JP7369123B2 - 肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを含む組成物およびその使用方法 - Google Patents

肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを含む組成物およびその使用方法 Download PDF

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Description

本発明は、別個の多糖類－タンパク質コンジュゲートを有する多価免疫原性組成物を提供する。各コンジュゲートは、担体タンパク質、好ましくはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた異なる血清型の肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から調製された莢膜多糖類からなる。免疫原性組成物は、肺炎球菌疾患に対する広範な適用範囲を提供する。
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）はグラム陽性菌であり、乳幼児の侵襲性細菌性疾患（肺炎、菌血症、髄膜炎および中耳炎など）の最も一般的な原因である。肺炎球菌は、血清型特異性を付与する化学的に結合した多糖類でカプセル化されている。肺炎球菌には９０を超える血清型が知られており、莢膜は細菌の内面を補体から保護するだけでなく、それ自体免疫原性が低いため、肺炎球菌の主要な病原性決定基である。多糖類はＴ細胞非依存性抗原であり、ほとんどの場合、Ｔ細胞と相互作用するためにＭＨＣ分子で処理または提示することはできない。しかしながら、これらはＢ細胞上の表面受容体の架橋を含む代替機構を通して免疫系を刺激することができる。
長年にわたって認可されている多価肺炎球菌多糖類ワクチンは、成人、特に高齢者および高リスクの人々の肺炎球菌疾患を予防する際に有益であると証明されている。しかしながら、乳幼児は、非コンジュゲート肺炎球菌多糖類に十分に反応しない。当時乳幼児で侵襲性肺炎球菌疾患を引き起こす７つの最も頻繁に分離された血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）を含有する肺炎球菌コンジュゲートワクチンであるＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）が、２０００年２月に米国で最初に認可された。米国でのＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）の普遍的な使用後、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）に存在する血清型により、子供の侵襲性肺炎球菌疾患が大幅に減少した。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ ２００５，５４（３６）：８９３－７を参照されたい。しかしながら、世界の一定の地域でのＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）による血清型の適用範囲には制限があり、米国で一定の血清型が出現していることを示すいくつかの証拠がある（例えば、１９Ａなど）。Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １５９：６３４－４４；Ｗｈｉｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：１７３７－４６；Ｋｙａｗ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５４：１４５５－６３；Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９６：１３４６－５４；Ｔｒａｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４８：Ｓ１８１－Ｓ１８９を参照されたい。
米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号明細書は、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含む１３価肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートワクチンを記載している。中国特許出願公開第１０１５９０２２４号明細書は、血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含む１４価肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートワクチンを記載している。
他のＰＣＶは、ＰＣＶ－１５に含まれる血清型７、１０、１１または１３をカバーしている（米国特許出願公開第２０１１／０１９５０８６号明細書）が、一部の血清型での免疫干渉（例えば、ＧＳＫのＰＣＶ－１１の血清型３に対する防御が低い）およびＰｆｉｚｅｒのＰＣＶ－１３（ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）１３）で血清型６Ｂに対する反応率が低いことが観察されている。Ｐｒｙｍｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｌａｎｃｅｔ ３６７：７４０－４８およびＫｉｅｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｎｏｎ－ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆ １３－ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ７－ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｉｖｅｎ ａｓ ａ ４－Ｄｏｓｅ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒｓ，ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ４８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＩＣＡＡＣ／ＩＳＤＡ ４６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２５－２８，２００８を参照されたい。
現在の多価肺炎球菌ワクチンは、ワクチンに存在する血清型に関連する肺炎球菌疾患の発生率を低下させるのに有効であった。しかしながら、現在利用可能なワクチンに存在しない血清型を発現する肺炎球菌の有病率が増加してきている。したがって、肺炎球菌血清型の異なるセットに対する防御を提供し、現在利用可能なワクチンには存在しない肺炎球菌血清型に対する補完的防御を提供することができる追加の肺炎球菌ワクチン組成物が必要とされている。
米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号明細書 中国特許出願公開第１０１５９０２２４号明細書 米国特許出願公開第２０１１／０１９５０８６号明細書
Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ ２００５，５４（３６）：８９３－７ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １５９：６３４－４４ Ｗｈｉｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：１７３７－４６ Ｋｙａｗ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５４：１４５５－６３ Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９６：１３４６－５４ Ｔｒａｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４８：Ｓ１８１－Ｓ１８９ Ｐｒｙｍｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｌａｎｃｅｔ ３６７：７４０－４８ Ｋｉｅｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｎｏｎ－ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆ １３－ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ７－ｖａｌｅｎｔ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｇｉｖｅｎ ａｓ ａ ４－Ｄｏｓｅ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒｓ，ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ４８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＩＣＡＡＣ／ＩＳＤＡ ４６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２５－２８，２００８
本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は本明細書で定義される通りである組成物を提供する。
本発明の特定の実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、
ａ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ；
ｂ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０；および
ｃ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０
からなる群から選択される血清型のセットを含む。
本発明のさらなる特定の実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、
ａ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ；
ｂ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ；および
ｃ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ
からなる群から選択される血清型のセットを含む。
本発明のさらなる特定の実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、
ａ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ；
ｂ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ｂ；および
ｃ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ｂ
からなる群から選択される血清型のセットを含む。
いくつかの実施形態では、ａ）、ｂ）またはｃ）に列挙される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型のセットは、血清型６Ｃ、血清型６Ａ、または血清型６Ａおよび６Ｂをさらに含む。
いくつかの実施形態では、多糖類タンパク質コンジュゲートの少なくとも１つが、非プロトン性溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むコンジュゲーション反応によって形成される。具体的な実施形態では、多糖類タンパク質コンジュゲートの各々が、非プロトン性溶媒を含むコンジュゲーション反応によって形成される。本明細書に示されるように、多糖類－タンパク質コンジュゲートの還元的アミノ化中の溶媒としてＤＭＳＯを使用すると、水性条件下で調製された同じコンジュゲートと比較して、これらの血清型の予想外に優れた安定性および免疫原性増強が得られる。
ヒト患者で防御免疫応答を誘導する方法であって、本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与するステップを含む方法も提供される。本発明の方法のいくつかの実施形態では、患者が以前に多価肺炎球菌ワクチンで処置された。
本発明の多価免疫原性組成物は、異なる補完的肺炎球菌ワクチンを用いた処置レジメンの一部として使用され得る。したがって、本発明は、ヒト患者で防御免疫応答を誘導する方法であって、任意の順序で、本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与するステップを含み、多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与するステップをさらに含む方法を提供する。特定の実施形態では、多価肺炎球菌ワクチンが、複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートよりなり、ここで、コンジュゲートの各々は、担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含む。他の実施形態では、多価肺炎球菌ワクチンが、非コンジュゲート莢膜多糖類よりなる。
非プロトン性溶媒中でのコンジュゲーション反応を利用する血清型８肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類－タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、ここで、コンジュゲーション反応はシアノ水素化ホウ素を使用しない方法も提供される。
本発明はまた、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供し、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の選択血清型は他の選択血清型との交差反応性を提供する。
５０℃での重水（Ｄ２Ｏ）中の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型６Ｃの莢膜多糖類の６００ＭＨｚ一次元１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。内部標準（ＤＭＳＯおよびＤＳＳ－ｄ６）および残留水（ＨＯＤ）から発生するシグナルが示されている。＊で示されたマイナーシグナルは、Ｃ－多糖類および／またはペプチドグリカンのような肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）細胞壁残留物によるものである。 ５０℃での重水（Ｄ２Ｏ）中の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１５Ａの莢膜多糖類の６００ＭＨｚ一次元１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。内部標準（ＤＭＳＯおよびＤＳＳ－ｄ６）および残留水（ＨＯＤ）から発生するシグナルが示されている。＊で示されたマイナーシグナルは、Ｃ－多糖類および／またはペプチドグリカンのような肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）細胞壁残留物によるものである。 ５０℃での重水（Ｄ２Ｏ）中の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型脱Ｏ－アセチル化１５Ｂの莢膜多糖類の６００ＭＨｚ一次元１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。内部標準（ＤＭＳＯおよびＤＳＳ－ｄ６）および残留水（ＨＯＤ）から発生するシグナルが示されている。＊で示されたマイナーシグナルは、Ｃ－多糖類および／またはペプチドグリカンのような肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）細胞壁残留物によるものである。 ５０℃でのＤ２Ｏ中の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型３５Ｂの莢膜多糖類の６００ＭＨｚ一次元１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。内部標準（ＤＭＳＯおよびＤＳＳ－ｄ６）および残留水（ＨＯＤ）から発生するシグナルが示されている。＊で示されたマイナーシグナルは、Ｃ－多糖類および／またはペプチドグリカンのような肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）細胞壁残留物によるものである。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型６Ｃの血清型同定に有用な１Ｈ ＮＭＲ同定領域を示す図である。各単糖残基からの反復単位の各アノマープロトンのシグナル位置が示されている。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１５Ａの血清型同定に有用な１Ｈ ＮＭＲ同定領域を示す図である。各単糖残基からの反復単位の各アノマープロトンのシグナル位置が示されている。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型脱Ｏ－アセチル化１５Ｂの血清型同定に有用な１Ｈ ＮＭＲ同定領域を示す図である。各単糖残基からの各アノマープロトンのシグナル位置が示されている。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型３５Ｂの血清型同定に有用な１Ｈ ＮＭＲ同定領域を示す図である。各単糖残基からの反復単位の各アノマープロトンのシグナル位置が示されている。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１５Ｂの天然莢膜多糖類の６００ＭＨｚ一次元１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１５Ｂの脱Ｏ－アセチル化莢膜多糖類の６００ＭＨｚ一次元１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１５Ｃの莢膜多糖類の６００ＭＨｚ一次元１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。スペクトルは５０℃で、重水（Ｄ２Ｏ）中で取得した。内部標準（ＤＭＳＯおよびＤＳＳ－ｄ６）および残留水（ＨＯＤ）から発生するシグナルが示されている。＊で示されたシグナルは、Ｃ－多糖類および／またはペプチドグリカンのような肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）細胞壁残留物によるものである。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１５Ｂの天然莢膜多糖類の６００ＭＨｚ一次元１Ｈ ＮＭＲスペクトルのアノマー領域を示す図である。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１５Ｂの脱Ｏ－アセチル化莢膜多糖類の６００ＭＨｚ一次元１Ｈ ＮＭＲスペクトルのアノマー領域を示す図である。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１５Ｃの莢膜多糖類の６００ＭＨｚ一次元１Ｈ ＮＭＲスペクトルのアノマー領域を示す図である。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１５Ｂの天然莢膜多糖類のＯ－アセチルおよびＮ－アセチルメチルシグナルのスペクトルの領域を示す図である。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１５Ｂの脱Ｏ－アセチル化莢膜多糖類のＯ－アセチルおよびＮ－アセチルメチルシグナルのスペクトルの領域を示す図である。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１５Ｃの莢膜多糖類のＯ－アセチルおよびＮ－アセチルメチルシグナルのスペクトルの領域を示す図である。 ＨＰＳＥＣ－ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩを使用した、ＰＣＶ１６（０．１２８ｍｇ／ｍＬ）またはＰＣＶ２１（０．０８４ｍｇ／ｍＬもしくは０．１６９ｍｇ／ｍＬ）製剤の多糖類濃度に対する時間および温度（４℃で最大１２週間－ひし形、２５℃で最大４週間－正方形、３７℃で最大４週間－三角形）の影響を示す図である（実施例３９参照）。 プレフィルドシリンジに分注されたＰＣＶ１６（０．１２８ｍｇ／ｍＬ）またはＰＣＶ２１（０．０８４ｍｇ／ｍＬもしくは０．１６９ｍｇ／ｍＬ）製剤の多糖類濃度に対する水平回転攪拌および温度（４℃、２５℃または３７℃のいずれかで１週間）の影響を示す図である（実施例３９参照）。 ＨＰＳＥＣ－ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩを使用した、ＰＣＶ１６（０．１２８ｍｇ／ｍＬ）またはＰＣＶ２１（０．０８４ｍｇ／ｍＬもしくは０．１６９ｍｇ／ｍＬ）製剤の平均分子量（ＭｗおよびＭｎ）に対する、時間および温度（４℃、２５℃または３７℃のいずれかで最大４週間）にわたるＰＳ濃度の影響を示す図である。 ２８０ｎｍの励起波長で固有のタンパク質蛍光分光法を使用した、プロトン性溶媒中でコンジュゲートされた製剤原料を用いて調製した肺炎球菌コンジュゲートワクチン（全て水性コンジュゲーションを使用して製剤化したＰＣＶ１５）の安定性に対する時間および温度（４℃または３７℃で最大１週間）の影響を示す図である（実施例４０参照）。 ２８０ｎｍの励起波長で固有のタンパク質蛍光分光法を使用した、非プロトン性溶媒中でコンジュゲートされた製剤原料を用いて調製した肺炎球菌コンジュゲートワクチン（０．０６４ｍｇ／ｍＬ ＰｎＰｓで全てＤＭＳＯコンジュゲーションを使用して製剤化したＰＣＶ１６）の安定性に対する時間および温度（４℃または３７℃で最大１週間）の影響を示す図である（実施例４０参照）。 ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）で製剤化された肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）一価血清型で免疫されたウサギのＥＬＩＳＡ ＩｇＧ抗体希釈抗体価（投与２後）を示す図である。記号は個々の抗体価を示し、エラーバーは幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。 ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされ、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）で製剤化された肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）一価血清型で免疫されたウサギの血清型特異的ＯＰＡ希釈抗体価（投与２後）を示す図である。記号は個々の抗体価を示し、エラーバーは幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５一価コンジュゲートで免疫されたウサギのＥＬＩＳＡ ＩｇＧ抗体希釈抗体価（投与２後）を示す図である。Ｘ軸は、ウサギを免疫するために使用されるワクチンを示す。破線は、コーティング抗原として別個の肺炎球菌多糖類を使用した３つの別個のＥＬＩＳＡアッセイを分けている。記号は個々の抗体価を示し、エラーバーは幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５一価コンジュゲートで免疫されたウサギの血清型特異的ＯＰＡ希釈抗体価（免疫前、投与１後（ＰＤ１、プール）および投与２後（ＰＤ２））を示す図である。Ｘ軸は、ウサギを免疫するために使用されるワクチンを示す。破線は、別個の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）菌株を使用した３つのＯＰＡアッセイを分けている。記号は個々の抗体価を示し、エラーバーは幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。 ４、２、１、０．４、０．０８または０．０１６μｇ／用量のＰＣＶ２１でのワクチン接種後のＮＺＷＲ（１群当たり５匹）におけるＰＤ１抗体応答の比較を示す図である。記号は、ＰＤ１幾何平均抗体価（ＧＭＴ）比（２μｇ／用量群対他の用量群）を示し、エラーバーは９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。 その下限９５％信頼限界が１．０を超えるＧＭＴ比は薄い灰色であり、その上限９５％信頼限界が１．０未満であるＧＭＴ比は濃い灰色である図１９ＡのＧＭＴ比に対応するＰＣＶ２１用量比較ＰＤ１ ＧＭＴ比（９５％ＣＩ）を示す図である。交差防御を評価するために、血清型１５Ｂデータが含まれる。 ４、２、１、０．４、０．０８または０．０１６μｇ／用量のＰＣＶ２１でのワクチン接種後のＮＺＷＲ（１群当たり５匹）におけるＰＤ２抗体応答の比較を示す図である。記号はＰＤ２ ＧＭＴ比（２μｇ／用量群対他の用量群）を示し、エラーバーは９５％ＣＩを表す。 その下限９５％信頼限界が１．０を超えるＧＭＴ比は薄い灰色である図２０ＡのＧＭＴ比に対応するＰＣＶ２１用量比較ＰＤ２ ＧＭＴ比（９５％信頼区間）を示す図である。交差防御を評価するために、血清型１５Ｂデータが含まれる。 ＰＣＶ２１（２μｇ／ＰｎＰｓ）で免疫されたウサギの血清型特異的ＰＤ１ ＯＰＡ希釈抗体価を示す図である。記号は個々の抗体価を示し、エラーバーは幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＰＣＶ２１（２μｇ／ＰｎＰｓ）で免疫されたウサギについての血清型特異的ＰＤ２ ＯＰＡ希釈抗体価を示す図である。記号は個々の抗体価を示し、エラーバーは幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。交差防御を評価するために、血清型１５Ｂデータが含まれる。 ２８０ｎｍの励起波長で固有のタンパク質蛍光分光法を使用した、水性溶媒またはＤＭＳＯ溶媒中でコンジュゲートされた全ての製剤原料を用いて調製した肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ１）の安定性に対する時間および温度（すなわち、４℃で７日間、３７℃で１日間または３７℃で７日間）の影響を示す図である。 ２８０ｎｍの励起波長で固有のタンパク質蛍光分光法を使用した、水性溶媒またはＤＭＳＯ溶媒中でコンジュゲートされた全ての製剤原料を用いて調製した肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ７）の安定性に対する時間および温度（すなわち、４℃で７日間、３７℃で１日間または３７℃で７日間）の影響を示す図である。 ２８０ｎｍの励起波長で固有のタンパク質蛍光分光法を使用した、水性溶媒またはＤＭＳＯ溶媒中でコンジュゲートされた全ての製剤原料を用いて調製した肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ１４）の安定性に対する時間および温度（すなわち、４℃で７日間、３７℃で１日間または３７℃で７日間）の影響を示す図である。 ２８０ｎｍの励起波長で固有のタンパク質蛍光分光法を使用した、ＤＭＳＯ溶媒中でコンジュゲートされた全ての製剤原料を用いて調製した２１価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（０．０８４ｍｇ／ｍＬ ＰｎＰｓのＰＣＶ２１）の安定性に対する時間および温度（すなわち、４℃または３７℃で７日間）の影響を示す図である。 ０．０８４ｍｇ／ｍＬ ＰｎＰｓで、ＰＳ－２０（０％、０．０２５％、０．０５％、０．１％、０．１５％または０．２％；全てｗ／ｖ ＰＳ－２０）を用いて製剤化された６つのＰＣＶ２１肺炎球菌コンジュゲートワクチン製剤のナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）によって分析される粒径分布に対する温度（４℃または３７℃で７日間）および４℃での攪拌の影響を示す図である。 ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイによって分析される３つのＰＣＶ２１製剤の平均分子量に対する温度（４℃および３７℃）および攪拌の影響を示す図である。３つのＰＣＶ２１肺炎球菌コンジュゲートワクチン製剤は、０．０８４ｍｇ／ｍＬ ＰｎＰｓで異なる濃度のＰＳ－２０（０．０５％、０．１％および０．１５％ｗ／ｖ）を用いて製剤化した。 ＰＣＶ２１免疫マウスが肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）２４Ｆ気管内曝露から防御されることを示す図である。 非アジュバント化ＰＣＶ２１で免疫されたウサギについてのＥＣＬによって決定されるプレ（プール）、ＰＤ１（プール）およびＰＤ２ ＩｇＧ抗体希釈抗体価を示す図である。 ＡＰＡを用いて製剤化されたＰＣＶ２１で免疫されたウサギについてのＥＣＬによって決定されるプレ（プール）、ＰＤ１（プール）およびＰＤ２ ＩｇＧ抗体希釈抗体価を示す図である。エラーバーは、幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。交差防御を評価するために、血清型１５Ｂデータが含まれる。 非アジュバント化ＰＣＶ８で免疫されたウサギについてのＥＣＬによって決定されるプレ（プール）、ＰＤ１（プール）およびＰＤ２ ＩｇＧ抗体希釈抗体価を示す図である。 非アジュバント化ＰＣＶ１６で免疫されたウサギについてのＥＣＬによって決定されるプレ（プール）、ＰＤ１（プール）およびＰＤ２ ＩｇＧ抗体希釈抗体価を示す図である。 ＡＰＡを用いたＰＣＶ３１で免疫されたウサギについてのＥＣＬによって決定されるプレ（プール）、ＰＤ１（プール）およびＰＤ２ ＩｇＧ抗体希釈抗体価を示す図である。エラーバーは、幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の９５％信頼区間（ＣＩ）を表す。交差防御を評価するために、血清型１５Ｂデータが含まれる。 ＡＰＡを用いたまたは用いないＰＣＶ２１によるワクチン接種後のＮＺＷＲ（１群当たり５匹）におけるＰＤ２ ＥＣＬ抗体応答の比較を示す図である。記号はＰＤ２ ＧＭＴ比率を示し、エラーバーは９５％ＣＩを表す。交差防御を評価するために、血清型１５Ｂデータが含まれる。 ＰＣＶ２１、ＰＣＶ８またはＰＣＶ１６によるワクチン接種後の一般的な血清型および交差防御血清型１５ＢについてのＮＺＷＲ（１群当たり５）におけるＰＤ２ ＥＣＬ抗体応答の比較を示す図である。記号はＰＤ２ ＥＣＬ ＧＭＴ比を示し、エラーバーは９５％ＣＩを表す。 ＰＣＶ２１／ＡＰＡまたはＰＣＶ３１／ＡＰＡによるワクチン接種後の一般的な血清型および交差防御血清型１５ＢについてのＮＺＷＲ（１群当たり５匹）におけるＰＤ２ ＥＣＬ抗体応答の比較を示す図である。記号はＰＤ２ ＥＣＬ ＧＭＴ比を示し、エラーバーは９５％ＣＩを表す。 ＰＣＶで免疫されたウサギについての血清型特異的プレ（プール）ＯＰＡ希釈抗体価を示す図である。 ＰＣＶで免疫されたウサギについての血清型特異的プレ（プール）ＯＰＡ希釈抗体価を示す図である。 ＰＣＶで免疫されたウサギについての血清型特異的ＰＤ２ ＯＰＡ希釈抗体価を示す図である。 ＰＣＶで免疫されたウサギについての血清型特異的ＰＤ２ ＯＰＡ希釈抗体価を示す図である。エラーバーは、ＧＭＴの９５％ＣＩを表す。ＰＣＶ２１を統計学的比較のベンチマークとして使用した。＊ｐ＜０．０５。図Ａおよび図Ｃは、評価した全てのＰＣＶの８つの一般的な血清型（６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ）ならびにＰＣＶ１６、ＰＣＶ２１およびＰＣＶ３１の追加の８つの一般的な血清型（８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ｂ）についてのデータを示す。図Ｂおよび図Ｄは、図Ａおよび図Ｃに含まれていない追加の１６の血清型についてのデータを示す。そのうちの５つはＰＣＶ２１およびＰＣＶ３１の一般的な血清型でもあり（３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ）、１０の血清型はＰＣＶ３１にのみ含まれる（１、４、５、６Ａ、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ）。交差防御を評価するために、血清型１５Ｂデータが含まれる。 ＰＣＶ２１で免疫された成体アカゲザル（ｎ＝８）についてのＥＣＬによって決定されるプレ、ＰＤ１、ＰＤ２およびＰＤ３ ＩｇＧ抗体希釈抗体価を示す図である。エラーバーは、ＧＭＴの９５％ＣＩを表す。交差防御を評価するために、血清型１５Ｂデータが含まれる。 ＰＣＶ２１で免疫された成体アカゲザル（ｎ＝８）のプレ、ＰＤ１（プール）およびＰＤ３ ＯＰＡ希釈抗体価を示す図である。エラーバーは、ＧＭＴの９５％ＣＩを表す。交差防御を評価するために、血清型１５Ｂデータが含まれる。 ＰＣＶ２１で免疫された成体アカゲザルについてのＰＣＶ２１ワクチンに含まれていない４つの血清型に対するプレおよびＰＤ３（７０日目）ＯＰＡ抗体価を示す図である。 ＡＰＡを用いたまたは用いないＰＣＶ２１によるワクチン接種後の成体アカゲザル（１群当たり５匹）におけるＰＤ１ ＥＣＬ抗体応答の比較を示す図である。記号はＰＤ１ ＥＣＬ ＧＭＴ比（ＰＣＶ２１対ＰＣＶ２１／ＡＰＡ）を示し、エラーバーは９５％ＣＩを表す。交差防御を評価するために、血清型１５Ｂデータが含まれる。 ＰＣＶ１５またはＰｒｅｖｎａｒ１３と比較した、ＰＣＶ２１によるワクチン接種後の成体アカゲザル（１群当たり２～５匹）における血清型３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆに対するＰＤ１ ＩｇＧ抗体応答を示す図である。記号はＰＤ１ ＥＣＬ ＧＭＴ比を示し、エラーバーは９５％ＣＩを表す。 ６Ａ－ＣＲＭ１９７一価製剤で免疫されたウサギについての６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ（（免疫前およびＰＤ１、プール）およびＰＤ２）に対するＥＬＩＳＡ ＩｇＧ抗体希釈抗体価を示す図である。 ６Ｂ－ＣＲＭ１９７一価製剤で免疫されたウサギについての６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ（（免疫前およびＰＤ１、プール）およびＰＤ２）に対するＥＬＩＳＡ ＩｇＧ抗体希釈抗体価を示す図である。バーは幾何平均抗体価（ＧＭＴ）を示し、エラーバーはＧＭＴの９５％信頼区間（ＣＩ）を示す。 ６Ａ－ＣＲＭ１９７一価製剤で免疫されたウサギについての６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ（（免疫前およびＰＤ１、プール）およびＰＤ２）に対する血清型特異的ＯＰＡ希釈抗体価を示す図である。 ６Ｂ－ＣＲＭ１９７一価製剤で免疫されたウサギについての６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ（（免疫前およびＰＤ１、プール）およびＰＤ２）に対する血清型特異的ＯＰＡ希釈抗体価を示す図である。バーは幾何平均抗体価（ＧＭＴ）を示し、エラーバーはＧＭＴの９５％信頼区間（ＣＩ）を示す。 ２０Ａ－ＣＲＭ１９７／ＡＰＡで免疫されたウサギについての２０Ａおよび２０Ｂ（免疫前（プール）、ＰＤ１およびＰＤ２）に対する血清型特異的ＯＰＡ希釈抗体価を示す図である。 ＰＣＶ２１で免疫されたウサギについての２０Ａおよび２０Ｂ（免疫前（プール）、ＰＤ１およびＰＤ２）に対する血清型特異的ＯＰＡ希釈抗体価を示す図である。バーは幾何平均抗体価（ＧＭＴ）を示し、エラーバーはＧＭＴの９５％信頼区間（ＣＩ）を示す。
本発明は、肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は本明細書で定義される通りである組成物を提供する。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、（ａ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ；（ｂ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０；および（ｃ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０からなる群から選択される肺炎球菌血清型のセットを含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、（ａ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ；（ｂ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ｂ；および（ｃ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ｂからなる群から選択される肺炎球菌血清型のセットを含む。他の実施形態では、免疫原性組成物は、（ａ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ；（ｂ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ；および（ｃ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａからなる群から選択される肺炎球菌血清型のセットを含む。さらなる実施形態では、免疫原性組成物は、（ｉ）血清型６Ａ；（ｉｉ）血清型６Ａおよび６Ｂ；または（ｉｉｉ）血清型６Ｃを含む。特定の実施形態では、本発明は、複数の肺炎球菌の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は血清型３、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３３Ｆおよび３５Ｂを含む。前記組成物は、ウサギにおいて免疫原性であり、試験した全ての用量でワクチン型細菌株を殺傷する機能的抗体を産生することが分かった（実施例４３）。別の特定の実施形態では、本発明は、複数の肺炎球菌の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、血清型３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０、６Ａ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂを含む。別の特定の実施形態では、本発明は、複数の肺炎球菌の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートの各々は、担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、血清型３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ｂ、６Ａ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂを含む。別の特定の実施形態では、本発明は、複数の肺炎球菌の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートの各々は、担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、血清型３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂを含む。
本発明の多価免疫原性組成物は、ワクチン型肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に対して患者を免疫するのに、および異なる補完的肺炎球菌ワクチン（類）を用いた処置レジメンの一部として有用である。したがって、本発明は、ヒト患者で防御免疫応答を誘導する方法であって、任意の順序で、本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与するステップを含み、更に、多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与するステップをさらに含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明の多価免疫原性組成物は、以前に異なる多価肺炎球菌ワクチンで免疫された患者に投与される。
本発明の実施形態では、少なくとも１つの肺炎球菌血清型からのコンジュゲートは、ＤＭＳＯのような非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用して調製される。さらなる実施形態では、多価免疫原性組成物は、各々が非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用して調製された肺炎球菌コンジュゲートを含む。各々が非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用して調製された製剤原料を含むＰＣＶ１、ＰＣＶ７、ＰＣＶ１４、ＰＣＶ１６およびＰＣＶ２１（以下で定義される）製剤は、炭水化物の解重合または化学分解に対して安定であり、製剤中のタンパク質の凝集に対して安定であることが本明細書で示されている（実施例４０および実施例４５参照）。ＤＭＳＯ溶媒を使用すると、担体タンパク質の表面上のリジン残基の直接消費を通して、多糖類とタンパク質の共有結合性会合が増強される。共有結合性会合の増加は、ＤＭＳＯ中でコンジュゲートされた多糖類抗原を含む多価免疫原性組成物の多糖類タンパク質コンジュゲートの安定性を増加させることに直接的な利益をもたらす。
Ｉ．定義および略語
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して使用される場合、以下の略語が適用される：
ＡＰＡ リン酸アルミニウムアジュバント
ＡＰＣ 抗原提示細胞
ＣＩ 信頼区間
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＳ 多糖類－タンパク質製剤原料
ＧＭＣ 幾何平均濃度
ＧＭＴ 幾何平均抗体価
ＨＰＳＥＣ 高速サイズ排除クロマトグラフィー
ＩＭ 筋肉内のまたは筋肉内に
ＬＯＳ リポオリゴ糖
ＬＰＳ リポ多糖
ＭＡＬＳ 多角度光散乱
ＭＢＣ 一価バルクコンジュゲート
ＭＯＰＡ 多重オプソニン食細胞アッセイ
ＭＷ 分子量
ＮＭＷＣＯ 公称分子量カットオフ
ＮＺＷＲ ニュージーランドホワイト種ウサギ
ＯＰＡ オプソニン食作用アッセイ
ＰＣＶ 肺炎球菌コンジュゲートワクチン
ＰＤ１ 投与１後
ＰＤ２ 投与２後
ＰｎＰｓ 肺炎球菌多糖類
Ｐｓ 多糖類
ＰＳ－２０ ポリソルベート－２０
ＲＩ 屈折率
ＵＶ 紫外線
ｗ／ｖ 体積当たり重量。
本発明がより容易に理解されるように、一定の技術用語および科学用語を以下に具体的に定義する。この文書の他で具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
本明細書を通しておよび添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の意味を有することが明らかな場合を除き、複数指示対象を含む。
「または」への言及は、文脈が示される可能性の１つを明確に指示しない限り、いずれかまたは両方の可能性を示す。場合によっては、いずれかまたは両方の可能性を強調するために「および／または」を使用した。
「水性溶媒」または「水性条件」という用語は、還元的アミノ化のようなコンジュゲーションで使用される場合、コンジュゲート反応のための溶媒としての水の使用を指す。水は、有機溶媒が存在しないことを除いて緩衝剤および他の成分を含有してもよい。
「非プロトン性溶媒」、「ＤＭＳＯ溶媒」または「ＤＭＳＯ条件」という用語は、還元的アミノ化のようなコンジュゲーションで使用される場合、コンジュゲーション反応のための溶媒としての、非プロトン性溶媒、または非プロトン性溶媒の組み合わせ（または該当する場合ＤＭＳＯ）の使用を指す。非プロトン性溶媒は、例えば最大１％、２％、５％、１０％または２０％存在するいくらかの水を含んでもよい。
「含む」という用語は、本発明の免疫原性組成物で使用される場合、アジュバントおよび賦形剤のような他の任意の成分の包含、または具体的に列挙されていない１以上の多糖類－タンパク質コンジュゲートの添加を指す。「～からなる」という用語は、多価多糖類－タンパク質コンジュゲート混合物で使用される場合、特定の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを有し、異なる血清型の他の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを有さない混合物を指す。「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「～から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のような変形は、列挙される要素または要素群の包含、および指定される投与レジメン、方法または組成物の基本的なまたは新規な特性を実質的に変化させない、列挙される要素と類似のまたは異なる性質の他の要素の任意の包含を示す。
本発明の組成物の「有効量」は、その後の曝露中に、微生物例えば肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）の感染性（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｉｙ）の可能性または重症度を有意に低下させる抗体を誘発するのに必要な用量を指す。
本明細書で使用される場合、「肺炎球菌疾患を予防するために必要とされる」という語句は、ワクチンまたは免疫原性組成物が、米国食品医薬品局などの１以上の規制当局によって、限定されるものではないが、肺炎球菌疾患一般、肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌性髄膜炎、肺炎球菌性菌血症、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）によって引き起こされる侵襲性疾患、および肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）によって引き起こされる中耳炎を含む、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のいずれかの血清型によって引き起こされる１以上の疾患を予防するために承認されていることを意味する。
