CN109336989B - 一种通过粘度控制制备肺炎球菌荚膜多糖的方法 - Google Patents
一种通过粘度控制制备肺炎球菌荚膜多糖的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109336989B CN109336989B CN201811232369.XA CN201811232369A CN109336989B CN 109336989 B CN109336989 B CN 109336989B CN 201811232369 A CN201811232369 A CN 201811232369A CN 109336989 B CN109336989 B CN 109336989B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- viscosity
- washing
- until
- collecting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
本发明属于生物制品领域,涉及一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。本发明的制备方法,包括以下步骤:以肺炎球菌灭活、澄清后的发酵液为初始料液进行纯化制备,制备步骤为将澄清后的发酵液进行超滤浓缩,加CTAB使其与多糖形成沉淀,离心收集沉淀,再经过氯化钠解聚和层析精纯,最终得到肺炎球菌荚膜多糖,其中,控制粘度的步骤包括:超滤、澄清过滤、CTAB沉积、氯化钠解聚、层析。
Description
技术领域
本发明属于生物制品领域,涉及一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。
背景技术
肺炎球菌是革兰氏阳性菌,具有荚膜,为多糖抗原。肺炎球菌可引起多种疾病,如肺炎、中耳炎、菌血症、脑膜炎等,病情较严重,病死率高,因此,发展预防性疫苗成为一种迫切需求。目前市场上用于预防肺炎球菌感染的有23价肺炎球菌多糖疫苗,10价、13价肺炎球菌多糖结合疫苗,其中23价肺炎球菌多糖疫苗用于成年人,10价、13价用于儿童。多糖疫苗和多糖结合疫苗均需要使用肺炎球菌的荚膜多糖作为原材料进行制备。
肺炎球菌的血清型多达90多种,制备方法与标准差异较大,本发明涉及的方法能够有效的用于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型肺炎球菌多糖的制备。
多糖制备的过程分析与控制大多根据多糖浓度、杂质浓度等指标展开。如层析纯化时,对层析样品进行检测,计算多糖和杂质的含量后,根据层析填料的载量得出具体的上样体积。但不同血清型的多糖在相同浓度的情况下粘度差异很大,对于粘度较大的多糖,层析纯化的过程中容易受到粘度的干扰,影响溶液在层析填料中的流动状态,导致杂质去除不充分。对于与膜相关的操作,如超滤、过滤等过程,粘度较大会直接影响大分子的过膜状态,导致多糖分子量不稳定,Kd值指标容易超标。所以粘度也是多糖制备中关键的影响因素。
粘度是物质的一种物理化学性质,反应了外力作用下发生变形的流体因抗拒变形而产生的相邻两流体层间的内摩擦力。粘度一般应用于化工和食品行业中,如通过粘度对样品进行条件或者组分的分析。现代医学也有针对于生物样品的相关研究。在生物制品行业,特别是疫苗行业中较少提及,主要因为生物制品的质量控制方法多样,质量标准严苛,理化、生物的方法构成了生物制品行业质量控制的主要手段。
但是常用检测手段过程较复杂,检验周期较长。如使用蒽酮硫酸法测定多糖含量,需要用到称量、移液、加热、比色等多步操作,连同前期的准备工作,整个检测过程至少需要2-3个小时。而粘度的检测方法操作简便、快速,锥板式粘度计或旋转式粘度计均可在几分钟内测出样品粘度值,相比于理化检测的滞后性具有明显的优势。
由于溶液粘度与多糖浓度正相关,并且粘度体现较为直观,经常作为一种感官指标,仅依靠经验进行判断,没有具体进行检测得出粘度值,所以批间差异较大。结合不同工艺特点,确定不同血清型各步骤的最佳粘度值,能有效的增加产品收获率,提高产品质量。
在超滤阶段,浓缩体积的选择是该工艺的关键,在优化流速和TMP的情况下,粘度会影响透过液的流量和透析效果。浓缩体积过小会使透过流速变慢,并且高粘度状态会影响透析液的置换效果;浓缩体积过大会在透析倍数相同的情况下降低效率,同时因体积变大增加下游工艺的压力。超滤阶段控制粘度能够更好的避免过度浓差极化、提高效率、保证效果。
在澄清过滤阶段,溶液的粘度会显著影响过滤的效果。粘度大的溶液在过滤时容易造成滤芯过快堵塞,并且会影响多糖的回收率;稀释倍数过大会降低效率,同时因体积变大增加下游工艺的压力。控制合适的粘度能够在保证回收率的情况下更好的达到澄清效果。
在CTAB聚合多糖阶段,只对CTAB终浓度进行控制,可能会因为糖浓度的不同使聚合过程不充分。粘度过大的溶液糖浓度较高,可能导致CTAB总量不足,并且影响搅拌效果,使局部反应浓度过高,影响反应的均一性;稀释倍数过大,加大了CTAB的添加量,同时增加了下游工艺的压力。
在氯化钠解聚阶段,粘度会影响解聚的效果。控制粘度可以使反应在合理的范围内进行,从而使解聚更充分,提高多糖的回收率。
在层析阶段,使用离子交换填料进行多糖的纯化,样品的浓度会影响上样的压力和分离效果,直接控制粘度能够比较直观的优化上样条件。
以上提到的关键步骤通过控制粘度指标,均能达到提高多糖质量,增加回收率的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法。
本发明通过快速直观的质量控制手段,确定制备过程中的参数,确保收回率高、质量好的荚膜多糖。由于肺炎血清型的类型较多,工艺差别较大,寻找其中的共性能有效提高生产效率。
本发明的制备方法,包括以下步骤:以肺炎球菌灭活、澄清后的发酵液为初始料液进行纯化制备,制备步骤为将澄清后的发酵液进行超滤浓缩,加CTAB使其与多糖形成沉淀,离心收集沉淀,再经过氯化钠解聚和层析精纯,最终得到肺炎球菌荚膜多糖,其中,控制粘度的步骤包括:超滤、澄清过滤、CTAB沉积、氯化钠解聚、层析。
具体的,本发明的制备方法,包括以下步骤:
(a)发酵液的超滤
发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,随着浓缩过程粘度逐渐增大,达到目标粘度范围后结束浓缩,开始透析;
(b)澄清过滤
超滤结束后将溶液进行澄清过滤,过滤前使用相同缓冲液将多糖溶液稀释至目标粘度范围。过滤完成后使用缓冲液冲洗滤芯并收集冲洗液;
(c)CTAB聚合多糖
添加CTAB前,使用缓冲液稀释多糖溶液至目标粘度范围,持续搅拌添加CTAB溶液;
(d)氯化钠解聚过程
将步骤(c)中的溶液进行离心,收集CTAB多糖聚合物(部分血清型收集离心上清液,不进行此纯化步骤),使用氯化钠溶液充分搅拌,搅拌过程通过氯化钠溶液稀释溶液至目标粘度范围;
(e)超滤
充分解聚的多糖溶液经过离心、澄清过滤后,先进行浓缩,随着浓缩过程粘度逐渐增大,达到目标粘度范围后结束浓缩,开始透析;
(f)澄清过滤
超滤结束后将溶液进行澄清过滤,过滤前使用相同缓冲液将多糖溶液稀释至目标粘度范围。过滤完成后使用缓冲液冲洗滤芯并收集冲洗液;
(g)层析
多糖溶液过滤后,使用缓冲液稀释至目标粘度范围,进行上样层析;
(h)超滤
将层析柱纯化的多糖溶液进行超滤,先进行浓缩,随着浓缩过程粘度逐渐增大,达到目标粘度范围后结束浓缩,开始透析;
(i)澄清过滤
超滤结束后将溶液进行澄清过滤,过滤前将多糖溶液稀释至目标粘度范围,过滤完成后冲洗滤芯并收集冲洗液;
(j)冻干
将多糖溶液进行冻干,结束后收集多糖。
其中,(a)(e)(h)三处的超滤步骤目标粘度范围是5-10cp;
(b)(f)(i)三处的过滤步骤目标粘度范围是5-20cp;
(c)的目标粘度范围是1-5cp;
(d)的目标粘度范围是1-3cp;
(g)的目标粘度范围是10-20cp。
本发明的发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,进入超滤步骤。发酵液的初始粘度范围为1-3cp,随着浓缩过程粘度逐渐增大,达到5-10cp后,透过流速有明显的降低现象,此时开始透析。透析完成后为了控制溶液体积需要进行过浓缩,然后通过多次冲洗膜包,收集浓缩液。
收集的浓缩液粘度较大,有的高粘度血清型可以达到50cp以上,不利于澄清过滤的进行,需要将溶液粘度稀释至5-20cp,之后进行澄清过滤。
过滤之后经过缓冲液冲洗滤器,多糖溶液粘度降低。继续稀释溶液至粘度达到1-5cp。搅拌状态添加CTAB溶液至目标浓度。
将CTAB多糖溶液进行离心,对于需要收集沉淀的血清型,将使用氯化钠溶液进行解聚,即将多糖和CTAB的复合物置于氯化钠溶液中搅拌,伴随搅拌过程溶液粘度逐渐增大,通过添加氯化钠溶液的方式控制溶液粘度的范围在1-3cp。
将充分解聚的溶液进行离心,收集的上清澄清过滤后进行超滤,同第一步超滤和过滤步骤,当浓缩进行至溶液粘度达到5-10cp时开始透析,透析完成后为了控制溶液体积需要进行过浓缩,然后通过多次冲洗膜包,收集浓缩液。
收集的浓缩液粘度较大,有的高粘度血清型可以达到50cp以上,不利于澄清过滤的进行,需要将溶液粘度稀释至10-20cp,之后进行澄清过滤。过滤之后维持该粘度进行层析纯化过程。
层析结束后,同超滤和过滤的步骤,分别控制粘度范围在5-10cp和10-20cp,过滤后溶液进行冻干,结束后即可收集多糖。
经检测,使用粘度控制制备的多糖,理化指标优于不控制粘度的制备方法制备的多糖,多糖回收率能够提高10-50%,回收率提高在粘度较高的血清型制备中更为明显。
优选的,本发明的制备方法,包括以下步骤:
(1)肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到5-10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包,收集浓缩液,搅拌均匀;
(2)检测溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至5-20cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为2-5cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液;
