0摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行20小时。将第二个活化产物用使用10kDaNMWCO切向流超滤膜用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将氧化的多糖溶液与水和1.5M磷酸钾(pH 6.0)混合。选择的缓冲液pH值是为了提高缀合反应过程中活化多糖的稳定性。将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197进行0.2微米过滤，并与缓冲的多糖溶液合并，多糖与CRM197的质量比为0.6。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。多糖和磷酸盐的浓度分别为9.75g/L和100mM。选择多糖浓度以控制所得缀合物的尺寸。使用100mM氯化镍溶液将氯化镍添加至约2mM。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)。缀合在10℃下进行148小时，以最大程度地消耗多糖和蛋白。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，将批料稀释至多糖浓度约为3.0g/L，冷却至2-8℃，并进行1.2微米过滤。将批料使用100kDa NMWCO切向流超滤膜在2-8℃下用100mM磷酸钾(pH 7.0)进行渗滤。然后，将在渗余物中回收的批料稀释至约2.0g多糖/L，并通过添加1.2M碳酸氢钠(pH 9.4)进行pH调节。加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)。随后加入1.5M磷酸钾(pH 6.0)。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM L-组氨酸进行渗滤。将聚山梨醇酯20以0.05％(w/v)的浓度添加至渗余物批料中，然后将该批料进行0.2微米过滤(使用0.5微米的预滤器)。
用另外的含0.03％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH7.0)缓冲液中的10mML-组氨酸将批料调节至1.0g/L的多糖浓度。将批料分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表12：来自水性缀合的用于15A/B/C交叉保护研究的血清型15A缀合物的属性
实施例16
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型15A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为200bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元1.75摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行20小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的已预热至34℃的DMSO中。将多糖溶液使用氯化钠加标至浓度为50mM。将多糖和CRM197溶液共混，以达到5.0g Ps/L的多糖浓度和2.0的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在34℃下缀合进行2小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表13：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型15A缀合物的属性
实施例17
使用DMSO缀合制备用于15A/B/C交叉保护研究的血清型15B缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为300bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.20摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行4小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到3.0g Ps/L的多糖浓度和2.0的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行5小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤(使用0.5微米的预滤器)，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表14：来自DMSO缀合的用于15A/B/C交叉保护研究的血清型15B缀合物的属性
实施例18
使用DMSO缀合制备用于单价研究和15A/B/C交叉保护研究的血清型15C缀合物
将来源于肺炎链球菌血清型15B的多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，进行温和的碱水解以释放O-乙酰基，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小、碱水解和氧化
将纯化的血清型15B肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为300bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
将多糖溶液加热至60℃，并加入碳酸氢钠pH 9缓冲液至终浓度50mM。将批料在60℃下混合孵育13小时以释放O-乙酰基。加入磷酸钾pH 6缓冲液至终浓度136mM以中和pH，并将溶液冷却至环境温度。然后将溶液浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.20摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到3.0g Ps/L的多糖浓度和2.0的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行4小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤(使用0.5微米的预滤器)，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表15：来自DMSO缀合的用于单价研究和15A/B/C交叉保护研究的血清型15C缀合物的属性
实施例19
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型15C缀合物
将来源于肺炎链球菌血清型15B的多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，进行温和的碱水解以释放O-乙酰基，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小、碱水解和氧化
将纯化的血清型15B肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为300bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
将多糖溶液加热至60℃，并加入碳酸氢钠pH 9缓冲液至终浓度50mM。将批料在60℃下混合孵育13小时以释放O-乙酰基。加入磷酸钾pH 6缓冲液至终浓度136mM以中和pH，并将溶液冷却至环境温度。然后将溶液浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.20摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到3.0g Ps/L的多糖浓度和1.75的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行8小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤(使用0.5微米的预滤器)，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表16：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型15C缀合物的属性
实施例20
使用水性缀合制备用于单价研究的血清型16F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。然后在水性反应混合物中使用氯化镍将纯化的CRM197与活化的多糖缀合，并在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为200bar/通过5次，随后为500bar/通过5次，以达到目标分子量。然后，将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.15摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将氧化的多糖溶液与水和1.5M磷酸钾(pH 7.0)混合。选择的缓冲液pH值是为了提高缀合反应过程中活化多糖的稳定性。将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197进行0.2微米过滤，并与缓冲的多糖溶液合并，多糖与CRM197的质量比为0.7。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。多糖和磷酸盐的浓度分别为7.5g/L和100mM。选择多糖浓度以控制所得缀合物的尺寸。然后将溶液进行0.2微米过滤。使用100mM氯化镍溶液将氯化镍添加至约2mM。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)。缀合在22℃下进行122小时，以最大程度地消耗多糖和蛋白。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，将批料稀释至多糖浓度约为3.0g/L，冷却至2-8℃，并进行1.2微米过滤。将批料使用100kDa NMWCO切向流超滤膜在2-8℃下用100mM磷酸钾(pH 7.0)进行渗滤。然后，将在渗余物中回收的批料稀释至约2.0g多糖/L，并通过添加1.2M碳酸氢钠(pH 9.4)进行pH调节。加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)。随后加入1.5M磷酸钾(pH 6.0)。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM L-组氨酸进行渗滤。将聚山梨醇酯20以0.05％(w/v)的浓度添加至渗余物批料中，然后将该批料进行0.2微米过滤(使用0.5微米的预滤器)。