「多価肺炎球菌ワクチン」は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の２つ以上の血清型によって引き起こされる疾患または病的症状に対する能動免疫を提供する、２つ以上の活性薬剤（例えば、肺炎球菌莢膜多糖類または肺炎球菌多糖類タンパク質コンジュゲート）を含む医薬品である。
「多糖類」という用語は、免疫および細菌ワクチン技術で一般的に用いられる任意の抗原糖要素（または抗原単位）を含むことを意味し、限定されるものではないが、「糖」、「オリゴ糖」、「多糖」または「リポ多糖」、「リポオリゴ糖（ＬＯＳ）」、「リポ多糖（ＬＰＳ）」、「グリコシレート」、「グリココンジュゲート（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」などを含む。
「ＰＣＶ１」は、本明細書で使用される場合、担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む、１つの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む１価肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は３である（実施例３８および４５に例示される）ワクチンを指す。特定の実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
「ＰＣＶ７」は、本明細書で使用される場合、各々が担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む、７つの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む７価肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は３、８、９Ｎ、１１Ａ、１９Ａ、１５Ａおよび１０Ａである。具体的な実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの１以上の担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。さらなる実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの各々の担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。
「ＰＣＶ８」は、本明細書で使用される場合、各々が担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む、８つの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む８価肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂである。具体的な実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの１以上の担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。さらなる実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの各々の担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。
「ＰＣＶ１４」は、本明細書で使用される場合、各々が担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む、１４の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む１４価肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は３、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆおよび３３Ｆである。具体的な実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの１以上の担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。さらなる実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの各々の担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。
「ＰＣＶ１５」は、本明細書で使用される場合、各々が担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む、１５の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆである。具体的な実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの１以上の担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。さらなる実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの各々の担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。
「ＰＣＶ１６」は、本明細書で使用される場合、各々が担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む、１６の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む１６価肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は６Ｃ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂならびに以下の血清群１５の血清型：１５Ｂ、１５Ｃまたは脱Ｏ－アセチル化１５Ｂの少なくとも１つである。特定の実施形態では、血清群１５の血清型が、血清型１５Ｃまたは脱Ｏ－アセチル化１５Ｂである。本明細書に示されるように（以下の実施例３参照）、脱Ｏ－アセチル化血清型１５Ｂ肺炎球菌多糖類は、血清型１５Ｃ肺炎球菌多糖類と同等であり、同一のＮＭＲスペクトルを有する。具体的な実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの１以上の担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。さらなる実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの各々の担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。
「ＰＣＶ２１」は、本明細書で使用される場合、各々が担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む、２１の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む２１価肺炎球菌コンジュゲートワクチンであって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は３、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３３Ｆおよび３５Ｂならびに以下の血清群１５の血清型：１５Ｂ、１５Ｃまたは脱Ｏ－アセチル化１５Ｂの少なくとも１つである。特定の実施形態では、血清群１５の血清型が、血清型１５Ｃまたは脱Ｏ－アセチル化１５Ｂである。具体的な実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの１以上の担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。さらなる実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの各々の担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。
肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２０Ａおよび２０Ｂが、遺伝子解析により２０１２年に血清群２０内で同定された（Ｃａｌｉｘ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１２）２８７（３３）：２７８８５－２７８９４）。Ｃａｌｉｘ Ｊ．Ｊ．らによって議論されるように、従来の血清型分類法および市販の抗体は、これら２つの血清型を以前は識別することができず、血清型２０Ａおよび２０Ｂの血清型分類の取り組みに関する情報は現在限られている。さらに、血清群２０によって引き起こされる特定された疾患内の２０Ａまたは２０Ｂの疾患有病率は、十分には理解されていない。したがって、当業者は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ワクチン組成物にこれらの２つの血清型（２０Ａおよび／または２０Ｂ）のいずれかまたは両方を含めることを選択するかもしれない。一方の血清型２０多糖類抗原を含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ワクチンが別の血清型に対して交差防御する可能性があることも考えられる（例えば、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２０Ａの多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、血清型２０Ｂの多糖類タンパク質コンジュゲートを含まないワクチンが、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２０Ｂによる感染に対して交差防御する可能性がある）。したがって、本明細書で使用される「血清型２０」は、血清型２０Ａおよび／または血清型２０Ｂの多糖類タンパク質コンジュゲートを含む組成物を指し得る。
「ＣｐＧ含有ヌクレオチド」、「ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」および類似の用語は、非メチル化ＣｐＧ部分を含む６～５０ヌクレオチド長のヌクレオチド分子を指す。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：４２９７を参照されたい。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、合成ヌクレオシド間結合、修飾塩基および／または修飾糖を使用した修飾オリゴヌクレオチドを含む。
本明細書で定義される「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を増強するのに役立つ物質である。免疫アジュバントは、単独で投与した場合に免疫原性が弱い、例えば誘導する抗体価もしくは細胞媒介免疫応答がないもしくは弱い抗原に対する免疫応答を増強する、抗原に対する抗体価を増加させる、および／または個体の免疫応答を達成するのに有効な抗原の用量を低下させることができる。したがって、アジュバントは、通常、免疫応答を増強するために与えられ、当業者に周知である。
「患者」（あるいは本明細書では「対象」と呼ばれる）は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染することができる哺乳動物を指す。好ましい実施形態では、患者がヒトである。患者を予防的または治療的に処置することができる。予防的処置は、肺炎球菌感染症またはその効果、例えば肺炎球菌性肺炎の可能性または重症度を減少させるのに十分な防御免疫を提供する。治療的処置は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染症またはその臨床的効果の重症度を減少させるまたは再発を防止するために実施され得る。本明細書に記載されるように、本発明の多価免疫原性組成物を使用して予防的処置を実施することができる。本発明の組成物を、一般集団または肺炎球菌感染症のリスクが高い人々、例えば高齢者、または高齢者と一緒に暮らしているもしくは高齢者を介護している人々に投与することができる。
「処置を必要とする」人には、以前に肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に曝露または感染した人、以前に肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対してワクチン接種された人、ならびに感染する傾向がある人、または感染の可能性の減少が望ましい人、例えば免疫不全、高齢者、子供、成人または健康な個体が含まれる。
「安定な」多価免疫原性組成物は、冷蔵温度（例えば、２～８℃または４℃）で少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月および／または２４ヶ月間、有意な変化が観察されない組成物である。さらに、「安定な」組成物は、２５℃および３７℃を含む温度で、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月および／または２４ヶ月を含む期間にわたって所望の特徴を示すものを含む。安定性の典型的な許容基準は次の通りである：以下の１以上の変動が約５％、約１０％、約１５％または約２０％以下である：（ａ）組成物中の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの数平均分子量（Ｍｎ）、（ｂ）組成物中の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの重量平均分子量（Ｍｗ）、（ｃ）組成物中の総多糖類濃度、（ｄ）特定の励起波長、例えば２８０ｎｍで固有のタンパク質蛍光分光法を使用して測定される組成物の発光極大、および（ｅ）特定の励起波長で固有のタンパク質蛍光分光法を使用して測定される組成物の蛍光強度。「安定な」という用語はまた、多価免疫原性組成物内の特定の肺炎球菌コンジュゲートを指すためにも使用され得る。このような使用において、この用語は、特定の温度で経時的に所望の特性を示すコンジュゲートを指し、このような特性は、言及される時間および温度にわたって約５％、約１０％、約１５％または約２０％以下しか変動しない。
ＩＩ．多価免疫原性組成物
本発明は、複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含む組成物を提供する。本発明の多価免疫原性組成物の異なる態様および実施形態を以下に記載する。
一実施形態（実施形態Ｅ１）では、本発明は、各々が担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む、複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、
（１）１５Ａ、
（２）１６Ｆ、
（３）（ａ）２３Ａおよび２３Ｂ、（ｂ）２３Ａおよび２３Ｆ、（ｃ）２３Ｂおよび２３Ｆ、（ｄ）２３Ａ、（ｅ）２３Ｂ、および（ｆ）２３Ｆから選択される１以上の血清群２３の血清型、
（４）２４Ｆ、
（５）３１、および
（６）３５Ｂ
を含む、からなる、またはから本質的になる組成物を提供する。
実施形態Ｅ１の下位実施形態では、１以上の血清群２３の血清型が２３Ａおよびおよび２３Ｂである（すなわち、他の血清群２３の血清型が存在しない）。実施形態Ｅ１のさらなる下位実施形態では、１以上の血清群２３の血清型が２３Ａおよび２３Ｆである。実施形態Ｅ１の別の下位実施形態では、１以上の血清群２３の血清型が２３Ｂおよび２３Ｆである。実施形態Ｅ１のさらに別の下位実施形態では、２３Ａが唯一の血清群２３の血清型である。実施形態Ｅ１のさらなる下位実施形態では、２３Ｂが唯一の血清群２３の血清型である。実施形態Ｅ１のなおさらなる下位実施形態では、２３Ｆが唯一の血清群２３の血清型である。
第２の実施形態（実施形態Ｅ２）では、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む、複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型が、実施形態Ｅ１または実施形態Ｅ１のいずれかの下位実施形態に示される血清型を含み、血清型：（１）６Ｃ、（２）６Ａ、または（３）６Ａおよび６Ｂをさらに含む組成物を提供する。
実施形態Ｅ２の下位実施形態では、組成物が血清型６Ｃを含む。実施形態Ｅ２のさらなる下位実施形態では、組成物が血清型６Ａおよび６Ｂを含み、そして、血清型６Ｃを含まない。実施形態Ｅ２の別の下位実施形態では、組成物が血清型６Ａを含む。
第３の実施形態（実施形態Ｅ３）では、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む、複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型が、実施形態Ｅ１、または実施形態Ｅ１のいずれかの下位実施形態、または実施形態Ｅ２、または実施形態Ｅ２のいずれかの下位実施形態に示される血清型を含み、そして、血清型：
（１）８、
（２）９Ｎ、
（３）１１Ａ
（４）１２Ｆ、
（５）１５Ｂまたは１５Ｃ、
（６）１７Ｆ、および
（７）２０Ａおよび／または２０Ｂ
をさらに含む組成物を提供する。
第４の実施形態（実施形態Ｅ４）では、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む、複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型が、実施形態Ｅ１～Ｅ３のまたはそのいずれかの下位実施形態のいずれかに示される血清型を含み、そして、血清型：１０Ａまたは３９をさらに含む組成物を提供する。
第５の実施形態（実施形態Ｅ５）では、本発明は、上記の複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型が、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂを含む、からなる、またはから本質的になる組成物を提供する。
第６の実施形態（実施形態Ｅ６）では、本発明は、上記の複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型が、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂを含む、からなる、またはから本質的になる組成物を提供する。
第７の実施形態（実施形態Ｅ７）では、本発明は、上記の複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型が、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂを含む、からなる、またはから本質的になる組成物を提供する。
第８の実施形態（実施形態Ｅ８）では、本発明は、上記の複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型が、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂを含む、からなる、またはから本質的になる組成物を提供する。
第９の実施形態（実施形態Ｅ９）では、本発明は、上記の複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型が、実施形態Ｅ１～Ｅ８（またはそのいずれかの下位実施形態）のいずれかに示される血清型を含み、そして、血清型：３、７Ｆおよび１９Ａをさらに含む組成物を提供する。
第１０の実施形態（実施形態Ｅ１０）では、本発明は、上記の複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型が、実施形態Ｅ１～Ｅ９（またはそのいずれかの下位実施形態）のいずれかに示される血清型を含み、そして、血清型２２Ｆをさらに含む組成物を提供する。
第１１の実施形態（実施形態Ｅ１１）では、本発明は、上記の複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型が、実施形態Ｅ１～Ｅ１０（またはそのいずれかの下位実施形態）のいずれかに示される血清型を含み、そして、血清型３３Ｆをさらに含む組成物を提供する。
第１２の実施形態（実施形態Ｅ１２）では、本発明は、上記の複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型は、
（１）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（３）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（４）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（５）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（６）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（７）６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（８）６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（９）６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１０）６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１１）６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１２）６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１３）６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１４）６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１５）６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１６）６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１７）６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１８）６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１９）６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２０）６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２１）６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２２）６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２４Ｆ、３１、および３５Ｂ、
（２３）６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、および３５Ｂ、および
（２４）６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３５Ｂ
からなる群から選択される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型のセットを含む、からなる、またはから本質的になる組成物を提供する。
第１３の実施形態（実施形態Ｅ１３）では、本発明は、上記の複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型は、
（１）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（３）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（４）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（５）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（６）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（７）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（８）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（９）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１０）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１１）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１２）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１３）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１４）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１５）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１６）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１７）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１８）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１９）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２０）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２１）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２２）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２３）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２４）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２５）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２６）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２７）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２８）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２９）８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（３０）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（３１）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、および
（３２）８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ
からなる群から選択される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型のセットを含む、からなる、またはから本質的になる組成物を提供する。
第１３の実施形態（実施形態Ｅ１３）は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の行（１）～（３２）のセットをさらに含み、ここで、各セットの血清型２０Ａは、血清型２０または血清型２０Ｂのいずれかで置換される。
本発明の第１４の実施形態（実施形態Ｅ１４）では、本発明は、上記の複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型は、実施形態Ｅ１３の行（１７）～（３２）に示される血清型のセットのいずれかから選択される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型のセットを含む、からなる、またはから本質的になり、血清型２３Ａおよび／または２３Ｂをさらに含む組成物を提供する。
第１５の実施形態（実施形態Ｅ１５）では、本発明は、上記の複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型は、
（１）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（３）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（４）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（５）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（６）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（７）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（８）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（９）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１０）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１１）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１２）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１３）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１４）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１５）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１６）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１７）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１８）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（１９）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２０）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２１）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２２）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２３）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２４）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２５）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２６）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２７）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２８）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（２９）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（３０）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（３１）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（３２）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０Ａ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
（３３）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ｂ、
（３４）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｂ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ、
（３５）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｂ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ｂ、
（３６）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ｂ、
（３７）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｂ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ、
（３８）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｂ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ｂ、
（３９）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０
（４０）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｂ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０
（４１）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｂ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０
（４２）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０
（４３）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｂ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０、および
（４４）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｂ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０
からなる群から選択される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型のセットを含む、からなる、またはから本質的になる組成物を提供する。
本発明の第１６の実施形態（実施形態Ｅ１６）では、本発明は、上記の複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型は、実施形態Ｅ１５の行（１７）～（３２）に示される血清型のセットのいずれかから選択される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型のセットを含む、からなる、またはから本質的になり、血清型２３Ａおよび／または２３Ｂをさらに含む組成物を提供する。
第１７の実施形態（実施形態Ｅ１７）では、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む、複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、
ｉ．６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、
ｉｉ．６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ、および
ｉｉｉ．３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ
からなる群から選択される血清型のセットを含む組成物を提供する。
実施形態Ｅ１７の下位実施形態では、免疫原性組成物は、さらなる肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含まない。
第１８の実施形態（実施形態Ｅ１８）では、本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂの莢膜多糖類を含む複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供する。実施形態Ｅ１８の下位実施形態では、免疫原性組成物は、さらなる肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含まない。
第１９の実施形態（実施形態Ｅ１９）では、本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａの莢膜多糖類を含む複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供する。実施形態Ｅ１９の下位実施形態では、免疫原性組成物は、さらなる肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含まない。
第２０の実施形態（実施形態Ｅ２０）では、本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａの莢膜多糖類を含む複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供する。実施形態Ｅ２０の下位実施形態では、免疫原性組成物は、さらなる肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含まない。
別の実施形態では、本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａの莢膜多糖類を含む複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供する。この実施形態の下位実施形態（すなわち、３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ）では、免疫原性組成物は、さらなる肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含まない。
別の実施形態では、本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０の莢膜多糖類を含む複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供する。この実施形態の下位実施形態（すなわち、３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０）では、免疫原性組成物は、さらなる肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含まない。
別の実施形態では、本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ｂの莢膜多糖類を含む複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を提供する。この実施形態の下位実施形態（すなわち、３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ｂ）では、免疫原性組成物は、さらなる肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含まない。
本明細書に示されるように（以下の実施例３参照）、脱Ｏ－アセチル化血清型１５Ｂ肺炎球菌多糖類は、血清型１５Ｃ肺炎球菌多糖類と同等であり、同一のＮＭＲスペクトルを有する。本明細書に記載および開示される脱Ｏ－アセチル化血清型１５Ｂ肺炎球菌多糖類は、血清型１５Ｃ肺炎球菌多糖類と同等であり、両者とも０～５％の範囲、または０～４％の範囲、または０～３％の範囲、または０～２％の範囲、または０～１％の範囲、または０～０．５％の範囲、または０～０．１％の範囲の反復単位当たりのＯ－アセチル含有量を有し得る、またはＯ－アセチル含有量がない。Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｂ．Ｌ．らの報告では、１５ＣがわずかにＯ－アセチル化されていてもよい（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｖａｃ．Ｉｍｍｕｎｏ．（２０１７）２４（８）：１－１３）。したがって、本明細書の多価免疫原性組成物の実施形態のいずれでも、血清型１５Ｃの代わりに脱Ｏ－アセチル化血清型１５Ｂを使用することができる。脱Ｏ－アセチル化の方法は、例えば、Ｒａｊａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７，１４（９）：１２２３－１２２７に記載されているように当技術分野で知られている。
実施形態Ｅ１～Ｅ２０およびそのいずれかの下位実施形態を含む、本発明の多価免疫原性組成物のいずれかの一定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
交差反応性
一実施形態では、本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は、担体タンパク質にコンジュゲートされた血清型６Ｃを含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型６Ｃは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型６Ａおよび６Ｂに対する交差防御を提供する組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、実施形態Ｅ１～Ｅ２０から選択される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々が担体タンパク質にコンジュゲートされた血清型６Ｃを含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型６Ｃは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型６Ａおよび６Ｂに対する交差防御を提供する組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々が担体タンパク質にコンジュゲートされた血清型１９Ａを含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１９Ａは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１９Ｆに対する交差防御を提供する組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、実施形態Ｅ１～Ｅ２０から選択される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた血清型１９Ａを含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１９Ａは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１９Ｆに対する交差防御を提供する組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた血清型２３Ａおよび／または２３Ｂを含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型２３Ａおよび／または２３Ｂは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型２３Ｆに対する交差防御を提供する組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、実施形態Ｅ１～Ｅ２０から選択される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた血清型２３Ａおよび／または２３Ｂを含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型２３Ａおよび／または２３Ｂは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型２３Ｆに対する交差防御を提供する組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた血清型６Ａを含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型６Ａは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型６Ｂおよび／または６Ｃに対する交差防御を提供する組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、実施形態Ｅ１～Ｅ２０から選択される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた血清型６Ａを含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型６Ａは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型６Ｂおよび／または６Ｃに対する交差防御を提供する組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた血清型２０Ａを含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型２０Ａは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型２０Ｂに対する交差防御を提供する組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、実施形態Ｅ１～Ｅ２０から選択される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた血清型２０Ａを含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型２０Ａは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型２０Ｂに対する交差防御を提供する組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた血清型２０Ｂを含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型２０Ｂは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型２０Ａに対する交差防御を提供する組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、実施形態Ｅ１～Ｅ２０から選択される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた血清型２０Ｂを含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型２０Ｂは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型２０Ａに対する交差防御を提供する組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた血清型１５Ｃを含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１５Ｃは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１５Ｂに対する交差防御を提供する組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、実施形態Ｅ１～Ｅ２０から選択される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた血清型１５Ｃを含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１５Ｃは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１５Ｂに対する交差防御を提供する組成物を提供する。