(3)将CTAB溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3-10cp时添加氯化钠溶液至粘度为1-3cp;增加至3-10cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为1-3cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束;
(4)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(1),浓缩至粘度达到5-10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包1-4次,收集浓缩液,搅拌均匀,在5-20cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度10-20cp,
(5)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到5-10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包,收集浓缩液,搅拌均匀,在5-20cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干,即得。
进一步优选的,本发明的制备方法,包括以下步骤:
(1)肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到5-10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀;
(2)检测溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至5-20cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为2-5cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液;
(3)将CTAB溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3-5cp时添加氯化钠溶液至粘度为2-3cp;增加至3-5cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2-3cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束;
(4)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(1),浓缩至粘度达到5-10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在5-20cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度10-20cp,
(5)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到5-10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在5-20cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干,即得。
本发明所述的肺炎球菌为1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型肺炎球菌。
根据实施例之一,本发明的制备方法,包括以下步骤:
(a)1型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,
(b)检测1型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至10cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为5cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液,
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至5cp时添加氯化钠溶液至粘度为3cp;增加至5cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为3cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束,
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在20cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度15cp,
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
根据实施例之一,本发明的制备方法,包括以下步骤:
(a)2型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,
(b)检测2型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至8cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为3cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液,
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3cp时添加氯化钠溶液至粘度为2cp;增加至3cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束,
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到8cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度12cp,
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干,即得。
根据实施例之一,本发明的制备方法,包括以下步骤:
(a)3型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,
(b)检测3型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至10cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为5cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液,
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至5cp时添加氯化钠溶液至粘度为3cp;增加至5cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为3cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束,
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在20cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度15cp,
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
根据实施例之一,本发明的制备方法,包括以下步骤:
(a)4型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,
(b)检测4型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至8cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为3cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液,
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3cp时添加氯化钠溶液至粘度为2cp;增加至3cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束,
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到8cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度12cp,
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
本发明其他优选的技术方案请见实施例。
本发明的制备方法相对于现有方法而言,降低了过程控制的难度,缩短了过程控制检测的时间,简化操作,有效性强。粘度直接由浓度影响,控制粘度可以有效控制浓度,改善液体状态。并且将粘度值进行准确测量,量化了常用的经验值,从而有目的的改善纯化条件,能够明显提高产品回收率和杂质含量的去除率,保证多糖分子量的大小。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。本实施例只是一种举例,是本发明的解决方案之一,并非将本发明局限于实施例。
实施例1、1型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)1型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测1型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至10cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为5cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至5cp时添加氯化钠溶液至粘度为3cp;增加至5cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为3cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束。