用另外的含0.03％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)缓冲液中的10mML-组氨酸将批料调节至1.0g/L的多糖浓度。将批料分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表17：来自水性缀合的用于单价研究的血清型16F缀合物的属性
实施例21
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型16F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为1000bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.15摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖溶液使用氯化钠加标至浓度为50mM。将多糖和CRM197溶液共混，以达到2.0g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行2小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表18：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型16F缀合物的属性
实施例22
使用DMSO缀合制备用于单价研究的血清型17F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为200bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.11摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖溶液使用氯化钠加标至浓度为50mM。将多糖和CRM197溶液共混，以达到2.0g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行2小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表19：来自DMSO缀合的用于单价研究的血清型17F缀合物的属性
实施例23
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型17F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为200bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.11摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖溶液使用氯化钠加标至浓度为20mM。将多糖和CRM197溶液共混，以达到2.1g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行2小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表20：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型17F缀合物的属性
实施例24
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型19A缀合物
将多糖溶解，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.26摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行20小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到3.8g Ps/L的多糖浓度和1.33的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行1.5小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表21：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型19A缀合物的属性
实施例25
使用DMSO缀合制备用于单价研究的血清型20A缀合物
将此前确定为血清型20A的多糖(Calix等，Biochemical,Genetic,andSerological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcuspneumoniae Serotype 20Strains,J.Biol.Chem.287(33):27885–27894,(2012))溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为200bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.11摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到2.0g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行6小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤(使用0.5微米的过滤器)，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表22：来自DMSO缀合的用于单价研究的血清型20A缀合物的属性
实施例26
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型20A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为220bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.16摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖溶液使用氯化钠加标至浓度为20mM。将多糖和CRM197溶液共混，以达到1.4g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行4小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤(使用0.5微米的过滤器)，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表23：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型20A缀合物的属性
实施例27
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型22F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为400bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.12摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到1.8g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行1小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表24：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型22F缀合物的属性
实施例28
使用DMSO缀合制备用于单价研究的血清型23A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。通过将乙酸添加至200mM，通过酸水解减小溶解的多糖尺寸，在90℃下孵育1.5小时，然后通过添加冷的磷酸钾pH 7缓冲液至400mM进行中和。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.20摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖溶液使用氯化钠加标至浓度为50mM。将多糖和CRM197溶液共混，以达到3.0g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行2小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表25：来自DMSO缀合的用于单价研究的血清型23A缀合物的属性
实施例29
使用DMSO缀合制备用于单价研究的血清型23A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。通过将乙酸添加至200mM，通过酸水解减小溶解的多糖尺寸，在90℃下孵育1.5小时，然后通过添加冷的磷酸钾pH 7缓冲液至400mM进行中和。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.20摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到3.5g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行2小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表26：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型23A缀合物的属性
实施例30
