CN108191930A - 一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法 - Google Patents

一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法，包括以下步骤：1)预处理：加热发酵液、冷却后离心除去菌体、变性蛋白等不溶物；2)絮凝与浓缩：上清液中加入适量壳聚糖、混匀，在适宜温度下自然沉降，弃掉上层液相；3)洗脱：蒸馏水清洗去除沉淀物中的残余发酵液后，加入适宜浓度的NaHCO3溶液，洗脱沉淀物中的鼠李糖脂，收集洗脱液；4)获取：调节洗脱液pH、静置沉淀、离心，获得鼠李糖脂产物。本发明方法是一种简便、高效提取发酵液中鼠李糖脂的方法，在鼠李糖脂发酵生产领域具有重要应用价值。

Description

一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法
技术领域
本发明属于鼠李糖脂发酵生产领域，具体地说，它涉及一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法。
背景技术
鼠李糖脂是由铜绿假单胞菌等细菌代谢合成的一种生物表面活性剂，因其具有表面活性高、临界胶束浓度低，安全无毒、可生物降解等优势，因而在微生物采油、环境污染修复、食品、生物医药等技术领域具有广泛的应用前景。
鼠李糖脂产生菌的发酵液成分复杂，从发酵液中提取鼠李糖脂的成本高、难度较大。目前，从发酵液中提取鼠李糖脂的方法主要为氯仿-甲醇萃取法、硅胶柱层析法等，在萃取法和柱层析法中需要用到大量的氯仿，而氯仿是一种高毒性的有机氯化物，危害人体和环境。上述提取方法的高成本和高毒性限制了鼠李糖脂的发酵生产和应用。因此，获得一种简便、绿色的鼠李糖脂产物提取方法，将能够解决上述瓶颈问题。
本发明的鼠李糖脂提取方法不需要使用氯仿和甲醇等有毒溶剂，为绿色提取工艺。因此，该提取发酵液中鼠李糖脂的方法，在鼠李糖脂的发酵生产领域将具有重要的应用价值。
发明内容：
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种简便、高效提取发酵液中鼠李糖脂的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法，包括以下步骤：1)预处理：加热发酵液、冷却后离心除去菌体、变性蛋白等不溶物；2)絮凝与浓缩：上清液中加入适量壳聚糖，搅拌混匀，在适宜温度下自然沉降，弃掉上层液相；3)洗脱：蒸馏水清洗去除沉淀物中残余发酵液后，加入适宜浓度的NaHCO3溶液，洗脱沉淀物中的鼠李糖脂，收集洗脱液；4)获取：调节洗脱液pH、静置沉淀、离心，获得鼠李糖脂产物。
将产鼠李糖脂菌种的种子液接种至含发酵培养基的培养体系中(如三角瓶、发酵罐等)中，在30～40℃、160～220rpm条件下，培养2～6天，得到的含鼠李糖脂的发酵液。种子液与发酵培养基的体积比为2-6:100。
发酵培养基按质量分数为：碳源2～5％，NaNO3 0.2～0.4％，KH2PO40.1～0.3％，K2HPO4·3H2O 0.1～0.3％，MgSO4·7H2O 0.02～0.06％，酵母粉0.05～0.15％，余量为水；pH6.5～7.0。
发酵培养基的碳源，可以为葡萄糖、蔗糖、甘油、糖蜜、大豆油。
利用本发明方法提取发酵液中的鼠李糖脂产物，先对发酵液进行预处理，将发酵液放置在80～100℃水浴中加热处理20～60min；在8,000g～10,000g条件下，离心除去菌体和变性蛋白等不溶物。
按照壳聚糖终浓度为5～20g/L，向预处理后发酵液中加入脱乙酰度≥90％的壳聚糖，搅拌混匀，然后在30～40℃下，絮凝沉降1～2h，然后弃掉上层液相。
用20-50ml蒸馏水洗涤沉淀物3次，弃掉液相；加入20～50ml浓度为1～5g/L的NaHCO3水溶液重悬沉淀物，洗脱3次，收集洗脱液。
用浓度1mol/L的HCl水溶液调节洗脱液的pH至1.5～2.0；在4～10℃条件下，静置8～12h；在10,000g～12,000g条件下，离心获得鼠李糖脂产物。
利用薄层色谱法对提取到的鼠李糖脂产物进行定性分析，在苯酚-硫酸显色剂下，产物显示黄色，表明为鼠李糖脂。
所述鼠李糖脂提取方法可以应用于鼠李糖脂的发酵生产领域，提取细菌发酵液中鼠李糖脂的产物。
本发明的有益效果：
本发明方法是一种简便、快捷提取发酵液中鼠李糖脂的方法；此外，利用本发明方法提取发酵液中鼠李糖脂，避免了有机溶剂的使用。
具体实施方式
结合下述具体实施例对本发明进行详细的说明，使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。在如下实施例中，如无特殊说明，所用的材料和试剂均可从生化试剂公司购买获得；除特殊说明的方法外，所用试验方法均为实验室常规实验方法。
实施例1：从以葡萄糖为碳源的发酵液中提取鼠李糖脂产物。
1)发酵培养基的制备：用电子天平分别称量，30g葡萄糖，3g NaNO3，1g KH2PO4，2gK2HPO4·3H2O，0.4g MgSO4·7H2O，1g酵母粉；加入200ml蒸馏水混匀后，倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至1L；加入质量分数30％的NaOH，调节培养基的pH至7.0；分装到三角瓶后，放置于115℃下灭菌30min。