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到10cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在20cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度15cp。
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(f)冻干后收获的多糖进行检测。
(g)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(h)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
1型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
实施例2、2型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)2型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测2型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至8cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为3cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3cp时添加氯化钠溶液至粘度为2cp;增加至3cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束。
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度12cp。
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(f)冻干后收获的多糖进行检测。
(g)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(h)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
2型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
实施例3、3型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)3型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测3型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至10cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为5cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至5cp时添加氯化钠溶液至粘度为3cp;增加至5cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为3cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束。
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到10cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在20cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度15cp。
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(f)冻干后收获的多糖进行检测。
(g)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(h)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
3型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
实施例4、4型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)4型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测4型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至8cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为3cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3cp时添加氯化钠溶液至粘度为2cp;增加至3cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束。
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度12cp。
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(f)冻干后收获的多糖进行检测。
(g)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(h)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
4型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
实施例5、5型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)5型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到5cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测5型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至5cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为2cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3cp时添加氯化钠溶液至粘度为2cp;增加至3cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束。
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到5cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度10cp。
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到5cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在8cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(f)冻干后收获的多糖进行检测。
(g)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(h)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
5型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
实施例6、6A型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)A6型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到5cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测6A型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至5cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为2cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3cp时添加氯化钠溶液至粘度为2cp;增加至3cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束。
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到5cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度10cp。
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到5cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在8cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(f)冻干后收获的多糖进行检测。
(g)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(h)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
6A型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