使用DMSO缀合制备用于单价研究的血清型23B缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为400bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.10摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖溶液使用氯化钠加标至浓度为50mM。将多糖和CRM197溶液共混，以达到5.0g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行2小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表27：来自DMSO缀合的用于单价研究的血清型23B缀合物的属性
实施例31
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型23B缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为400bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.13摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到5.0g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行4小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表28：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型23B缀合物的属性
实施例32
使用DMSO缀合制备用于单价和多价研究的血清型24F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。通过将乙酸添加至200mM，通过酸水解减小溶解的多糖尺寸，在92℃下孵育50分钟，然后通过添加冷的磷酸钾pH 7缓冲液至400mM进行中和。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.18摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以2mg Ps/mL、蔗糖浓度为10％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖溶液使用氯化钠加标至终浓度为50mM。将多糖和CRM197溶液共混，以达到1.5g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行2小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表29：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型24F缀合物的属性
实施例33
使用DMSO缀合制备用于单价研究的血清型31缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。通过将乙酸添加至200mM，通过酸水解减小溶解的多糖尺寸，在90℃下孵育30分钟，然后通过添加冷的磷酸钾pH 7缓冲液至400mM进行中和。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.16摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到4.0g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行1小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表30：来自DMSO缀合的用于单价研究的血清型31缀合物的属性
实施例34
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型31缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为400bar/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.12摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖溶液使用氯化钠加标至终浓度为50mM。将多糖和CRM197溶液共混，以达到3.5g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行1小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表31：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型31缀合物的属性
实施例35
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型33F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为350bar/通过4次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.12摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到1.8g Ps/L的多糖浓度和1.75的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下缀合进行4小时。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤(使用0.5微米的预滤器)，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表32：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型33F缀合物的属性
实施例36
使用DMSO缀合制备用于单价研究的血清型35B缀合物
将多糖溶解，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.05摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别重新溶解在等体积的含25nM氯化钠的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到10g Ps/L的多糖浓度和4.0的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。缀合在22℃下进行2.5小时。在缀合孵育过程中，在两个加标物(spike)中添加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元0.025摩尔)。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1.5小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤(使用0.5微米的预滤器)，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表33：来自DMSO缀合的用于单价研究的血清型35B缀合物的属性
实施例37
使用DMSO缀合制备用于多价研究的血清型35B缀合物
将多糖溶解，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在DMSO中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，例如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。偏高碘酸钠的添加量为每摩尔多糖重复单元0.05摩尔偏高碘酸钠，以达到多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛数)。氧化反应在22℃下进行2小时。
将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖与CRM197缀合
将如前所述(WO 2012/173876 A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps重新溶解在含50mM氯化钠的DMSO中。将冻干的CRM197重新溶解在等体积DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到5.25gPs/L的多糖浓度和3.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。缀合在34℃下进行3小时。在缀合孵育过程中，在三个加标物中添加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元0.0375摩尔)。
用硼氢化钠还原
缀合反应后，加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在34℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。将该批料浓缩，并使用30kDa NMWCO切向流超滤膜在约4℃下用150mM氯化钠、25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。
最终过滤和产品储存
然后将该批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸进行渗滤。
将渗余物批料进行0.2微米过滤(使用0.5微米的预滤器)，然后用另外的含0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠(pH 7.0)中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
表34：来自DMSO缀合的用于多价研究的血清型35B缀合物的属性
在实施例38-51中没有针对所有血清型描述一些水性缀合方法。对于本文中未描述的那些水性缀合方法，可以在WO2018/156491中找到类似的方法。
实施例38
肺炎球菌缀合物疫苗的配制
将利用如上文实施例中所述的不同化学物质制备的个体肺炎球菌多糖-蛋白缀合物用于配制分别称为PCV1、PCV7、PCV8、PCV14、PCV15、PCV16、PCV21和PCV31的1-、7-、8-、14-、15-、16-、21-和31-价肺炎球菌缀合物疫苗。