担体タンパク質
本発明の特定の実施形態では、ＣＲＭ１９７が担体タンパク質として使用される。ＣＲＭ１９７は、以下のアミノ酸配列：
ＧＡＤＤＶＶＤＳＳＫ ＳＦＶＭＥＮＦＳＳＹ ＨＧＴＫＰＧＹＶＤＳ ＩＱＫＧＩＱＫＰＫＳ ＧＴＱＧＮＹＤＤＤＷ ＫＥＦＹＳＴＤＮＫＹ ＤＡＡＧＹＳＶＤＮＥ ＮＰＬＳＧＫＡＧＧＶ ＶＫＶＴＹＰＧＬＴＫ ＶＬＡＬＫＶＤＮＡＥ ＴＩＫＫＥＬＧＬＳＬ ＴＥＰＬＭＥＱＶＧＴ ＥＥＦＩＫＲＦＧＤＧ ＡＳＲＶＶＬＳＬＰＦ ＡＥＧＳＳＳＶＥＹＩ ＮＮＷＥＱＡＫＡＬＳ ＶＥＬＥＩＮＦＥＴＲ ＧＫＲＧＱＤＡＭＹＥ ＹＭＡＱＡＣＡＧＮＲ ＶＲＲＳＶＧＳＳＬＳ ＣＩＮＬＤＷＤＶＩＲ ＤＫＴＫＴＫＩＥＳＬ ＫＥＨＧＰＩＫＮＫＭ ＳＥＳＰＮＫＴＶＳＥ ＥＫＡＫＱＹＬＥＥＦ ＨＱＴＡＬＥＨＰＥＬ ＳＥＬＫＴＶＴＧＴＮ ＰＶＦＡＧＡＮＹＡＡ ＷＡＶＮＶＡＱＶＩＤ ＳＥＴＡＤＮＬＥＫＴ ＴＡＡＬＳＩＬＰＧＩ ＧＳＶＭＧＩＡＤＧＡ ＶＨＨＮＴＥＥＩＶＡ ＱＳＩＡＬＳＳＬＭＶ ＡＱＡＩＰＬＶＧＥＬ ＶＤＩＧＦＡＡＹＮＦ ＶＥＳＩＩＮＬＦＱＶ ＶＨＮＳＹＮＲＰＡＹ ＳＰＧＨＫＴＱＰＦＬ ＨＤＧＹＡＶＳＷＮＴ ＶＥＤＳＩＩＲＴＧＦ ＱＧＥＳＧＨＤＩＫＩ ＴＡＥＮＴＰＬＰＩＡ ＧＶＬＬＰＴＩＰＧＫ ＬＤＶＮＫＳＫＴＨＩ ＳＶＮＧＲＫＩＲＭＲ ＣＲＡＩＤＧＤＶＴＦ ＣＲＰＫＳＰＶＹＶＧ ＮＧＶＨＡＮＬＨＶＡ ＦＨＲＳＳＳＥＫＩＨ ＳＮＥＩＳＳＤＳＩＧ ＶＬＧＹＱＫＴＶＤＨ ＴＫＶＮＳＫＬＳＬＦ ＦＥＩＫＳ（配列番号１）
を有するジフテリア毒素の非毒性変異体（すなわち、トキソイド）である。
一実施形態では、ＣＲＭ１９７は、カザミノ酸および酵母エキス系培地で増殖させたジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離される。別の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号明細書に記載される方法に従って組換え的に調製される。典型的には、ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせを通して精製される。いくつかの実施形態では、ＣＲＭ１９７は、Ｐｆｅｎｅｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）（Ｐｆｅｎｅｘ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）で調製される。
他の適切な担体タンパク質には、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）またはＤＴのフラグメントＢ（ＤＴＦＢ）、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、国際公開第２００４／０８３２５１号に記載される）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の外毒素Ａなどの追加の不活化細菌毒素が含まれる。細菌外膜タンパク質、例えば外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ；国際公開第０２／０９１９９８号参照）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）、Ａ群もしくはＢ群連鎖球菌のＣ５ａペプチダーゼ、またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）プロテインＤ、肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３；２７０６－１３）（ある様式で解毒されたｐｌｙ、例えばｄＰＬＹ－ＧＭＢＳ（国際公開第０４／０８１５１５号参照）またはｄＰＬＹ－ホルモールを含む）、ＰｈｔＸ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥおよびＰｈｔタンパク質の融合体、例えばＰｈｔＤＥ融合体、ＰｈｔＢＥ融合体（国際公開第０１／９８３３４号および国際公開第０３／５４００７号参照）を含む）も使用することができる。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ＰｏｒＢ（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来）、ＰＤ（インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ；例えば欧州特許第０５９４ ６１０号明細書参照）またはその免疫学的に機能的な等価物、合成ペプチド（欧州特許第０３７８８８１号明細書および欧州特許第０４２７３４７号明細書参照）、熱ショックタンパク質（国際公開第９３／１７７１２号および国際公開第９４／０３２０８号参照）、百日咳タンパク質（国際公開第９８／５８６６８号および欧州特許第０４７１１７７号明細書参照）、サイトカイン、リンホカイン、成長因子またはホルモン（国際公開第９１／０１１４６号参照）、種々の病原体由来抗原の複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３８１６－３８２４参照）、例えばＮ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：４８８４－７参照）、鉄取り込みタンパク質（国際公開第０１／７２３３７号参照）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ（国際公開第００／６１７６１号参照）、およびフラジェリン（Ｂｅｎ－Ｙｅｄｉｄｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６４：９参照）などの他のタンパク質も担体タンパク質として使用することができる。
ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２１８：３８３８－３８４４）；ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７ならびにＮｉｃｈｏｌｌｓ ａｎｄ Ｙｏｕｌｅ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ，Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ，１９９２によって記載される他の突然変異；Ｇｌｕ－１４８からＡｓｐ、ＧｌｎまたはＳｅｒおよび／またはＡｌａ １５８からＧｌｙへの欠失または突然変異ならびに米国特許第４，７０９，０１７号明細書または米国特許第４，９５０，７４０号明細書に開示される他の突然変異；少なくとも１以上の残基Ｌｙｓ ５１６、Ｌｙｓ ５２６、Ｐｈｅ ５３０および／またはＬｙｓ ５３４の突然変異ならびに米国特許第５，９１７，０１７号明細書または米国特許第６，４５５，６７３号明細書に開示される他の突然変異；または米国特許第５，８４３，７１１号明細書に開示される断片のような他のＤＴ突然変異体を、担体タンパク質として使用することができる。このようなＤＴ突然変異体を使用して、エピトープ領域を含むＢフラグメントを含むＤＴＦＢ変異体を作製することもできる。
一定の実施形態では、担体タンパク質は、外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、プロテインＤおよびＣＲＭ１９７からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態では、第２の担体を、多価免疫原性組成物中の多糖類タンパク質コンジュゲートの１以上に使用することができる。第２の担体タンパク質は、好ましくは、非毒性で、非反応原性（ｎｏｎ－ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）で、十分な量および純度で入手可能なタンパク質である。第２の担体タンパク質も、抗原の免疫原性を増強するために肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類とコンジュゲートまたは連結される。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適しているべきである。一実施形態では、第１の担体タンパク質にコンジュゲートされていない各莢膜多糖類が、同じ第２の担体タンパク質にコンジュゲートされている（例えば、各莢膜多糖類分子が単一の担体タンパク質にコンジュゲートされている）。別の実施形態では、第１の担体タンパク質にコンジュゲートされていない莢膜多糖類が、２つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートされている（各莢膜多糖類分子が単一の担体タンパク質にコンジュゲートされている）。このような実施形態では、同じ血清型の各莢膜多糖類が、典型的には、同じ担体タンパク質にコンジュゲートされている。
実施形態Ｅ１～Ｅ２０およびそのいずれかの下位実施形態のいずれかを含む本発明の実施形態では、多糖類血清型の１以上（該当する場合、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１を含む）がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。実施形態Ｅ１～Ｅ２０およびそのいずれかの下位実施形態のいずれかを含む本発明のさらなる実施形態では、多糖類血清型の各々がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。
本発明の多糖類－タンパク質コンジュゲートの製剤化は、当技術分野で認識されている方法を使用して達成することができる。例えば、個々の肺炎球菌コンジュゲートは、組成物を調製するため生理学的に許容されるビヒクルを用いて製剤化することができる。このようなビヒクルの例としては、限定されるものではないが、水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびデキストロース溶液を含む。
好ましい実施形態では、ワクチン組成物は、塩化ナトリウムを含むＬ－ヒスチジン緩衝剤中で製剤化される。
本発明のいくつかの実施形態では、多価免疫原性組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートと、アジュバントとを含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型は本明細書に記載される通りである。組成物の有効性を増強するための適切なアジュバントには、限定されるものではないが、以下が含まれる：
（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等；
（２）水中油型エマルジョン配合物（他の特定の免疫賦活剤、例えばムラミルペプチド（以下に定義される）または細菌細胞壁成分を含むまたは含まない）、例えば（ａ）Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフリューダイザ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）などのマイクロフリューダイザを使用してサブミクロン粒子に製剤化される、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％Ｓｐａｎ ８５（種々の量のＭＴＰ－ＰＥを含んでもよい）を含むＭＦ５９（国際特許出願公開番号、国際公開第９０／１４８３７号）、（ｂ）サブミクロンエマルジョンに微小流動化されるまたはボルテックスされてより大きな粒径のエマルジョンを生成する、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ－ＭＤＰを含むＳＡＦ、（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ ８０、ならびに米国特許第４，９１２，０９４号明細書に記載される３－Ｏ－脱アシル化モノリン脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標）からなる群の１以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；および（ｄ）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ；
（３）サポニンアジュバント、例えばＱｕｉｌ ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ－２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）（米国特許第５，０５７，５４０号明細書参照）を使用してもよく、またはそこから作製された粒子、例えばＩＳＣＯＭ（コレステロール、サポニン、リン脂質および両親媒性タンパク質の組み合わせによって形成される免疫賦活複合体）およびＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（ＩＳＣＯＭと本質的に同じ構造を有するが、タンパク質を含まない）；
（４）細菌のリポ多糖、合成脂質Ａ類似体、例えばＣｏｒｉｘａから入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号明細書に記載されているアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）またはその誘導体もしくは類似体；１つのこのようなＡＧＰは、水性形態または安定なエマルジョンとして配合される、５２９（以前はＲＣ５２９として知られていた）としても知られている２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２－デオキシ－４－Ｏ－ホスホノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］－２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］－ｂ－Ｄ－グルコピラノシド、
（５）合成ポリヌクレオチド、例えば（１以上の）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号明細書）；および
（６）サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８等）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７－１およびＢ７－２等；および
（７）補体、例えば補体成分Ｃ３ｄの三量体。
別の実施形態では、アジュバントは、上記のアジュバントの２、３またはそれ以上の混合物、例えば、ＳＢＡＳ２（３－脱アシル化モノホスホリル脂質ＡおよびＱＳ２１も含む水中油型エマルジョン）である。
ムラミルペプチドには、限定されるものではないが、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）等が含まれる。
一定の実施形態では、アジュバントはアルミニウム塩である。アルミニウム塩アジュバントは、ミョウバン沈殿ワクチンまたはミョウバン吸着ワクチンであり得る。アルミニウム塩アジュバントは、当技術分野で周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ（１９８８；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）およびＮｉｃｋｌａｓ，Ｗ．（１９９２；Ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓａｌｔｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：４８９－４９３）に記載されている。アルミニウム塩には、限定されるものではないが、水和アルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物（ＡＴＨ）、アルミニウム水和物、アルミニウム三水和物、ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ａｍｐｈｏｇｅｌ、水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）、非晶質アルミナ、三水和アルミナ、またはトリヒドロキシアルミニウムが含まれる。
ＡＰＡは、ヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。ＡＰＡは、塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムを１：１の体積比でブレンドして、ヒドロキシリン酸アルミニウムを沈殿させることによって製造される。混合工程後、材料を高剪断ミキサーでサイズ縮小して、単分散粒径分布を達成する。次いで、生成物を生理食塩水に対して透析濾過し、蒸気滅菌する。
一定の実施形態では、市販のＡｌ（ＯＨ）３（例えば、Ｄｅｎｍａｒｋ／Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓ）を使用して、５０～２００μｇタンパク質／水酸化アルミニウムｍｇの比でタンパク質を吸着する。別の実施形態では、タンパク質の吸着は、タンパク質のｐＩ（等電点ｐＨ）および培地のｐＨに依存する。ｐＩが低いタンパク質は、ｐＩが高いタンパク質よりも強く、正に帯電したアルミニウムイオンに吸着する。アルミニウム塩は、２～３週間にわたってゆっくり放出される抗原のデポーを確立し、マクロファージの非特異的活性化および補体活性化に関与し、および／または自然免疫機構を刺激し得る（おそらく尿酸の刺激による）。例えば、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：２３を参照されたい。
一価バルク水性コンジュゲートは、典型的には一緒にブレンドし、標的８μｇ／ｍＬに希釈する６Ｂを除いて全ての血清型について標的４μｇ／ｍＬに希釈する。いったん希釈したら、バッチを濾過滅菌し、等体積のリン酸アルミニウムアジュバントを、２５０μｇ／ｍＬの最終アルミニウム濃度を目標として無菌的に添加する。アジュバント製剤化バッチを単回使用０．５ｍＬ／用量バイアルに充填する。
一定の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧ含有ヌクレオチド配列、例えば、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、特に、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）である。別の実施形態では、アジュバントがＯＤＮ １８２６であり、これはＣｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐから入手することができる。
ＣｐＧオリゴヌクレオチドを使用する方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｓｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６２８４－９３；Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ，２００６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１２７：１３９－５８；ａｎｄ Ｙａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２３：８９－１１０に記載されている。
代替実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書に、例えば実施形態Ｅ１～Ｅ２０またはそのいずれかの下位実施形態のいずれかに記載される複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、そして、アジュバントを含まない。
製剤
本発明の組成物は、単回投与バイアル、複数回投与バイアル、またはプレフィルドガラスもしくはプラスチックシリンジとして製剤化され得る。
別の実施形態では、本発明の組成物は経口投与され、したがって、経口投与に適した形態で、すなわち、固体または液体調製物として製剤化される。固体経口製剤には、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレットなどが含まれる。液体経口製剤には、液剤、懸濁剤、分散剤、エマルジョン、油などが含まれる。
液体製剤のための薬学的に許容される担体は、水性または非水性の溶液、懸濁液、エマルジョンまたは油である。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれ、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。油の例は、動物、植物または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の海産油、または乳もしくは卵の脂質である。
医薬組成物は、等張、低張または高張であり得る。しかしながら、注入または注射用の医薬組成物は、投与される場合、本質的に等張であることが通常好ましい。よって、貯蔵のために、医薬組成物は、好ましくは等張または高張であり得る。医薬組成物が貯蔵のために高張である場合、これを投与前に希釈して等張液にすることができる。
等張剤は、塩のようなイオン性等張剤または炭水化物のような非イオン性等張剤であり得る。イオン性等張剤の例としては、限定されるものではないが、ＮａＣｌ、１ｌ２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２を含む。非イオン性等張剤の例としては、限定されるものではないが、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む。
少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤が緩衝剤であることも好ましい。いくつかの目的のために、例えば、医薬組成物が注入または注射を目的とする場合、組成物が、溶液を４～１０、例えば５～９、例えば６～８の範囲のｐＨに緩衝することができる緩衝剤を含むことが通常望ましい。
緩衝剤は、例えば、ＴＲＩＳ、酢酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、グリシン、コハク酸塩およびトリエタノールアミン緩衝剤からなる群から選択され得る。
緩衝剤は、特に医薬製剤が非経口使用のためのものである場合、非経口使用のためのＵＳＰ適合性緩衝剤から選択され得る。例えば、緩衝剤は、酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸および乳酸のような一塩基酸；アコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸および酒石酸などの二塩基酸、クエン酸およびリン酸のような多塩基酸；アンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミンおよびＴＲＩＳのような塩基からなる群から選択され得る。
非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内または筋肉内注射用）には、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液および不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補充液、電解質補充液、例えばリンガーデキストロースに基づくものなどが含まれる。例には、界面活性剤および他の薬学的に許容されるアジュバントの添加を伴うまたは伴わない水および油のような無菌液体がある。一般に、水、生理食塩水、デキストロース水溶液および関連する糖溶液、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコール、ポリソルベート８０（ＰＳ－８０）、ポリソルベート２０（ＰＳ－２０）、およびポロキサマー１８８（Ｐ１８８）が、特に注射可能な溶液にとって好ましい液体担体である。油の例は、動物、植物または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の海産油、または乳もしくは卵の脂質である。
本発明の製剤はまた、界面活性剤を含み得る。好ましい界面活性剤には、限定されるものではないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎｓと呼ばれる）、特にＰＳ－２０およびＰＳ－８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商品名で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復エトキシ（オキシ－１，２－エタンジイル）基の数が変化し得るオクトキシノール（オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、またはｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に重要である）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られている）、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして知られている）、例えばソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレートが含まれる。エマルジョンに含めるのに好ましい界面活性剤は、ＰＳ－８０である。
界面活性剤の混合物、例えばＰＳ－８０／Ｓｐａｎ ８５混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＰＳ－８０）のようなポリオキシエチレンソルビタンエステルとｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）のようなオクトキシノールの組み合わせも適している。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ＰＳ－８０など）０．０１～１％、特に約０．１％；オクチル－またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤など）０．００１～０．１％、特に０．００５～０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）０．１～２０％、好ましくは０．１～１０％、特に０．１～１％または約０．５％である。
一定の実施形態では、組成物は、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡ（リン酸アルミニウムアジュバント）を含み、ｐＨ５．８で、ヒスチジン（２０ｍＭ）、生理食塩水（１５０ｍＭ）、および０．２％ＰＳ－２０または０．０４％ＰＳ－８０から本質的になる。ＰＳ－２０は０．００５％～０．３％（ｗ／ｖ）の範囲であり得、シミュレーション製造中の凝集を制御する製剤化および一次包装を使用した出荷では、ＰＳ－２０またはＰＳ－８０が存在する。別の実施形態では、ＰＳ－２０が０．０２５％～０．８％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。別の実施形態では、ＰＳ－２０が０．０５％～０．８％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。別の実施形態では、ＰＳ－２０が０．０５％～０．２％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。方法は、ヒスチジン、生理食塩水、およびＰＳ－２０またはＰＳ－８０中で最大２４の血清型のブレンドを組み合わせ、次いで、このブレンドした材料を、抗微生物保存剤の有無にかかわらずＡＰＡおよび生理食塩水と組み合わせることからなる。
特定の実施形態では、多価免疫原性組成物は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートの各々が担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、多糖類タンパク質コンジュゲート中の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型が本明細書に示される血清型のセットのいずれかを含み、そして、２０～８０ｍＭのヒスチジンｐＨ５．８および１５０ｍＭのＮａＣｌをさらに含む。いくつかの実施形態では、多価免疫原性組成物が、０．２％～０．８％ｗ／ｖのポリソルベート２０をさらに含む。
界面活性剤の選択は、異なる製剤および製剤原料に最適化する必要があり得る。１５以上の血清型を有する多価ワクチンの場合、ＰＳ－２０およびＰ１８８が好ましい。コンジュゲートを作製するために使用される化学の選択も、製剤の安定化で重要な役割を果たし得る。特に、異なる多糖類タンパク質コンジュゲートを多価組成物に調製するために使用されるコンジュゲーション反応が水性溶媒とＤＭＳＯ溶媒の両方を含む場合、特定の界面活性剤系が安定性に有意な差をもたらす。多糖類タンパク質コンジュゲートの安定性改善は、ポリソルベート２０単独またはポリオールと組み合わせたポロキサマー１８８で見られた。
特定の界面活性剤がどのようにバイオ医薬品を保護するかについての正確な機構はよく理解されておらず、先験的に予測することができない。考えられる安定化機構には、優先的水和、優先的排除、バイオ医薬品と表面との間の空気／液体界面競合、表面張力、および／または凝集の種として機能する疎水性パッチをマスクする界面活性剤とバイオ医薬品の直接的会合が含まれる。
ポロキサマーも、本発明の組成物に使用され得る。ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が隣接する、ポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖で構成される非イオン性トリブロックコポリマーである。ポロキサマーは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）という商品名でも知られている。ポリマーブロックの長さはカスタマイズすることができるため、わずかに異なる特性を有する多くの異なるポロキサマーが存在する。総称「ポロキサマー」の場合、これらのコポリマーは一般に文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）、引き続いて３桁の数字で命名され、最初の２桁の数字×１００はポリオキシプロピレンコアのおよその分子質量を示し、最後の桁×１０はポリオキシエチレン含有率を示す（例えば、Ｐ４０７＝４，０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシプロピレン分子質量および７０％ポリオキシエチレン含有量のポロキサマー）。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の商品名では、これらのコポリマーの記号化が、室温での物理的形態を定義する文字（Ｌ＝液体、Ｐ＝ペースト、Ｆ＝フレーク（固体））で始まり、２つまたは３つの数字が続く。数値表示の最初の数字（３桁の数字の２桁）に３００を掛けたものが、疎水性物質のおおよその分子量を示し；最後の桁×１０がポリオキシエチレン含有率を示す（例えば、Ｌ６１＝１，８００ｇ／ｍｏｌのポリオキシプロピレン分子質量および１０％のポリオキシエチレン含有量のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））。米国特許第３７４０４２１号明細書を参照されたい。
ポロキサマーの例は、一般式：
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ（式中、ａおよびｂブロックは以下の値を有する）
を有する：
Figure 0007369123000001
好ましくは、ポロキサマーは、一般に、１１００～１７，４００Ｄａ、７，５００～１５，０００Ｄａ、または７，５００～１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ポロキサマーは、ポロキサマー１８８またはポロキサマー４０７から選択することができる。製剤中のポロキサマーの最終濃度は、０．００１％～５％重量／体積、または０．０２５％～１％重量／体積である。一定の態様では、ポリオールがプロピレングリコールであり、最終濃度で１％～２０％重量／体積である。一定の態様では、ポリオールがポリエチレングリコール４００であり、最終濃度で１％～２０％重量／体積である。
本発明の製剤に適したポリオールは、ポリマーポリオール、特に、限定されるものではないが、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルを含むポリエーテルジオールである。プロピレングリコールは、モノマーの分子量が約４２５～約２７００の範囲で利用可能である。ポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールモノメチルエーテルはまた、約２００～約３５０００に及ぶ分子量の範囲で利用可能であり、限定されるものではないが、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ ＭＭＥ ５５０、ＰＥＧ ＭＭＥ ６００、ＰＥＧ ＭＭＥ ２０００、ＰＥＧ ＭＭＥ ３３５０およびＰＥＧ ＭＭＥ ４０００を含む。好ましいポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコール４００である。本発明の製剤中のポリオールの最終濃度は、１％～２０％重量／体積または６％～２０％重量／体積であり得る。
製剤はまた、ｐＨ緩衝生理食塩水も含む。緩衝剤は、例えば、ＴＲＩＳ、酢酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、グリシン、コハク酸塩、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）およびトリエタノールアミン緩衝剤からなる群から選択され得る。緩衝剤は、溶液を４～１０、５．２～７．５または５．８～７．０の範囲のｐＨに緩衝することができる。本発明の一定の態様では、緩衝剤が、リン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩またはクエン酸塩からなる群から選択される。緩衝剤は、さらに、例えば、特に医薬製剤が非経口使用のためのものである場合、非経口使用のためのＵＳＰ適合性緩衝剤から選択され得る。緩衝剤の濃度は１ｍＭ～１００ｍＭの範囲である。緩衝剤の濃度は１０ｍＭ～８０ｍＭの範囲である。緩衝剤の濃度は１ｍＭ～５０ｍＭまたは５ｍＭ～５０ｍＭの範囲である。一定の態様では、緩衝剤が、５ｍＭ～５０ｍＭの最終濃度のヒスチジン、または１ｍＭ～１０ｍＭの最終濃度のコハク酸塩である。一定の態様では、ヒスチジンが２０ｍＭ±２ｍＭの最終濃度である。
生理食塩水溶液（すなわち、ＮａＣｌを含む溶液）が好ましいが、製剤に適した他の塩には、限定されるものではないが、ＣａＣｌ２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２ならびにこれらの組み合わせが含まれる。限定されるものではないが、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む非イオン性等張剤が、塩の代わりに使用され得る。適切な塩の範囲には、限定されるものではないが、２５ｍＭ～５００ｍＭまたは４０ｍＭ～１７０ｍＭが含まれる。一態様では、生理食塩水がＮａＣｌであり、２０ｍＭ～１７０ｍＭの濃度で存在してもよい。
好ましい実施形態では、製剤が、塩化ナトリウムを含むＬ－ヒスチジン緩衝剤を含む。
別の実施形態では、医薬組成物は制御放出システムで送達される。例えば、薬剤は、静脈内注入、経皮パッチ、リポソームまたは他の投与様式を使用して投与することができる。別の実施形態では、ポリマー材料が、例えば、ミクロスフェアまたはインプラントで使用される。
各ワクチン用量中のコンジュゲートの量は、有意な有害効果なしに免疫防御応答を誘導する量として選択される。このような量は、肺炎球菌の血清型に応じて変化し得る。一般に、多糖類系コンジュゲートの場合、各用量は０．０８～１００μｇの各多糖類を含む。本発明のいくつかの実施形態では、各多糖類コンジュゲートの用量は、０．０８～１０μｇである。さらなる実施形態では、用量は、１～５μｇ、０．４～４μｇ、０．４～３μｇ、０．４～２μｇまたは０．４～１μｇである。いくつかの実施形態では、１以上の多糖類コンジュゲートの用量は、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００もしくは７５０ｎｇまたは０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．５、２、３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００μｇである。
本発明の組成物のいくつかの実施形態では、多糖類コンジュゲートの全てが組成物中に同じ量で存在する。さらなる実施形態では、多糖類コンジュゲートが、組成物中に異なる量で存在する（すなわち、少なくとも１つの多糖類コンジュゲートが、組成物の他の多糖類コンジュゲートの１以上とは異なる量で存在する）。
特定のワクチンの成分の最適量は、対象における適切な免疫応答の観察を含む標準的な試験によって確認することができる。例えば、別の実施形態では、ヒトワクチン接種についての投与量が、動物試験からヒトデータへの外挿によって決定される。別の実施形態では、投与量が経験的に決定される。
一実施形態では、アルミニウム塩の用量が、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０、１００、１２５、１５０、２００、３００、５００もしくは７００μｇ、または１、１．２、１．５、２、３、５ｍｇまたはそれ以上である。さらに別の実施形態では、上記のミョウバン塩の用量が、組換えタンパク質１μｇ当たりである。
本発明の組成物はまた、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１以上のタンパク質を含み得る。含めるのに適した肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）タンパク質の例としては、国際特許出願公開番号、国際公開第０２／０８３８５５号および国際公開第０２／０５３７６１号で同定されたものが挙げられる。
一定の実施形態では、本発明の組成物が、対象に、当業者に知られている１以上の方法によって、例えば、非経口、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、腹腔内投与され、それに応じて製剤化される。一実施形態では、本発明の組成物は、液体調製物の表皮注射、筋肉内注射、静脈内、動脈内、皮下注射、または呼吸器内粘膜注射を介して投与される。注射用の液体製剤には、溶液などが含まれる。
ＩＩＩ．作製方法
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の莢膜多糖類は、当業者に知られている標準的な技術によって調製することができる。例えば、多糖類は細菌から単離することができ、既知の方法によって（例えば、欧州特許第４９７５２４号明細書および欧州特許第４９７５２５号明細書参照）、好ましくはホモジナイザーを使用して達成される微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）または化学的加水分解によってある程度の大きさにすることができる。一実施形態では、各肺炎球菌多糖類血清型は、大豆系培地で増殖される。次いで、遠心分離、沈殿および限外濾過を含む標準的なステップを通して、個々の多糖類が精製される。例えば、米国特許出願公開第２００８／０２８６８３８号明細書および米国特許第５，８４７，１１２号明細書を参照されたい。多糖類試料の粘度を低下させるため、および／または機械的もしくは化学的サイジングのような技術を使用してコンジュゲートされた生成物の濾過性を改善するために、多糖類をサイジングすることができる。化学的加水分解は、酢酸を使用して実施され得る。機械的サイジングは、高圧均質化剪断を使用して実施され得る。
精製された多糖類を化学的に活性化して、糖類を担体タンパク質と反応できるようにすることができる。精製された多糖類を、リンカーに接続することができる。いったん活性化またはリンカーに接続されると、各莢膜多糖類は担体タンパク質に個別にコンジュゲートされてグリココンジュゲートを形成する。多糖類コンジュゲートは、既知のカップリング技術によって調製され得る。
多糖類は、リンカーにカップリングして、リンカーの遊離末端がエステル基である多糖類－リンカー中間体を形成することができる。したがって、リンカーは、少なくとも１つの末端がエステル基であるリンカーとなる。他方の末端は、多糖類と反応して多糖類－リンカー中間体を形成することができるように選択される。
多糖類を、多糖類中の一級アミン基を使用してリンカーにカップリングすることができる。この場合、リンカーは、典型的には両末端にエステル基を有する。これにより、エステル基の１つを、求核アシル置換により多糖類中の一級アミン基と反応させることによって、カップリングを行うことができる。反応は、多糖類がアミド結合を介してリンカーにカップリングしている多糖類－リンカー中間体をもたらす。
したがって、リンカーは、多糖類の一級アミン基と反応するための第１のエステル基と担体分子の一級アミン基と反応するための第２のエステル基を提供する二官能性リンカーである。典型的なリンカーは、アジピン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドジエステル（ＳＩＤＥＡ）である。
カップリングはまた、間接的に、すなわちリンカーへのカップリングの前に多糖類を誘導体化するために使用される追加のリンカーを用いて行うこともできる。
多糖類は、多糖類の還元末端でカルボニル基を使用して追加のリンカーにカップリングする。このカップリングは２つのステップ：（ａ１）カルボニル基を追加のリンカーと反応させるステップ；および（ａ２）追加リンカーの遊離末端をリンカーと反応させるステップを含む。これらの実施形態では、追加のリンカーが、典型的には両末端に一級アミン基を有し、それにより、還元的アミノ化によって一級アミン基の１つを多糖類のカルボニル基と反応させることによりステップ（ａ１）を行うことができる。多糖類のカルボニル基と反応性の一級アミン基が使用される。ヒドラジドまたはヒドロキシルアミノ基が適している。典型的には追加のリンカーの両末端に同じ一級アミン基が存在する。反応は、多糖類がＣ－Ｎ結合を介して追加のリンカーにカップリングしている多糖類－追加のリンカー中間体をもたらす。
多糖類は、多糖類中の異なる基、特にカルボキシル基を使用して追加のリンカーにカップリングすることができる。このカップリングは２つのステップ：（ａ１）基を追加のリンカーと反応させるステップ；および（ａ２）追加リンカーの遊離末端をリンカーと反応させるステップを含む。この場合、追加のリンカーが、典型的には両末端に一級アミン基を有し、それにより、ＥＤＡＣ活性化によって一級アミン基の１つを多糖類のカルボキシル基と反応させることによりステップ（ａ１）を行うことができる。多糖類のＥＤＡＣ活性化カルボキシル基と反応性の一級アミン基が使用される。ヒドラジド基が適している。典型的には追加のリンカーの両末端に同じ一級アミン基が存在する。反応は、多糖類がアミド結合を介して追加のリンカーにカップリングしている多糖類－追加のリンカー中間体をもたらす。