实施例7、6B型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)6B型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到5cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测6B型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至5cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为2cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3cp时添加氯化钠溶液至粘度为2cp;增加至3cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束。
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到5cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度10cp。
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到5cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在8cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(f)冻干后收获的多糖进行检测。
(g)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(h)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
6B型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
实施例8、7F型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)7F型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测7F型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至8cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为3cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集上清,澄清过滤后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度12cp。
(d)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(e)冻干后收获的多糖进行检测。
(f)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(g)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
7F型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
实施例9、9V型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)9V型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测9V型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至8cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为3cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3cp时添加氯化钠溶液至粘度为2cp;增加至3cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束。
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度12cp。
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(f)冻干后收获的多糖进行检测。
(g)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(h)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
9V型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
实施例10、12F型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)12F型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测12F型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至8cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为3cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3cp时添加氯化钠溶液至粘度为2cp;增加至3cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束。
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度12cp。
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(f)冻干后收获的多糖进行检测。
(g)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(h)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
12F型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
实施例11、14型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)14型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测14型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至8cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为3cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集上清,澄清过滤后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度12cp。
(d)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(e)冻干后收获的多糖进行检测。
(f)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(g)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
14型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
实施例12、18C型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)18C型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测18C型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至10cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为5cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至5cp时添加氯化钠溶液至粘度为3cp;增加至5cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为3cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束。
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到10cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在20cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度15cp。
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(f)冻干后收获的多糖进行检测。
(g)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(h)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
18C型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
实施例13、19A型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)19A型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测19A型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至8cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为3cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3cp时添加氯化钠溶液至粘度为2cp;增加至3cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束。