PCV1疫苗药物产品制剂包含血清型3，其可通过在质子性(水性)溶剂或非质子性(DMSO)溶剂中使用还原胺化缀合，并且在20mM L-组氨酸pH 5.8、150mM NaCl和0.1％(w/v)PS-20中配制，使得在疫苗中肺炎球菌多糖(PnPs)的目标终浓度为84μg/mL(w/v)。
PCV7疫苗药物产品制剂包含血清型3、8、9N、10A、11A、15A和19A，其可通过在质子性(水性)溶剂或非质子性(例如，DMSO)溶剂中使用还原胺化缀合，并且在20mM L-组氨酸pH5.8、150mM NaCl和0.1％(w/v)PS-20中配制。在PCV7中，每种多糖-蛋白缀合物均以肺炎球菌多糖(PnPs)12μg/mL(w/v)配制，使得在疫苗中PnPs的目标终浓度为84μg/mL。
PCV8疫苗药物产品包含血清型6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，其可通过在非质子性溶剂(例如，DMSO)中使用还原胺化缀合，并且在20mM L-组氨酸pH 5.8、150mM NaCl和0.2％(w/v)PS-20中配制。在PCV8中，每种多糖-蛋白缀合物均以肺炎球菌多糖(PnPs)4μg/mL(w/v)配制，使得在疫苗中PnPs的目标终浓度为32μg/mL。
PCV14疫苗药物产品包含血清型3、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、16F、17F、19A、20A、22F和33F，其可通过在质子性(水性)溶剂或非质子性(例如，DMSO)溶剂中使用还原胺化缀合，并且在20mM L-组氨酸pH 5.8、150mM NaCl和0.1％(w/v)PS-20中配制。在PCV14中，每种多糖-蛋白缀合物均以肺炎球菌多糖(PnPs)6μg/mL(w/v)配制，使得在疫苗中PnPs的目标终浓度为84μg/mL。
PCV15疫苗药物产品包含血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F，其可通过在质子性(水性)溶剂中缀合，并且在20mM L-组氨酸pH 5.8、150mM NaCl和0.2％(w/v)PS-20中配制。除了6B以外，每种多糖-蛋白缀合物均以肺炎球菌多糖(PnPs)4μg/mL(w/v)配制，6B以8μg/mL配制，使得在疫苗中PnPs的目标终浓度为64μg/mL。
PCV16疫苗药物产品包含血清型6C、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、20A、23A、23B、24F、31和35B，其可通过在非质子性(例如，DMSO)溶剂中使用还原胺化缀合，并且在20mM L-组氨酸pH 5.8、150mM NaCl和0.2％(w/v)PS-20中配制。每种多糖-蛋白缀合物均以肺炎球菌多糖(PnPs)4μg/mL(w/v)或8μg/mL(w/v)配制，使得在疫苗中PnPs的目标终浓度为64μg/mL或128μg/mL。
PCV21疫苗药物产品包含血清型3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、24F、31、33F和35B，其可通过在非质子性(例如，DMSO)溶剂中使用还原胺化缀合，并且在20mM L-组氨酸pH 5.8、150mM NaCl和如每个实施例中所定义的各种浓度的PS-20中配制。每种多糖-蛋白缀合物均以肺炎球菌多糖(PnPs)4μg/mL(w/v)或8μg/mL(w/v)配制，使得在疫苗中PnPs的目标终浓度为84μg/mL或168μg/mL。在一些实施例中，使用磷酸铝形式的250μg[Al]/mL配制PCV21。
PCV31疫苗药物产品包含血清型1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20A、22F、23A、23B、23F、24F、31、33F和35B，其可通过在质子性(水性)溶剂或非质子性(例如，DMSO)溶剂中使用还原胺化缀合，并且在20mM L-组氨酸pH 5.8、150mM NaCl和0.2％(w/v)PS-20中配制。除了6B以外，每种多糖-蛋白缀合物均以肺炎球菌多糖(PnPs)4μg/mL(w/v)配制，6B以8μg/mL配制，使得在疫苗中PnPs的目标终浓度为128μg/mL。在一些实施例中，使用磷酸铝形式的250μg[Al]/mL配制PCV31。
其他单价PCV药物产品制剂是使用肺炎球菌多糖-蛋白缀合物血清型6A、6B、6C、10A、15A、15B、15C、16F、17F、20A、23A、23B、24F、31或35B制备的。在这些制剂的具体实施例中描述了其他细节。
为制备PCV药物制剂，根据批料体积和多糖原料(bulk)浓度计算获得肺炎球菌多糖(也称为PnPs)的所示终浓度(w/v)所需的缀合物原料的期望体积。
配制过程由在10-80mM组氨酸、0.0-0.8％(w/v)PS-20和150mM氯化钠(pH 5.8)中以终浓度1X至4X的PnPs混合物通过缀合物原料混合制备。
制备组氨酸pH 5.8、PS-20(如果使用)和150mM氯化钠溶液，并将其添加到配制容器中。将冷冻保存的个体肺炎球菌多糖-蛋白缀合物在2-8℃下解冻，然后添加到配制容器中。在将多糖-蛋白缀合物添加到配制缓冲液(缀合物混合物)期间，使用磁力搅拌棒或磁力叶轮将容器混合以确保均质。在完成所有添加并搅拌溶液之后，使缀合物混合物通过除菌过滤器，并收集在具有或不具有磷酸铝佐剂的容器中。在一些情况下，在除菌过滤器中再加入150mM氯化钠，以将批料调整至目标浓度。
将制剂装入塑料注射器、玻璃注射器或小瓶中。
实施例39
肺炎球菌缀合物疫苗的稳定性评估
将PCV16(128μg/mL PnPs)或两种PCV21肺炎球菌缀合物疫苗制剂(84μg/mL或168μg/mL PnPs)装入注射器或小瓶中。通过在非质子溶剂(例如，DMSO)中进行还原胺化来制备多糖蛋白缀合物，并在20mM L-组氨酸(pH 5.8)、150mM NaCl和0.2％(w/v)PS-20中配制。将这些制剂置于25℃或37℃下长达4周和置于4℃下长达12周。在一些情况下，将注射器放置在水平旋转平台上，并在4℃、25℃或37℃储存1周后摇动至多18小时。这样做是为了模拟可能伴随制剂生产和分销的运输和搬运压力。为评估PCV16或PCV21制剂的稳定性，使用了HPSEC UV/MALS/RI。将使用两个Shodex色谱柱(803和806)的高效体积排阻色谱(HPSEC)与紫外(UV)多角度光散射(MALS)和折射率(RI)检测器串联在一起，以测量在储存期间PCV药物产品制剂的浓度和摩尔质量。计算峰上每个时间间隔的浓度，然后在所有间隔积分，以获得最终浓度值。光散射与分子量和分析物浓度的乘积成正比。从检测器信号计算每个间隔的摩尔质量或分子量。在峰的所有间隔内计算加权平均(Mw)或数均(Mn)分子量，并报告为平均分子量。
储存可能会导致缀合物疫苗的蛋白和/或碳水化合物损失。在多糖的重复单元中具有磷酸二酯主链键或其他不稳定性的碳水化合物抗原在储存延长的时间和温度时可能易于通过水解而解聚。此外，缀合物疫苗中使用的载体蛋白或碳水化合物在储存和物理应激下可能易于聚集。
如图11中所示，无论多糖浓度如何，PCV16和PCV21制剂在25℃和37℃下4周和在4℃下长达12周是稳定的。此外，在热应激后的水平搅拌下，PCV16和PCV21制剂显示是稳定的。在这些热和物理应激下，未观察到由于非特异性吸附到容器或药瓶侧面而引起的抗原量损失。另外，在估计疫苗的总剂量时，未观察到制剂的聚集会影响其在色谱柱上的性能(例如，不可逆地与柱结合或不能进入/退出分离柱)(图12)。
将HPSEC UV/MAL/RI用于测量多糖-蛋白缀合物的分子量。如果制剂中的多糖-蛋白缀合物降解或解聚，则分子量明显下降；如果制剂发生聚集，则分子量将增加。该测量结果提供了疫苗制剂或中间体质量的其他特征。如图13中所示，包含分别在非质子溶剂(例如，DMSO)中使用还原胺化制备的原料药(drug substances)的PCV16和PCV21制剂针对碳水化合物的解聚或化学降解是稳定的，并且针对药物产品制剂中的蛋白聚集是稳定的。这表明使用在非质子溶剂(如DMSO)中通过还原胺化制备的多糖蛋白缀合物的PCV16和PCV21制剂在高温和物理应激作用下是稳定的。该制剂在数量和质量上均表现出优异的稳定性。该制剂不会由于容器或其他表面的非特异性吸附而损失总剂量，并且如疫苗制剂的稳定分子量(重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn))所示，该制剂不会降解或聚集。缀合化学物质对肺炎球菌缀合物疫苗稳定性的影响
将利用如上文实施例中所述的不同化学物质制备的个体肺炎球菌多糖-蛋白缀合物用于配制64μg/mL的分别称为PCV15和PCV16的15-和16-价肺炎球菌缀合物疫苗。PCV15疫苗制剂包含血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F，其在质子溶剂(全部为水溶液)中使用还原胺化反应缀合和在20mM L-组氨酸(pH 5.8)、150mM NaCl和0.2％w/v PS-20中配制(参见实施例38)。PCV16疫苗制剂包含血清型6C、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、20A、23A、23B、24F、31和35B，其在非质子溶剂(例如，全部为DMSO)中使用还原胺化反应缀合和在20mM L-组氨酸(pH 5.8)、150mM NaCl和0.2％(w/v)PS-20中配制(参见实施例38)。除PCV15中的6B外，每种多糖-蛋白缀合物均以4μg/mL(w/v)肺炎球菌多糖(PnPs)配制，PCV15中的6B以8μg/mL配制，终浓度为每支疫苗64μg/mL PnPs。
将装有疫苗的容器置于4℃或37℃下长达1周。将本征蛋白荧光光谱法(IPFS)用于评估在4℃和37℃下储存长达1周后在PCV15或PCV16组合物中与肺炎球菌多糖缀合的载体蛋白CRM197的稳定性。使用Jasco FP-6500荧光分光光度计在环境室温下于1cm光程的石英比色杯中采集未稀释样品的荧光发射光谱(Em 290-400nm)。激发波长为280nm，扫描速度为100nm/min，激发和发射带通为3nm。