一実施形態では、多糖類の化学的活性化およびその後の還元的アミノ化による担体タンパク質とのコンジュゲーションが、米国特許第４，３６５，１７０号明細書、同第４，６７３，５７４号明細書および同第４，９０２，５０６号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号明細書、同第２００７／１８４０７２号明細書、同第２００７／０２３１３４０号明細書および同第２００７／０１８４０７１号明細書、ならびに国際公開第２００６／１１０３８１号、国際公開第２００８／０７９６５３号および国際公開第２００８／１４３７０９号に記載される手段によって達成され得る。化学は、過ヨウ素酸塩（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムまたは過ヨウ素酸を含む）のような、末端ヒドロキシル基をアルデヒドに酸化する任意の酸化剤との反応による肺炎球菌多糖類の活性化を含み得る。この反応により、炭水化物の隣接ヒドロキシル基がランダムに酸化的開裂し、反応性アルデヒド基が形成される。
担体タンパク質へのカップリングは、タンパク質のリシル基への直接的アミノ化を介した還元的アミノ化による。例えば、コンジュゲーションは、活性化多糖類と担体タンパク質の混合物を、ニッケルの存在下でシアノ水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤と反応させることによって行うことができる。コンジュゲーション反応は、水溶液下またはＤＭＳＯの存在下で行うことができる。例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２３１２７０号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１９５０８６号明細書および欧州特許第０４７１ １７７号明細書を参照されたい。次いで、水素化ホウ素ナトリウムなどの強力な還元剤を添加して、未反応アルデヒドをキャッピングする。
還元的アミノ化は、（１）多糖類の酸化による反応性アルデヒドの形成、（２）活性化多糖類と担体タンパク質との間に形成されたイミン（シッフ塩基）の還元による安定なアミンコンジュゲート結合の形成という２つのステップを含む。酸化の前に、多糖類のサイズを減少させてもよい。機械的方法（例えば、均質化）または化学的加水分解を使用することができる。化学的加水分解は、酢酸を使用して実施され得る。酸化ステップは、過ヨウ素酸塩との反応を含み得る。本発明の目的のために、「過ヨウ素酸塩」という用語は、過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を含む；この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４）とオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６）の両方を含み、種々の過ヨウ素酸塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）を含む。一実施形態では、莢膜多糖類が、メタ過ヨウ素酸塩の存在下で、好ましくは過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）の存在下で酸化される。別の実施形態では、莢膜多糖類が、オルト過ヨウ素酸塩の存在下で、好ましくは過ヨウ素酸の存在下で酸化される。
一実施形態では、酸化剤は、一級ヒドロキシルを選択的に酸化する酸化剤の存在下の、ピペリジン－Ｎ－オキシまたはピロリジン－Ｎ－オキシ化合物のような安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物である（国際公開第２０１４／０９７０９９号に記載される）。前記反応では、実際の酸化剤は、触媒サイクルにおけるＮ－オキソアンモニウム塩である。一態様では、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ピペリジン－Ｎ－オキシまたはピロリジン－Ｎ－オキシ化合物である。一態様では、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ）またはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５－テトラメチル－１－ピロリジニルオキシ）部分を有する。一態様では、前記安定なニトロキシルラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯまたはその誘導体である。一態様では、前記酸化剤は、Ｎ－ハロ部分を有する分子である。一態様では、前記酸化剤は、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５－トリクロロ－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５－トリブロモ－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン、ジヨードイソシアヌル酸および１，３，５－トリヨード－１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオンからなる群から選択される。好ましくは、前記酸化剤はＮ－クロロスクシンイミドである。
一定の態様では、酸化剤は、２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）フリーラジカルおよび共酸化剤としてのＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）である（国際公開第２０１４／０９７０９９号に記載される）。したがって、一態様では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のグリココンジュゲートは、ａ）水性溶媒中で、糖を２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と反応させて、活性化糖を得るステップと；ｂ）活性化糖を、１以上のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップとを含む方法によって得られる（前記方法は、その後「ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ還元的アミノ化」と呼ばれる）。
クエンチ剤を添加して、酸化反応をクエンチしてもよい。クエンチ剤は、隣接ジオール、１－、２－アミノアルコール、アミノ酸、グルタチオン、亜硫酸塩、重硫酸塩、亜ジチオン酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩、次亜リン酸塩または亜リン酸（グリセロール、エチレングリコール、プロパン－１，２－ジオール、ブタン－１，２－ジオールまたはブタン－２，３－ジオール、アスコルビン酸など）から選択され得る。
一定の実施形態では、本発明は、非プロトン性溶媒中でのコンジュゲーション反応を利用する血清型８肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類－タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、ここで、コンジュゲーション反応がシアノ水素化ホウ素を使用しない方法を提供する。さらなる実施形態では、コンジュゲーション反応は、シッフ塩基還元または還元的アミノ化である。さらなる実施形態では、タンパク質が破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドまたはＣＲＭ１９７である。さらに別の実施形態では、タンパク質がＣＲＭ１９７である。さらなる実施形態では、コンジュゲーション反応は、還元的アミノ化である。さらなる実施形態では、還元的アミノ化は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で実施される。
いくつかの実施形態では、コンジュゲーション前の酸化多糖類は、３０ｋＤａ～１，０００ｋＤａの分子量を有する。分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）と多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）および屈折率検出器（ＲＩ）を組み合わせて計算することができる。一部の実施形態では、多糖類は、５０ｋＤａ～３００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、多糖類は、５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａの分子量を有する。追加の実施形態では、多糖類は、７０ｋＤａ～９００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、多糖類は、１００ｋＤａ～８００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態では、多糖類は、２００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態では、多糖類は、１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～９００ｋＤａ；１００ｋＤａ～８００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７００ｋＤａ；１００ｋＤａ～６００ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～９００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～８００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～３００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～９００ｋＤａ；２００ｋＤａ～８００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７００ｋＤａ；２００ｋＤａ～６００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３００；２５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～９００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～８００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～３５０ｋＤａ；３００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；３００ｋＤａ～９００ｋＤａ；３００ｋＤａ～８００ｋＤａ；３００ｋＤａ～７００ｋＤａ；３００ｋＤａ～６００ｋＤａ；３００ｋＤａ～５００ｋＤａ；３００ｋＤａ～４００ｋＤａ；４００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；４００ｋＤａ～９００ｋＤａ；４００ｋＤａ～８００ｋＤａ；４００ｋＤａ～７００ｋＤａ；４００ｋＤａ～６００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。
コンジュゲーション方法の第２のステップは、還元剤を使用して、活性化多糖類と担体タンパク質との間のイミン（シッフ塩基）結合を還元して、安定なコンジュゲート結合を形成すること（いわゆる還元的アミノ化）である。適切な還元剤には、シアノ水素化ホウ素（シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素ナトリウムなど）が含まれる。一実施形態では、還元剤がシアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
一定の実施形態では、還元的アミノ化反応が、非プロトン性溶媒（または非プロトン性溶媒の混合物）中で行われる。一実施形態では、還元反応が、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で行われる。凍結乾燥されている場合、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒を使用して、活性化多糖類および担体タンパク質を再構成してもよい。一実施形態では、非プロトン性溶媒はＤＭＳＯである。
還元反応の最後に、未反応アルデヒド基がコンジュゲート中に残っている可能性があり、これを適切なキャッピング剤を使用してキャッピングすることができる。一実施形態では、このキャッピング剤が、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である。適切な代替物には、ブレンステッド酸またはルイス酸の存在下でのナトリウムトリアセトキシボロヒドリドまたは水素化ホウ素ナトリウムもしくは亜鉛、アミンボラン、例えばピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅ’ＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）または水素化ホウ素交換樹脂が含まれる。コンジュゲーション（還元反応および場合によりキャッピング）後、グリココンジュゲートを、当業者に知られている種々の技術によって精製（多糖類－タンパク質コンジュゲートの量に関して濃縮）してもよい。これらの技術には、透析、濃縮／ダイアフィルトレーション操作、タンジェント流濾過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルイオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）、およびデプス濾過が含まれる。一実施形態では、グリココンジュゲートを、ダイアフィルトレーションまたはイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。
非プロトン性溶媒中の還元的アミノ化を使用して調製されたグリココンジュゲートが、一般的に多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンに使用される。よって、全ての血清型が非プロトン性溶媒中で調製されるわけではない多価組成物の一定の実施形態では、残りの血清型の還元反応が、水性溶媒（例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ビス－トリス、ＡＤＡ（Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＭＯＰＳＯ（３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ－２－ヒドロキシプロパン－１－スルホン酸）、ＭＯＢＳ（４－（Ｎ－モルホリノ）ブタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ－（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸））、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、ＥＰＰＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－プロパンスルホン酸）、ｐＨ６．０～８．５、７．０～８．０または７．０～７．５のＢｉｃｉｎｅから選択される）中で行われる。
非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用して調製することができる肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）莢膜多糖類－タンパク質コンジュゲートには、限定されるものではないが、血清型：３、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９が含まれる。非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用して調製することができる肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）莢膜多糖類－タンパク質コンジュゲートには、限定されるものではないが、血清型：３、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９が含まれる。非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用して調製することができる肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）莢膜多糖類－タンパク質コンジュゲートには、限定されるものではないが、血清型：３、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９が含まれる。多糖類は、オリゴ糖の形態で使用することができる。これらは、（例えば、加水分解による）精製多糖類の断片化によって都合よく形成され、通常、引き続いて所望のサイズの断片が精製される。
一定の実施形態では、血清型３、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９の１以上の肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートは、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用して調製される。一定の実施形態では、血清型３、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９の１以上の肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートは、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用して調製される。一定の実施形態では、血清型３、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３３Ｆ、３５Ｂおよび３９の１以上の肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートは、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用して調製される。一定の実施形態では、多価免疫原性組成物中の血清型の各々は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用して調製される。一定の実施形態では、多価組成物中の１以上の血清型の多糖類は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用してコンジュゲートされ、そして、１以上の血清型の多糖類は、水性溶媒中での還元的アミノ化を使用してコンジュゲートされる。一定の実施形態では、多価組成物中の２つ以上の血清型の多糖類は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用してコンジュゲートされる。他の実施形態では、多価組成物中の３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、または２１以上の血清型の多糖類は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用してコンジュゲートされる。一定の実施形態では、多価組成物中の１以上の血清型の多糖類は、非プロトン性溶媒中または水性溶媒中にあり得る他の化学物質を使用してコンジュゲートされる。
よって、本発明は、各々が担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む、複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は本明細書（すなわち、第ＩＩ節、「多価免疫原性組成物」）に記載される通りであり、ここで、多糖類タンパク質コンジュゲートの１以上の多糖類はそれによって担体タンパク質にコンジュゲートされるコンジュゲーション反応が非プロトン性溶媒中にある。一定の実施形態では、多価組成物中の血清型の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％が非プロトン性溶媒中で調製される。血清型の残りは、代替化学を使用して、および／または水性溶媒中で調製される。
多糖類－タンパク質コンジュゲートの還元的アミノ化における溶媒としてＤＭＳＯを使用すると、水性条件下で調製された同じコンジュゲートと比較して、これらの血清型の予想外に優れた安定性および免疫原性増強が得られることが決定された（米国出願番号第６２／４６３，２１６号明細書および同第６２／５５５，４４４号明細書参照）。本明細書に示されるように（実施例４０参照）、非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化を使用して調製された本発明の肺炎球菌コンジュゲートを含む製剤は、コンジュゲーション方法で還元的アミノ化中にプロトン性（すなわち、水性）溶媒を使用して調製された製剤原料を利用したワクチンと比較して、優れた物理的および化学的安定性をもたらした。よって、いくつかの実施形態では、多価組成物中の肺炎球菌多糖類コンジュゲートの全てが非プロトン性溶媒中で調製される。
本発明の一定の実施形態では、組成物中の総多糖類濃度は、約０．０２～約０．１７５ｍｇ／ｍＬである。本発明の一定の実施形態では、組成物中の総多糖類濃度は、約０．０３～約０．１７５ｍｇ／ｍＬである。本発明の一定の実施形態では、組成物中の総多糖類濃度が、約０．０４～約０．１７５ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態では、組成物中の総多糖類濃度は、約０．０６５～約０．０８５ｍｇ／ｍＬ、約０．０７０～約０．０８０ｍｇ／ｍＬ、約０．０６５～約０．０８０ｍｇ／ｍＬ、約０．０７０～約０．０８５ｍｇ／ｍＬ、約０．１１０～約０．１２８ｍｇ／ｍＬ、約０．１１０～約０．１７５ｍｇ／ｍＬ、約０．１０～約０．１７５ｍｇ／ｍＬ、約０．１１０～約０．１７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１１５～約０．１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１１０～約０．１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１１０～約０．１２５ｍｇ／ｍＬ、約０．１５０～約０．１７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１５０～約０．１６５ｍｇ／ｍＬ、約０．１４０～約０．１７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１３０～約０．１７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１５０～約０．１７５ｍｇ／ｍＬ、約０．０７０～約０．１７０ｍｇ／ｍＬ、約０．０６５～約０．１７５ｍｇ／ｍＬまたは約０．０６５～約０．１８０ｍｇ／ｍＬである。
多価免疫原性組成物中の多糖類－タンパク質コンジュゲートの１以上または全てが非プロトン性溶媒中で調製される本発明の実施形態では、組成物中の総多糖類濃度は、３７℃で４週間以上、２５℃で４週間以上および４℃で１２週間以上安定である。
多価免疫原性組成物中の多糖類－タンパク質コンジュゲートの１以上または全てが非プロトン性溶媒中で調製される本発明の一定の実施形態では、組成物中の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの全ての重量平均分子量（Ｍｗ）（組成物中の全てのコンジュゲートの平均）は、約３，５００～約４，７００ｋＤａ、約３，５００～約４，６００ｋＤａ、約３，５００～約４，５００ｋＤａ、約３，５００～約４，４００ｋＤａ、約３，５００～約４，３００ｋＤａ、約３，５００～約４，２００ｋＤａ、約３，６００～約４，７００ｋＤａ、約３，６００～約４，６００ｋＤａ、約３，６００～約４，５００ｋＤａ、約３，６００～約４，４００ｋＤａ、約３，６００～約４，３００ｋＤａ、約３，６００～約４，２００ｋＤａ、約３，７００～約４，７００ｋＤａ、約３，７００～約４，６００ｋＤａ、約３，７００～約４，５００ｋＤａ、約３，７００～約４，４００ｋＤａ、約３，７００～約４，３００ｋＤａ、約３，７００～約４，２００ｋＤａ、約３，８００～約４，７００ｋＤａ、約３，８００～約４，６００ｋＤａ、約３，８００～約４，５００ｋＤａ、約３，８００～約４，４００ｋＤａ、約３，８００～約４，３００ｋＤａ、約３，８００～約４，２００ｋＤａ、約３，９００～約４，７００ｋＤａ、約３，９００～約４，６００ｋＤａ、約３，９００～約４，５００ｋＤａ、約３，９００～約４，４００ｋＤａ、約３，９００～約４，３００ｋＤａまたは約３，９００～約４，２００ｋＤａである。
多価免疫原性組成物中の多糖類－タンパク質コンジュゲートが非プロトン性溶媒中で調製される本発明の一定の実施形態では、組成物中の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの各々のＭｗ（単一血清型について）は、約１，０００～約１０，０００ｋＤａ、約１，５００～約５，５００ｋＤａ、約１，５００～約５，６００ｋＤａ、約１，５００～約５，７００ｋＤａ、約１，５００～約５，８００ｋＤａ、約１，５００～約５，９００ｋＤａ、約１，５００～約６，０００ｋＤａ、約１，０００～約５，５００ｋＤａ、約１，０００～約５，０００ｋＤａ、約１，０００～約４，０００ｋＤａ、約１，０００～約４，５００ｋＤａ、約１，０００～約４，０００ｋＤａまたは約１，０００～約３，５００ｋＤａである。他の実施形態では、組成物中の単一の血清型のコンジュゲートのＭｗは、約１，０００ｋＤａ、約１，１００ｋＤａ、約１，２００ｋＤａ、約１，３００ｋＤａ、約１，４００ｋＤａ、約１，５００ｋＤａ、約１，６００ｋＤａ、約１，７００ｋＤａ、約１，８００ｋＤａ、約１，９００ｋＤａ、約２，０００ｋＤａ、約２，１００ｋＤａ、約２，２００ｋＤａ、約２，３００ｋＤａ、約２，４００ｋＤａ、約２，５００ｋＤａ、約２，６００ｋＤａ、約２，７００ｋＤａ、約２，８００ｋＤａ、約２，９００ｋＤａ、約３，０００ｋＤａ、約３，１００ｋＤａ、約３，２００ｋＤａ、約３，３００ｋＤａ、約３，４００ｋＤａ、約３，５００ｋＤａ、約３，６００ｋＤａ、約３，７００ｋＤａ、約３，８００ｋＤａ、約３，９００ｋＤａ、約４，０００ｋＤａ、約４，１００ｋＤａ、約４，２００ｋＤａ、約４，３００ｋＤａ、約４，４００ｋＤａ、約４，５００ｋＤａ、約４，６００ｋＤａ、約４，７００ｋＤａ、約４，８００ｋＤａ、約４，９００ｋＤａ、約５，０００ｋＤａ、約５，１００ｋＤａ、約５，２００ｋＤａ、約５，３００ｋＤａ、約５，４００ｋＤａまたは約５，５００ｋＤａである。
本発明の一定の実施形態では、多価免疫原性組成物中の多糖類－タンパク質コンジュゲートは、非プロトン性溶媒中で調製される。（プロトン性溶媒中で調製されるのと反対に）非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類の割合が高い組成物が好ましい場合がある。一定の実施形態では、非プロトン性溶媒中で調製された肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型特異的コンジュゲートの割合（非プロトン性溶媒中で調製された多糖類血清型の数を多糖類血清型の総数で割ることによって計算され、総数は非プロトン性溶媒またはプロトン性溶媒中で調製されたものを含む）は、５０％超、または６０％超、または７０％超、または８０％超、または９０％超であり得る、または１００％である。
本発明の一定の実施形態では、組成物中の血清型３多糖類－タンパク質コンジュゲートは、非プロトン性溶媒中で調製され、前記コンジュゲートのＭｗは、約１，０００～約５，０００ｋＤａ、または約１，０００～約４，０００ｋＤａ、または約１，０００～約３，０００ｋＤａ、または約１，０００～約２，５００ｋＤａ、または約１，０００～約２，０００ｋＤａである。
多価免疫原性組成物中の多糖類－タンパク質コンジュゲートの１以上または全てが非プロトン性溶媒中で調製される本発明の一定の実施形態では、組成物中の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの数平均分子量（Ｍｎ）（組成物中の全てのコンジュゲートの平均）は、約９００～約３０００ｋＤａ、約１０００～約３０００ｋＤａ、約１０００～約２５００ｋＤａ、約１５００～約２５００ｋＤａ、約１８００～約２５００ｋＤａ、約１９００～約２５００ｋＤａまたは約２０００～約２５００ｋＤａである。
多価免疫原性組成物中の多糖類－タンパク質コンジュゲートの１以上または全てが非プロトン性溶媒中で調製される本発明の一定の実施形態では、組成物中の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの各々のＭｎ（単一血清型について）は、約７００～約７０００ｋＤａ、約１０００～約６０００ｋＤａ、約１０００～約５０００ｋＤａ、約１０００～約４０００ｋＤａ、約１０００～約３０００ｋＤａ、約９００～約５５００ｋＤａ、約９００～約５０００ｋＤａ、約９００～約４５００ｋＤａ、約９００～約４０００ｋＤａ、約９００～約３５００ｋＤａまたは約９００～約３０００ｋＤａである。
本発明の実施形態では、組成物中の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートのＭｗおよび／またはＭｎは、３７℃で４週間以上、２５℃で４週間以上および／または４℃で１２週間以上安定である。
本発明の実施形態では、多糖類濃度、Ｍｗおよび／またはＭｎは、ＨＰＳＥＣ ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩを使用して決定される。
多価免疫原性組成物中の多糖類－タンパク質コンジュゲートの１以上または全てが非プロトン性溶媒中で調製される本発明のいくつかの実施形態では、２８０ナノメートル（ｎｍ）の励起波長で固有のタンパク質蛍光分光法を使用して測定される組成物の発光極大は、約３３５ｎｍ～約３４２ｎｍである。いくつかの実施形態では、発光極大は、約３３５ｎｍ～約３４２ｎｍを維持し、蛍光強度が３７℃で少なくとも１週間安定である。いくつかの実施形態では、発光極大は約３３５ｎｍ～約３４２ｎｍを維持し、蛍光強度が３７℃で１週間安定である。
いくつかの実施形態では、多価組成物中の肺炎球菌多糖類コンジュゲートの全ては、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を使用して調製される。一定の下位実施形態では、全てがＤＭＳＯを使用して調製された多糖類コンジュゲートを含む多価組成物は、アジュバントを含まない。
いかなる理論によっても拘束されないが、ＤＭＳＯ中で調製されたグリココンジュゲートで観察される免疫原性増強の１つの考えられる機構には、タンパク質と多糖類との間の追加の結合点をもたらして安定性を付与し、ペプチドの炭水化物結合の化学的解重合または分解に対抗する、炭水化物（莢膜多糖類）と担体タンパク質の表面上のリジン残基との間の結合の数の増加が含まれる。例えば、Ｈｓｉｅｈ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ＣＲＭ１９７ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ Ｂｒｏｗｎ Ｆ，Ｃｏｒｂｅｌ Ｍ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ Ｅ（ｅｄｓ）：Ｐｈｙｓｉｃｏ－Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，２０００，ｖｏｌ １０３，ｐｐ．９３－１０４を参照されたい。ＤＭＳＯ溶媒中でのコンジュゲーション中に作成される多糖類－タンパク質結合の増加の追加の利点は、Ｔ細胞へのペプチド－炭水化物の提示を成功させるための追加の機会であり得るだろう。炭水化物抗原にコンジュゲートされた特定のペプチド配列による負荷またはこれらとの会合の異なる能力および感受性をもたらすヒト集団の遺伝的多様性により、担体タンパク質上の追加の結合点により、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面での抗原提示の成功の機会増加が可能となり、他のＴ細胞非依存性抗原に対するＴ細胞依存性応答が可能になることが理解され得る。ＤＭＳＯ溶媒中でのコンジュゲーションによって観察される免疫原性増強の別の考えられる機構は、多糖類結合のための追加のリジンを露出して、異なるペプチドエピトープに対するＴ細胞依存性応答のためのＡＰＣの表面での糖ペプチド提示の機会の増加をもたらす有機溶媒中でのＣＲＭ １９７の変性によるものであり得る。Ａｖｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７：１６０２－１６１０を参照されたい。
コンジュゲート中の変性ＣＲＭ１９７を生成する有機溶媒中でのコンジュゲーションのさらに別の利点は、天然ＣＲＭ １９７エピトープに対する減少された抗体の免疫学的干渉であり得る。ＤＭＳＯ溶媒中でのコンジュゲーション中に作成される多糖類－タンパク質結合の増加のさらなる利点は、免疫原性の向上をもたらす、より大きなサイズの多糖類タンパク質コンジュゲートの形成であり得る。本発明の組成物は、ヒト応答を誘発することにおいて重要な利点を提供すると考えられている。
一定の実施形態では、コンジュゲーション反応は、還元的アミノ化によって実施され、コンジュゲーション反応効率を高めるためにおよび遊離シアン化物の除去を助けるために、ニッケルが使用される。遷移金属はシアン化物と安定な錯体を形成することが知られており、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによるタンパク質アミノ基とホルムアルデヒドの還元的メチル化を改善することが知られている（Ｓ Ｇｉｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９８２，２０３：３３１－３３４；Ｊｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８０，１０６：１８６－１９０）。残留阻害性シアン化物を錯化することによって、ニッケルの添加は、コンジュゲーション中のタンパク質の消費を増加し、より大きく潜在的に免疫原性の高いコンジュゲートの形成を導く。
シアノ水素化ホウ素ナトリウム試薬ロットの開始シアン化物レベルの差はまた、一貫性のないコンジュゲーション性能をもたらし、コンジュゲートサイズおよびコンジュゲートのＰｓ対ＣＲＭ１９７比のような製品属性が変動する。ニッケルの添加により、シアン化物を錯化することでコンジュゲーション不整合が減少し、シアノ水素化ホウ素ナトリウムロットの差が排除された。
適切な代替化学には、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）により糖を活性化してシアン酸エステルを形成することが含まれる。よって、活性化された糖を、直接的にまたはスペーサー（リンカー）基を介して担体タンパク質上のアミノ基にカップリングすることができる。例えば、スペーサーは、チオール化多糖類を与えるシスタミンまたはシステアミンであり得、チオール化多糖類をマレイミド活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを使用）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド［例えば、エチルヨードアセトイミドＨＣｌ］またはＮ－スクシンイミジルブロモアセテートまたはＳＩＡＢ、またはＳＩＡ、またはＳＢＡＰを使用）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体にカップリングすることができるだろう。好ましくは、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学によって生成されてもよい）を、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングし、アミノ誘導体化糖を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学を使用して担体タンパク質にコンジュゲートする。このようなコンジュゲートは、国際特許出願公開番号、国際公開第９３／１５７６０号、国際公開第９５／０８３４８号および国際公開第９６／２９０９４号；ならびにＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４０：２４５－２５６に記載されている。
他の適切な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する。多くは国際特許出願公開番号、国際公開第９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションは、糖の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩの反応によって形成され得るカルボニルリンカー（Ｂｅｔｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：２５７２－４；Ｈｅａｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９－１８参照）を含み、引き続いてタンパク質との反応によってカルバメート結合を形成する。これは、アノマー末端の一級ヒドロキシル基への還元、一級ヒドロキシル基の任意の保護／脱保護、一級ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応によるＣＤＩカルバメート中間体の形成、およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基のカップリングを含み得る。
莢膜多糖類の担体タンパク質へのコンジュゲーション後、多糖類－タンパク質コンジュゲートを、種々の技術の１以上によって精製する（多糖類－タンパク質コンジュゲートの量に関して濃縮する）。これらの技術の例は当業者に周知であり、濃縮／ダイアフィルトレーション操作、限外濾過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィーおよびデプス濾過を含む。例えば、米国特許第６，１４６，９０２号明細書を参照されたい。
個々のグリココンジュゲートを精製した後、これらを配合して、本発明の免疫原性組成物を製剤化する。これらの肺炎球菌コンジュゲートは、別々の方法で調製され、単一投与製剤にバルク製剤化される。
本発明のグリココンジュゲートを特徴付けるための代替方法は、コンジュゲートリジンの範囲（コンジュゲーションの程度）として特徴付けることができる糖にコンジュゲートされた担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）中のリジン残基の数によるものである。多糖類との共有結合による担体タンパク質のリジン修飾の証拠は、当業者に知られている日常的な方法を使用したアミノ酸分析によって得ることができる。コンジュゲーションにより、コンジュゲート物質を生成するために使用される担体タンパク質出発材料と比較して、回収されるリジン残基の数が減少する。好ましい実施形態では、本発明のグリココンジュゲートのコンジュゲーションの程度は、２～１５、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、３～１５、３～１３、３～１０、３～８、３～６、３～５、３～４、５～１５、５～１０、８～１５、８～１２、１０～１５または１０～１２である。一実施形態では、本発明のグリココンジュゲートのコンジュゲーションの程度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。好ましい実施形態では、本発明のグリココンジュゲートのコンジュゲーションの程度は４～７である。いくつかのこのような実施形態では、担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。
本発明の組成物のグリココンジュゲートはまた、糖と担体タンパク質の比（重量／重量）（Ｐｓ：Ｐｒ）によって特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、組成物中のグリココンジュゲートの多糖類と担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、０．５～３．０（例えば、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９または約３．０）である。他の実施形態では、糖と担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、０．５～２．５、０．５～１．５、０．８～２．５、０．５～１．０、１．０～１．５、１．０～２．０、０．８～２．４、０．８～２．３、０．８～２．２、０．８～２．１、０．８～２．０、０．８～１．９、０．８～１．８、０．８～１．７、０．８～１．６、０．８～１．５、０．８～１．４、０．８～１．３、０．９～２．４、０．９～２．３、０．９～２．２、０．９～２．１、０．９～２．０、０．９～１．９、０．９～１．８、０．９～１．７、０．９～１．６、０．９～１．５、０．９～１．４、０．９～１．３、０．９～１．２、１．０～２．４、１．０～２．３、１．０～２．２、１．０～２．１、１．０～２．０、１．０～１．９、１．０～１．８、１．０～１．７、１．０～１．６、１．０～１．５、１．０～１．４、１．０～１．３または１．０～１．２である。さらなる実施形態では、糖と担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は０．８～１．２である。いくつかのこのような実施形態では、担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。本発明のグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲートされているわけではないが、それにもかかわらずグリココンジュゲート組成物中に存在する遊離糖を含んでもよい。遊離糖は、グリココンジュゲートに非共有結合的に会合していてもよい（すなわち、非共有結合、吸着、または捕捉されている）。
具体的な実施形態では、血清型１５Ａコンジュゲートについての糖と担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、約１．０～約２．０、約１．２５～約１．７５または約１．３～約１．７である。他の実施形態では、血清型１５Ａについての糖と担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７または１．８である。
具体的な実施形態では、血清型１５Ｃコンジュゲートについての糖と担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、約１．０～約２．０、約１．２５～約１．７５または約１．３～約１．７である。他の実施形態では、血清型１５Ｃについての糖と担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７または１．８である。
具体的な実施形態では、血清型３３Ｆコンジュゲートについての糖と担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、約１．０～約２．０、約１．２５～約１．７５または約１．３～約１．７である。他の実施形態では、血清型３３Ｆについての糖と担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７または１．８である。
具体的な実施形態では、血清型３５Ｂコンジュゲートについての糖と担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、約１．２５～約２．２５、約１．２５～約２．０または約１．３～約１．８である。他の実施形態では、血清型３３Ｂについての糖と担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、約１．２、１．３、１．３、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０である。
具体的な実施形態では、血清型２４Ｆコンジュゲートについての糖と担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、約０．５～約１．５、約０．７５～約１．２５または約０．８～約１．０である。他の実施形態では、血清型２４Ｆについての糖と担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０である。
好ましい実施形態では、グリココンジュゲートは、多糖類の総量と比較して約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％または１５％未満の遊離多糖類を含む。好ましい実施形態では、グリココンジュゲートは、多糖類の総量と比較して約２５％未満の遊離多糖類を含む。好ましい実施形態では、グリココンジュゲートは、多糖類の総量と比較して約２０％未満の遊離多糖類を含む。好ましい実施形態では、グリココンジュゲートは、多糖類の総量と比較して約１５％未満の遊離多糖類を含む。
ＩＶ．使用方法
本発明の実施形態はまた、（ａ）治療（例えば、ヒトの体の）；（ｂ）医薬；（ｃ）肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染の阻害；（ｄ）肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答または防御免疫応答の誘導；（ｅ）肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染の予防；（ｆ）肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染の再発の予防；（ｇ）脳損傷、難聴および発作などの関連する合併症の予防を含む肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染に関連する病理学的症状の進行、発症または重症度の減少；（ｈ）肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染の可能性の減少；または（ｉ）限定されるものではないが、肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌性菌血症、肺炎球菌性髄膜炎、中耳炎および副鼻腔炎を含む、（１以上の）肺炎球菌疾患の発症、重症度または進行の処置、予防または遅延の；（ｉ）使用するため、（ｉｉ）医薬または組成物として使用するため、または（ｉｉｉ）医薬品の調製に使用するため、の本明細書に記載される多価免疫原性組成物の１以上も含む。これらの使用では、本発明の多価肺炎球菌多糖類－コンジュゲート組成物は、１以上のアジュバントと組み合わせて、またはアジュバントなしで使用してもよい。
