CN109265500B - 一种鼠李糖脂酸沉淀的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鼠李糖脂酸沉淀的方法，采用离心的方法去除菌体，收集上清液，然后将收集的上清液置于水浴锅中水浴除蛋白，采用离心的方法去除沉淀的蛋白，收集上清液，加入磷酸调节pH至2让鼠李糖脂析出，产生沉淀，在4℃静置18h。最后经过离心收集鼠李糖脂沉淀。本发明的方法通过水浴去蛋白结合磷酸沉淀获取鼠李糖脂，鼠李糖脂回收率高、纯度高，此外，本发明的方法操作简单、经济，高效，适合工业化的批量生产。
Description
技术领域
本发明涉及到一种鼠李糖脂的酸沉淀方法。
背景技术
鼠李糖脂是一种性能优良的生物表面活性剂，无毒、易生物降解，鼠李糖脂可用作乳化剂、破乳剂、功能性食品添加剂、洗涤剂和环境污染修复剂等，在农用化学品、食品饮料、化妆品和药品、环境污染治理、采矿冶金和石油石化工业等领域具有良好的应用前景，然而鼠李糖脂的分离一直是很棘手的难题，酸沉淀是普遍使用的一种方法，然而就酸沉淀本身仍然存在很多亟待的问题。
目前对鼠李糖脂的研究多集中于提高产率上及其应用效果上，在提取工艺方面的研究较少。酸沉淀是对于鼠李糖脂分离普遍适用的方法，因为其有简便、高效、回收率高等优点。现有的酸沉淀方法主要使用盐酸，硫酸调节pH，这些提取方法都存在着一些缺陷。其中盐酸是一种挥发性极强的酸，在使用过程中存在安全隐患。同时盐酸水溶液中含有氯离子，氯离子是化妆品中检测的指标之一，使用盐酸调节pH，会造成产品氯离子含量超标，使产品品质下降，而硫酸是一种强腐蚀酸，在使用过程中存在安全隐患。
发明内容
本方法目的就在于克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种简便、经济、高效的鼠李糖脂酸沉淀方法。
本发明的目的可通过以下技术方案来实现：
一种鼠李糖脂酸沉淀的方法，包括如下步骤：
（1）将鼠李糖脂发酵液置于离心管中离心富集菌体，收集无菌的发酵液上清液；
（2）将步骤（1）中收集的发酵液上清液置于水浴锅中，90℃水浴60min；
（3）将（2）中水浴处理后的发酵液上清液置于离心管中离心富集蛋白，收集上清液；
（4）将（3）中收集的上清液量取体积，加入磷酸调节pH使鼠李糖脂析出，产生沉淀；
（5）将（4）中产生沉淀的发酵液置于离心管中离心富集鼠李糖脂沉淀，测量上清液的鼠李糖脂浓度计算鼠李糖脂回收率，将所得的固体烘干，得到鼠李糖脂酸沉淀产品。
本发明的方法，所述步骤（1）中，离心条件为10000rpm，4℃，20min。
所述离心管为尖底离心管，可以更有利于富集菌体。
所述步骤（3）中，离心条件为6000rpm，4℃，10min。
所述步骤（4）中所用的酸为分析纯级的磷酸；加酸调节至pH=2，之后在4℃下静置3-18h。
所述步骤（5）中，离心条件为6000rpm，4℃，10min。
进一步的，本发明的方法还包括：取步骤（1）的发酵液上清液和步骤（5）中离心后的上清液，加入定量蒽酮硫酸试剂，沸水浴反应10min，控制紫外波长为620nm，利用酶标仪测试发酵液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，计算鼠李糖脂损失率。
与现有的技术相比，本发明采用添加磷酸调节pH，可以很好的沉淀鼠李糖脂，重复性良好。该方法克服了现有技术中存在的危险性大，回收率低，产品品质差等缺陷，是一种工艺简单，适合工业化批次生产的简便、经济、高效的提取方法。
附图说明
图1为不同种类的酸沉淀对鼠李糖脂回收率的影响；
图2为不同种类的酸沉淀对鼠李糖脂产物纯度的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种鼠李糖脂酸沉淀的新方法，该方法主要包含以下步骤：
（1）将20mL鼠李糖脂发酵液均匀的分装于2个10 mL尖底离心管中，使用低温高速离心机10000rpm，4℃，离心20min，小心收集上清液。
（2）将步骤（1）中收集的上清液重新收集倒入烧杯中，放到事先加热到90℃的水浴锅中水浴60 min。
（3）将（2）中处理结束的发酵液均匀分装于2个10mL的尖底离心管中，使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10min，富集沉淀蛋白，小心收集去除蛋白的上清液，并重新收集，得到去除蛋白的鼠李糖脂发酵液。
（4）将（3）中收集到的鼠李糖脂发酵液均匀分装于9个1.5 mL的尖底离心管中，每管定量装1mL鼠李糖脂发酵液。分别加入磷酸、硫酸、盐酸、硝酸调节pH至2，在4℃静置3h。
（5）将（4）中处理完成的发酵液使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10 min，测量上清液的鼠李糖脂浓度计算鼠李糖脂回收率，将所得的固体放入105℃烘箱，烘干沉淀称重。