如图14中所示，与利用在缀合过程中的还原胺化期间使用质子溶剂制备的原料药的疫苗相比(均为水性缀合)，含有使用在非质子溶剂(例如，全部为DMSO)中通过还原胺化制备的原料药的药物产品制剂具有优异的物理和化学稳定性。在37℃下短短16小时内，PCV15制剂(以64μg/mL使用用于缀合过程的在质子溶剂(全部为水溶液)中还原胺化制备的PnPs)的荧光强度降低并且疫苗的最大发射从332nm迁移至338nm。PCV16疫苗制剂(64μg/mLPnPs，使用在非质子溶剂(例如，全部为DMSO)中通过还原胺化化学方法制备的原料药)未显示出荧光强度或最大发射338nm的变化。应当理解的是，从IPFS测量中获得的最终信号强度和发射最大值是由于多价复合制剂中个体原料药的复合稳定性所致。我们已经发现，利用在非质子溶剂中制备的所有原料药的疫苗制剂是稳定的，而利用在质子溶剂中制备的所有原料药的疫苗制剂是不稳定的。
不受任何特定理论的束缚，这种稳定性可能是由于在DMSO中的缀合导致载体蛋白解折叠和变性所致。与变性载体蛋白的缀合将在缀合后将构象锁定在变性状态。如果是这样，则这项研究还表明，在本文评价的应激研究中，最终构象是稳定的。因此，优选使用主要由非质子溶剂制备的具有缀合物的疫苗，以提供一致且稳定的疫苗制剂。
如果疫苗制剂组合物包含在缀合过程中利用不同还原胺化溶剂(水性或DMSO)的原料药、糖缀合物或多糖蛋白缀合物的混合物，则由于每种水性多糖蛋白缀合物在332nm处的发射和每种非水性多糖蛋白缀合物在338nm处的发射的贡献，将加权从药物制剂中测得的平均最大发射或强度。对于在多价药物制剂中不使用在非质子溶剂中通过还原胺化制备的所有多糖蛋白缀合物的混合物，在升高温度下，预期在强度或发射最大值上将会发生变化。因此，优选使用具有主要由非质子溶剂制备的缀合物的疫苗，以提供一致且稳定的疫苗制剂。
实施例41
汇总的针对选定血清型的单价兔子免疫原性研究
在第0天和第14天(不同侧)用0.25mL或0.5mL(仅15C)相应的单价缀合物疫苗肌内(IM)免疫成年新西兰白兔(NZWR，n＝3/组)。在20mM L-组氨酸(pH 5.8)、150mM NaCl和0.2％(w/v)PS-20中配制以及使用实施例38中所述配制方法的单价肺炎球菌疫苗的给药方法如下所示：(1)每次免疫使用1μg PnPs(6C、10A、15A、16F、17F、20A、23A、23B、24F、31或35B，分别与CRM197缀合)和62.5μg磷酸铝佐剂(APA)，或(2)每次免疫使用2μg PnPs(15C-CRM197)和125μg APA。在研究开始前(免疫前)以及第14天(第1次给药后，PD1)和第28天(第2次给药后，PD2)收集血清。至少每天由训练有素的动物护理人员观察NZWR，看是否有任何疾病或困扰的迹象。由于未发现与疫苗相关的不良事件，因而NZWR中的疫苗制剂被认为是安全且耐受性良好的。所有动物实验均严格按照美国国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health)《实验动物的护理和使用指南》中的建议进行。NZWR实验方案得到了Merck&Co.,Inc(Kenilworth,NJ)和Covance(Denver,PA)两者的机构动物护理和使用委员会的批准。
使用1-2mg/ml相应PnPs包被浓度在ELISA测定中测试NZWR血清，以评估IgG的免疫原性。根据前述方案，使用3软件，通过调理吞噬作用测定法(OPA)确定功能性抗体，所述方案可在阿拉巴马大学伯明翰分校细菌呼吸病原体参考实验室在线获得(UAB研究基金会，Caro-Aguilar等，Immunogenicity differences of a 15-valentpneumococcal polysaccharide conjugate vaccine(PCV15)based on vaccine dose,route of immunization and mouse strain.Vaccine35(6):865-72(2017)；Burton等，Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay(MOPA4)for pneumococcal antibodies.Clin Vaccine Immunol 13(9):1004-9(2006))。
发现所有单价肺炎球菌缀合物疫苗在兔子中均具有免疫原性(图15)，并产生杀死相应细菌菌株的功能性抗体(图16)。
实施例42
血清型15A、15B、15C的交叉保护作用评价
使用15A-CRM197/APA、15B-CRM197/APA或15C-CRM197/APA免疫兔子，以评价每种血清型之间的交叉反应性。
在第0天和第14天(不同测)用0.5mL相应的单价缀合物疫苗肌内(IM)免疫成年新西兰白兔(NZWR，n＝3/组)。在20mM L-组氨酸(pH 5.8)、150mM NaCl和0.2％(w/v)PS-20中配制以及使用实施例38中所述配制方法的单价肺炎球菌疫苗每次免疫以2μg PnPs(15A、15B或15C，分别与CRM197缀合)和125μg APA给药。在研究开始前(免疫前)以及第14天(第1次给药后，PD1)和第28天(第2次给药后，PD2)收集血清。至少每天由训练有素的动物护理人员观察NZWR，看是否有任何疾病或困扰的迹象。由于未发现与疫苗相关的不良事件，因而NZWR中的疫苗制剂被认为是安全且耐受性良好的。所有动物实验均严格按照美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)《实验动物的护理和使用指南》中的建议进行。NZWR实验方案得到了Merck&Co.,Inc和Covance(Denver,PA)两者的机构动物护理和使用委员会的批准。
使用1-2mg/ml相应PnPs包被浓度在ELISA测定中测试NZWR血清，以评估IgG的免疫原性。根据前述方案，使用3软件，通过调理吞噬作用测定法(OPA)确定功能性抗体，所述方案可在阿拉巴马大学伯明翰分校细菌呼吸病原体参考实验室在线获得(UAB研究基金会)(Caro-Aguilar等，2017；Burton等，2006)。
发现全部三种血清型15的单价肺炎球菌缀合物疫苗在兔子中均具有免疫原性(图17)，并产生杀死相应细菌菌株的功能性抗体(图18)。此外，使用血清型15单价肺炎球菌缀合物疫苗免疫的兔子分别对同源和异源多糖和细菌菌株具有等同的PD2 IgG和OPA效价。使用15A-CRM197/APA、15B-CRM197/APA或15C-CRM197/APA免疫的兔子对每种肺炎球菌多糖(15A、15B、15C)均具有交叉反应性(图17)。使用单因素ANOVA结合Tukey多重比较检验分析第2次给药后(PD2)的对数转化IgG数据(P-值＝0.354)，血清型15组的IgG效价没有显著差异。另外，用15A-CRM197/APA，15B-CRM197/APA或15C-CRM197/APA免疫的兔子都与每种肺炎链球菌细菌菌株(15A、15B、15C)具有交叉反应性，因为所有兔子超免疫血清对所评价的每种菌株均具有功能性抗体并杀死细菌(图18)。类似地，使用单因素ANOVA结合Tukey多重比较检验分析第2次给药后(PD2)的对数转化OPA数据(P-值＝0.054)，血清型15组的OPA效价没有显著差异。
实施例43
PCV21在新西兰白兔中的免疫原性
在第0天和第14天(不同测)用0.1-0.5mL肺炎球菌缀合物疫苗肌内(IM)免疫成年新西兰白兔(NZWR，n＝5/组)。在20mM L-组氨酸(pH 5.8)、150mM NaCl和0.2％(w/v)PS-20中配制以及使用实施例38中所述配制方法的PCV21肺炎球菌疫苗每次免疫以4、2、1、0.4、0.08或0.016μg PnPs(3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、24F、31、33F或35B，分别与CRM197缀合)给药。在研究开始前(免疫前)以及第14天(第1次给药后，PD1)和第28天(第2次给药后，PD2)收集血清。至少每天由训练有素的动物护理人员观察NZWR，看是否有任何疾病或困扰的迹象。由于未发现与疫苗相关的不良事件，因而NZWR中的疫苗制剂被认为是安全且耐受性良好的。所有动物实验均严格按照美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)《实验动物的护理和使用指南》中的建议进行。NZWR实验方案得到了Merck&Co.,Inc和Covance(Denver,PA)两者的机构动物护理和使用委员会的批准。
使用多重电化学发光(ECL)测定评估NZWR血清的IgG免疫原性。基于Marchese等(Optimization and validation of a multiplex,electrochemiluminescence-baseddetection assay for the quantitation of immunoglobulin G serotype-specificantipneumococcal antibodies in human serum.Clin Vaccine Immunol.16(3):387-96(2009))描述的人测定使用由MesoScale Discovery(MesoScale Diagnostics,LLC的分公司，Gaithersburg,MD)开发的采用在电化学刺激下发光的SULFO-TAGTM标记的技术，开发了该测定法用于与兔子血清一起使用。SULFO-TAGTM标记的抗兔IgG用作测试NZWR血清样品的二抗。使用3软件，基于先前描述的可在阿拉巴马大学伯明翰分校细菌呼吸病原体参考实验室在线获得的方案(UAB研究基金会，Caro-Aguilar等，2017，同上，Burton等，2006，同上)，通过多重调理吞噬作用测定法(MOPA)确定功能性抗体。
发现PCV21肺炎球菌缀合物疫苗在兔子中具有免疫原性(图19A、19B、20A和20B)，并产生了在所有测试剂量下均能杀死疫苗型细菌菌株(图21A和21B)的功能性抗体。
对于给予4、2、1和0.4μg每种PnPs的PCV21，可观察到相当的PD1免疫原性，但是24F除外，与4或1μg剂量相比，其在2μg剂量下具有更高的免疫原性，而15A、15B和15C与2μg剂量相比在0.4μg剂量下具有更高的免疫原性(图19A和19B)。因此，在较高PnPs剂量(0.4-4μg/PnPs)下，疫苗的剂量应答没有很高。在0.08和0.016μg PnPs疫苗剂量下观察到较低的免疫原性，因为与2μg疫苗剂量相比，很多血清型显著降低。
对于给予4、2、1和0.4μg每种PnPs的PCV21，可观察到相当的PD2免疫原性(图20A和20B)。