したがって、本発明は、本発明の多価免疫原性肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲート組成物の１以上を、処置を必要とする患者に投与するステップを含む、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染症または肺炎球菌疾患の予防的処置（すなわち、防御）のための方法を提供する。
本発明の組成物および製剤を、全身または粘膜経路を介して使用して、本発明の組成物を投与することによって、感染症、例えば肺炎球菌感染症にかかりやすいヒトを防御または処置することができる。
一実施形態では、本発明は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、免疫学的有効量の本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、肺炎球菌感染症に対してヒトをワクチン接種する方法であって、免疫学的有効量の本発明の多価免疫原性組成物をヒトに投与するステップを含む方法を提供する。
よって、一態様では、本発明は、（１）ヒト患者で免疫応答を誘導する、（２）ヒト患者で防御免疫応答を誘導する、（３）肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染に対してヒト患者にワクチン接種する、または（４）ヒト患者の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染の可能性を減少させる方法であって、本発明の多価免疫原性組成物（すなわち、本明細書に記載されるいずれかの多価免疫原性組成物、例えば、上記の「多価免疫原性組成物」と題された第ＩＩ節に記載される多価免疫原性組成物）を、患者に投与するステップを含む方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、１８歳以上の成人において肺炎球菌性肺炎および侵襲性疾患を予防する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、２４種の肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）菌株（３、６Ａ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３３Ｆおよび３５Ｂ）によって引き起こされる肺炎球菌性肺炎および侵襲性疾患を予防する方法を提供する。
上記方法の一実施形態では、組成物は、複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、血清型：３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａのセットを含む。上記方法の一実施形態では、組成物は、複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、血清型：３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０のセットを含む。上記方法の一実施形態では、組成物は、複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、血清型：３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ｂのセットを含む。上記方法の別の実施形態では、組成物は、血清型６Ａまたは６Ｃの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートをさらに含む。
血清型６Ａを含む肺炎球菌コンジュゲートワクチンが血清型６Ｃに対するいくらかの交差防御を提供し得ることが示されている（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２９（２０１１）７２０７－７２１１）。したがって、上記方法のいくつかの実施形態では、本発明はまた、血清型６Ｃを含まず、代わりに血清型６Ａまたは血清型６Ａおよび６Ｂを含む多価免疫原性組成物の使用を提供する。他の実施形態では、免疫原性組成物は、血清型６Ａ、６Ｂおよび６Ｃの肺炎球菌コンジュゲートを含む。上記方法の特定の実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、
Ｉ－ａ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ；
Ｉ－ｂ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ；
Ｉ－ｃ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ；および
Ｉ－ｄ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ
からなる群から選択される血清型のセットを含む。
上記血清型（Ｉ－ａ～Ｉ－ｄ）のセットの特定の実施形態では、血清型２０または２０Ｂが、血清型２０Ａに置換し得る。
上記方法のさらなる実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、
ＩＩ－ａ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ；
ＩＩ－ｂ）６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ；
ＩＩ－ｃ）６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ；
ＩＩ－ｄ）６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ；
ＩＩ－ｅ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ；
ＩＩ－ｆ）６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆ、および２０Ａ；
ＩＩ－ｇ）６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ；および
ＩＩ－ｈ）６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ
からなる群から選択される血清型のセットを含む。
上記血清型（ＩＩ－ｅ～ＩＩｈ）のセットの特定の実施形態では、血清型２０または２０Ｂは、血清型２０Ａに置換し得る。
上記方法のさらなる実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、実施形態Ｉ－ａ）、ＩＩ－ａ）またはＩＩ－ｅ）のいずれかに示される血清型のセットを含み、血清型６Ａ、６Ｂおよび６Ｃをさらに含む。
血清型１０Ａを含む肺炎球菌コンジュゲートワクチンが血清型３９に対するいくらかの交差防御を提供し得ることも示されている（国際公開第２０１７／０８５５８６号参照）。したがって、上記方法のいくつかの実施形態では、本発明はまた、血清型１０Ａを含まず、代わりに血清型３９を含む多価免疫原性組成物の使用を提供する。他の実施形態では、免疫原性組成物は、血清型１０Ａおよび３９の肺炎球菌コンジュゲートを含む。上記方法の特定の実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、
ＩＩＩ－ａ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ；
ＩＩＩ－ｂ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ；
ＩＩＩ－ｃ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ；
ＩＩＩ－ｄ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ；
ＩＩＩ－ｅ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ；
ＩＩＩ－ｆ）６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ；
ＩＩＩ－ｇ）６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ；および
ＩＩＩ－ｈ）６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、３９、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０Ａ
からなる群から選択される血清型のセットを含む。
上記血清型（ＩＩ－ａ～ＩＩＩ－ｈ）のセットの特定の実施形態では、血清型２０または２０Ｂは、血清型２０Ａに置換し得る。
上記方法のさらなる実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、実施形態ＩＩＩ－ａ）～ＩＩＩ－ｈ）のいずれかに示される血清型のセットを含み、そして、血清型１０Ａをさらに含む。
担体タンパク質と共有結合的に結合した肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖類を含む免疫原性コンジュゲートが、血清型１５Ｃおよび／または血清型１５Ａに対するいくらかの交差防御を提供し得ることも示されている（国際公開第２０１５／１１０９４２号参照）。したがって、上記方法のいくつかの実施形態では、本発明はまた、血清型１５Ｃ（または脱Ｏ－アセチル化１５Ｂ）を含まず、代わりに血清型１５Ｂ（すなわち、血清型１５Ｂ多糖類は脱Ｏ－アセチル化されていない）を含む多価免疫原性組成物の使用を提供する。他の実施形態では、免疫原性組成物は、血清型１５Ｂおよび１５Ｃ（または脱Ｏ－アセチル化１５Ｂ）の肺炎球菌コンジュゲートを含む。上記方法の特定の実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、
ＩＶ－ａ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０Ａ；
ＩＶ－ｂ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０Ａ；
ＩＶ－ｃ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０Ａ；
ＩＶ－ｄ）３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０Ａ；
ＩＶ－ｅ）１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０Ａ；
ＩＶ－ｆ）６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０Ａ；
ＩＶ－ｇ）６Ａ、６Ｂ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０Ａ；および
ＩＶ－ｈ）６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０Ａ
からなる群から選択される血清型のセットを含む。
上記血清型（ＩＶａ～ＩＶｈ）のセットの特定の実施形態では、血清型２０または２０Ｂは、血清型２０Ａに置換し得る。
上記方法のさらなる実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型は、実施形態ＩＶ－ａ）～ＩＶ－ｈ）のいずれかに示される血清型のセットを含み、そして、血清型１５Ｃ（および／または脱Ｏ－アセチル化１５Ｂ）をさらに含む。
本発明の組成物は、以前に多価肺炎球菌ワクチンを受けた患者において肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する補完的防御を提供する方法に有用である。この使用では、本発明の組成物が、患者が以前にワクチン接種されなかった特定の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に対する防御を提供することができ、患者が以前にワクチン接種された肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に対する追加の防御を提供することができ、または患者が以前にワクチン接種されなかった肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型と患者が以前にワクチン接種された肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の両方に対する防御を提供することができる。
よって、本発明は、患者で肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を誘導する、ワクチン接種する、または防御免疫応答を誘導する方法であって、多価免疫原性組成物を患者に投与するステップを含み、ここで、組成物は複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、多糖類タンパク質コンジュゲートは担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含み、ここで、患者は、以前に肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対してワクチン接種された方法を提供する。本発明のこの態様の実施形態では、多価免疫原性組成物は、本明細書に記載されるいずれかの多価免疫原性組成物であり得る。本発明の方法の特定の実施形態では、多価免疫原性組成物は、以前に多価肺炎球菌ワクチンで処置された患者に投与される。多価免疫原性ワクチンは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の２つ以上の血清型によって引き起こされる肺炎球菌疾患を予防するために必要とされる任意のワクチンであり得る。
上記方法の具体的な実施形態では、患者は、以前に
ａ）４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ；
ｂ）４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、６Ａ、７Ｆおよび１９Ａ；
ｃ）１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ；
ｄ）４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、６Ａ、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆ；
ｅ）４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、２、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０；および
ｆ）４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、６Ａ、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆおよび１５Ｂ
からなる群から選択される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型によって引き起こされる肺炎球菌疾患を予防するために必要とされる多価肺炎球菌ワクチンで処置された。
上記方法の具体的な実施形態では、多価肺炎球菌ワクチンは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、２、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０Ａの莢膜多糖類を含む。上記方法の具体的な実施形態では、多価肺炎球菌ワクチンは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、２、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０の莢膜多糖類を含む。上記方法の具体的な実施形態では、多価肺炎球菌ワクチンは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、２、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０Ｂの莢膜多糖類を含む。
上記方法の具体的な実施形態では、多価肺炎球菌ワクチンは複数の多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、多糖類タンパク質コンジュゲートは、担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含む。他の実施形態では、多価肺炎球菌ワクチンは、担体タンパク質にコンジュゲートされていない複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖類を含む。
上記方法の追加の実施形態では、患者は、以前にＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）１３（肺炎球菌１３価コンジュゲートワクチン［ジフテリアＣＲＭ１９７タンパク質］、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．、フィラデルフィア、ＰＡ、米国）で処置された。
上記方法のさらなる実施形態では、患者は、以前にＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）２３（肺炎球菌ワクチン多価、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、ケニルワース、ＮＪ、米国）で処置された。
上記方法のなおさらなる実施形態では、患者は、以前にＳＹＮＦＬＯＲＩＸ（商標）（肺炎球菌多糖類コンジュゲートワクチン（吸着）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ｓ．ａ．、リクサンサール、ベルギー）で処置された。
上記方法の実施形態では、本発明の多価免疫原性組成物は、医療専門家、例えば医師によって提供される処置レジメンに従って、患者が多価肺炎球菌ワクチンを受けた後の任意の時点で患者に投与される。特定の実施形態では、本発明の多価免疫原性組成物は、患者が多価肺炎球菌ワクチンを受けた１ヶ月～５年後、あるいは患者が多価肺炎球菌ワクチンを受けた１ヶ月～１年後、１ヶ月～２年後、１ヶ月～３年後、１ヶ月～４年後、１ヶ月～６ヶ月後、２ヶ月～６ヶ月後、２ヶ月～１年後、１年～５年後、６ヶ月～５年後、６ヶ月～４年後、６ヶ月～３年後、６ヶ月～２年後、６ヶ月～１年後、１年～４年後、１年～３年後または１年～２年後に患者に投与される。さらなる実施形態では、多価免疫原性組成物は、患者が多価肺炎球菌ワクチンを受けた約１ヶ月後、約２ヶ月後、約３ヶ月後、約４ヶ月後、約５ヶ月後、約６ヶ月後、約７ヶ月後、約８ヶ月後、約９ヶ月後、約１０ヶ月後、約１１ヶ月後、約１年後、約１．２５年後、約１．５年後、約１．７５年後、約２年後、約２．２５年後、約２．５年後、約２．７５年後、約３年後、約３．２５年後、約３．５年後、約３．７５年後、約４年後、約４．２５年後、約４．５年後、約４．７５年後または約５年後に患者に投与される。
さらなる実施形態では、本発明は、（１）ヒト患者で免疫応答を誘導する、（２）ヒト患者で防御免疫応答を誘導する、（３）肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染に対してヒト患者にワクチン接種する、または（４）ヒト患者の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染の可能性を減少させる方法であって、任意の順序で本発明の多価免疫原性組成物を患者に投与するステップと多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与するステップと含む方法を提供する。多価肺炎球菌ワクチンは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の２つ以上の血清型によって引き起こされる肺炎球菌疾患を予防するために必要とされる任意のワクチンであり得る。
上記方法の特定の実施形態では、患者は、
ａ）４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ；
ｂ）４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、６Ａ、７Ｆおよび１９Ａ；
ｃ）１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ；
ｄ）４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、６Ａ、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆ；
ｅ）４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、２、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０；および
ｆ）４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、６Ａ、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆおよび１５Ｂ
からなる群から選択される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型によって引き起こされる肺炎球菌疾患を予防するために必要とされる本発明の多価免疫原性組成物および多価肺炎球菌ワクチンで処置される。
上記方法の具体的な実施形態では、多価肺炎球菌ワクチンは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、３、５、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、２、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０Ａの莢膜多糖類を含む。
上記方法の具体的な実施形態では、多価肺炎球菌ワクチンは複数の多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、多糖類タンパク質コンジュゲートは、担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含む。他の実施形態では、多価肺炎球菌ワクチンは、担体タンパク質にコンジュゲートされていない複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖類を含む。
上記方法の追加の実施形態では、患者は、任意の順序で、本発明の多価免疫原性組成物で処置され、ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）１３（肺炎球菌１３価コンジュゲートワクチン［ジフテリアＣＲＭ１９７タンパク質］、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．、フィラデルフィア、ＰＡ、米国）で処置される。一実施形態では、患者は最初にＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）１３を投与され、患者は第２に本発明の多価免疫原性組成物を投与される。代替実施形態では、患者は最初に本発明の多価免疫原性組成物を投与され、第２にＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）１３を投与される。
上記方法のさらなる実施形態では、患者は、任意の順序で、本発明の多価免疫原性組成物で処置され、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）２３（肺炎球菌ワクチン多価、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、ケニルワース、ＮＪ、米国）で処置される。一実施形態では、患者は最初にＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）２３を投与され、患者は第２に本発明の多価免疫原性組成物を投与される。代替実施形態では、患者は最初に本発明の多価免疫原性組成物を投与され、第２にＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）２３を投与される。
上記方法のなおさらなる実施形態では、患者は、任意の順序で、本発明の多価免疫原性組成物で処置され、ＳＹＮＦＬＯＲＩＸ（商標）（肺炎球菌多糖類コンジュゲートワクチン（吸着）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ｓ．ａ．、リクサンサール、ベルギー）で処置される。一実施形態では、患者は最初にＳＹＮＦＬＯＲＩＸ（商標）を投与され、患者は第２に本発明の多価免疫原性組成物を投与される。代替実施形態では、患者は最初に本発明の多価免疫原性組成物を投与され、第２にＳＹＮＦＬＯＲＩＸ（商標）を投与される。
上記方法のいくつかの実施形態では、多価免疫原性組成物および多価肺炎球菌ワクチンが同時に投与される。本明細書で使用される場合、「同時投与」は、２つの組成物を同時に投与することに限定されず、任意の順序で次々に投与することを含む。いくつかの実施形態では、多価免疫原性組成物および多価肺炎球菌ワクチンは、筋肉内または皮下投与を介して、別々の解剖学的部位、例えば２つの異なる腕に投与される。
上記方法のいくつかの実施形態では、本発明の多価免疫原性組成物と多価肺炎球菌ワクチンの投与の間の時間量が、約４週間～約１年である。代替実施形態では、時間量は、約１ヶ月～約５年である。
一実施形態では、患者は最初に多価肺炎球菌ワクチンを投与され、第２に本発明の多価免疫原性組成物を投与される。代替実施形態では、患者は最初に本発明の多価免疫原性組成物を投与され、第２に多価肺炎球菌ワクチンを投与される。
患者において肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を誘導する、ワクチン接種する、または防御免疫応答を誘導する方法であって、
（１）多価免疫原性組成物を患者に投与し、該組成物は複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、多糖類タンパク質コンジュゲートの各々は、担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含むステップと、
（２）所定の量の時間が経過するのを待つステップと、
（３）多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与するステップと
を含む方法も提供される。
この方法では、多価免疫原性組成物は、本明細書に示される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの任意の組み合わせを含むことができ、そして、多価肺炎球菌ワクチンは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の２つ以上の血清型によって引き起こされる疾患を予防するために必要とされる任意のワクチンであり得る。
患者において肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を誘導する、ワクチン接種する、または防御免疫応答を誘導する方法であって、
（１）多価肺炎球菌ワクチンを患者に投与するステップと、
（２）所定の量の時間が経過するのを待つステップと、
（３）多価免疫原性組成物を患者に投与し、組成物は複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、多糖類タンパク質コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含むステップと、
を含む方法も本発明によって提供される。
この方法では、多価免疫原性組成物は、本明細書に示される肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートの任意の組み合わせを含むことができ、そして、多価肺炎球菌ワクチンは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の２つ以上の血清型によって引き起こされる疾患を予防するために必要とされる任意のワクチンであり得る。
上記方法のいくつかの実施形態では、多価肺炎球菌ワクチンは複数の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類タンパク質コンジュゲートを含み、ここで、多糖類タンパク質コンジュゲートは、担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の莢膜多糖類を含む。代替実施形態では、多価肺炎球菌ワクチンは、担体タンパク質にコンジュゲートされていない肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖類を含む。
本発明の方法の任意の実施形態（すなわち、本明細書に記載される方法のいずれか）では、該方法は、本発明の多価免疫原性組成物の１以上の追加の用量を患者に投与するステップをさらに含み得る。このような方法では、患者が、上記の本発明の多価免疫原性組成物の最初の投与を受ける前に多価肺炎球菌ワクチンを既に受けていてもよい、または本発明の多価免疫原性組成物を受ける前に肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対してワクチン接種されていなくてもよい。よって、一実施形態では、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）によって引き起こされる肺炎球菌疾患を予防するために必要とされる多価肺炎球菌ワクチンを受けた患者は、２回用量以上の本発明の多価免疫原性組成物を投与される。代替実施形態では、以前に肺炎球菌疾患を予防するために必要とされるいずれかのワクチンで処置されていない患者は、２回用量以上の本発明の多価免疫原性組成物を投与される。
上記方法の実施形態では、２回以上の用量が、同じ本発明の多価免疫原性組成物である。代替実施形態では、２回以上の用量が、異なる本発明の多価免疫原性組成物である。
これらの方法のいずれかの具体的な実施形態では、患者は、２回、３回または４回用量の本発明の多価免疫原性組成物を投与される。特定の実施形態では、患者は（例えば、幹細胞移植後の免疫抑制レジメンで）免疫不全であり、投与回数が３回である。
いくつかの実施形態では、本発明の多価免疫原性組成物の各用量の投与間の時間量は、約４週間～約１年である。代替実施形態では、本発明の多価免疫原性組成物の各用量の投与間の時間量は、約１ヶ月～約５年である。
本発明の方法のいずれかの実施形態では、本発明の（１以上の）組成物で処置される患者はヒトである。一定の実施形態では、ヒト患者は、幼児（およそ１２ヶ月～２４ヶ月）、または小児（およそ２～５歳）である。本発明の組成物はまた、より年長の子供、青年および成人（例えば、１８～４５歳、１８～５０歳、１８～５５歳、１８～６０歳または１８～６５歳）での使用にも適している。本発明の方法のいずれかの他の実施形態では、患者は、約２～約１８歳である。本発明の方法のいずれかのさらなる実施形態では、患者は、１８歳以上である。
本発明の方法のさらなる実施形態では、ヒト患者は高齢者である。本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、患者は５０歳以上である。本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、患者は５５歳以上である。本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、患者は６０歳以上である。本発明の方法のいずれかのなおさらなる実施形態では、患者は６５歳以上である。本発明の方法のいずれかの追加の実施形態では、患者は７０歳以上である。
本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物で処置される患者は免疫不全である。
本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、多価免疫原性組成物は、インフルエンザに対するワクチンと同時に投与される。一定の実施形態では、インフルエンザワクチンは、「シニアインフルエンザワクチン」、高齢者、例えば６５歳以上の人に必要とされる高用量インフルエンザワクチンである。
本発明は、肺炎球菌感染症に対する患者の防御免疫応答を誘導する方法であって、免疫学的有効量の本明細書に記載される多価免疫原性肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲート組成物のいずれかを患者に投与するステップを含む方法を提供する。特定のワクチンの成分（すなわち、多価免疫原性組成物）の最適量は、対象における適切な免疫応答の観察を含む標準的な試験によって確認することができる。例えば、別の実施形態では、ヒトワクチン接種についての投与量は、動物試験からヒトデータへの外挿によって決定される。別の実施形態では、投与量が経験的に決定される。
本発明の方法を、侵襲性感染症（髄膜炎、肺炎および菌血症）と非侵襲性感染症（急性中耳炎および副鼻腔炎）の両方を含む微生物、例えば肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）によって引き起こされる一次臨床症候群の予防および／または減少に使用することができる。
本発明の組成物の投与は、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路を介した注射；または、口腔／食事性、呼吸器もしくは尿生殖器管への粘膜投与の１以上を含むことができる。一実施形態では、鼻腔内投与は、肺炎または中耳炎の処置に使用される（肺炎球菌の鼻咽頭運搬をより有効に防ぎ、よってその初期段階で感染症を弱毒化することができるため）。具体的な実施形態では、本発明の組成物は、筋肉内または皮下投与を介して患者に投与される。
本明細書で言及される全ての出版物は、本発明に関連して使用され得る方法論および材料を記載および開示する目的で参照により組み込まれる。
添付の図面を参照して本明細書で本発明の異なる実施形態を記載してきたが、本発明はこれらの正確な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲または精神から逸脱することなく、種々の変更および修正が当業者によってその中で行われ得ることを理解されたい。
以下の実施例は本発明を例示するが、限定するものではない。
［実施例１］
肺炎球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖類の調製
肺炎球菌を培養する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｃｈａｓｅ，１９６７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １：５２を参照されたい。肺炎球菌莢膜多糖類を調製する方法も当該分野で周知である。例えば、欧州特許第０ ４９７ ５２４号明細書を参照されたい。以下に記載される方法は、一般に、欧州特許第０ ４９７ ５２４号明細書に記載される方法に従い、一般に、全ての肺炎球菌血清型に適用可能である。
血清型６Ｃ、２３Ｂおよび３１についての肺炎球菌株の分離株はアメリカ疾病予防管理センター（Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）から入手した。血清型３、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、２２Ｆおよび３３Ｆについての菌株は、ペンシルベニア大学（Ｒｏｂｅｒｔ Ａｕｓｔｒｉａｎ博士）から入手した。血清型１７Ｆおよび１９Ａについての菌株は、ＦＤＡ生物医薬品局（Ｊｏｈｎ Ｒｏｂｂｉｎｓ博士）から入手した。血清型７Ｆは、ニューヨーク州立大学、ダウンステート・メディカル・センター（Ｇｅｒａｌｄ Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ博士）から入手した。上に列挙されていない肺炎球菌血清型の分離株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（マナサス、ＶＡ）から入手した。必要に応じて、サブタイプを、特定の抗血清を使用したクェルング反応に基づいて区別した。例えば、米国特許第５，８４７，１１２号明細書を参照されたい。得られた分離株を、ヘミン無しで、大豆ペプトン、酵母エキスおよびグルコースを含む動物成分を含まない培地からなる寒天プレート上に２段階で連続的に播種することによってさらにクローン分離した。血清型７Ｆの場合、使用した寒天プレートがヘミンも含んでいた。各血清型についてのクローン分離株を、大豆ペプトン、酵母エキス、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウム、グルコースおよびグリセロールを含む動物成分を含まない培地を使用した液体培養でさらに拡大して、プレマスター細胞バンクを調製した。
肺炎球菌多糖類の各血清型の生産は、細胞拡大およびバッチ生産発酵、引き続いて下流精製前の化学的不活性化からなっていた。大豆ペプトンまたは大豆ペプトン限外濾過液、酵母エキスまたは酵母エキス限外濾過液、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびグルコースを含む滅菌済みの動物成分を含まない増殖培地を含む振盪フラスコまたは培養ボトルを使用して、各血清型の解凍細胞バンクバイアルを拡大した。細胞拡大培養物を密封振盪フラスコまたはボトル内で増殖させて、温度および攪拌制御によりガス交換を最小化した。血清型３、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆおよび３３Ｆの場合、同じ培地を含む発酵槽を使用して、解凍した細胞バンクバイアルを拡大した。これらの血清型の細胞拡大中に、温度、ｐＨ、圧力および攪拌を制御した。スパージングを使用しなかったため、通気オーバーレイも制御した。６００ｎｍでの光学濃度によって測定される特定の培養密度に達した後、細胞拡大培養物の一部を、大豆ペプトンまたは大豆ペプトン限外濾過液、酵母エキスまたは酵母エキス限外濾過液、塩化ナトリウム、リン酸カリウムおよびグルコースを含む滅菌済みの動物成分を含まない増殖培地を含む生産発酵槽に移した。温度、ｐＨ、圧力および攪拌を制御した。スパージングを使用しなかったため、通気オーバーレイも制御した。
グルコースがほぼ枯渇したら、化学的不活性化剤であるフェノールを添加してバッチ発酵を終了した。純粋なフェノールを最終濃度０．８～１．２％まで添加して、細胞を不活性化し、細胞壁から莢膜多糖類を遊離させた。一次不活性化が発酵槽内で指定された時間起こり、そこでは温度および攪拌が制御され続ける。一次不活化後、バッチを別の容器に移し、これを制御された温度でさらなる指定時間保持し、完全に不活化するために攪拌した。これを、微生物プレーティング技術またはフェノール濃度および指定時間の検証によって確認した。次いで、不活化ブロスを精製した。
［実施例２］
肺炎球菌多糖類の精製
肺炎球菌多糖類の精製方法は、いくつかの遠心分離、デプス濾過、濃縮／ダイアフィルトレーション操作および沈殿ステップからなっていた。特に指定のない限り、全ての手順を室温で実施した。
肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の発酵槽培養物からの不活化ブロスをカチオン性ポリマー（ＢＰＡ－１０００、ＴＲＥＴＯＬＩＴＥ（登録商標）（Ｂａｋｅｒ Ｈｕｇｈｅｓ Ｉｎｃ．、ヒューストン、ＴＸ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ８１６０、ポリ（エチレンイミン）およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ｐＤＡＤＭＡＣなど）で凝集させた。カチオン性ポリマーは、不純物タンパク質、核酸および細胞片に結合した。凝集ステップおよび熟成期間後、凝集した固体を、遠心分離および複数回のデプス濾過ステップを介して除去した。清澄化ブロスを濃縮し、１００ｋＤａ～５００ｋＤａのＭＷＣＯ（分子量カットオフ）フィルタを使用してダイアフィルトレーションした。トリス、ＭｇＣｌ２緩衝液およびリン酸ナトリウム緩衝液を使用してダイアフィルトレーションを達成した。ダイアフィルトレーションにより、残留核酸およびタンパク質を除去した。
変性アルコールおよび／またはイソプロパノールを用いた酢酸ナトリウムおよびフェノール中の多糖類の再沈殿によってさらなる不純物の除去を達成した。フェノール沈殿ステップ中、リン酸ナトリウム生理食塩水緩衝液中の酢酸ナトリウムとフェノール（液化フェノールまたは固体フェノール）をダイアフィルトレーション保持液に装入した。次いで、多糖類のアルコール分画を２段階で実施した。第一段階では、低濃度のアルコールを調製物に添加して、細胞片およびその他の不要な不純物を沈殿させたが、粗多糖類は溶液中に残った。遠心分離、引き続いてデプス濾過ステップを介して不純物を除去した。次いで、追加のイソプロパノールまたは変性アルコールをバッチに添加することによって、溶液から多糖類を回収した。沈殿した多糖類ペレットを遠心分離によって回収し、研和し、粉末として乾燥させ、－７０℃で凍結保存した。
［実施例３］
ＮＭＲ試験による一定の肺炎球菌血清型の構造同一性分析
０．０１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および０．０１％２，２－ジメチル－２－シラペンタン－５－スルホネート－ｄ６ナトリウム塩（ＤＳＳ－ｄ６）を含む重水（Ｄ２Ｏ）に、５ｍｇ粉末／ｍＬ溶液で多糖類粉末を溶解することによって、ＮＭＲ分析用の試料を調製した。ＤＭＳＯは定量分析に使用した内部標準であり、ＤＳＳ－ｄ６は化学シフトスケールを０ｐｐｍに設定するために使用した。一次元プロトンＮＭＲデータセットを５０℃で取得し、次いで、アノマー共鳴を含むスペクトルの一部を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌワークブックを使用して分析するために、ＡＳＣＩＩファイルにｘ、ｙ座標として選択的に書き込んだ。次いで、Ｙ座標（すなわち、スペクトルプロファイル）を、参照データベース内の莢膜細菌多糖類のスペクトルプロファイルと比較した。参照プロファイルは、その後、参照ロットとして指定される各血清型の選択された調製物について同様に作成した。試料スペクトルと参照スペクトルからのｙ値を対比較して、スペクトル間の類似性の尺度として相関係数（ρｘｙ）を作成した。参照スペクトルのいずれかで０．９５以上のρ値を、多糖類構造の正の同定と見なした。
図１～図４は、それぞれ、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型６Ｃ、１５Ａ、脱Ｏ－アセチル化１５Ｂおよび３５Ｂの莢膜多糖類の６００ＭＨｚ一次元１Ｈ ＮＭＲスペクトルを提供する。肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型６Ｃ、１５Ａ、脱Ｏ－アセチル化１５Ｂおよび３５Ｂの血清型同定に使用される１Ｈ ＮＭＲ同定領域は、それぞれ図５～図８に提供される。
肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型脱Ｏ－アセチル化１５Ｂおよび１５Ｃの莢膜多糖類の構造
ニュージーランドホワイト種ウサギでＰＣＶ２１を使用して免疫原性試験を行った（下記の実施例４３参照）。これらの試験では、血清型１５Ｃの代わりに脱Ｏ－アセチル化多糖類血清型１５Ｂを多価組成物に使用した。ＮＭＲ試験を行って、脱Ｏ－アセチル化１５Ｂ多糖類が血清型１５Ｃ多糖類と同等であることを確認した。
莢膜多糖類血清型間の構造的差が、ＮＭＲスペクトルの化学シフトの差として現れる。アノマー領域（およそ４．４ｐｐｍ～６．０ｐｐｍ）は、多糖類の反復単位の全ての構造的特徴に感受性である。立体化学、単糖組成、Ｏ－アセチル化およびグリコシド結合の差が、各血清型に固有のスペクトルのこの領域を残して、アノマーシグナルの化学シフトに影響を及ぼす。脱Ｏ－アセチル化血清型１５Ｂ多糖類の場合、完全な１Ｈ ＮＭＲスペクトルは血清型１５Ｃ多糖類の１Ｈ ＮＭＲスペクトルと同一であり、両多糖類の反復単位が同じ単糖置換基およびグリコシド結合部位からなることを示している（図９Ｂ～図９Ｃおよび図１０Ｂ～図１０Ｃ参照）。脱Ｏ－アセチル化ステップによって１５Ｂ多糖類に存在するＯ－アセテート基が除去されたこと、および観察されるＯ－アセテート基が本質的に残っていないことも明確に示されている（図１０Ａ～図１０Ｆ参照）。
［実施例４］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型３コンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ １９７を個別に凍結乾燥し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、３８０ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．２５モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で１２時間進行した。
活性化された生成物を、１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、１０％ｗ／ｖのスクロース濃度で２ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度１．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．３を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で１時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１．６時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000002