（6）利用蒽酮硫酸法检测酸沉淀前和酸沉淀后的鼠李糖脂浓度。取定量酸沉淀前发酵液和步骤（5）中所述离心后的上清液，加入定量蒽酮硫酸试剂，沸水浴反应10 min，控制紫外波长为620nm，利用酶标仪测试发酵液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，判断鼠李糖脂损失率。酸沉淀前发酵液体积为1mL，测得的鼠李糖脂浓度为43.77g/L，酸沉淀后发酵液体积为1mL，如图1所示，测得的盐酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为3.45 g/L，计算得到鼠李糖脂回收率为92.1 %。测得的硫酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为3.45 g/L，计算得到鼠李糖脂回收率为92.1 %。测得的硝酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为3.94 g/L, 计算得到的鼠李糖脂回收率为91.0 %。测得的磷酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为2.49g/L，计算得到鼠李糖脂回收率为94.3 % 。
实施例2
一种鼠李糖脂酸沉淀的新方法，该方法主要包含以下步骤：
（1）将20mL鼠李糖脂发酵液均匀的分装于2个10 mL尖底离心管中，使用低温高速离心机10000rpm，4℃，离心20min，小心收集上清液。
（2）将步骤（1）中收集的上清液重新收集倒入烧杯中，放到事先加热到90℃的水浴锅中水浴60 min。
（3）将（2）中处理结束的发酵液均匀分装于2个10mL的尖底离心管中，使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10min，富集沉淀蛋白，小心收集去除蛋白的上清液，并重新收集，得到去除蛋白的鼠李糖脂发酵液。
（4）将（3）中收集到的鼠李糖脂发酵液均匀分装于9个1.5 mL的尖底离心管中，每管定量装1mL鼠李糖脂发酵液。分别加入磷酸、硫酸、盐酸、硝酸调节pH至2，在4℃静置6h。
（5）将（4）中处理完成的发酵液使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10 min，，测量上清液的鼠李糖脂浓度计算鼠李糖脂回收率，将所得的固体放入放入105℃烘箱，烘干沉淀称重。
（6）利用蒽酮硫酸法检测酸沉淀前和酸沉淀后的鼠李糖脂浓度。取定量酸沉淀前发酵液和步骤（5）中所述离心后的上清液，加入定量蒽酮硫酸试剂，沸水浴反应10 min，控制紫外波长为620nm，利用酶标仪测试发酵液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，判断鼠李糖脂损失率。酸沉淀前发酵液体积为1mL，测得的鼠李糖脂浓度为43.77g/L， 酸沉淀后发酵液体积为1mL，如图1所示，测得的盐酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为2.49 g/L，计算得到鼠李糖脂回收率为94.3 %。测得的硫酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为3.37 g/L，计算得到鼠李糖脂回收率为92.3 %。测得的硝酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为3.84 g/L, 计算得到的鼠李糖脂回收率为91.23 %。测得的磷酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为1.48 g/L，计算得到鼠李糖脂回收率为96.6 % 。
实施例3
一种鼠李糖脂酸沉淀的新方法，该方法主要包含以下步骤：
（1）将20mL鼠李糖脂发酵液均匀的分装于2个10 mL尖底离心管中，使用低温高速离心机10000rpm，4℃，离心20min，小心收集上清液。
（2）将步骤（1）中收集的上清液重新收集倒入烧杯中，放到事先加热到90℃的水浴锅中水浴60 min。
（3）将（2）中处理结束的发酵液均匀分装于2个10mL的尖底离心管中，使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10min，富集沉淀蛋白，小心收集去除蛋白的上清液，并重新收集，得到去除蛋白的鼠李糖脂发酵液。
（4）将（3）中收集到的鼠李糖脂发酵液均匀分装于9个1.5 mL的尖底离心管中，每管定量装1mL鼠李糖脂发酵液。分别加入磷酸、硫酸、盐酸、硝酸调节pH至2，在4℃静置9h。
（5）将（4）中处理完成的发酵液使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10 min，，测量上清液的鼠李糖脂浓度计算鼠李糖脂回收率，将所得的固体放入放入105℃烘箱，烘干沉淀称重。
（6）利用蒽酮硫酸法检测酸沉淀前和酸沉淀后的鼠李糖脂浓度。取定量酸沉淀前发酵液和步骤（5）中所述离心后的上清液，加入定量蒽酮硫酸试剂，沸水浴反应10 min，控制紫外波长为620nm，利用酶标仪测试发酵液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，判断鼠李糖脂损失率。酸沉淀前发酵液体积为1mL，测得的鼠李糖脂浓度为43.77g/L， 酸沉淀后发酵液体积为1mL，如图1所示，测得的盐酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为1.76 g/L，计算得到鼠李糖脂回收率为95.99 %。测得的硫酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为2.52 g/L，计算得到鼠李糖脂回收率为94.23 %。测得的硝酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为3.07 g/L, 计算得到的鼠李糖脂回收率为92.95 %。测得的磷酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为1.26 g/L，计算得到鼠李糖脂回收率为97.1 %。