在通常情况下，对于给予4、2、1和0.4μg每种PnPs的PCV21，可观察到相当的PD2MOPA效价，而0.08和0.016μg PnPs疫苗的MOPA效价趋于更低，尽管很多未达到统计学意义(数据未显示)。选择给予2μg每种PnPs的PCV21作为MOPA的代表性数据集。具体而言，以2μg剂量使用PCV21免疫的兔子，除血清型3外，比较的所有血清型均具有比免疫前的兔子血清显著更高的PD1 MOPA效价(图21A)。应当指出的是，对于血清型16F、31和35B，来自这项研究的兔子免疫前血清具有较高的背景效价。与免疫前的兔子血清相比，使用2μg剂量PCV21免疫的兔子对于所有血清型均具有显著更高的PD2 MOPA效价(图21B)。通过单因素ANOVA结合Dunnett检验分析对数转换后的数据以确定其显著性。
实施例44
材料和方法
游离多糖的测试
缀合物样品中的游离多糖(即未与CRM197缀合的多糖)是通过首先将游离蛋白和缀合物与脱氧胆酸盐(DOC)和盐酸沉淀而测定的。然后滤出沉淀物，并通过HPSEC/UV/MALS/RI分析滤液中游离多糖的浓度。游离多糖计算为通过HPSEC/UV/MALS/RI测量的总多糖的百分比。
游离蛋白的测试
通过胶束电动色谱(MEKC)模式下的毛细管电泳分离缀合物样品中的游离多糖、多糖-CRM197缀合物和游离CRM197。简而言之，将样品与含有25mM硼酸盐、100mM SDS，pH 9.3的MEKC运行缓冲液混合，并在预处理的裸露石英毛细管中分离。在200nm处监测分离，并用CRM197标准曲线对游离CRM197进行定量。游离蛋白结果报告为通过HPSEC/UV/MALS/RI方法测定的总蛋白含量的百分比。
使用HPSEC/UV/MALS/RI测定分析缀合物的分子量和浓度
注入缀合物样品，并通过高效体积排阻色谱法(HPSEC)进行分离。检测是通过串联的紫外线(UV)、多角度光散射(MALS)和折射率(RI)检测器完成的。使用消光系数由UV280计算蛋白浓度。使用dn/dc因子(这是溶液折射率的变化，溶质浓度的变化以mL/g表示)从RI信号(由蛋白质和多糖共同贡献)中反卷积多糖浓度。样品的平均分子量通过Astra软件(Wyatt Technology Corporation,Santa Barbara,CA)使用整个样品峰上测得的浓度和光散射信息进行计算。多分散分子的分子量平均值有多种形式。例如，数均分子量Mn，重均分子量Mw和z均分子量Mz(Molecules,2015,20,10313-10341)。除非另有说明，否则在整个说明书中使用的术语分子量是重均分子量。
测定缀合蛋白中赖氨酸的消耗，以衡量多糖和载体蛋白之间共价连接的数量
Waters AccQ-Tag氨基酸分析(AAA)用于测量缀合物样品中的缀合程度。在Eldex工作站中使用气相酸水解法水解样品，以将载体蛋白分解成其组分氨基酸。游离氨基酸使用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)衍生化。然后使用UPLC在C18色谱柱上进行紫外检测，分析衍生样品。使用赖氨酸以外的代表性氨基酸获得平均蛋白质浓度。缀合过程中赖氨酸的消耗量(即，赖氨酸损失)由缀合物中赖氨酸的平均测得量与起始蛋白中预期赖氨酸的量之差确定。
实施例45
缀合过程对肺炎球菌缀合物疫苗稳定性的影响
将利用如上文实施例中所述的不同还原胺化溶剂(水性或DMSO)制备的个体肺炎球菌多糖-蛋白缀合物用于配制84μg/mL的分别称为PCV1、PCV7、PCV14和PCV21的1-、7-、14-和21-价肺炎球菌缀合物疫苗制剂。
将装有疫苗制剂的容器置于4℃或37℃下长达7天。将本征蛋白荧光光谱法(IPFS)用于评估在4℃和37℃下储存长达7天后在PCV1、PCV7、PCV14或PCV21组合物中与肺炎球菌多糖缀合的载体蛋白CRM197的稳定性。使用Jasco FP-6500荧光分光光度计在环境室温下于1cm光程的石英比色杯中采集未稀释样品的荧光发射光谱(Em 290-400nm)。激发波长为280nm，扫描速度为100nm/min，激发和发射带通为3nm。
如图22A-C中所示，与利用在缀合过程中的还原胺化期间使用水性溶剂(质子)制备的所有多糖-蛋白缀合物的疫苗相比，含有使用在非质子溶剂(例如，DMSO)中通过还原胺化制备的所有多糖-蛋白缀合物的药物产品制剂具有优异的物理和化学稳定性。在37℃下短短16小时内，使用所有多糖-蛋白缀合物(在水性溶剂中使用还原胺化制备的，84μg/mLPnPs)制备的PCV1、PCV7和PCV14制剂的荧光强度降低并且疫苗的最大发射从332nm迁移至338nm。PCV1、PCV7和PCV14疫苗制剂(84μg/mL PnPs，使用在非质子溶剂(例如，DMSO)使用还原胺化化学方法制备的原料药)未显示出荧光强度或在338nm处最大发射的变化。此外，还研究了PCV21制剂。如实施例38中所述，其在20mM L-组氨酸(pH 5.8)、150mM NaCl和0.1％(w/v)PS-20中配制，含有在非质子溶剂(例如，DMSO)中使用还原胺化制备的多糖-蛋白缀合物。研究表明，在37℃下储存后，具有优异的物理和化学稳定性。PCV21未显示出荧光强度或在338nm处最大发射的变化(图22D)。
应当理解的是，从IPFS(实施例40)测量中获得的最终信号强度和发射最大值是由于多价复合制剂中个体多糖-蛋白复合物的复合稳定性所致。我们已经发现，在应激条件下，利用在非质子溶剂中制备的所有多糖-蛋白缀合物的疫苗制剂是稳定的，而利用在质子溶剂中制备的所有原料药的疫苗制剂是不稳定的。如果疫苗制剂组合物包含使用质子和非质子缀合过程制备的多糖-蛋白质缀合物的混合物，则由于每种质子多糖蛋白缀合物在332nm处的发射和每种非质子多糖蛋白缀合物在338nm处的发射的贡献，将加权从药物制剂中测得的平均最大发射或强度。可以预期的是，由于存在使用质子缀合方法制备的多糖蛋白缀合物，则这种混合物在升高的温度下强度或发射最大值将发生加权变化。
如图23中所示，为评估以0.084mg/mL PnPs制备的PCV21制剂的稳定性，使用了纳米颗粒跟踪分析(NTA)。该技术收集通过布朗运动移动的直接跟踪的纳米颗粒群的视频，以推断出粒径和浓度。1级635nm激光将80微米的红色激光束聚焦在液体样品中，照亮作为光的快速扩散点的颗粒。CCD摄像机以每秒30帧的速度录制视频，以跟踪随时间推移每个个体发光颗粒的运动。系统软件从视频中识别个体颗粒的中心，并跟踪独立移动的距离以确定均方根位移。对于每帧中样本总体中的每个颗粒，同时执行此跟踪，直到分析完从整个视频中收集的原始数据为止。通过同时测量所跟踪的每个个体颗粒的均方位移，可通过应用斯托克斯-爱因斯坦方程确定其扩散系数(Dt)和球形等效流体力学半径(rh)。然后，软件将这些累积数据表示为粒径和浓度分布。不仅收集有关粒径和浓度的原始数据信息，而且还收集有关个体颗粒的强度或亮度的原始数据信息。将数据合并在一起进行拟合并以相对于粒径的颗粒强度和相对于粒径的颗粒浓度分别作图，然后在三维轮廓图上比较所有颗粒群的粒径、浓度和强度。
由载体蛋白和多糖抗原组成的缀合物疫苗可能一起或分别在10-1000nm粒径范围内易于聚集，从而使NTA成为评估和定量聚集现象的适宜稳定性指示技术。在将制剂暴露于4℃和37℃下1周后，对于含有浓度为0.025％w/v、0.05％w/v、0.1％w/v、0.15％w/v和0.2％w/v PS-20的制剂通过NTA未观察到制剂的显著聚集(如图23中所示)。然而，将制剂搅拌6hr后，在4℃时，缺乏聚山梨醇酯20的制剂在减轻由搅拌引起的制剂聚集方面无效，如由NTA提供的D90粒径增大、粒径分布变宽和粒径强度增大所证明的那样。因此，优选将聚山梨醇酯20保持在0.025至0.2％或更高水平(w/v)，以在常规生产、储存、运输和处理期间稳定制剂。
如在实施例39中所述，使用HPSEC UV/MALS/RI测量在20mM L-组氨酸(pH 5.8)、150mM NaCl和0至0.2％(w/v)PS-20中配制以及根据实施例38中所述配制方法的21价(PCV21)多糖-蛋白缀合制剂的分子量。将制剂4℃或37℃下放置长达一周。在一些情况下，将注射器放置在水平旋转平台上，并在4℃或37℃下保存1周后摇动至多6小时。这样做是为了模拟可能伴随制剂生产和分销的运输和搬运压力。如果制剂中的多糖-蛋白缀合物降解或解聚，则分子量明显下降，并且如果药物制剂发生聚集，则分子量将增加。该测量结果提供了疫苗制剂或多糖-蛋白缀合物的质量随PS-20浓度变化的附加特征。如图24中所示，PS-20在0.05％至0.15％之间时，包含均在非质子溶剂(例如，DMSO)中使用还原胺化制备的所有原料药的PCV21制剂针对碳水化合物的解聚或化学降解是稳定的，以及对由于热处理而使得药物制剂中的蛋白聚集是稳定的。总的来说，这表明当使用PS-20以0.025％和0.2％或更高含量配制时，PCV21制剂在高温和物理应激下是稳定的。
实施例46
PCV21在小鼠中对攻击的保护作用
在第0天、第14天和第28天，用0.1-0.5mL 21价肺炎球菌缀合物疫苗(PCV21)腹腔注射(IP)免疫年轻雌性Swiss Webster小鼠(6-8周龄，n＝10只/组)。每次免疫以4、2、0.4、0.08或0.016μg PnPs(分别与CRM197缀合的3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、24F、31、33F和35B)给予PCV21肺炎球菌疫苗。至少每天由训练有素的动物护理人员观察小鼠，看是否有任何疾病或困扰的迹象。由于未发现与疫苗相关的不良事件，因而小鼠中的疫苗制剂被认为是安全且耐受性良好的。在第52天，对小鼠进行气管内肺炎链球菌血清型24F攻击。将肺炎链球菌的指数期培养物离心、洗涤并混悬在无菌PBS中。攻击前用异氟烷麻醉小鼠。将在0.1mL PBS中的105cfu肺炎链球菌置于切牙直立小鼠的喉部。通过将舌头轻轻向外拉并覆盖鼻孔来诱导细菌的吸入。每天对小鼠称重，如果体重减轻超过初始重量的20％，则实施安乐死。在24小时、48小时和72小时收集血液以评估菌血症。至少每天两次由训练有素的动物护理人员观察小鼠，看是否有任何疾病或困扰的迹象。所有动物实验均严格按照美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)《实验动物的护理和使用指南》中的建议进行。小鼠实验方案得到了Merck&Co.,Inc的机构动物护理和使用委员会的批准。
使用多重电化学发光(ECL)测定评估小鼠血清的IgG免疫原性。基于Marchese等，Clin Vaccine Immunol.(2009)16(3):387-96描述的人测定，使用由MesoScale Discovery(MesoScale Diagnostics,LLC的分公司，Gaithersburg,MD)开发的采用在电化学刺激下发光的SULFO-TAGTM标记的技术，开发了该测定法用于与小鼠血清一起使用。SULFO-TAGTM标记的抗小鼠IgG用作测试小鼠血清样品的二抗。通过此前在www.vaccine.uab.edu上描述的方案，使用阿拉巴马大学(UAB)研究基金会所有并许可的3软件(参见Caro-Aguilar I.等，Vaccine(2017)35(6):865-72以及Burton R.L.和Nahm M.H.Clin.VaccineImmunol.(2006)13(9):1004-9)，通过多重调理吞噬作用测定法(MOPA)确定功能性抗体。