［実施例５］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用したコンジュゲート多価試験用の血清型６Ｃの調製
多糖類を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類の酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。濾過し溶解した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１０モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度２．２ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．４を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で１５時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で３時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000003

［実施例６］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型６Ｃコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類の酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。濾過し溶解した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１０モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度１．９ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．４を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で１５時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で３時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000004

ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した一価試験用の血清型６Ａコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、２００ｂａｒ／５通過に制御した。サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１０モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度１．５ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．４を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で１５時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で３時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000005

［実施例７］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型７Ｆコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、１５０ｂａｒ／７通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．２４モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は４℃で４時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度２．６ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で４時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で３時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000006

［実施例８］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型８コンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、６００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１８モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で４時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度４．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。ブレンド後、コンジュゲーション反応は２２℃で２時間進行した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加すると、血清型８のコンジュゲーション反応中に不可逆的沈殿が生じる可能性があることが観察されたため、シアノ水素化ホウ素ナトリウムをコンジュゲーション反応に添加しなかった。反応からシアノ水素化ホウ素ナトリウムを省略すると、コンジュゲートの属性に有意に影響を及ぼすことなく沈殿が回避された。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過（０．５ミクロンプレフィルタを使用）し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000007

［実施例９］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型９Ｎコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、２５０ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１６モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で４時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度３．２５ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で１時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000008

［実施例１０］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した一価試験用の血清型１０Ａコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、２００ｂａｒ／５通過、引き続いて６００ｂａｒ／５通過に制御して、標的分子質量を達成した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１５モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度５．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比２．０を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で４時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過（０．５ミクロンプレフィルタを使用）し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000009

［実施例１１］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型１０Ａコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、６００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１６モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度４．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．７５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で４時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過（０．５ミクロンプレフィルタを使用）し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000010

［実施例１２］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型１１Ａコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を、酢酸を２００ｍＭに添加して酸加水分解によってサイズを減少させ、９２℃で７５分間インキュベートし、次いで、冷リン酸カリウムｐＨ７緩衝液を４００ｍＭに添加して中和した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１３モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、２５ｍＭ塩化ナトリウムを含む等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度３．５ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で４時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過（０．５ミクロンプレフィルタを使用）し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000011

［実施例１３］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型１２Ｆコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を、酢酸を２００ｍＭに添加して酸加水分解によってサイズを減少させ、９０℃で４５分間インキュベートし、次いで、冷リン酸カリウムｐＨ７緩衝液を４００ｍＭに添加して中和した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．２６モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、２５ｍＭ塩化ナトリウムを含む等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度３．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で４時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で３時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000012

［実施例１４］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した一価試験用の血清型１５Ａコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、２００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり１．７５モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２０時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、２５ｍＭ塩化ナトリウムを含む等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度６．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比２．０を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で２．５時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過（０．５ミクロンプレフィルタを使用）し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000013

［実施例１５］
水性コンジュゲーションを使用した１５Ａ／Ｂ／Ｃ交差防御試験用の血清型１５Ａコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、サイズを減少させ、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。次いで、精製したＣＲＭ１９７を、水性反応混合物中の塩化ニッケルを利用して活性化多糖類にコンジュゲートさせ、得られたコンジュゲートを最終０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜多糖類粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、２００ｂａｒ／５通過に制御して、標的分子質量を達成した。次いで、サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類反復単位１モル当たり０．４５モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウムとした。酸化反応は２２℃で２０時間進行した。活性化された生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。限外濾過生成物を２２℃およびｐＨ５に調整することによって、さらなる活性化を達成した。多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり２．０モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）を装入して、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加して活性化を行った。酸化反応は２２℃で２０時間進行した。第２の活性化された生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
酸化多糖類溶液を水および１．５Ｍリン酸カリウムｐＨ６．０と混合した。選択した緩衝液ｐＨは、コンジュゲーション反応中の活性化多糖類の安定性を向上させるためのものであった。以前記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通して得られた精製ＣＲＭ１９７を、０．２ミクロン濾過し、多糖類とＣＲＭ１９７の質量比０．６で、緩衝多糖類溶液と合わせた。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。多糖類濃度およびリン酸塩濃度は、それぞれ９．７５ｇ／Ｌおよび１００ｍＭであった。多糖類濃度は、得られるコンジュゲートのサイズを制御するように選択した。１００ｍＭ塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニッケルをおよそ２ｍＭまで添加した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）を添加した。多糖類およびタンパク質の消費を最大化するために１０℃で１４８時間コンジュゲーションを進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲーション反応後、バッチをおよそ３．０ｇ／Ｌの多糖類濃度に希釈し、２～８℃に冷却し、１．２ミクロン濾過した。バッチを、１００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、２～８℃で、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０に対してダイアフィルトレーションした。次いで、保持液に回収されたバッチをおよそ２．０ｇ多糖類／Ｌに希釈し、１．２Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．４を添加してｐＨを調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加した。１．５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６．０を後で添加した。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。ポリソルベート２０を保持液バッチに０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度まで添加し、次いで、バッチを０．２ミクロン濾過した（０．５ミクロンプレフィルタを使用）。
バッチを、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０緩衝液中追加の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンで、１．０ｇ／Ｌの多糖類濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000014

［実施例１６］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型１５Ａコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、２００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり１．７５モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２０時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、３４℃に予熱した等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液に塩化ナトリウムを５０ｍＭの濃度まで添加した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度５．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比２．０を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを３４℃で２時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000015

［実施例１７］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した１５Ａ／Ｂ／Ｃ交差防御試験用の血清型１５Ｂコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、３００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．２０モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で４時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度３．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比２．０を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で５時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過（０．５ミクロンプレフィルタを使用）し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000016

［実施例１８］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した一価試験および１５Ａ／Ｂ／Ｃ交差防御試験用の血清型１５Ｃコンジュゲートの調製
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、温和な塩基加水分解に供してＯ－アセチル基を放出し、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少、塩基加水分解および酸化
精製された血清型１５Ｂ肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、３００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
多糖類溶液を６０℃に加熱し、重炭酸ナトリウムｐＨ９緩衝液を最終濃度５０ｍＭまで添加した。バッチを６０℃で１３時間混合しながらインキュベートして、Ｏ－アセチル基を放出した。リン酸カリウムｐＨ６緩衝液を最終濃度１３６ｍＭまで添加してｐＨを中和し、溶液を周囲温度に冷却した。次いで、溶液を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．２０モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度３．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比２．０を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で４時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過（０．５ミクロンプレフィルタを使用）し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000017

［実施例１９］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型１５Ｃコンジュゲートの調製
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、温和な塩基加水分解に供してＯ－アセチル基を放出し、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少、塩基加水分解および酸化
精製された血清型１５Ｂ肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、３００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
多糖類溶液を６０℃に加熱し、重炭酸ナトリウムｐＨ９緩衝液を最終濃度５０ｍＭまで添加した。バッチを６０℃で１３時間混合しながらインキュベートして、Ｏ－アセチル基を放出した。リン酸カリウムｐＨ６緩衝液を最終濃度１３６ｍＭまで添加してｐＨを中和し、溶液を周囲温度に冷却した。
次いで、溶液を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．２０モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度３．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．７５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で８時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過（０．５ミクロンプレフィルタを使用）し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000018

［実施例２０］
水性コンジュゲーションを使用した一価試験用の血清型１６Ｆコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、サイズを減少させ、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。次いで、精製したＣＲＭ１９７を、水性反応混合物中の塩化ニッケルを利用して活性化多糖類にコンジュゲートさせ、得られたコンジュゲートを最終０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜多糖類粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、２００ｂａｒ／５通過、引き続いて５００ｂａｒ／５通過に制御して、標的分子質量を達成した。次いで、サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１５モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
酸化多糖類溶液を水および１．５Ｍリン酸カリウムｐＨ７．０と混合した。選択した緩衝液ｐＨは、コンジュゲーション反応中の活性化多糖類の安定性を向上させるためのものであった。以前記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通して得られた精製ＣＲＭ１９７を、０．２ミクロン濾過し、多糖類とＣＲＭ１９７の質量比０．７で、緩衝多糖類溶液と合わせた。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。多糖類濃度およびリン酸塩濃度は、それぞれ７．５ｇ／Ｌおよび１００ｍＭであった。多糖類濃度は、得られるコンジュゲートのサイズを制御するように選択した。次いで、溶液を０．２ミクロン濾過した。１００ｍＭ塩化ニッケル溶液を使用して、塩化ニッケルをおよそ２ｍＭまで添加した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）を添加した。多糖類およびタンパク質の消費を最大化するために２２℃で１２２時間コンジュゲーションを進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲーション反応後、バッチをおよそ３．０ｇ／Ｌの多糖類濃度に希釈し、２～８℃に冷却し、１．２ミクロン濾過した。バッチを、１００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、２～８℃で、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０に対してダイアフィルトレーションした。次いで、保持液に回収されたバッチをおよそ２．０ｇ多糖類／Ｌに希釈し、１．２Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．４を添加してｐＨを調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加した。１．５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６．０を後で添加した。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。ポリソルベート２０を保持液バッチに０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度まで添加し、次いで、バッチを０．２ミクロン濾過した（０．５ミクロンプレフィルタを使用）。
バッチを、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０緩衝液中追加の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンで、１．０ｇ／Ｌの多糖類濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000019

［実施例２１］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型１６Ｆコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、１０００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１５モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液に塩化ナトリウムを５０ｍＭの濃度まで添加した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度２．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で２時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000020

［実施例２２］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した一価試験用の血清型１７Ｆコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、２００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１１モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液に塩化ナトリウムを５０ｍＭの濃度まで添加した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度２．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で２時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000021

［実施例２３］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型１７Ｆコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、２００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１１モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液に塩化ナトリウムを２０ｍＭの濃度まで添加した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度２．１ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で２時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過（０．５ミクロンプレフィルタを使用）し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000022

［実施例２４］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型１９Ａコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類の酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．２６モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２０時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度３．８ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．３３を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で１．５時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で３時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000023

［実施例２５］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した一価試験用の血清型２０Ａコンジュゲートの調製
以前に血清型２０Ａであると決定された多糖類（Ｃａｌｉｘ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｇｅｎｅｔｉｃ，ａｎｄ Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｗｏ Ｃａｐｓｕｌｅ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ ａｍｏｎｇ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ２０ Ｓｔｒａｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７（３３）：２７８８５－２７８９４，（２０１２））を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、２００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。メタ過ヨウ素酸ナトリウムを、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１１モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）で添加した。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度２．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で６時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過（０．５ミクロンプレフィルタを使用）し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000024

［実施例２６］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型２０Ａコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、２２０ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。メタ過ヨウ素酸ナトリウムを、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１６モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）で添加した。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液に塩化ナトリウムを２０ｍＭの濃度まで添加した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度１．４ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で４時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過（０．５ミクロンプレフィルタを使用）し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000025

［実施例２７］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型２２Ｆコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、４００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。メタ過ヨウ素酸ナトリウムを、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１２モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）で添加した。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度１．８ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で１時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000026

［実施例２８］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した一価試験用の血清型２３Ａコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を、酢酸を２００ｍＭに添加して酸加水分解によってサイズを減少させ、９０℃で１．５時間インキュベートし、次いで、冷リン酸カリウムｐＨ７緩衝液を４００ｍＭに添加して中和した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムは、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．２０モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液に塩化ナトリウムを５０ｍＭの濃度まで添加した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度３．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で２時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で３時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000027

［実施例２９］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型２３Ａコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を、酢酸を２００ｍＭに添加して酸加水分解によってサイズを減少させ、９０℃で１．５時間インキュベートし、次いで、冷リン酸カリウムｐＨ７緩衝液を４００ｍＭに添加して中和した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムは、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．２０モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度３．５ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で２時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000028

［実施例３０］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した一価試験用の血清型２３Ｂコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、４００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。メタ過ヨウ素酸ナトリウムを、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１０モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）で添加した。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液に塩化ナトリウムを５０ｍＭの最終濃度まで添加した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度５．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で２時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000029

［実施例３１］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型２３Ｂコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、４００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。メタ過ヨウ素酸ナトリウムを、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１３モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）で添加した。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度５．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で４時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000030

［実施例３２］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した一価および多価試験用の血清型２４Ｆコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を、酢酸を２００ｍＭに添加して酸加水分解によってサイズを減少させ、９２℃で５０分間インキュベートし、次いで、冷リン酸カリウムｐＨ７緩衝液を４００ｍＭに添加して中和した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムは、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１８モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、１０％ｗ／ｖのスクロース濃度で２ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液に塩化ナトリウムを５０ｍＭの最終濃度まで添加した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度１．５ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で２時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000031

［実施例３３］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した一価試験用の血清型３１コンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を、酢酸を２００ｍＭに添加して酸加水分解によってサイズを減少させ、９０℃で３０分間インキュベートし、次いで、冷リン酸カリウムｐＨ７緩衝液を４００ｍＭに添加して中和した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムは、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１６モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度４．０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で１時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000032

［実施例３４］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型３１コンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、４００ｂａｒ／５通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。メタ過ヨウ素酸ナトリウムを、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１２モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）で添加した。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液に塩化ナトリウムを５０ｍＭの最終濃度まで添加した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度３．５ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で１時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000033

［実施例３５］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型３３Ｆコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、標的分子質量にサイジングし、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類のサイズ減少および酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を均質化して、Ｐｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、３５０ｂａｒ／４通過に制御した。
サイズが減少した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。メタ過ヨウ素酸ナトリウムを、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．１２モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）で添加した。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７材料を、等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度１．８ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比１．７５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを２２℃で４時間進めた。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過（０．５ミクロンプレフィルタを使用）し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000034

［実施例３６］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した一価試験用の血清型３５Ｂコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類の酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムは、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．０５モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ１９７を、２５ｍＭ塩化ナトリウムを含む等体積のＤＭＳＯに個別に再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度１０ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ１９７の質量比４．０を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。コンジュゲーションは２２℃で２．５時間進行した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり０．０２５モル）を、コンジュゲーションインキュベーション中に２回の添加にわたって添加した。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、２２℃で１．５時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過（０．５ミクロンプレフィルタを使用）し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000035

［実施例３７］
ＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した多価試験用の血清型３５Ｂコンジュゲートの調製
多糖類を溶解し、化学的に活性化し、限外濾過によって緩衝液交換した。活性化された多糖類および精製されたＣＲＭ１９７を個別に凍結乾燥し、ＤＭＳＯに再溶解した。次いで、再溶解した多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液を合わせ、下記のようにコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを、最後の０．２ミクロン濾過の前に限外濾過によって精製した。ｐＨ、温度、濃度および時間のような各ステップ内のいくつかのプロセスパラメータを制御して、所望の属性を有するコンジュゲートを得た。
多糖類の酸化
精製された肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、０．４５ミクロン濾過した。溶解した多糖類を濃縮し、１０ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。
次いで、多糖類溶液を２２℃および酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ５に調整して、活性化による多糖類のサイズ減少を最小化した。多糖類活性化を、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加で開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムは、多糖類活性化の標的レベルを達成するために、多糖類反復単位１モル当たり０．０５モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル）とした。酸化反応は２２℃で２時間進行した。
活性化された生成物を１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．４に対してダイアフィルトレーションし、引き続いて５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して水に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過は２～８℃で行った。
ＣＲＭ１９７への多糖類コンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）での発現を通じて得られた精製ＣＲＭ１９７を、５ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、０．２ミクロン濾過した。
活性化された多糖類を、５％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。ＣＲＭ１９７を、１％ｗ／ｖのスクロース濃度で６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬで凍結乾燥用に製剤化した。
製剤化したＰｓおよびＣＲＭ１９７溶液を個別に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓを、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むＤＭＳＯに再溶解した。凍結乾燥したＣＲＭ１９７を等体積のＤＭＳＯに再溶解した。多糖類溶液およびＣＲＭ１９７溶液をブレンドして、多糖類濃度５．２５ｇ Ｐｓ／Ｌおよび多糖類とＣＲＭ １９７の質量比３．５を達成した。質量比は、得られるコンジュゲートの多糖類とＣＲＭ１９７の比を制御するように選択した。コンジュゲーションは３４℃で３時間進行した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり０．０３７５モル）を、コンジュゲーションインキュベーション中に３回の添加にわたって添加した。
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位１モル当たり２モル）をコンジュゲーション反応後に添加し、３４℃で１時間インキュベートした。バッチをおよそ４℃で、およそ０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウムに希釈した。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加してｐＨを中和した。バッチを濃縮し、３０ｋＤ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に対しておよそ４℃でダイアフィルトレーションした。
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、バッチを濃縮し、３００ｋＤａ ＮＭＷＣＯタンジェント流限外濾過膜を使用して、４℃で、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションした。
保持液バッチを０．２ミクロン濾過（０．５ミクロンプレフィルタを使用）し、次いで、０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で追加の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、－６０℃以下で凍結した。
Figure 0007369123000036