实施例4
一种鼠李糖脂酸沉淀的新方法，该方法主要包含以下步骤：
（1）将20mL鼠李糖脂发酵液均匀的分装于2个10 mL尖底离心管中，使用低温高速离心机10000rpm，4℃，离心20min，小心收集上清液。
（2）将步骤（1）中收集的上清液重新收集倒入烧杯中，放到事先加热到90℃的水浴锅中水浴60 min。
（3）将（2）中处理结束的发酵液均匀分装于2个10mL的尖底离心管中，使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10min，富集沉淀蛋白，小心收集去除蛋白的上清液，并重新收集，得到去除蛋白的鼠李糖脂发酵液。
（4）将（3）中收集到的鼠李糖脂发酵液均匀分装于9个1.5 mL的尖底离心管中，每管定量装1mL鼠李糖脂发酵液。分别加入磷酸、硫酸、盐酸、硝酸调节pH至2，在4℃静置18h。
（5）将（4）中处理完成的发酵液使用低温高速离心机6000rpm，4℃，离心10 min，，测量上清液的鼠李糖脂浓度计算鼠李糖脂回收率，将所得的固体放入放入105℃烘箱，烘干沉淀称重。
（6）利用蒽酮硫酸法检测酸沉淀前和酸沉淀后的鼠李糖脂浓度。取定量酸沉淀前发酵液和步骤（5）中所述离心后的上清液，加入定量蒽酮硫酸试剂，沸水浴反应10 min，控制紫外波长为620nm，利用酶标仪测试发酵液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，判断鼠李糖脂损失率。酸沉淀前发酵液体积为1mL，测得的鼠李糖脂浓度为43.77g/L， 酸沉淀后发酵液体积为1mL，如图1所示，测得的盐酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为1.63 g/L，计算得到鼠李糖脂回收率为96.28 %。测得的硫酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为2.07 g/L，计算得到鼠李糖脂回收率为95.27 %。测得的硝酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为3.06 g/L, 计算得到的鼠李糖脂回收率为92.94 %。测得的磷酸酸沉淀上清液鼠李糖脂浓度为0.93 g/L，计算得到鼠李糖脂回收率为97.87 %。
实施例5
本实施例对实施例4获取的鼠李糖脂沉淀进行纯度测定。
（1）将烘干的鼠李糖脂于电子天平上准确称量，分别称取使用盐酸，硫酸，硝酸，磷酸酸沉淀所得的鼠李糖脂固体1 g。
（2）使用纯水分别溶解鼠李糖脂，使用100mL容量瓶定容到100mL。配成10 g/L的理论浓度。
（3）使用蒽酮比色法分别测量盐酸，硫酸，硝酸，磷酸酸沉淀配置成的鼠李糖脂溶液。测得浓度分别为5.810 g/L，5.737 g/L, 5.510 g/L, 6.450 g/L。计算得到纯度分别为58.10%，57.37%，55.10%，64.50%，如图2所示。
Claims (4)
1.一种鼠李糖脂酸沉淀的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将鼠李糖脂发酵液置于离心管中10000rpm，4℃条件下离心20min富集菌体，收集无菌的发酵液上清液；
(2)将步骤(1)中收集的发酵液上清液置于水浴锅中，90℃水浴60min；
(3)将(2)中水浴处理后的发酵液上清液置于离心管中6000rpm，4℃条件下离心10min富集蛋白，收集上清液；
(4)将(3)中收集的上清液量取体积，加入分析纯级的磷酸调节至pH＝2，在4℃下静置3-18h使鼠李糖脂析出，产生沉淀；
(5)将(4)中产生沉淀的发酵液置于离心管中6000rpm，4℃条件下离心10min富集鼠李糖脂沉淀，测量上清液的鼠李糖脂浓度计算鼠李糖脂回收率，将所得的固体烘干，得到鼠李糖脂酸沉淀产品。
2.根据权利要求1所述的一种鼠李糖脂酸沉淀方法，其特征在于，所述离心管为尖底离心管。
3.根据权利要求1所述的一种鼠李糖脂酸沉淀方法，其特征在于，还包括：取步骤(1)的发酵液上清液和步骤(5)中离心后的上清液，加入定量蒽酮硫酸试剂，沸水浴反应10min，控制紫外波长为620nm，利用酶标仪测试发酵液吸光度，代入用标准鼠李糖制作的标准曲线中计算鼠李糖脂浓度，计算鼠李糖脂损失率。
4.根据权利要求1所述的一种鼠李糖脂酸沉淀方法，其特征在于，还包括：取步骤(5)得到鼠李糖脂酸沉淀产品，纯水溶解，使用蒽酮比色法测量溶液中鼠李糖脂溶液，计算鼠李糖脂纯度。
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