2)种子液制备：产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853的斜面菌种2接种环，接种到含100ml LB培养基的三角瓶中，在37℃、180rpm/min下，培养6-10小时，至OD600值为0.7，即得到培养至对数生长后期的种子液，菌数为105个/ml。
3)含鼠李糖脂发酵液的制备：待灭菌后的发酵培养基冷却至室温(20-30℃)后，接种培养基体积3％的菌株ATCC 27853的种子液(菌数为105个/ml)，在37℃、180rpm条件下，培养4天，用于发酵生产鼠李糖脂，获得含鼠李糖脂的发酵液。参考文献(Feng Zhao,etal.,Comparison ofmethods to quantify rhamnolipid and optimization of oilspreading method.Tenside Surfactants Detergents,2016,53(3):243-248.)中的排油圈方法，对发酵液中的鼠李糖脂含量进行定量，测得鼠李糖脂产量为3.16g/L。
4)鼠李糖脂产物提取：培养结束后，将1000ml发酵液放置在80℃水浴中加热处理30min；冷却至室温后，在10,000g条件下，离心除去菌体等不溶物。向预处理后发酵液中加入10克脱乙酰度为95％的壳聚糖，搅拌混匀，然后在35℃下，絮凝沉降2h，然后弃掉上层液相。用30ml蒸馏水洗涤沉淀物，重复此过程共洗涤3次，弃掉液相；加入50ml浓度为5g/L的NaHCO3水溶液重悬沉淀物，自然沉降，收集液体作为洗脱液，重复此过程共3次，收集3次得到的洗脱液。用浓度1mol/L的HCl水溶液调节洗脱液的pH至2.0；在4℃条件下，静置12h；在10,000g条件下，离心收集固体，获得鼠李糖脂产物。待产物冷冻干燥后，称量得到鼠李糖脂产量为2.08g，计算鼠李糖脂产物的得率：2.08/3.16*100％＝65.8％。
5)鼠李糖脂产物定性分析：利用薄层色谱法对提取到的鼠李糖脂产物进行定性分析，将提取的鼠李糖脂产物溶于二氯甲烷中，将样品点在硅胶板上，在氯仿/甲醇/水＝65:15:2(v/v/v)的展开剂中展开，用显色剂进行显色。在苯酚-硫酸显色剂下，产物显示黄色，说明利用该方法从葡萄糖为碳源的发酵液中提取到了鼠李糖脂产物。
实施
实施例2：所选择菌株、培养基成分、培养条件与实施例1相同，不同之处在于所用的壳聚糖具有不同的脱乙酰度，分别设置添加脱乙酰度为85％、90％和92％的3种壳聚糖的实验处理，利用本发明方法提取发酵液中鼠李糖脂。鼠李糖脂的得率分别为45.8％，60.8％和62.1％；结果表明，当壳聚糖的脱乙酰度≥90％时，鼠李糖脂产物的收率≥60％。
实施例3：从以大豆油为碳源的发酵液中提取鼠李糖脂产物
制备以大豆油为碳源的发酵培养基，用电子天平分别称量，3g NaNO3，1g KH2PO4，2g K2HPO4·3H2O，0.4g MgSO4·7H2O，1g酵母粉；加入200ml蒸馏水混匀后，倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至1L；加入质量分数30％的NaOH，调节培养基的pH至7.0；分装到三角瓶后，按照浓度为30g/L，分别向三角瓶中加入大豆油；然后在121℃下灭菌20min。
产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DSM 22644的斜面菌种2接种环，接种到含100ml LB培养基的三角瓶中，在37℃、180rpm/min下，培养6-10小时，至OD600值为0.7，即得到培养至对数生长后期的种子液，菌数为105个/ml。
待发酵培养基冷却至室温(20-30℃)后，接种培养基体积3％的菌株DSM22644的种子液(菌数为105个/ml)，在37℃、180rpm条件下，培养4天，获得含鼠李糖脂的发酵液。参考文献中的排油圈方法，测得鼠李糖脂产量为4.03g/L。
培养结束后，将发酵液放置在80℃水浴中加热处理30min；冷却至室温后，在10,000g条件下，离心除去菌体等不溶物和上层的残余大豆油。向预处理后发酵液中加入10克脱乙酰度为90％的壳聚糖，搅拌混匀，然后在35℃下，絮凝沉降2h，然后弃掉上层液相。用30ml蒸馏水洗涤沉淀物，重复此过程共洗涤3次，弃掉液相；加入50ml浓度为5g/L的NaHCO3水溶液重悬沉淀物，自然沉降，收集液体作为洗脱液，重复此过程共3次，收集3次得到的洗脱液。用浓度1mol/L的HCl水溶液调节洗脱液的pH至2.0；在4℃条件下，静置12h；在10,000g条件下，离心收集固体，获得鼠李糖脂产物。待产物冷冻干燥后，称量得到鼠李糖脂产量为2.51g，计算鼠李糖脂产物的得率：2.51/4.03*100％＝62.3％。
利用薄层色谱法对获得的鼠李糖脂产物进行定性分析，将提取的鼠李糖脂产物溶于二氯甲烷中，将样品点在硅胶板上，在氯仿/甲醇/水＝65:15:2(v/v/v)的展开剂中展开，用显色剂进行显色。在苯酚-硫酸显色剂下，产物显示黄色，说明利用该方法从大豆油为碳源的发酵液中提取到了鼠李糖脂产物。
本发明方法是一种简便、快捷提取发酵液中鼠李糖脂的方法，且提取过程中避免了有机溶剂的使用，在鼠李糖脂的发酵生产领域具有重要的推广和应用价值。