いくつかの水性コンジュゲーション方法は、実施例３８～５１で全ての血清型については記載しなかった。本明細書に記載されていないこれらの水性コンジュゲーション方法については、類似の方法を国際公開第２０１８／１５６４９１号に見出すことができる。
［実施例３８］
肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤化
上記の実施例に記載される異なる化学を利用して調製された個々の肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを、それぞれＰＣＶ１、ＰＣＶ７、ＰＣＶ８、ＰＣＶ１４、ＰＣＶ１５、ＰＣＶ１６、ＰＣＶ２１およびＰＣＶ３１と呼ばれる１価、７価、８価、１４価、１５価、１６価、２１価および３１価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤化に使用した。
ＰＣＶ１ワクチン製剤は、プロトン性（水性）溶媒または非プロトン性（ＤＭＳＯ）溶媒中での還元的アミノ化を使用してコンジュゲートされ、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０に、ワクチン中８４μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）の肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ）の標的最終濃度で製剤化された血清型３を含んでいた。
ＰＣＶ７ワクチン製剤は、プロトン性（水性）溶媒または非プロトン性（例えば、ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化を使用してコンジュゲートされ、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０に製剤化された血清型３、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１５Ａおよび１９Ａを含んでいた。ＰＣＶ７の各多糖類－タンパク質コンジュゲートを、ワクチン中８４μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓの標的最終濃度で１２μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ）で製剤化した。
ＰＣＶ８ワクチン製剤は、非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化を使用してコンジュゲートされ、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０に製剤化された血清型６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂを含んでいた。ＰＣＶ８の各多糖類－タンパク質コンジュゲートを、ワクチン中３２μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓの標的最終濃度で４μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ）で製剤化した。
ＰＣＶ１４ワクチン製剤は、プロトン性（水性）溶媒または非プロトン性（例えば、ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化を使用してコンジュゲートされ、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０に製剤化された血清型３、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆを含んでいた。ＰＣＶ１４の各多糖類－タンパク質コンジュゲートを、ワクチン中８４μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓの標的最終濃度で６μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ）で製剤化した。
ＰＣＶ１５ワクチン製剤は、プロトン性（水性）溶媒中でコンジュゲートされ、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０に製剤化された血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを含んでいた。各多糖類－タンパク質コンジュゲートを、ワクチン中６４μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓの標的最終濃度で、８μｇ／ｍＬで製剤化した６Ｂを除いて、４μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ）で製剤化した。
ＰＣＶ１６ワクチン製剤は、非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化を使用してコンジュゲートされ、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０に製剤化された血清型６Ｃ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂを含んでいた。各多糖類－タンパク質コンジュゲートを、ワクチン中６４μｇ／ｍＬまたは１２８μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓの標的最終濃度で４μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）または８μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ）で製剤化した。
ＰＣＶ２１ワクチン製剤は、非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化を使用してコンジュゲートされ、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび各実施例で定義される種々の濃度のＰＳ－２０に製剤化された血清型３、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３３Ｆおよび３５Ｂを含んでいた。各多糖類－タンパク質コンジュゲートを、ワクチン中８４μｇ／ｍＬまたは１６８μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓの標的最終濃度で４μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）または８μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ）で製剤化した。いくつかの実施例では、ＰＣＶ２１をリン酸アルミニウムの形態で２５０μｇ［Ａｌ］／ｍＬで製剤化した。
ＰＣＶ３１ワクチン製剤は、プロトン性溶媒（水性）または非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化を使用してコンジュゲートされ、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％ＰＳ－２０に製剤化された血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、３３Ｆおよび３５Ｂを含んでいた。各多糖類－タンパク質コンジュゲートを、ワクチン中１２８μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓの標的最終濃度で、８μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓで製剤化した６Ｂを除いて、４μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ）で製剤化した。いくつかの実施例では、ＰＣＶ３１をリン酸アルミニウムの形態で２５０μｇ［Ａｌ］／ｍＬで製剤化した。
肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲート血清型６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、１０Ａ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１または３５Ｂを利用して、追加の一価ＰＣＶ製剤を調製した。追加の詳細は、これらの製剤についての具体的な実施例に記載する。
ＰＣＶ製剤を調製するために、指示される最終濃度（ｗ／ｖ）の肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓとも呼ばれる）を得るために必要なバルクコンジュゲートの必要体積を、バッチ体積およびバルク多糖類濃度に基づいて計算した。
製剤化方法は、１０～８０ｍＭヒスチジン、０．０～０．８％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０および１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．８中１倍～４倍の最終濃度のＰｎＰｓブレンドでのコンジュゲートバルクブレンド調製からなっていた。
ヒスチジンｐＨ５．８、ＰＳ－２０（利用する場合）および１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液を調製し、製剤容器に添加した。凍結貯蔵された個々の肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを２～８℃で解凍し、次いで、製剤容器に添加した。多糖類－タンパク質コンジュゲートを製剤緩衝液（コンジュゲートブレンド）に添加する間、容器を混合して、磁気攪拌棒または磁気インペラーを使用して均質性を確保した。全ての添加を行い、溶液を攪拌した後、コンジュゲートブレンドを滅菌フィルタに通過させ、リン酸アルミニウムアジュバントの有無にかかわらず容器に回収した。場合によっては、滅菌フィルタを１５０ｍＭ塩化ナトリウムで追跡して、バッチを目標濃度に調整した。
製剤をプラスチックシリンジ、ガラスシリンジまたはバイアルに充填した。
［実施例３９］
肺炎球菌コンジュゲートワクチンの安定性評価
ＰＣＶ１６（１２８μｇ／ｍＬ ＰｎＰ）または２つのＰＣＶ２１肺炎球菌コンジュゲートワクチン製剤（８４μｇ／ｍＬまたは１６８μｇ／ｍＬ ＰｎＰ）をシリンジまたはバイアルに充填した。多糖類タンパク質コンジュゲートを、非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化によって作製し、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０に製剤化した。これらの製剤を、２５℃または３７℃で最大４週間および４℃で最大１２週間置いた。場合によっては、シリンジを水平回転プラットフォームに置き、４℃、２５℃または３７℃で１週間貯蔵した後、最大１８時間振盪した。製剤製造および流通に伴う可能性のある輸送および取り扱いのストレスをシミュレートするためにこれを行った。ＰＣＶ１６またはＰＣＶ２１製剤の安定性を評価するために、ＨＰＳＥＣ ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩを使用した。２つのＳｈｏｄｅｘカラム（８０３および８０６）を使用した高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）を紫外線（ＵＶ）多角度光散乱（ＭＡＬＳ）および屈折率（ＲＩ）検出と直列に組み合わせて、貯蔵中のＰＣＶ製剤の濃度およびモル質量を測定した。濃度を、ピーク全体にわたって各時間間隔で計算し、次いで、全ての間隔で積分して最終的な濃度値を達成する。光散乱は、分析物の分子質量と濃度の積に比例する。各間隔での分子質量または分子量を、検出器シグナルから計算する。加重平均（Ｍｗ）または数平均（Ｍｎ）分子質量を、ピークの全ての間隔にわたって計算し、平均分子量として報告する。
貯蔵すると、コンジュゲートワクチンのタンパク質および／または炭水化物への損傷が生じ得る。多糖類の反復単位にホスホジエステル主鎖結合または他の不安定性を有する炭水化物抗原は、拡大された時間および温度での貯蔵で加水分解を通した解重合を受けやすくなり得る。さらに、コンジュゲートワクチンに使用される担体タンパク質または炭水化物は、貯蔵および物理的ストレスで凝集しやすくなり得る。
図１１に示されるように、ＰＣＶ１６およびＰＣＶ２１製剤は、多糖類濃度に関係なく、２５℃および３７℃で４週間ならびに４℃で最大１２週間安定であった。さらに、熱的ストレス後の水平攪拌で、ＰＣＶ１６およびＰＣＶ２１製剤は安定していることが示された。これらの熱的ストレスおよび物理的ストレス下では、容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）または容器（ｖｅｓｓｅｌ）の側面への非特異的吸着による抗原量の損失は観察されなかった。さらに、ワクチンの総用量を推定する際に、カラムでの性能に影響を与える可能性のある製剤の凝集（例えば、カラムへの不可逆的な結合または分離カラムへの出入りができない）は観察されなかった（図１２）。
ＨＰＳＥＣ ＵＶ／ＭＡＬｓ／ＲＩを使用して、多糖類－タンパク質コンジュゲートの分子量を測定した。製剤中の多糖類－タンパク質コンジュゲートが分解または解重合している場合、分子量の減少が自明であり、製剤の凝集が起こっている場合、分子量の増加が生じるだろう。この測定は、ワクチン製剤または中間体の品質に関する追加の特性評価を提供する。図１３に示されるように、各々が非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化を使用して調製された製剤原料を含むＰＣＶ１６およびＰＣＶ２１製剤は、炭水化物の解重合または化学分解に対して安定であり、製剤中のタンパク質の凝集に対して安定であった。これは、ＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用して調製された多糖類タンパク質コンジュゲートを使用するＰＣＶ１６およびＰＣＶ２１製剤が、高温および物理的ストレスを通して安定であることを示している。製剤は量と質の両方に関して優れた安定性を実証する。製剤は、容器の側面または他の表面への非特異的吸着により総用量を失うことはなく、製剤は、ワクチン製剤の安定な分子量（重量平均分子量（Ｍｗ））および数平均分子量（Ｍｎ））によって示されるように、分解も凝集もしない。
［実施例４０］
肺炎球菌コンジュゲートワクチンの安定性に対するコンジュゲーション化学の影響
上記の実施例に記載されるように異なる化学を利用して調製された個々の肺炎球菌多糖類－タンパク質複合体を、６４μｇ／ｍＬのＰＣＶ１５およびＰＣＶ１６と呼ばれる１５価および１６価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤化に使用した。ＰＣＶ１５ワクチン製剤は、プロトン性溶媒（全て水性）中での還元的アミノ化を使用してコンジュゲートされ、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％ｗ／ｖ ＰＳ－２０に製剤化された血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを含んでいた（実施例３８参照）。ＰＣＶ１６製剤は、非プロトン性溶媒（例えば、全てＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化を使用してコンジュゲートされ、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０に製剤化された血清型６Ｃ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂを含んでいた（実施例３８参照）。各多糖類－タンパク質コンジュゲートを、各ワクチン中６４μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓの最終濃度で、８μｇ／ｍＬで製剤化したＰＣＶ１５の６Ｂを除いて、４μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ）で製剤化した。
ワクチンを充填した容器を４℃または３７℃で最大１週間置いた。固有のタンパク質蛍光分光法（ＩＰＦＳ）を使用して、ＰＣＶ１５またはＰＣＶ１６組成物中の肺炎球菌多糖類コンジュゲート担体タンパク質、ＣＲＭ１９７の安定性を、４℃および３７℃で最大１週間貯蔵して評価した。非希釈試料の蛍光発光スペクトル（Ｅｍ２９０～４００ｎｍ）を、Ｊａｓｃｏ ＦＰ－６５００分光蛍光光度計を使用して、周囲室温で経路長１ｃｍの石英キュベットで収集した。励起波長２８０ｎｍを走査速度１００ｎｍ／分ならびに励起および発光バンドパス３ｎｍと共に使用した。
図１４に示されるように、非プロトン性溶媒（例えば、全てＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化を使用して調製された製剤原料を含む製剤は、コンジュゲーション方法（全て水性コンジュゲーション）で還元的アミノ化中にプロトン性溶媒を使用して調製された製剤原料を利用したワクチンと比較して、優れた物理的および化学的安定性をもたらした。３７℃でわずか１６時間で、コンジュゲーション方法でプロトン性溶媒（全て水性）での還元的アミノ化を使用して調製された、６４μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓのＰＣＶ１５製剤の蛍光強度が減少し、ワクチンの発光極大は３３２ｎｍから３３８ｎｍにシフトした。非プロトン性溶媒（例えば、全てＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化化学により調製された製剤原料を利用した、６４μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓのＰＣＶ１６ワクチン製剤は、蛍光強度も発光極大３３８ｎｍも変化を示さなかった。ＩＰＦＳ測定から得られた結果のシグナル強度および発光極大は、多価複合製剤中の個々の製剤原料の集団的安定性によるものであることを理解すべきである。本発明者らは、非プロトン性溶媒中で調製された全ての製剤原料を利用したワクチン製剤は安定であるが、プロトン性溶媒中で調製された全ての製剤原料を利用したワクチン製剤は安定ではないことを示した。
特定の理論に拘束されるものではないが、この安定性は、担体タンパク質のアンフォールディングおよび変性をもたらすＤＭＳＯ中でのコンジュゲーションによるものであり得るだろう。変性した担体タンパク質へのコンジュゲーションは、コンジュゲーション後の変性状態でコンフォメーションを固定するだろう。もしそうなら、この試験はまた、ここで評価されたストレス試験の下で最終的なコンフォメーションが安定であることも示唆している。したがって、一貫して安定なワクチン製剤を提供するために、主に非プロトン性溶媒で調製されたコンジュゲートを含むワクチンを使用することが好ましい。
ワクチン製剤組成物が、コンジュゲーション方法において異なる還元的アミノ化溶媒（水性またはＤＭＳＯ）を利用した製剤原料、グリココンジュゲートまたは多糖類タンパク質コンジュゲートの混合物を含む場合、製剤から測定される平均発光極大または強度は、３３２ｎｍでの各水性多糖類タンパク質コンジュゲート発光と３３８ｎｍでの各非水性多糖類タンパク質コンジュゲート発光の寄与により重みづけされるだろう。多価製剤において、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を使用して調製された全ての多糖類タンパク質コンジュゲートを使用しているわけではない混合物については、高温で強度または発光極大のいずれかで変化が生じると予想されるだろう。したがって、一貫して安定なワクチン製剤を提供するために、主に非プロトン性溶媒で調製されたコンジュゲートを含むワクチンを使用することが好ましい。
［実施例４１］
選択された血清型に関する収集された一価ウサギ免疫原性試験
成体ニュージーランドホワイト種ウサギ（ＮＺＷＲ、ｎ＝３／群）を、０日目と１４日目（交互の側）に、０．２５ｍｌまたは０．５ｍＬ（１５Ｃのみ）のそれぞれの一価コンジュゲートワクチンで筋肉内（ＩＭ）免疫した。２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０ならびに実施例３８に記載される製剤化方法で製剤化された一価肺炎球菌ワクチンを、以下のように投与した：（１）１免疫当たり６２．５μｇのリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を含む、１μｇ ＰｎＰｓ（６Ｃ、１０Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１または３５Ｂ、各々がＣＲＭ１９７にコンジュゲート）、または（２）２μｇ ＰｎＰｓ（１５Ｃ－ＣＲＭ１９７、１免疫あたり１２５μｇのＡＰＡを含む）。血清を、試験開始前（免疫前）および１４日目（投与１後、ＰＤ１）および２８日目（投与２後、ＰＤ２）に回収した。病気または苦痛の徴候について、訓練を受けた動物管理スタッフが少なくとも毎日、ＮＺＷＲを観察した。ＮＺＷＲにおけるワクチン製剤は、ワクチン関連の有害事象が認められなかったため、安全で忍容性が高いと見なされた。全ての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施した。ＮＺＷＲ実験プロトコルは、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（ケニルワース、ＮＪ）とＣｏｖａｎｃｅ（デンバー、ＰＡ）の両方の施設内動物管理および使用委員会によって承認された。
ＮＺＷＲ血清をＥＬＩＳＡアッセイで試験して、１～２ｍｇ／ｍＬのそれぞれのＰｎＰｓコーティング濃度を使用してＩｇＧ免疫原性を評価した。Ｏｐｓｏｔｉｔｅｒ（登録商標）３ソフトウェア（ＵＡＢ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｃａｒｏ－Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｆ ａ １５－ｖａｌｅｎｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ（ＰＣＶ１５）ｂａｓｅｄ ｏｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｏｓｅ，ｒｏｕｔｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｓｔｒａｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ ３５（６）：８６５－７２（２０１７）；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｏｕｒｆｏｌｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ（ＭＯＰＡ４）ｆｏｒ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３（９）：１００４－９（２００６））を使用して、アラバマ大学バーミンガム校の細菌呼吸器病原体参考検査室でオンラインで入手可能な以前に記載されたプロトコルに基づいてオプソニン食作用アッセイ（ＯＰＡ）を通して機能的抗体を決定した。
全ての一価肺炎球菌コンジュゲートワクチンが、ウサギにおいて免疫原性であり（図１５）、それぞれの細菌株を殺傷する機能的抗体を生成する（図１６）ことが分かった。
［実施例４２］
血清型１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃの交差防御の評価
ウサギを１５Ａ－ＣＲＭ１９７／ＡＰＡ、１５Ｂ－ＣＲＭ１９７／ＡＰＡまたは１５Ｃ－ＣＲＭ１９７／ＡＰＡで免疫して、各血清型間の交差反応性を評価した。
成体ニュージーランドホワイト種ウサギ（ＮＺＷＲ、ｎ＝３／群）を、０日目と１４日目（交互の側）に、０．５ｍＬのそれぞれの一価コンジュゲートワクチンで筋肉内（ＩＭ）免疫した。２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０ならびに実施例３８に記載される製剤化方法で製剤化された一価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを、１免疫当たり１２５μｇのＡＰＡを含む、２μｇ ＰｎＰｓ（各々がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた１５Ａ、１５Ｂまたは１５Ｃ）で投与した。血清を、試験開始前（免疫前）および１４日目（投与１後、ＰＤ１）および２８日目（投与２後、ＰＤ２）に回収した。病気または苦痛の徴候について、訓練を受けた動物管理スタッフが少なくとも毎日、ＮＺＷＲを観察した。ＮＺＷＲにおけるワクチン製剤は、ワクチン関連の有害事象が認められなかったため、安全で忍容性が高いと見なされた。全ての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施した。ＮＺＷＲ実験プロトコルは、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，ＩｎｃとＣｏｖａｎｃｅ（デンバー、ＰＡ）の両方の施設内動物管理および使用委員会によって承認された。
ＮＺＷＲ血清をＥＬＩＳＡアッセイで試験して、１～２ｍｇ／ｍＬのそれぞれのＰｎＰｓコーティング濃度を使用してＩｇＧ免疫原性を評価した。Ｏｐｓｏｔｉｔｅｒ（登録商標）３ソフトウェア（ＵＡＢ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｃａｒｏ－Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）を使用して、アラバマ大学バーミンガム校の細菌呼吸器病原体参考検査室でオンラインで入手可能な以前に記載されたプロトコルに基づいてＯＰＡを通して機能的抗体を決定した。
血清群１５の３つ全ての一価肺炎球菌コンジュゲートワクチンが、ウサギにおいて免疫原性であり（図１７）、それぞれの細菌株を殺傷する機能的抗体を生成する（図１８）ことが分かった。さらに、血清群１５の一価肺炎球菌コンジュゲートワクチンで免疫したウサギは、それぞれ同種および異種の多糖類および細菌株と同等のＰＤ２ ＩｇＧおよびＯＰＡ価を有していた。１５Ａ－ＣＲＭ１９７／ＡＰＡ、１５Ｂ－ＣＲＭ１９７／ＡＰＡまたは１５Ｃ－ＣＲＭ１９７／ＡＰＡで免疫したウサギは全て、各肺炎球菌多糖類（１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ）に対する交差反応性を有していた（図１７）。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定（Ｐ値＝０．３５４）を使用した一元配置ＡＮＯＶＡによって分析された投与２後（ＰＤ２）の対数変換ＩｇＧデータを使用すると、血清群１５全体でＩｇＧ価に有意差はなかった。さらに、１５Ａ－ＣＲＭ１９７／ＡＰＡ、１５Ｂ－ＣＲＭ１９７／ＡＰＡまたは１５Ｃ－ＣＲＭ１９７／ＡＰＡで免疫したウサギ全てが、全てのウサギ高免疫血清が評価された各菌株に対する機能的抗体を有し、細菌を殺傷したので、それぞれの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）菌株（１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ）に対して交差反応性を有した（図１８）。同様に、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定（Ｐ値＝０．０５４）を使用した一元配置ＡＮＯＶＡによって分析された投与２後（ＰＤ２）の対数変換ＯＰＡデータを使用すると、血清群１５全体でＯＰＡ価に有意差はなかった。
［実施例４３］
ニュージーランドホワイト種ウサギにおけるＰＣＶ２１の免疫原性
成体ニュージーランドホワイト種ウサギ（ＮＺＷＲ、ｎ＝５／群）を、０日目と１４日目（交互の側）に、０．１～０．５ｍＬの肺炎球菌コンジュゲートワクチンで筋肉内（ＩＭ）免疫した。２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０ならびに実施例３８に記載される製剤化方法で製剤化されたＰＣＶ２１肺炎球菌ワクチンを、１免疫当たり４、２、１、０．４、０．０８または０．０１６μｇ ＰｎＰｓ（各々ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた３、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３３Ｆまたは３５Ｂ）で投与した。血清を、試験開始前（免疫前）および１４日目（投与１後、ＰＤ１）および２８日目（投与２後、ＰＤ２）に回収した。病気または苦痛の徴候について、訓練を受けた動物管理スタッフが少なくとも毎日、ＮＺＷＲを観察した。ＮＺＷＲにおけるワクチン製剤は、ワクチン関連の有害事象が認められなかったため、安全で忍容性が高いと見なされた。全ての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施した。ＮＺＷＲ実験プロトコルは、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，ＩｎｃとＣｏｖａｎｃｅ（デンバー、ＰＡ）の両方の施設内動物管理および使用委員会によって承認された。
多重電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイを使用して、ＮＺＷＲ血清をＩｇＧ免疫原性について評価した。このアッセイは、電気化学刺激で発光するＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識を利用するＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤの事業部）によって開発された技術を使用して、Ｍａｒｃｈｅｓｅら（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ，ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｓｅｒｏｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（３）：３８７－９６（２００９））によって記載されるヒトアッセイに基づいてウサギ血清で使用するために開発された。ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識抗ウサギＩｇＧを、ＮＺＷＲ血清試料を試験するための二次抗体として使用した。Ｏｐｓｏｔｉｔｅｒ（登録商標）３ソフトウェア（ＵＡＢ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｃａｒｏ－Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７、上記、Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６、上記）を使用して、アラバマ大学バーミンガム校の細菌呼吸器病原体参考検査室でオンラインで入手可能な以前に記載されたプロトコルに基づいて多重オプソニン食細胞アッセイ（ＭＯＰＡ）を通して機能的抗体を決定した。
ＰＣＶ２１肺炎球菌コンジュゲートワクチンは、試験した全ての用量で、ウサギで免疫原性であり（図１９Ａ、図１９Ｂ、図２０Ａおよび図２０Ｂ）、ワクチン型細菌株を殺傷する機能的抗体を生成する（図２１Ａおよび図２１Ｂ）ことが分かった。
４または１μｇの用量と比較して２μｇ用量でより高い免疫原性を有した２４Ｆ、ならびに２μｇ用量と比較して０．４μｇ用量でより高い免疫原性を有した１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃを除いて、４、２、１および０．４μｇ／ＰｎＰｓで投与したＰＣＶ２１について同等のＰＤ１免疫原性が観察された（図１９Ａおよび図１９Ｂ）。したがって、より高いＰｎＰｓ用量（０．４～４μｇ／ＰｎＰｓ）で、ワクチン用量反応はあまりなかった。多くの血清型が２μｇワクチン用量と比較した場合に有意に低かったため、０．０８および０．０１６μｇ ＰｎＰｓワクチン用量でより低い免疫原性が観察された。
４、２、１および０．４μｇ／ＰｎＰｓで投与されたＰＣＶ２１について同等のＰＤ２免疫原性が観察された（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。
一般に、４、２、１および０．４μｇ／ＰｎＰｓで投与されたＰＣＶ２１について同等のＰＤ２ ＭＯＰＡ価が観察され、ＭＯＰＡ価は０．０８および０．０１６μｇ ＰｎＰｓワクチン用量で低い傾向があったが、多くは統計学的有意性に達していない（データは示さず）。２μｇ／ＰｎＰｓで投与されたＰＣＶ２１を、ＭＯＰＡの代表的なデータセットとして選択した。具体的には、２μｇ用量のＰＣＶ２１で免疫したウサギが、血清型３を除いて、免疫前ウサギ血清と比較して、全ての血清型でＰＤ１ ＭＯＰＡ価が有意に高かった（図２１Ａ）。この試験のウサギ免疫前血清は、血清型１６Ｆ、３１および３５Ｂに対してより高いバックグラウンド価を有していたことに留意すべきである。２μｇ用量のＰＣＶ２１で免疫したウサギは、免疫前ウサギの血清と比較して、全ての血清型で有意に高いＰＤ２ ＭＯＰＡ価を有していた（図２１Ｂ）。対数変換データを、ダネット検定を使用した一元配置ＡＮＯＶＡによって分析して有意性を決定した。
［実施例４４］
材料および方法
遊離多糖類試験
コンジュゲート試料中の遊離多糖類（ＣＲＭ１９７とコンジュゲートしていない多糖類）を、最初に遊離タンパク質およびコンジュゲートをデオキシコール酸（ＤＯＣ）および塩酸で沈殿させることによって測定する。次いで、沈殿を濾別し、濾液をＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩによって遊離多糖類濃度について分析する。遊離多糖類を、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩによって測定される総多糖類の割合として計算する。
遊離タンパク質試験
コンジュゲート試料中の遊離多糖類、多糖類－ＣＲＭ１９７コンジュゲートおよび遊離ＣＲＭ１９７を、ミセル動電クロマトグラフィー（ｍｉｃｅｌｌａｒ ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＭＥＫＣ）モードのキャピラリー電気泳動によって分離する。手短に言えば、試料を、２５ｍＭホウ酸塩、１００ｍＭ ＳＤＳを含むＭＥＫＣ泳動緩衝液、ｐＨ９．３と混合し、事前調整された裸の溶融シリカキャピラリーで分離する。分離を２００ｎｍで監視し、遊離ＣＲＭ１９７をＣＲＭ１９７標準曲線で定量化する。遊離タンパク質の結果を、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩ手順によって決定される総タンパク質含有量の割合として報告する。
ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイを使用したコンジュゲートの分子量および濃度分析
コンジュゲート試料を注入し、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）によって分離した。直列の紫外線（ＵＶ）、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）および屈折率（ＲＩ）検出器で検出を達成した。タンパク質濃度を、吸光係数を使用してＵＶ２８０から計算した。ｍＬ／ｇで報告される溶質濃度の変化を伴う溶液の屈折率の変化であるｄｎ／ｄｃ係数を使用して、多糖類濃度をＲＩシグナル（タンパク質と多糖類の両方が寄与する）からデコンボリューションした。試料の平均分子量を、試料ピーク全体にわたる測定された濃度および光散乱情報を使用して、Ａｓｔｒａソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、サンタバーバラ、ＣＡ）によって計算した。多分散分子の分子量の平均値には複数の形式がある。例えば、数平均分子量Ｍｎ、重量平均分子量Ｍｗおよびｚ平均分子量Ｍｚがある（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１５，２０，１０３１３－１０３４１）。特に明記しない限り、分子量は重量平均分子量である。
多糖類と担体タンパク質との間の共有結合の数の尺度としてのコンジュゲートタンパク質中のリジン消費の決定
Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ－Ｔａｇアミノ酸分析（ＡＡＡ）を使用して、コンジュゲート試料中のコンジュゲーションの程度を測定した。Ｅｌｄｅｘワークステーションで気相酸加水分解を使用して試料を加水分解して、担体タンパク質を構成アミノ酸に分解した。遊離アミノ酸を、６－アミノキノリル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）を使用して誘導体化した。次いで、誘導体化された試料を、Ｃ１８カラムでＵＶ検出を備えたＵＰＬＣを使用して分析した。リジン以外の代表的なアミノ酸を使用して平均タンパク質濃度を得た。コンジュゲーション中のリジン消費（すなわち、リジン損失）を、コンジュゲート中のリジンの測定された平均量と、開始タンパク質中のリジンの予想量との間の差によって決定した。
［実施例４５］
肺炎球菌コンジュゲートワクチンの安定性に対するコンジュゲーション方法の影響
上記の実施例に記載される異なる還元的アミノ化溶媒（水性またはＤＭＳＯ）を利用して調製された個々の肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを、８４μｇ／ｍＬで、ＰＣＶ１、ＰＣＶ７、ＰＣＶ１４およびＰＣＶ２１と呼ばれる１価、７価、１４価および２１価肺炎球菌コンジュゲートワクチン製剤の製剤化に使用した。
製剤ワクチンを充填した容器を４℃または３７℃で最大７日間置いた。固有のタンパク質蛍光分光法（ＩＰＦＳ）を使用して、ＰＣＶ１、ＰＣＶ７、ＰＣＶ１４またはＰＣＶ２１組成物中の肺炎球菌多糖類コンジュゲート担体タンパク質、ＣＲＭ１９７の安定性を、最大４℃および３７℃で貯蔵して評価した。非希釈試料の蛍光発光スペクトル（Ｅｍ２９０～４００ｎｍ）を、Ｊａｓｃｏ ＦＰ－６５００分光蛍光光度計を使用して、周囲室温で経路長１ｃｍの石英キュベットで収集した。励起波長２８０ｎｍを走査速度１００ｎｍ／分ならびに励起および発光バンドパス３ｎｍと共に使用した。
図２２Ａ～図２２Ｃに示されるように、非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化を使用して調製された全ての多糖類－タンパク質コンジュゲートを含む製剤は、コンジュゲーション方法（プロトン性）で還元的アミノ化中に水性溶媒を使用して調製された全ての多糖類－タンパク質コンジュゲートを利用したワクチンと比較して、優れた物理的および化学的安定性をもたらした。３７℃でわずか１６時間で、８４μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓの水性溶媒中での還元的アミノ化を使用して調製された全ての多糖類－タンパク質コンジュゲートを使用して調製されたＰＣＶ１、ＰＣＶ７およびＰＣＶ１４製剤の蛍光強度が減少し、ワクチンの発光極大は３３２ｎｍから３３８ｎｍにシフトした。非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化化学により調製された製剤原料を利用した、８４μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓのＰＣＶ１、ＰＣＶ７およびＰＣＶ１４ワクチン製剤は、蛍光強度も３３８ｎｍの発光極大も変化を示さなかった。さらに、ＰＣＶ２１製剤も試験した。これを、非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化を使用して調製された多糖類－タンパク質複合体を含む、実施例３８に記載されるように２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０に製剤化した。この試験は、３７℃での貯蔵後に優れた物理的および化学的安定性を示した。ＰＣＶ２１は、蛍光強度も発光極大３３８ｎｍも変化を示さなかった（図２２Ｄ）。