PCV21免疫在Swiss Webster小鼠中针对疫苗中的所有血清型产生了抗体效价(数据未显示)。PCV21在Balb/c和CD1小鼠中也具有免疫原性(数据未显示)。还保护了PCV21免疫的Swiss Webster小鼠免受肺炎链球菌血清型24F的攻击(图25)。Mantel Cox对数秩检验表明，与天然组相比，所有PCV21免疫组均受到了显著保护，免受攻击(P<0.05)。同样地，经PCV21免疫的小鼠组几乎没有菌血症，当与天然组比较时其显著更低(数据未显示)。
实施例47
在兔子中的PCV免疫原性和功能性抗体
在第0天和第14天(不同测)，用0.1mL PCV肌内(IM)免疫成年新西兰白兔(NZWR，n＝5只/组)。每次免疫时，以每种血清型0.4μg PnPs以及磷酸铝佐剂(APA)形式的25μg[Al]给予PCV。在PCV31的情况下，每次免疫时，血清型6B的剂量浓度增加一倍，达到0.8μg PnPs。PCV21(如在实施例38中所述)包含分别与CRM197缀合的血清型3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、24F、31、33F和35B的纯化多糖。每种多糖-蛋白缀合物均未使用佐剂制备，或使用磷酸铝或APA形式的250μg[Al]/mL配制，以评价佐剂(PCV21/APA)的作用。还配制了低价PCV(如在实施例38中所述)以包括8个新的ST(PCV8：分别与CRM197缀合的6C、15A、16F、23A、23B、24F、31和35B，无佐剂)，未包括在任何已许可PCV中的16ST(PCV16：分别与CRM197缀合的6C、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、20、23A、23B、24F、31和35B，无佐剂)或PCV31(分别与CRM197缀合的1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20A、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B，使用磷酸铝形式的250μg[Al]/mL配制)，以评价随着疫苗效价增加(PCV31/APA)对载体的抑制作用。每种疫苗均使用以4μg/mL(w/v)肺炎球菌多糖(PnPs)配制的多糖蛋白缀合物，但6B除外，其在PCV31或PCV31/APA中使用8μg/mL(w/v)肺炎球菌多糖(PnPs)配制。在每种疫苗中，肺炎球菌多糖(PnPs)的终浓度为在PCV31中128μg/mL PnPs、在PCV21中84μg/mL PnPs、在PCV16中64μg/mL和在PCV8中32μg/mL。
在研究开始前(免疫前)以及在第14天(PD1)和第28天(PD2)收集血清。至少每天由训练有素的动物护理人员观察NZWR，看是否有任何疾病或困扰的迹象。由于未发现与疫苗相关的不良事件，因而NZWR中的疫苗制剂被认为是安全且耐受性良好的。所有动物实验均严格按照美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)《实验动物的护理和使用指南》中的建议进行。NZWR实验方案得到了Merck&Co.,Inc和Covance(Denver,PA)两者的机构动物护理和使用委员会的批准。
使用多重电化学发光(ECL)测定评估兔子血清的IgG免疫原性。基于Marchese等，Clin Vaccine Immunol.(2009)16(3):387-96描述的人测定，使用由MesoScale Discovery(MesoScale Diagnostics,LLC的分公司，Gaithersburg,MD)开发的采用在电化学刺激下发光的SULFO-TAGTM标记的技术，开发了该测定法用于与兔子血清一起使用。SULFO-TAGTM标记的抗兔子IgG用作测试NZWR血清样品的二抗。通过此前在www.vaccine.uab.edu上描述的方案，使用阿拉巴马大学(UAB)研究基金会所有并许可的3软件(参见Caro-Aguilar I.等，Vaccine(2017)35(6):865-72以及Burton R.L.和Nahm M.H.Clin.VaccineImmunol.(2006)13(9):1004-9)，通过多重调理吞噬作用测定法(MOPA)确定功能性抗体。
在多重电化学发光测定中，以免疫前和PD1的混合(pool)以及单独对PD2而对兔子血清进行检测以确定抗体效价。用疫苗免疫后，PCV针对所有血清型在兔子中产生了抗体效价(数据未显示)。在PCV16、PCV21或PCV31中不包含血清型15B多糖，但是在用PCV16、PCV21和PCV31免疫后观察到针对血清型15B的抗体效价。
当与使用APA的PCV21比较时，无佐剂的PCV21具有相当的或显著更高的免疫原性(血清型3、7F、10A、19A、23A和23B)(图26A-B和图28)，提示在疫苗中包含APA在兔子中没有额外的免疫原性获益。
载体诱导的表位抑制是指干扰抗体对与相同载体蛋白(如CRM197)偶联的抗原(如荚膜多糖)的应答。认为干扰是由于竞争了有限数量的载体特异性初免辅助性T细胞所致。结果，对荚膜多糖的应答可能降低。辉瑞公司(Pfizer)已观察到，随着疫苗效价从7价增加到13价，共有血清型的疫苗免疫原性降低[沛儿(7价)与沛儿13的IgG抗体GMC的比较(PCV13专论的第29页表9)]。因此，我们试图研究与PCV21相比低价PCV的免疫原性(图27A-C)。对于8种共有的血清型，PCV8(8种新型血清型)相对于PCV21具有相当的免疫原性(图29)。对于16种共有血清型中的15种，PCV16(PCV21扣除来自PCV15的5种重叠血清型)相对于PCV21具有相当的免疫原性(图29)。在PCV16中血清型31具有更高的免疫原性(图29)。总体而言，在NZWR中PCV21没有载体抑制的主要趋势。对于21种共有血清型中的12种，PCV31/APA相对于PCV21/APA具有相当的免疫原性。在PCV31中，10种血清型(6C、7F、9N、12F、15A、15B(不在PCV21中)、15C、17F、19A和23A)具有更高的免疫原性，范围在2.9倍至11倍之间(图30)。总体而言，在NZWR中PCV31没有载体抑制的主要趋势。
发现PCV在兔子中具有免疫原性，并产生杀死疫苗型细菌菌株的功能性抗体。在多重调理吞噬测定(MOPA)中测试了兔子血清，以确定功能性抗体的效价。与PCV21/APA、PCV8和PCV16相比，PCV21具有相当或更高的PD2 OPA效价(图31)。通过单因素方差分析结合Dunnett检验分析对数转换后的数据，以确定显著性。针对血清型16F与PCV8相比和针对血清型12F、23A和19A与PCV21/APA相比，PCV21具有显著更高的OPA效价。针对血清型23A，PCV31与PCV21相比具有显著更高的OPA效价。
实施例48
在成年恒河猴(Rhesus Macaques)中PCV21的免疫原性
还在成年恒河猴免疫原性模型中评估了PCV21。在第0天、第28天和第56天使用PCV21肌内免疫恒河猴。每次免疫，在0.25mL体积中以1μg PnPs(分别与CRM197缀合的3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20A、22F、23A、23B、24F、31、33F和35B)给予PCV21。在研究开始前(免疫前，第0天)以及第14(PD1)、28、42(PD2)、56、70(PD3)和84天收集血清。
使用多重电化学发光(ECL)测定评估恒河猴血清的IgG免疫原性。基于Marchese等和Skinner等(Marchese R.D.等，Clin.Vaccine Immunol.(2009)16(3):387-96和Skinner,J.M.等，Vaccine(2011)29(48):8870-8876)描述的人测定，使用由MesoScale Discovery(MesoScale Diagnostics,LLC的分公司，Gaithersburg,MD)开发的采用在电化学刺激下发光的SULFO-TAGTM标记的技术，开发了该测定法用于与恒河猴血清一起使用。SULFO-TAGTM标记的抗人IgG用作测试恒河猴血清样品的二抗。通过此前在www.vaccine.uab.edu上描述的方案，使用阿拉巴马大学(UAB)研究基金会所有并许可的3软件(参见Caro-Aguilar I.等，Vaccine(2017)35(6):865-72以及Burton R.L.和Nahm M.H.Clin.VaccineImmunol.(2006)13(9):1004-9)，通过多重调理吞噬作用测定法(MOPA)确定功能性抗体。
已发现PCV21在成年猴中具有免疫原性，并产生了在所有测试时间点均杀死疫苗型细菌菌株的功能性抗体(图32和33)。还值得注意的是，如ECL所证实的，包含多糖缀合物15A-CRM197和15C-CRM197的PCV21也提供了与15B的交叉反应性。在猴中使用一剂疫苗，PCV21即具有免疫原性(图32)。大多数血清型在PD1时达到其最大效价，但ST 6C、12F和24F除外，其从另外的免疫接种中获益。与此前在婴儿恒河猴中进行的PCV研究相比，成年恒河猴具有更高的预先存在的抗体效价。当在MOPA中测试血清样品时，预先存在的抗体效价最明显，这使确定调理吞噬效价变得困难。所有研究时间点均以混合或个体样品的形式在MOPA中进行了测试，但为了便于查看，仅显示了免疫前、PD1和PD3(图33)，因为PD1和PD3之间的OPA效价没有太大差异。
评价了PCV21免疫的成年恒河猴血清对其他肺炎链球菌细菌的交叉保护作用(图34)。PCV21免疫的恒河猴血清对血清型6A、6B和23F具有交叉保护作用，但对19F没有交叉保护作用。对6A和6B的交叉保护作用可能是由于用多糖缀合物6C-CRM197作为多价PCV21的一部分进行了免疫。类似地，用多糖缀合物23A-CRM197和23B-CRM197作为多价PCV的一部分进行免疫导致对血清型23F的交叉保护。用包含多糖缀合物19A-CRM197的PCV21进行的免疫不能为19F提供交叉保护。
实施例49
在成年猕猴中PCV21的免疫原性-佐剂和载体抑制评价
另一项猴研究包括评价具有和不具有APA的PCV21，并对共有血清型的免疫原性进行比较以评价载体抑制。在研究第0天，以一半的人用剂量用疫苗肌内免疫成年恒河猴(n＝5只/组)。每次免疫以在0.25mL体积中的1μg PnPs(分别与CRM197缀合的3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20、22F、23A、23B、24F、31、33F和35B)给予PCV21。一组包含PCV21以及磷酸铝形式的62.5μg[Al]佐剂。另一组包含PCV15，每次免疫在0.25mL体积中以1μg PnPs(均与CRM197缀合的1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F，以2μg给予6B)给予，以及磷酸铝形式的62.5μg[Al]佐剂。另一组包含沛儿(PCV13)，每次免疫在0.25mL体积中以1.1μg PnPs给予(均与CRM197缀合的1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F，以2.2μg给予6B)。在研究开始时(免疫前，第0天)和在第28天收集血清。
发现PCV21在成年猴中具有免疫原性，并产生杀死疫苗型细菌菌株的功能性抗体。当与具有APA的PCV21比较时，不具有佐剂的PCV21具有相当或显著更高的免疫原性(血清型15A和15B)(图35)。PCV21不包含血清型15B。
将PCV21免疫的猴与使用PCV15和沛儿13免疫的那些进行比较。PCV21和PCV15具有5种共有的血清型(3、7F、19A、22F、33F)；在用PCV21或PCV15免疫的猴之间，这5种血清型的免疫原性没有差异(图36)。PCV21和沛儿13具有3种共有的血清型(3、7F、19A)；血清型7F和19A的免疫原性没有差异。与PCV21相比，沛儿13免疫的猴对血清型3的抗体效价较低(图36)。这一发现与PCV15人类临床数据一致，表明血清型3在默克PCV15疫苗中更具免疫原性。综上所述，这些结果表明，与沛儿13或PCV15相比，在用PCV21免疫的成年恒河猴中未观察到载体抑制。
实施例50
血清型6A、6B和6C的交叉反应性-单价研究
使用肺炎球菌多糖6A-CRM197缀合物或肺炎球菌多糖6B-CRM197缀合物制备单价制剂，并在20mM组氨酸(pH 5.8)和150mM氯化钠和0.1％w/v聚山梨醇酯20(PS-20)中配制，每种血清型的目标总多糖浓度为4.0μg/mL。通过将CRM197蛋白分别与肺炎球菌多糖(PnPs)类型(-6A或-6B)缀合来制备缀合物。根据批料体积和每种多糖原料浓缩物的浓度，计算获得每种血清型目标浓度所需的缀合物原料的期望体积。将每种缀合物添加到组氨酸、氯化钠和PS-20溶液中，以形成2X缀合物混合物。使用磁力搅拌棒将包含2X缀合物混合物的配制容器混合，并无菌过滤到另一个容器中。然后将无菌过滤的2X混合物用盐水稀释，以达到期望的目标总多糖和赋形剂浓度。然后将制剂填充到小瓶中并在2-8℃下保存。
用6A-CRM197或6B-CRM197免疫兔子，以评价血清组6中的交叉反应性。在第0天和第14天(不同测)使用0.25mL相应的单价缀合物疫苗肌内(IM)免疫成年新西兰白兔(NZWR，n＝3只/组)。以1μg PnPs(均与CRM197缀合的6A或6B)给予单价肺炎球菌缀合物疫苗，该疫苗在20mM L-组氨酸(pH 5.8)、150mM NaCl和0.1％(w/v)PS-20中使用实施例38中所述的配制过程配制。在研究开始前(免疫前)以及第14天(第1次给药后，PD1)和第28天(第2次给药后，PD2)收集血清。至少每天由训练有素的动物护理人员观察NZWR，看是否有任何疾病或困扰的迹象。由于未发现与疫苗相关的不良事件，因而NZWR中的疫苗制剂被认为是安全且耐受性良好的。所有动物实验均严格按照美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)《实验动物的护理和使用指南》中的建议进行。NZWR实验方案得到了Merck&Co.,Inc和Covance(Denver,PA)两者的机构动物护理和使用委员会的批准。
在ELISA测定中检测NZWR血清，以分别使用2μg/mL PnPs包被浓度评价IgG的免疫原性。通过此前在www.vaccine.uab.edu上描述的方案，使用UAB研究基金会所有并许可的3软件(参见Caro-Aguilar I.等，Vaccine(2017)35(6):865-72以及BurtonR.L.和Nahm M.H.Clin.Vaccine Immunol.(2006)13(9):1004-9)，通过调理吞噬作用测定法(OPA)确定功能性抗体。
发现6A-CRM197和6B-CRM197在兔子中都是免疫原性的(图37)，并产生杀死相应细菌菌株的功能性抗体(图38)。另外，用血清组6单价肺炎球菌缀合物疫苗免疫的兔子分别具有与同源和异源多糖和细菌菌株相当的PD2 IgG和OPA效价。用6A-CRM197或6B-CRM197免疫的兔子均与每种肺炎球菌多糖(PnP 6A、PnP 6B和PnP 6C)具有交叉反应性(图37)。通过单因素ANOVA使用第2次给药后(PD2)的对数转换IgG数据分析，血清组6中的IgG效价无显著性差异。此外，用6A-CRM197或6B-CRM197免疫的兔子均对每种肺炎链球菌菌株(6A、6B和6C)有交叉反应性，因为所有兔子超免疫血清对每种评价的菌株均具有功能性抗体并杀死了细菌(图38)。类似地，通过单因素ANOVA使用第2次给药后(PD2)的对数转换OPA数据分析，血清组6中的OPA效价无显著性差异。
实施例51
血清型20A和20B的交叉反应性-单价研究
使用肺炎球菌多糖20A-CRM197缀合物制备单价制剂，并以4.0μg/mL在20mM组氨酸(pH 5.8)和150mM氯化钠和0.2％w/v聚山梨醇酯-20(PS-20)中配制。使用磷酸铝形式的250.0μg[Al]/mL作为佐剂制备制剂(20A-CRM197/APA)。通过分别将CRM197蛋白与肺炎球菌多糖(PnPs)20型缀合制备缀合物。根据批料体积和每种多糖原料浓缩物的浓度，计算获得每种血清型目标浓度所需的缀合物原料的期望体积。将每种缀合物添加到组氨酸、氯化钠和PS-20溶液中，以形成16.0μg/mL的4X缀合物混合物。使用磁力搅拌棒将包含缀合物混合物的配制容器混合，并无菌过滤到另一个容器中。然后将无菌过滤的4X混合物加入含有磷酸铝佐剂的另一个容器中，以达到期望的目标总多糖、赋形剂和佐剂浓度。然后将制剂填充到玻璃小瓶中并在2-8℃下保存。
使用20A-CRM197/APA或PCV21免疫兔子以评价血清组20中的交叉反应性。在第0天和第14天(不同测)使用肺炎球菌缀合物疫苗肌内(IM)免疫成年新西兰白兔(NZWR，n＝3只/组)。以在0.25ml中的1μg PnPs(与CRM197缀合的ST20A，磷酸铝形式的62.5μg[Al]用作佐剂)给予如上所述配制的单价肺炎球菌缀合物疫苗，以在0.1ml中的0.4μg PnPs(均与CRM197缀合的血清型3、6C、7F、8、9N、10A、11A、12F、15A、15C、16F、17F、19A、20、22F、23A、23B、24F、31、33F和35B)给予PCV21多价肺炎球菌缀合物疫苗(84μg/mL PnPs)(在20mM L-组氨酸(pH 5.8)、150mM NaCl和0.2％(w/v)PS-20中以实施例38中所述的配制过程配制)。在研究开始前(免疫前)以及第14天(第1次给药后，PD1)和第28天(第2次给药后，PD2)收集血清。至少每天由训练有素的动物护理人员观察NZWR，看是否有任何疾病或困扰的迹象。由于未发现与疫苗相关的不良事件，因而NZWR中的疫苗制剂被认为是安全且耐受性良好的。所有动物实验均严格按照美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)《实验动物的护理和使用指南》中的建议进行。NZWR实验方案得到了Merck&Co.,Inc和Covance(Denver,PA)两者的机构动物护理和使用委员会的批准。
通过此前在www.vaccine.uab.edu上描述的方案，使用UAB研究基金会所有并许可的3软件(参见Caro-Aguilar I.等，Vaccine(2017)35(6):865-72以及BurtonR.L.和Nahm M.H.Clin.Vaccine Immunol.(2006)13(9):1004-9)，通过调理吞噬作用测定法(OPA)对NZWR血清进行检测以评价功能性抗体。
使用单价20A-CRM197/APA和多价PCV21疫苗免疫兔子均产生杀死两种肺炎链球菌血清型20A和20B的功能性抗体(图39)。这表明血清型20A和20B具有结构相似性，导致血清组内发生交叉反应。

Claims (4)

1.一种多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖载体蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的特定肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌血清型由以下组成：3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、去-O-乙酰化的15B、17F和20A，和所述载体蛋白是CRM197。
2.根据权利要求1所述的多价免疫原性组合物，其中所述去-O-乙酰化的15B多糖的每个重复单元的O-乙酰基含量小于5％。
3.一种多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖载体蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的特定肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌血清型由以下组成：3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15C、17F和20A，和所述载体蛋白是CRM197。
4.一种多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖载体蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的特定肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌血清型由以下组成：3、7F、19A、22F、33F、6A、15A、16F、23A、23B、24F、31、35B、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20A，和所述载体蛋白是CRM197。
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