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度12cp。
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(f)冻干后收获的多糖进行检测。
(g)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(h)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
19A型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
实施例14、19F型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)19F型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测19F型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至8cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为3cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3cp时添加氯化钠溶液至粘度为2cp;增加至3cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束。
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度12cp。
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(f)冻干后收获的多糖进行检测。
(g)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(h)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
19F型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
实施例15、23F型肺炎球菌多糖溶液超滤的粘度控制
(a)23F型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到5cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。
(b)检测23F型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至5cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为2cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液。
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3cp时添加氯化钠溶液至粘度为2cp;增加至3cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束。
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到5cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度10cp。
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到5cp时,开始透析。透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀。在8cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
(f)冻干后收获的多糖进行检测。
(g)同时与不控制粘度的传统方法进行对比,在上述关键控制点取样检测粘度,与目标值均相差3-10cp。
(h)对两组方法制备的多糖进行检测对比,结果如下:
23F型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
Claims (5)
1.一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(a)1型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,
(b)检测1型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至10cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为5cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液,
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至5cp时添加氯化钠溶液至粘度为3cp;增加至5cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为3cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束,
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在20cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度15cp,
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
2.一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(a)2型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,
(b)检测2型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至8cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为3cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液,
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3cp时添加氯化钠溶液至粘度为2cp;增加至3cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束,
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到8cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度12cp,
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干,即得。
3.一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(a)3型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,
(b)检测3型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至10cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为5cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液,
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至5cp时添加氯化钠溶液至粘度为3cp;增加至5cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为3cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束,
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在20cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度15cp,
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
4.一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(a)4型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,
(b)检测4型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至8cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为3cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液,
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至3cp时添加氯化钠溶液至粘度为2cp;增加至3cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为2cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束,
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到8cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度12cp,
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到8cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在10cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