Claims (9)

1.一种提取发酵液中鼠李糖脂产物的方法，所述方法包括以下步骤：
1)预处理：加热鼠李糖脂产生菌发酵液、冷却至室温后离心除去不溶物，得上清液；2)絮凝与浓缩：上清液中加入壳聚糖，搅拌混匀，自然沉降后，弃掉上层液相；3)洗脱：蒸馏水清洗去除沉淀物中残余发酵液后，加入NaHCO3溶液，洗脱沉淀物中的鼠李糖脂，收集洗脱液；4)获取：调节洗脱液pH、静置沉淀、离心，获得鼠李糖脂产物。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)的发酵液在80～100℃下，加热处理20～60min；在8,000g～10,000g条件下，离心除去菌体和变性蛋白等不溶物。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中加入壳聚糖至终浓度为5～20g/L，在30～40℃下，絮凝沉降1～2h，然后弃掉上层液相。
4.按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于：选择脱乙酰度≥90％的壳聚糖。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中，对于每5-15克沉淀物，用20～50ml蒸馏水洗涤沉淀物，此洗涤过程共进行1-3次；用20～50ml浓度为1～5g/L的NaHCO3水溶液重悬沉淀物，自然沉降，收集液体作为洗脱液，重复此过程共2-4次，收集洗脱液。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)用浓度1-3mol/L的HCl水溶液调节洗脱液的pH至1.5～2.0；在4～10℃条件下，静置8～12h；在10,000g～12,000g条件下，离心获得鼠李糖脂产物。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
由鼠李糖脂产生菌，利用碳源为葡萄糖、或者蔗糖、或者甘油、或者糖蜜、或者大豆油中一种或二种以上的培养基，发酵得到的含鼠李糖脂的发酵液。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：将产鼠李糖脂菌种的种子液接种至含发酵培养基的培养体系中(如三角瓶或发酵罐等)中，生产鼠李糖脂表面活性剂；种子液与发酵培养基的体积比为2～6:100。
9.按照权利要求7或8所述的方法，其特征在于：发酵培养基按质量分数为：碳源2～5％，NaNO3 0.2～0.4％，KH2PO4 0.1～0.3％，K2HPO4·3H2O 0.1～0.3％，MgSO4·7H2O 0.02～0.06％，酵母粉0.05～0.15％，余量为水；pH 6.5～7.0。
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