ＩＰＦＳ（実施例４０）測定から得られた結果のシグナル強度および発光極大は、多価複合製剤中の個々の多糖類－タンパク質コンジュゲートの集団的安定性によるものであることを理解すべきである。本発明者らは、非プロトン性溶媒中で調製された全ての多糖類－タンパク質コンジュゲートを利用したワクチン製剤は安定であるが、プロトン性溶媒中で調製された全ての製剤原料を利用したワクチン製剤はストレス条件下で安定ではないことを示した。ワクチン製剤組成物が、プロトン性コンジュゲーション方法と非プロトン性コンジュゲーション方法の両方を使用した多糖類－タンパク質コンジュゲートの混合物を含む場合、製剤から測定される平均発光極大または強度は、３３２ｎｍでの各プロトン性多糖類タンパク質コンジュゲート発光と３３８ｎｍでの各非プロトン性多糖類タンパク質コンジュゲート発光の寄与により重みづけされるだろう。プロトン性コンジュゲーション方法を使用して調製された多糖類タンパク質コンジュゲートの存在により、このような混合物については、高温で強度または発光極大のいずれかで加重変化が生じると予想される。
図２３に示されるように、０．０８４ｍｇ／ｍＬ ＰｎＰｓで調製されたＰＣＶ２１製剤の安定性を評価するために、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を利用した。この技術は、ブラウン運動で移動するナノ粒子集団を直接追跡したビデオを収集して、粒径および濃度を外挿する。クラス１、６３５ｎｍレーザーは、８０ミクロンの赤色レーザービームを液体試料に集中させ、光の急速な拡散点として粒子を照射する。ＣＣＤカメラは、毎秒３０フレームのビデオを記録して、経時的な個々の照射粒子の動きを追跡する。システムソフトウェアは、ビデオから個々の粒子の中心を識別し、独立に移動した距離を追跡して、平均二乗変位を決定する。この追跡を、ビデオ全体から収集された生データが分析されるまで、各フレームの試料集団内の全ての粒子に対して同時に実施する。追跡された全ての個々の粒子の平均二乗変位を同時に測定することによって、その拡散係数（Ｄｔ）および等価球面度数流体力学半径（ｒｈ）を、ストークス－アインシュタイン方程式を適用することによって決定する。次いで、ソフトウェアはこの累積データを粒径および濃度分布として表す。粒径および濃度だけでなく、個々の粒子の強度または輝度に関する生データ情報も収集する。まとめると、データを、粒径に対する粒子強度、および粒径に対する粒子濃度として個別に当てはめ、プロットし、次いで、全ての粒子集団の粒径、濃度および強度を比較する３次元等高線図にプロットする。
担体タンパク質および多糖類抗原で構成されるコンジュゲートワクチンは、一緒にまたは別々に１０～１０００ｎｍの粒径範囲内で凝集しやすく、それによってＮＴＡが凝集現象を評価および定量化するための適切な安定性を示す技術になる。製剤を４℃および３７℃に１週間曝露すると、０．０２５％ｗ／ｖ、０．０５％ｗ／ｖ、０．１％ｗ／ｖ、０．１５％ｗ／ｖおよび０．２％ｗ／ｖ ＰＳ２０の濃度でＰＳ－２０を含む製剤では、ＮＴＡによって製剤の有意な凝集は観察されなかった（図２３に示される）。しかしながら、製剤を４℃で６時間攪拌に供した後、ポリソルベート２０を欠く製剤は、ＮＴＡによって提供されるＤ９０粒径の増加、粒径分布の拡大および粒子強度の増加によって証明されるように、製剤の攪拌誘導凝集の軽減に有効でなかった。そのため、ポリソルベート２０を０．０２５～０．２％またはそれ以上のレベル（ｗ／ｖ）に維持して、日常的な製造、貯蔵、輸送および取り扱いの間、製剤を安定させることが好ましい。
実施例３９に記載されるように、ＨＰＳＥＣ ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩを使用して、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０～０．２％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０ならびに実施例３８に記載される製剤化方法で製剤化された２１価（ＰＣＶ２１）多糖類－タンパク質コンジュゲート製剤の分子量を測定した。製剤を４℃または３７℃で最大１週間置いた。場合によっては、シリンジを水平回転プラットフォームに置き、４℃または３７℃で１週間貯蔵した後、最大６時間振盪した。製剤製造および流通に伴う可能性のある輸送および取り扱いのストレスをシミュレートするためにこれを行った。製剤中の多糖類－タンパク質コンジュゲートが分解または解重合している場合、分子量の減少が自明であり、製剤の凝集が起こっている場合、分子量の増加が生じるだろう。この測定は、ＰＳ－２０濃度の関数としてワクチン製剤または多糖類－タンパク質コンジュゲートの品質に関する追加の特性評価を提供する。図２４に示されるように、各々が非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化を使用して調製された全ての製剤原料を含むＰＣＶ２１製剤は、炭水化物の解重合または化学分解に対して安定であり、０．０５％～０．１５％のＰＳ－２０で熱処理による製剤中のタンパク質の凝集に対して安定であった。まとめると、これは、ＰＣＶ２１製剤が、０．０２５％および０．２％以上のレベルのＰＳ－２０を使用して製剤化した場合、高温および物理的ストレスを通して安定であることを示している。
［実施例４６］
マウスでの曝露からのＰＣＶ２１防御
若い雌のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（６～８週齢、ｎ＝１０／群）を、０日目、１４日目および２８日目に０．１～０．５ｍＬの２１価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ２１）で腹腔内（ＩＰ）免疫した。ＰＣＶ２１肺炎球菌ワクチンを、１免疫当たり４、２、０．４、０．０８または０．０１６μｇのＰｎＰｓ（各々がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた３、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３３Ｆおよび３５Ｂ）で投与した。病気または苦痛の徴候について、訓練を受けた動物管理スタッフが少なくとも毎日、マウスを観察した。マウスにおけるワクチン製剤は、ワクチン関連の有害事象が認められなかったため、安全で忍容性が高いと見なされた。５２日目に、マウスに肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２４Ｆを気管内曝露した。肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の対数期培養物を遠心分離し、洗浄し、滅菌ＰＢＳに懸濁した。曝露前にイソフルランでマウスを麻酔した。０．１ｍＬのＰＢＳ中１０５ｃｆｕの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、切歯によって直立につるされたマウスの喉に入れた。舌を外側にそっと引き、鼻孔を覆うことによって細菌の吸引を誘導した。マウスの体重を毎日測定し、体重減少が開始時体重の２０％を超えたら安楽死させた。血液を２４時間、４８時間および７２時間で採取して菌血症を評価した。病気または苦痛の徴候について、訓練を受けた動物管理スタッフが少なくとも毎日２回、マウスを観察した。全ての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施した。マウス実験プロトコルは、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．の施設内動物管理および使用委員会によって承認された。
多重電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイを使用して、マウス血清をＩｇＧ免疫原性について評価した。このアッセイは、電気化学刺激で発光するＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識を利用するＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤの事業部）によって開発された技術を使用して、Ｍａｒｃｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００９）１６（３）：３８７－９６によって記載されるヒトアッセイに基づいてマウス血清で使用するために開発された。ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識抗マウスＩｇＧを、マウス血清試料を試験するための二次抗体として使用した。ｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅ．ｕａｂ．ｅｄｕで以前に記載されたプロトコルならびにアラバマ大学（ＵＡＢ）研究財団によって所有およびライセンス供与されるＯｐｓｏｔｉｔｅｒ（登録商標）３ソフトウェア（Ｃａｒｏ－Ａｇｕｉｌａｒ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１７）３５（６）：８６５－７２ ａｎｄ Ｂｕｒｔｏｎ Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｎａｈｍ Ｍ．Ｈ．Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００６）１３（９）：１００４－９参照）に基づいて多重オプソニン食細胞アッセイ（ＭＯＰＡ）を通して機能的抗体を決定した。
ＰＣＶ２１免疫は、ワクチンの全ての血清型について、Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスで抗体価を生成した（データは示さず）。ＰＣＶ２１は、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣＤ１マウスでも免疫原性であった（データは示さず）。ＰＣＶ２１免疫Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスはまた、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２４Ｆによる曝露からも防御された（図２５）。Ｍａｎｔｅｌ Ｃｏｘログ・ランク検定は、全てのＰＣＶ２１免疫群が、ナイーブ群と比較すると、曝露から有意に防御されたことを示している（Ｐ＜０．０５）。同様に、ＰＣＶ２１免疫マウス群はほとんど～全く菌血症がなく、ナイーブ群と比較すると、有意に少なかった（データは示さず）。
［実施例４７］
ウサギにおけるＰＣＶ免疫原性および機能的抗体
成体ニュージーランドホワイト種ウサギ（ＮＺＷＲ、ｎ＝５／群）を、０日目と１４日目（交互の側）に、０．１ｍＬのＰＣＶで筋肉内（ＩＭ）免疫した。ＰＣＶを、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）の形態で２５μｇ［Ａｌ］を含む１免疫当たり１血清型当たり０．４μｇ ＰｎＰｓで投与した。ＰＣＶ３１の場合、血清型６Ｂの投与濃度を、１免疫当たり０．８μｇ ＰｎＰｓに倍増した。ＰＣＶ２１（実施例３８に記載される）は、各々がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型３、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３３Ｆおよび３５Ｂの精製多糖類を含んでいた。各多糖類－タンパク質コンジュゲートを、非アジュバント化またはリン酸アルミニウムもしくはＡＰＡの形態で２５０μｇ［Ａｌ］／ｍＬで製剤化して、アジュバントの効果を評価した（ＰＣＶ２１／ＡＰＡ）。低価ＰＣＶも（実施例３８に記載されるように）、８つの新規ＳＴ（ＰＣＶ８：各々がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた６Ｃ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、非アジュバント化）を含むように製剤化し、１６ＳＴをいずれのライセンス化ＰＣＶ（ＰＣＶ１６：各々がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた６Ｃ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１および３５Ｂ、非アジュバント化）にもＰＣＶ３１（各々がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆおよび３５Ｂ、リン酸アルミニウムの形態の２５０μｇ［Ａｌ］／ｍＬを用いて製剤化）にも含めず、ワクチン価の増加に伴う担体抑制を評価した（ＰＣＶ３１／ＡＰＡ）。各ワクチンは、ＰＣＶ３１またはＰＣＶ３１／ＡＰＡで８μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ）で製剤化された６Ｂを除いて、４μｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ）で製剤化された多糖類タンパク質コンジュゲートを使用した。各ワクチン中の肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ）の最終濃度は、ＰＣＶ３１で１２８μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓ、ＰＣＶ２１で８４μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓ、ＰＣＶ１６で６４μｇ／ｍＬおよびＰＣＶ８で３２μｇ／ｍＬであった。
血清を、試験開始前（免疫前）および１４日目（ＰＤ１）および２８日目（ＰＤ２）に回収した。病気または苦痛の徴候について、訓練を受けた動物管理スタッフが少なくとも毎日、ＮＺＷＲを観察した。ＮＺＷＲにおけるワクチン製剤は、ワクチン関連の有害事象が認められなかったため、安全で忍容性が高いと見なされた。全ての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施した。ＮＺＷＲ実験プロトコルは、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，ＩｎｃとＣｏｖａｎｃｅ（デンバー、ＰＡ）の両方の施設内動物管理および使用委員会によって承認された。
多重電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイを使用して、ウサギ血清をＩｇＧ免疫原性について評価した。このアッセイは、電気化学刺激で発光するＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識を利用するＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤの事業部）によって開発された技術を使用して、Ｍａｒｃｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００９）１６（３）：３８７－９６によって記載されるヒトアッセイに基づいてウサギ血清で使用するために開発された。ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識抗ウサギＩｇＧを、ＮＺＷＲ血清試料を試験するための二次抗体として使用した。ｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅ．ｕａｂ．ｅｄｕで以前に記載されたプロトコルならびにアラバマ大学（ＵＡＢ）研究財団によって所有およびライセンス供与されるＯｐｓｏｔｉｔｅｒ（登録商標）３ソフトウェア（Ｃａｒｏ－Ａｇｕｉｌａｒ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１７）３５（６）：８６５－７２ ａｎｄ Ｂｕｒｔｏｎ Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｎａｈｍ Ｍ．Ｈ．Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００６）１３（９）：１００４－９参照）に基づいて多重オプソニン食細胞アッセイ（ＭＯＰＡ）を通して機能的抗体を決定した。
ウサギ血清を、多重電気化学発光アッセイで免疫前およびＰＤ１についてはプールとして、ＰＤ２については個別に試験して、抗体価を決定した。ＰＣＶは、ワクチンによる免疫後、ウサギにおいて全ての血清型について抗体価を生成した（データは示さず）。ＰＣＶ１６、ＰＣＶ２１またはＰＣＶ３１には血清型１５Ｂ多糖類は含まれていなかったが、ＰＣＶ１６、ＰＣＶ２１およびＰＣＶ３１の両方での免疫後、血清型１５Ｂに対する抗体価が観察された。
非アジュバント化ＰＣＶ２１は、ＡＰＡを使用したＰＣＶ２１（図２６Ａ～図２６Ｂおよび図２８）と比較して、同等または有意に高い免疫原性（血清型３、７Ｆ、１０Ａ、１９Ａ、２３Ａおよび２３Ｂ）を有し、ＡＰＡをワクチンに含めたウサギで追加の免疫原性の利点がないことを示唆している。
担体誘導エピトープ抑制は、同じ担体タンパク質（ＣＲＭ１９７など）にカップリングされた抗原（莢膜多糖類など）に対する抗体応答の干渉を指す。干渉は、限られた数の担体特異的プライミングＴヘルパー細胞の競合から生じると考えられている。結果として、莢膜多糖類への応答が低下し得る。Ｐｆｉｚｅｒは、ワクチン価が７価から１３価に増加するにつれて、共有血清型のワクチン免疫原性の低下を観察した［Ｐｒｅｖｎａｒ（７価）対Ｐｒｅｖｎａｒ１３のＩｇＧ抗体ＧＭＣの比較］。（ＰＣＶ１３モノグラフの表９、２９頁）］。したがって、本発明者らは、ＰＣＶ２１と比較して、より低い価のＰＣＶの免疫原性を調査しようとした（図２７Ａ～図２７Ｃ）。ＰＣＶ８（８つの新規血清型）は、８つの共有血清型について、ＰＣＶ２１と比較して同等の免疫原性を有していた（図２９）。ＰＣＶ１６（ＰＣＶ２１－ＰＣＶ１５の５つの重複する血清型）は、１６の共有血清型のうち１５について、ＰＣＶ２１と比較して同等の免疫原性を有していた（図２９）血清型３１は、ＰＣＶ１６でより高い免疫原性を有していた（図２９）。全体として、ＮＺＷＲにおいてＰＣＶ２１による担体抑制の主要な傾向はなかった。ＰＣＶ３１／ＡＰＡは、２１の共有血清型のうち１２について、ＰＣＶ２１／ＡＰＡと比較して同等の免疫原性を有していた。１０の血清型（６Ｃ、７Ｆ、９Ｎ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ（ＰＣＶ２１にはない）、１５Ｃ、１７Ｆ、１９Ａおよび２３Ａ）が、ＰＣＶ３１においてより高い免疫原性を有し、２．９倍から１１倍の範囲であった（図３０）。全体として、ＮＺＷＲにおけるＰＣＶ３１による担体抑制の主要な傾向はなかった。
ＰＣＶは、ウサギにおいて免疫原性であり、ワクチン型細菌株を殺傷する機能的抗体を生成することが分かった。ウサギ血清を、多重オプソニン食細胞アッセイ（ＭＯＰＡ）でテストして、機能的抗体価を決定した。ＰＣＶ２１は、ＰＣＶ２１／ＡＰＡ、ＰＣＶ８およびＰＣＶ１６と比較した場合、同等またはより高いＰＤ２ ＯＰＡ価を有していた（図３１）。対数変換データを、ダネット検定を使用した一元配置ＡＮＯＶＡによって分析して有意性を決定した。ＰＣＶ２１は、ＰＣＶ８と比較して血清型１６Ｆについて、ならびにＰＣＶ２１／ＡＰＡと比較して血清型１２Ｆ、２３Ａおよび１９Ａについて有意に高いＯＰＡ価を有していた。ＰＣＶ３１は、ＰＣＶ２１と比較して、血清型２３Ａについて、有意に高いＯＰＡ価を有していた。
［実施例４８］
成体アカゲザルにおけるＰＣＶ２１免疫原性
ＰＣＶ２１を、成体アカゲザル免疫原性モデルでも評価した。アカゲザルを、０日目、２８日目および５６日目にＰＣＶ２１で筋肉内免疫した。ＰＣＶ２１を、１免疫当たり０．２５ｍＬ体積中１μｇのＰｎＰｓ（各々がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた３、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３３Ｆおよび３５Ｂ）で投与した。血清を、試験開始前（免疫前、０日目）および１４日目（ＰＤ１）、２８日目、４２日目（ＰＤ２）、５６日目、７０日目（ＰＤ３）および８４日目に回収した。
多重電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイを使用して、アカゲザル血清をＩｇＧ免疫原性について評価した。このアッセイは、電気化学刺激で発光するＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識を利用するＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤの事業部）によって開発された技術を使用して、ＭａｒｃｈｅｓｅらおよびＳｋｉｎｎｅｒら（Ｍａｒｃｈｅｓｅ Ｒ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００９）１６（３）：３８７－９６およびＳｋｉｎｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１１）２９（４８）：８８７０－８８７６）によって記載されるヒトアッセイに基づいてアカゲザル血清で使用するために開発された。ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識抗ヒトＩｇＧを、アカゲザル血清試料を試験するための二次抗体として使用した。ｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅ．ｕａｂ．ｅｄｕで以前に記載されたプロトコルならびにアラバマ大学（ＵＡＢ）研究財団によって所有およびライセンス供与されるＯｐｓｏｔｉｔｅｒ（登録商標）３ソフトウェア（Ｃａｒｏ－Ａｇｕｉｌａｒ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１７）３５（６）：８６５－７２ ａｎｄ Ｂｕｒｔｏｎ Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｎａｈｍ Ｍ．Ｈ．Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００６）１３（９）：１００４－９参照）に基づいて多重オプソニン食細胞アッセイ（ＭＯＰＡ）を通して機能的抗体を決定した。
ＰＣＶ２１は、試験した全ての時点で、成体サルにおいて免疫原性であり、ワクチン型細菌株を殺傷する機能的抗体を生成することが分かった（図３２および図３３）。ＥＣＬで証明されているように、多糖類コンジュゲート１５Ａ－ＣＲＭ１９７および１５Ｃ－ＣＲＭ１９７を含むＰＣＶ２１も１５Ｂとの交差反応性を提供することも注目に値する。ＰＣＶ２１はサルにおいて１回用量のワクチンで免疫原性であった（図３２）。追加の免疫の恩恵を受けたＳＴ ６Ｃ、１２Ｆおよび２４Ｆを除いて、ほとんどの血清型がＰＤ１で最大価に達した。成体アカゲザルは、乳児アカゲザルでの以前のＰＣＶ試験と比較して、高い既存の抗体価を有していた。ＭＯＰＡで血清試料を試験した場合、既存の抗体価が最も明らかであり、オプソニン食細胞価の決定を困難にした。全ての試験時点を、プールされた試料または個別の試料としてＭＯＰＡで試験したが、ＰＤ１とＰＤ３との間でＯＰＡ価に大きな差がなかったので、見やすくするために、免疫前、ＰＤ１およびＰＤ３のみを示している（図３３）。
ＰＣＶ２１免疫成体アカゲザル血清を、他の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する交差防御について評価した（図３４）。ＰＣＶ２１免疫アカゲザル血清は、血清型６Ａ、６Ｂおよび２３Ｆとの交差防御を有していたが、１９Ｆはなかった。６Ａおよび６Ｂに対する交差防御は、多価ＰＣＶ２１の一部としての多糖類コンジュゲート６Ｃ－ＣＲＭ１９７による免疫によるものと思われる。同様に、多価ＰＣＶの一部としての多糖類コンジュゲート２３Ａ－ＣＲＭ１９７および２３Ｂ－ＣＲＭ１９７による免疫は、血清型２３Ｆに対する交差防御をもたらした。多糖類コンジュゲート１９Ａ－ＣＲＭ１９７を含むＰＣＶ２１による免疫は、１９Ｆに対する交差防御を提供しなかった。
［実施例４９］
成体アカゲザルにおけるＰＣＶ２１免疫原性－アジュバントおよび担体抑制の評価
別のサルの試験は、ＡＰＡを用いたおよび用いないＰＣＶ２１の評価、ならびに担体抑制を評価するための共有血清型免疫原性の比較を含んでいた。試験の０日目に、成体アカゲザル（ｎ＝５／群）を、ヒトの半分の用量のワクチンで筋肉内免疫した。ＰＣＶ２１を、１免疫当たり０．２５ｍＬ体積中１μｇのＰｎＰｓ（各々がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた３、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３３Ｆおよび３５Ｂ）で投与した。ある群は、リン酸アルミニウムの形態で６２．５μｇ［Ａｌ］をアジュバント化されたＰＣＶ２１を含んでいた。別の群は、１免疫当たり０．２５ｍＬ体積中１μｇのＰｎＰｓ（各々がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ、６Ｂを２μｇで投与）で投与され、リン酸アルミニウムの形態で６２．５μｇ［Ａｌ］でアジュバント化されたＰＣＶ１５を含んでいた。別の群は、１免疫当たり０．２５ｍＬ体積中１．１μｇのＰｎＰｓ（各々がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆ、６Ｂを２．２μｇで投与）で投与されるＰｒｅｖｎａｒ１３（登録商標）（ＰＣＶ１３）を含んでいた。血清を、試験開始前（免疫前、０日目）および２８日目に回収した。
ＰＣＶ２１は、成体サルにおいて免疫原性であり、ワクチン型細菌株を殺傷する機能的抗体を生成することが分かった。アジュバントを含まないＰＣＶ２１は、ＡＰＡを含むＰＣＶ２１と比較した場合、同等のまたは有意に高い免疫原性（血清型１５Ａおよび１５Ｂ）を有していた（図３５）。ＰＣＶ２１は血清型１５Ｂを含まなかった。
ＰＣＶ２１免疫サルを、ＰＣＶ１５およびＰｒｅｖｎａｒ１３で免疫したサルと比較した。ＰＣＶ２１およびＰＣＶ１５は５つの共有血清型（３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ）を有し；ＰＣＶ２１またはＰＣＶ１５で免疫したサル間で、これら５つの血清型の免疫原性に差はなかった（図３６）。ＰＣＶ２１およびＰｒｅｖｎａｒ１３は３つの共有血清型（３、７Ｆ、１９Ａ）を有し；血清型７Ｆおよび１９Ａについては免疫原性に差はなかった。Ｐｒｅｖｎａｒ１３免疫サルは、ＰＣＶ２１と比較して血清型３について低い抗体価を有していた（図３６）。この発見は、血清型３がＭｅｒｃｋのＰＣＶ１５ワクチンでより免疫原性であることを示しているＰＣＶ１５ヒト臨床データと一致している。まとめると、これらの結果は、Ｐｒｅｖｎａｒ１３またはＰＣＶ１５と比較した場合、ＰＣＶ２１で免疫した成体アカゲザルでは担体抑制が観察されなかったことを示唆している。
［実施例５０］
血清型６Ａ、６Ｂおよび６Ｃの交差反応性－一価試験
一価製剤を、肺炎球菌多糖類６Ａ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートまたは肺炎球菌多糖類６Ｂ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを使用して調製し、４．０μｇ／ｍＬのいずれかの血清型の標的総多糖類濃度で、２０ｍＭヒスチジンｐＨ５．８および１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．１％ｗ／ｖポリソルベート－２０（ＰＳ－２０）に製剤化した。ＣＲＭ１９７タンパク質を肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ）型（－６Ａまたは－６Ｂのいずれか）に個別にコンジュゲートさせることによってコンジュゲートを調製した。個々の血清型の標的濃度を得るために必要なバルクコンジュゲートの必要体積を、個々のバルク多糖類濃度のバッチ体積および濃度に基づいて計算した。個々のコンジュゲートを、ヒスチジン、塩化ナトリウム、ＰＳ－２０の溶液に添加して、２Ｘコンジュゲートブレンドを作成した。２Ｘコンジュゲートブレンドを含む製剤容器を、磁気攪拌棒を使用して混合し、別の容器に滅菌濾過した。次いで、滅菌濾過した２Ｘブレンドを生理食塩水で希釈して、所望の標的総多糖類および賦形剤濃度を達成した。次いで、製剤をバイアルに充填し、２～８℃で貯蔵した。
ウサギを６Ａ－ＣＲＭ１９７または６Ｂ－ＣＲＭ１９７で免疫して、血清群６内の交差反応性を評価した。成体ニュージーランドホワイト種ウサギ（ＮＺＷＲ、ｎ＝３／群）を、０日目と１４日目（交互の側）に、０．２５ｍＬのそれぞれの一価コンジュゲートワクチンで筋肉内（ＩＭ）免疫した。実施例３８に記載される製剤化方法で２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、ｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０に製剤化された一価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを、１μｇ ＰｎＰｓ（各々がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた６Ａまたは６Ｂ）で投与した。血清を、試験開始前（免疫前）および１４日目（投与１後、ＰＤ１）および２８日目（投与２後、ＰＤ２）に回収した。病気または苦痛の徴候について、訓練を受けた動物管理スタッフが少なくとも毎日、ＮＺＷＲを観察した。ＮＺＷＲにおけるワクチン製剤は、ワクチン関連の有害事象が認められなかったため、安全で忍容性が高いと見なされた。全ての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施した。ＮＺＷＲ実験プロトコルは、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，ＩｎｃとＣｏｖａｎｃｅ（デンバー、ＰＡ）の両方の施設内動物管理および使用委員会によって承認された。
ＮＺＷＲ血清をＥＬＩＳＡアッセイで試験して、それぞれの２μｇ／ｍＬのＰｎＰｓコーティング濃度を使用してＩｇＧ免疫原性を評価した。ｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅ．ｕａｂ．ｅｄｕで以前に記載されたプロトコルならびにＵＡＢ研究財団によって所有およびライセンス供与されるＯｐｓｏｔｉｔｅｒ（登録商標）３ソフトウェア（Ｃａｒｏ－Ａｇｕｉｌａｒ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１７）３５（６）：８６５－７２ ａｎｄ Ｂｕｒｔｏｎ Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｎａｈｍ Ｍ．Ｈ．Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００６）１３（９）：１００４－９参照）に基づいてオプソニン食細胞アッセイ（ＯＰＡ）を通して機能的抗体を決定した。
６Ａ－ＣＲＭ１９７と６Ｂ－ＣＲＭ１９７の両方がウサギにおいて免疫原性であり（図３７）、それぞれの細菌株を殺傷する機能的抗体を生成することが分かった（図３８）。さらに、血清群６の一価肺炎球菌コンジュゲートワクチンで免疫したウサギは、それぞれ同種および異種の多糖類および細菌株と同等のＰＤ２ ＩｇＧおよびＯＰＡ価を有していた。６Ａ－ＣＲＭ１９７または６Ｂ－ＣＲＭ１９７で免疫したウサギは全て、各肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ ６Ａ、ＰｎＰｓ ６ＢおよびＰｎＰｓ ６Ｃ）に対する交差反応性を有していた（図３７）。一元配置ＡＮＯＶＡによって分析された投与２後（ＰＤ２）の対数変換ＩｇＧデータを使用すると、血清群６全体でＩｇＧ価に有意差はなかった。さらに、６Ａ－ＣＲＭ１９７または６Ｂ－ＣＲＭ１９７で免疫したウサギ全てが、全てのウサギ高免疫血清が評価された各菌株に対する機能的抗体を有し、細菌を殺傷したので、それぞれの肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）菌株（６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）に対して交差反応性を有した（図３８）。
同様に、一元配置ＡＮＯＶＡによって分析された投与２後（ＰＤ２）の対数変換ＯＰＡデータを使用すると、血清群６にわたってＯＰＡ価に有意差はなかった。
［実施例５１］
血清型２０Ａおよび２０Ｂの交差反応性－一価試験
一価製剤を、肺炎球菌多糖類２０Ａ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを使用して調製し、４．０μｇ／ｍＬで、２０ｍＭヒスチジンｐＨ５．８および１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．２％ｗ／ｖポリソルベート－２０（ＰＳ－２０）に製剤化した。アジュバントとしてリン酸アルミニウムの形態で２５０．０μｇ［Ａｌ］／ｍＬで製剤を調製した（２０Ａ－ＣＲＭ１９７／ＡＰＡ）。ＣＲＭ１９７タンパク質を肺炎球菌多糖類（ＰｎＰｓ）型２０に個別にコンジュゲートさせることによってコンジュゲートを調製した。個々の血清型の標的濃度を得るために必要なバルクコンジュゲートの必要体積を、個々のバルク多糖類濃度のバッチ体積および濃度に基づいて計算した。単一コンジュゲートを、１６．０μｇ／ｍＬで、ヒスチジン、塩化ナトリウムおよびＰＳ－２０の溶液に添加して、４Ｘコンジュゲートブレンドを生成した。コンジュゲートブレンドを含む製剤容器を、磁気攪拌棒を使用して混合し、別の容器に滅菌濾過した。次いで、滅菌濾過した４Ｘブレンドを、リン酸アルミニウムアジュバントを含む別の容器に添加して、所望の標的総多糖類、賦形剤およびアジュバント濃度を達成した。次いで、製剤をガラスバイアルに充填し、２～８℃で貯蔵した。
ウサギを２０Ａ－ＣＲＭ１９７／ＡＰＡまたはＰＣＶ２１で免疫して、血清群２０内の交差反応性を評価した。成体ニュージーランドホワイト種ウサギ（ＮＺＷＲ、ｎ＝３／群）を、０日目と１４日目（交互の側）に、肺炎球菌コンジュゲートワクチンで筋肉内（ＩＭ）免疫した。上記のように製剤化された一価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを、０．２５ｍｌ中１μｇのＰｎＰｓ（ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたＳＴ２０Ａ、リン酸アルミニウムの形態の６２．５μｇ［Ａｌ］をアジュバントとして使用した）で投与し、実施例３８に記載される製剤化方法で２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジンｐＨ５．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％（ｗ／ｖ）ＰＳ－２０に製剤化されたＰＣＶ２１多価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（８４μｇ／ｍＬ ＰｎＰｓ）を、０．１ｍｌ中０．４μｇのＰｎＰｓ（各々がＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた血清型３、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３３Ｆおよび３５Ｂ）で投与した。血清を、試験開始前（免疫前）および１４日目（投与１後、ＰＤ１）および２８日目（投与２後、ＰＤ２）に回収した。病気または苦痛の徴候について、訓練を受けた動物管理スタッフが少なくとも毎日、ＮＺＷＲを観察した。ＮＺＷＲにおけるワクチン製剤は、ワクチン関連の有害事象が認められなかったため、安全で忍容性が高いと見なされた。全ての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施した。ＮＺＷＲ実験プロトコルは、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，ＩｎｃとＣｏｖａｎｃｅ（デンバー、ＰＡ）の両方の施設内動物管理および使用委員会によって承認された。
ｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅ．ｕａｂ．ｅｄｕで以前に記載されたプロトコルならびにＵＡＢ研究財団によって所有およびライセンス供与されるＯｐｓｏｔｉｔｅｒ（登録商標）３ソフトウェア（Ｃａｒｏ－Ａｇｕｉｌａｒ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１７）３５（６）：８６５－７２ ａｎｄ Ｂｕｒｔｏｎ Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｎａｈｍ Ｍ．Ｈ．Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００６）１３（９）：１００４－９参照）に基づいて機能的抗体を評価するためにＮＺＷＲ血清をオプソニン食細胞アッセイ（ＯＰＡ）で試験した。
一価２０Ａ－ＣＲＭ１９７／ＡＰＡと多価ＰＣＶ２１ワクチンの両方で免疫したウサギは、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２０Ａと２０Ｂの両方を殺傷する機能的抗体を生成した（図３９）。これは、血清型２０Ａおよび２０Ｂが構造的類似性を共有し、血清群内で交差反応性をもたらすことを示唆している。

Claims (4)

  1. 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類担体タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、前記コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた特定の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型は、３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、脱Ｏ－アセチル化１５Ｂ、１７Ｆおよび２０からなり、そして、前記担体タンパク質はＣＲＭ１９７である、組成物。
  2. 脱Ｏ－アセチル化１５Ｂ多糖類が、５％未満の反復単位当たりのＯ－アセチル含有量を有する、請求項１に記載の多価免疫原性組成物。
  3. 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類担体タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、前記コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた特定の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型は、３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｃ、１７Ｆおよび２０からなり、そして、前記担体タンパク質はＣＲＭ１９７である、組成物。
  4. 肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖類担体タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、ここで、前記コンジュゲートの各々は担体タンパク質にコンジュゲートされた特定の肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の多糖類を含み、ここで、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型は、３、７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆ、３３Ｆ、６Ａ、１５Ａ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３５Ｂ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆおよび２０からなり、そして、前記担体タンパク質はＣＲＭ１９７である、組成物。
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