5.一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(a)18C型肺炎球菌发酵液经过灭活、离心、澄清过滤后,先进行浓缩,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,
(b)检测18C型多糖溶液粘度,使用缓冲液稀释溶液粘度至10cp进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液继续稀释至粘度为5cp,持续搅拌状态添加CTAB溶液,
(c)将CTAB多糖溶液进行离心,收集沉淀,置于氯化钠溶液中持续搅拌,当粘度增加至5cp时添加氯化钠溶液至粘度为3cp;增加至5cp时再次添加氯化钠溶液至粘度为3cp,直至粘度不再上升时解聚过程结束,
(d)多糖解聚溶液进行离心、澄清后,进行超滤,同步骤(a),浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在20cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,再添加缓冲液至溶液粘度15cp,
(e)将溶液进行层析纯化,收集的层析组分同步骤(a)进行超滤,浓缩至粘度达到10cp时,开始透析,透析结束后继续将溶液过浓缩,使用缓冲液冲洗膜包2-3次,收集浓缩液,搅拌均匀,在15cp的粘度下进行澄清过滤,过滤完成后使用缓冲液冲洗滤器,收集冲洗液,搅拌均匀后冻干。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811232369.XA CN109336989B (zh) | 2018-10-22 | 2018-10-22 | 一种通过粘度控制制备肺炎球菌荚膜多糖的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811232369.XA CN109336989B (zh) | 2018-10-22 | 2018-10-22 | 一种通过粘度控制制备肺炎球菌荚膜多糖的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109336989A CN109336989A (zh) | 2019-02-15 |
CN109336989B true CN109336989B (zh) | 2022-05-13 |
Family
ID=65311596
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811232369.XA Active CN109336989B (zh) | 2018-10-22 | 2018-10-22 | 一种通过粘度控制制备肺炎球菌荚膜多糖的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109336989B (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3720483A2 (en) | 2017-12-06 | 2020-10-14 | Merck Sharp&Dohme Corp. | Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
CR20210333A (es) | 2018-12-19 | 2021-08-18 | Merck Sharp & Dohme | Composiciones que comprenden conjugados de polisacárido de streptococcus pneumoniae con proteína y sus métodos de uso |
CN110736796B (zh) * | 2019-10-23 | 2022-07-01 | 北京智飞绿竹生物制药有限公司 | 一种检测肺炎球菌荚膜多糖分子量的方法 |
CN112646050B (zh) * | 2021-01-09 | 2023-01-10 | 北京智飞绿竹生物制药有限公司 | 一种肺炎球菌多糖的纯化工艺 |
CN113980104B (zh) * | 2021-10-25 | 2023-08-22 | 北京智飞绿竹生物制药有限公司 | 一种切向流超滤纯化15价肺炎球菌多糖蛋白结合物的工艺方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5714354A (en) * | 1995-06-06 | 1998-02-03 | American Home Products Corporation | Alcohol-free pneumococcal polysaccharide purification process |
GB0502096D0 (en) * | 2005-02-01 | 2005-03-09 | Chiron Srl | Purification of streptococcal capsular polysaccharide |
CN103687600B (zh) * | 2011-03-22 | 2016-05-04 | 印度血清研究所私人有限公司 | 一种制备多糖的方法 |
BR112015005081B1 (pt) * | 2012-09-07 | 2021-10-26 | Sk Bioscience Co., Ltd. | Método para produzir um polissacarídeo capsular tendo um sorotipo de pneumococo |
CN104592408A (zh) * | 2015-01-11 | 2015-05-06 | 云南沃森生物技术股份有限公司 | 一种荚膜多糖的纯化方法 |
-
2018
- 2018-10-22 CN CN201811232369.XA patent/CN109336989B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109336989A (zh) | 2019-02-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109336989B (zh) | 一种通过粘度控制制备肺炎球菌荚膜多糖的方法 | |
JP5260531B2 (ja) | 肺炎連鎖球菌3型多糖体の精製 | |
CN101798357B (zh) | 一种提取燕麦β-葡聚糖的方法 | |
US6648978B2 (en) | Membrane filtration for thickening and starch washing in corn wet milling | |
AU2017299082B2 (en) | Separation of enzymes from trichoderma reesei by filter press and tangential filtration on a ceramic membrane | |
KR20190128259A (ko) | 접선방향 유동 여과 모드에서 작동되는 나노섬유 한외여과막을 사용하여 샘플에서 목적하는 생물학적 물질을 정제하는 방법 | |
Andersson et al. | Comparison of diafiltration and size-exclusion chromatography to recover hemicelluloses from process water from thermomechanical pulping of spruce | |
CN107474147A (zh) | 一种大分子酯化水溶性大豆多糖的制备方法及其应用 | |
Pagliero et al. | Orange juice clarification by microfiltration: Effect of operational variables on membrane fouling | |
CN105669877B (zh) | 一种高纯度葡甘露聚糖制备方法 | |
Mellal et al. | Separation of oligoglucuronans of low degrees of polymerization by using a high shear rotating disk filtration module | |
CN106496022A (zh) | 一种从微生物发酵液或酶转化液中提取丙酮酸的方法 | |
CN112110830B (zh) | 一种用于制备茶叶茶氨酸的物料预处理方法 | |
CN107698693B (zh) | 一种水果多糖脱色方法 | |
CN116829576A (zh) | 利用切向流超滤技术制备可控的高浓度丝素蛋白溶液的方法 | |
CN109265500B (zh) | 一种鼠李糖脂酸沉淀的方法 | |
CN105837815B (zh) | 一种从发酵液中高效提取γ‑聚谷氨酸的工艺 | |
US2221560A (en) | Stabilization of a zein solution by clarification | |
Vercellotti et al. | Sugarcane components that affect efficiency of membrane filtration: identification and removal | |
CN117618551A (zh) | 一种肺炎球菌多糖-蛋白结合物制备的方法 | |
CN108017721A (zh) | 一种大分子右旋糖酐的分离提纯方法 | |
KR20090110723A (ko) | 알로에 베라 겔의 농축 방법 | |
CN113603805A (zh) | 一种白刺多糖的制备方法 | |
CN117659168A (zh) | 一种去除卵黄抗体制备过程中内毒素的方法 | |
CN113980104A (zh) | 一种切向流超滤纯化15价肺炎球菌多糖蛋白结合物的工艺方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |