CN103937856B - 一种提高井冈霉素产量的发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高井冈霉素产量的发酵方法。该方法采用将孢子悬浮液进行菌种活化与平板培养，制成孢子活化液，再将孢子活化液接种于种子培养基中进行初步培养，得到种子培养液，再将种子培养液接种于发酵培养基中进行发酵培养，并将发酵一定时间的培养液取上清液灭菌后加入发酵培养基中，实现井冈霉素的发酵生产。本发明所述的方法在不加大能耗的前提下，获得了较高的井冈霉素产量，缩短了发酵周期，降低了生产成本，在工业化生产中具有较大的应用价值。

Description

一种提高井冈霉素产量的发酵方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的微生物发酵方法，具体是一种提高井冈霉素产量的发酵方法。

背景技术

井冈霉素又称有效霉素，是一种安全高效的抗真菌抗生素。目前在我国以及东南亚各主要粮食产区，井冈霉素作为一种优质农药在防治水稻、玉米以及小麦纹枯病方面取得了显著的成效。另外，作为合成抗糖尿病临床药物阿卡波糖（拜糖平）和伏格列波糖（倍欣）的重要原料，井冈霉素的发酵生产在医药领域也受到了广泛关注。目前工业化发酵采用的菌株是上海农药所报道的吸水链霉菌5008变种（Streptomyceshygroscopicusvar.jinggangensis5008），尽管自70年代开始该菌株使用已有近40年，但其代谢产物井冈霉素仍是最为有效、应用面积最广的农用抗生素。

微生物的群体感应（Quorumsensing，QS）也称为自诱导，最初是指细菌调节自身菌体密度的一种环境感应系统。通过扩散性信号小分子（又称为自诱导物）与转录活化蛋白的相互作用而打开与细胞群体密度有关的基因表达。这些信号分子从细菌细胞扩散到环境中，一旦达到一个临界浓度（或者说达到某一特定的群体密度），这些信号分子就可诱导调节一系列目标基因的转录，可调节的功能包括抗生素的生物合成、稳定期的进入等。目前，已在许多革兰氏阳性菌和阴性菌中发现群体感应系统可调控许多基因的表达。

经文献查阅发现为提高井冈霉素的产量人们也做了广泛研究，从优良菌种选育、培养及优化到发酵条件控制和产品的分离纯化，都取得了卓越的成果。中国发明申请号200610112671.2（循环发酵生产井冈霉素的方法），公开了一种循环发酵生产井冈霉素的新方法。中国发明申请号201010173832.5（井冈霉素发酵生产方法），公开了一种生物工程技术领域的井冈霉素发酵生产方法，该方法在不加大能耗的前提下，缩短了发酵周期，提高了设备利用率，获得较高的井冈霉素产量。中国发明申请号201110088294.4（一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法），公开了一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法，明确了碳源的品种、补入时机和补入方式，根据碳源不同的补入量，把发酵周期延长，较大幅度地提高井冈霉素的发酵水平。中国发明申请号201310010562.X（一种高效节能的井冈霉素发酵方法），公开了一种高效节能的井冈霉素发酵方法。而这些研究也表明，在现有的高效发酵基础上，再靠这些方面的技术操作来提高井冈霉素产量，其提升空间就比较有限。

前人研究显示，通过向发酵培养基中添加发酵上清液，利用群体感应的方法可提高菌核青霉发酵过程中核丛青霉素的产量。因此，在现有的发酵水平的基础上，控制成本能耗的前提下，若能通过发酵液回添，在发酵过程中提前添加内源群体感应信号分子，刺激细胞之间的感应作用，促进相关基因的表达，从而实现相关次级代谢产物的产量提高，将为提高井冈霉素的产量提供一种新的思路。

参考文献

RainaS,OdellM,KeshavarzT.QuorumsensingasamethodforimprovingsclerotiorinproductioninPenicilliumsclerotiorum[J].Journalofbiotechnology,2010,148(2):91-98。

发明内容

本发明在现有的发酵技术基础上，通过向发酵液中添加前一批发酵上清液，利用群体感应现象，使细胞群体感应分子的数量快速达到启动次级代谢的阈值，提前进入发酵稳定阶段，以提高井冈霉素的发酵效率及产量。该方法在控制能耗的前提下，缩短了发酵周期，提高了设备利用率，获得较高的井冈霉素产量，降低了生产成本，在未来的工业化生产中具有巨大的应用价值。

本发明是通过以下技术方案实现的。

提高井冈霉素产量的发酵方法包括如下步骤：

第一步，将-80℃保存的吸水链霉菌井冈变种5008菌株的孢子悬浮液融化，将其涂布于含有固体产孢培养基的平板上，然后将平板倒置，并于37℃培养5-8d后取平板表面覆盖的孢子，制备孢子活化液；所述的吸水链霉菌井冈变种5008菌株为中国专利公报中公告的授权专利号为ZL2010173832.5的生物材料，所述的吸水链霉菌井冈变种5008菌株，Streptomyceshygroscopicusvar.jinggangensis5008，属于放线菌门、放线菌纲、放线菌目、链霉菌科、链霉菌属，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC4.1026；

第二步，将孢子活化液与种子培养基按照体积比为1：1000的比例接种到种子培养基中，接种后于37℃下培养，培养15-30h；

第三步，将种子培养液与发酵培养基按照体积比为1：10的比例接种到发酵培养基中，接种后于37℃下培养72-120h后发酵结束，将发酵液6000-12000rpm离心10min，并用无菌滤膜过滤得到上清液后，于-20℃保存；

第四步，将种子培养液与发酵培养基按照体积比为1：10的比例接种到发酵培养基中，接种后于37℃下培养5-20h后，在发酵培养基中添加第三步得到的发酵上清液0.01-2.0%，继续培养72-108h后发酵结束。

所述的固体培养基的组分为：黄豆饼粉20g/L、甘露醇20g/L以及琼脂20g/L，余量为自来水。

所述的种子培养基的组分为：玉米粉30g/L、黄豆饼粉22g/L、酵母粉10g/L、NaCl2g/L以及KH₂PO₄0.8g/L，余量为蒸馏水。

所述的发酵培养基的组分为：玉米粉100g/L、黄豆饼粉25g/L、酵母粉5g/L、NaCl1g/L以及KH₂PO₄1.5g/L，余量为去离子水。

本发明利用微生物的群体感应现象，提前向发酵液中添加含群体感应信号分子的发酵上清液，利用群体感应信号分子对其进行刺激，可激活群体感应通路的响应，促进相关基因的表达，使得某些次级代谢物的分泌提前进行，并提高次级代谢物的产量，提高生产效率。本发明确定了发酵上清液的最适添加时间为发酵开始12h，最适添加浓度为0.5%，96h发酵培养后，井冈霉素的绝对积累量从12g/L提高到了16g/L，降低了生产成本。且使发酵96h就达到最高产量，发酵提前24h结束，缩短了发酵周期，取得了更大的生产效率。

附图说明

图1为实施例中发酵上清液的添加时间对井冈霉素发酵产量的动态影响图。

图2为实施例中发酵上清液的添加浓度对井冈霉素发酵产量的动态影响图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

提高井冈霉素产量的发酵方法包括如下步骤：

第一步，将-80℃保存的吸水链霉菌井冈变种5008菌株的孢子悬浮液融化，将其涂布于含有固体培养基的平板上，然后将平板倒置，于37℃培养5-8d，待表面布满青灰色孢子时取出，制备孢子活化液；所述的吸水链霉菌井冈变种5008菌株为中国专利公报中公告的授权专利号为ZL2010173832.5的生物材料，所述的吸水链霉菌井冈变种5008菌株，Streptomyceshygroscopicusvar.jinggangensis5008，属于放线菌门、放线菌纲、放线菌目、链霉菌科、链霉菌属，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC4.1026；

第二步，将孢子活化液与种子培养基按照体积比为1：1000的比例接种到种子培养基中，接种后于37℃下培养，培养15-30h；

第三步，将种子培养液与发酵培养基按照体积比为1：10的比例接种到发酵培养基中，接种后于37℃下培养72-120h后发酵结束，将发酵液6000-12000rpm离心10min，并用无菌滤膜过滤得到上清液后，于-20℃保存；

第四步，将种子培养液与发酵培养基按照体积比为1：10的比例接种到发酵培养基中，接种后于37℃下培养5-20h后，在发酵培养基中添加第三步得到的发酵上清液0.01-2.0%，继续培养到72-108h后发酵结束。

所述的固体培养基的组分为：黄豆饼粉20g/L、甘露醇20g/L以及琼脂20g/L，余量为自来水。

所述的种子培养基的组分为：玉米粉30g/L、黄豆饼粉22g/L、酵母粉10g/L、NaCl2g/L以及KH₂PO₄0.8g/L，余量为蒸馏水。

所述的发酵培养基的组分为：玉米粉100g/L、黄豆饼粉25g/L、酵母粉5g/L、NaCl1g/L以及KH₂PO₄1.5g/L，余量为去离子水。

实施例1

发酵培养基中发酵上清液添加时间对井冈霉素产量的影响考察，选择3个时间段：种子液接种前即0h、发酵开始后12h、发酵开始后24h，分别添加不同浓度的发酵上清液，进行发酵试验。实施步骤和结果如下：

1.实施步骤

（1）菌种活化与平板培养

将配制的固体孢子培养基（成分：黄豆饼粉2g、甘露醇2g、琼脂按2g，自来水100mL）

灭菌，倒平板冷却后待用。将-80℃保存的井冈霉素产生菌吸水链霉菌5008的孢子悬浮液甘油冻存管融化，将其涂布于固体培养基平板上，然后将平板倒置，于37℃培养5-8d后可以看到平板表面形成大量的青色孢子。往孢子长势良好的平板上加入5mL无菌水，用涂布棒轻轻刮动平板表面覆盖的孢子，使其悬浮于无菌水中，制成孢子活化液。

（2）种子培养

将不锈钢弹簧卷曲成环状，置于250mL锥形瓶底部，装入50mL种子培养基（成分：玉米粉3g、黄豆饼粉2.2g、酵母粉1g、NaCl0.2g、KH₂PO₄0.08g、蒸馏水100mL），灭菌。待培养基冷却至室温，吸取孢子活化液50μL加入摇瓶中接种。接种后，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养24h，至少设置3个平行样。

（3）发酵培养

对照组：将不锈钢弹簧卷曲成环状，置于250mL锥形瓶底部，瓶内装入50mL发酵培养基（成分：玉米粉10g、黄豆饼粉2.5g、酵母粉0.5g、NaCl0.1g、KH₂PO₄0.15g、去离子水100mL）。转接时首先将三个平行种子液混合均匀，然后使用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵摇瓶中，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养，至少设置3个平行样。培养进行到24h、48h、72h、96h、120h，每个摇瓶分别取出2mL培养液进行井冈霉素检测。

发酵液添加组：设置了三个发酵上清液添加时间0h、12h、24h，设置相对较宽的添加浓度范围0.01%、0.1%、1.0%。

0h添加组：发酵摇瓶选择放入弹簧的250mL锥形瓶，瓶内装入50mL发酵培养基，灭菌冷却后直接加入不同量的处理好的发酵上清液（0.01%、0.1%、1.0%）。每个剂量组至少3个平行样，然后将9个摇瓶接种种子液。转接时首先将3个平行种子液混合均匀，然后用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵摇瓶中，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养，至少设置3个平行样。培养进行到24h、48h、72h、96h、120h，每个摇瓶分别取出2mL培养液进行井冈霉素检测。

12h添加组：发酵摇瓶选择放入弹簧的250mL锥形瓶，瓶内装入50mL发酵培养基，灭菌。转接时首先将3个平行种子液混合均匀，然后用灭过菌的5mL移液管吸取5mL，种子液转移到发酵摇瓶中，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养。培养进行到12h时，将摇瓶取出，在超净台中加入不同剂量的处理好的发酵上清液（0.01%、0.1%、1.0%），每个剂量组至少设置3个平行样，然后将9个摇瓶放置摇床内按37℃、220rpm继续培养，培养再进行12h即达到24h取样点，依次在24h、48h、72h、96h、120h，每个摇瓶分别取出2mL培养液进行井冈霉素检测。

24h添加组：发酵摇瓶选择放入弹簧的250mL锥形瓶，瓶内装入50mL发酵培养基，灭菌。转接时首先将3个平行种子液混合均匀，然后用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵摇瓶中，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养。培养进行到24h时，将摇瓶取出，在超净台中先取出2mL培养液作为井冈霉素检测样品（24h取样点），然后加入不同剂量的处理好的发酵上清液（0.01%、0.1%、1.0%），每个剂量组至少设置3个平行样，然后将9个摇瓶放置摇床内按37℃、220rpm继续培养，培养再进行24h即达到48h取样点，依次在48h、72h、96h、120h，每个摇瓶分别取出2mL培养液进行井冈霉素检测。

（4）井冈霉素产量检测

样品处理：取2mL发酵液于离心管，10000rpm离心5min，吸取0.5mL上清液于新离心管。加入0.5mL氯仿，剧烈震荡直至形成乳浊液。将乳浊液常温静置15min，12000rpm离心5min。吸取上清液，并稀释5倍到测量范围内，以0.22μm微孔滤膜过滤，作为HPLC上样样品。

井冈霉素标品处理：井冈霉素标准品粉末，配成10g/L（0.1g/10mL）,取100μL、200μL、300μL、400μL、500μL加水至1mL（浓度为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L，乘以标品纯度即为标准品的实际浓度）。

流动相配置：5mmol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液，吸取7.8g/L的NaH₂PO₄·2H₂O溶液51mL，吸取17.9g/L的Na₂HPO₄·12H₂O溶液49mL，用去离子水定容1000mL，调节pH到7.0。流动相抽滤、脱气处理20min。

液相色谱条件：流动相为98%的磷酸盐缓冲液与2%的甲醇；流速为1mL/min；检测波长210nm，使用伊力特HypersilODS25μm、4.6mm×250mm分析柱，柱温为35℃；出峰时间约为8min。根据峰面积对比标准曲线得到井冈霉素含量，因样品处理时均稀释5倍，所以比对得到的含量乘以5得到井冈霉素的发酵产量。

2.实施结果分析

对照组与发酵上清液不同添加时间下井冈霉素的最高产量分别为：对照组12.47g/L；0h添加0.01%发酵上清液组13.24g/L、0h添加0.1%发酵上清液组13.71g/L、0h添加1.0%发酵上清液组14.06g/L，12h添加0.01%发酵上清液组13.59g/L、12h添加0.1%发酵上清液组14.13g/L、12h添加1.0%发酵上清液组15.35g/L，24h添加0.01%发酵上清液组13.08g/L、24h添加0.1%发酵上清液组13.62g/L、24h添加1.0%发酵上清液组13.94g/L。由此可见，在不同的添加浓度下，处理组均在12h添加的井冈霉素产量更高。其中发酵上清液添加量在1.0%时相对于对照组井冈霉素产量有较大提高，所以对其在不同添加时间的动态影响作图（见图1）。由于吸水链霉菌5008在发酵进行到10-12h时处于细胞代谢最旺盛的对数生长期，因此我们分析相对于0h和24h，12h向发酵液中添加上清液对井冈霉素产量提高的影响更明显，与对照组相比可提高23%左右。

实施例2

由实施例1得出，发酵培养基中在12h添加发酵上清液可以促进井冈霉素产量提高，接下来更加详细地比较了不同上清液添加量对井冈霉素产量的影响，先选择3组相对较低添加浓度0.01%、0.05%、0.10%。实施步骤和结果如下：

1.实施步骤

（1）菌种活化与平板培养

同实施例1。

（2）种子培养

同实施例1。

（3）发酵培养

对照组：同实施例1。

发酵液添加组：发酵摇瓶选择放入弹簧的250mL锥形瓶，瓶内装入50mL发酵培养基。转接时首先将三个平行种子液混合均匀，然后用灭过菌的5mL移液管吸取5mL，种子液转移到发酵摇瓶中，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养。培养进行到12h时，将摇瓶取出，在超净台中加入不同剂量的处理好的发酵上清液（0.01%、0.05%、0.1%），每个剂量组至少设置三个平行样，然后将9个摇瓶放置摇床内按37℃、220rpm继续培养，培养再进行12h即达到24h取样点，依次在24h、48h、72h、96h、120h，每个摇瓶分别取出2mL培养液进行井冈霉素检测。

（4）井冈霉素产量检测

同实施例1。

（5）吸水链霉菌5008生物量检测

样品处理：取2mL发酵液于离心管中，10000rpm离心5min，去除上清液，沉淀用作测量。用STE缓冲液悬浮菌体沉淀，离心后去上清反复洗涤两次，用STE缓冲液将沉淀复溶到2mL，分装两个2mL离心管（250μL/管+250μLSTE）。将20μL溶菌酶液(50mg/mL)加入其中的一个离心管，另一管做为对照实验。将加入溶菌酶的离心管与对照离心管一同放入37℃的恒温水浴中反应1h。在反应后的样品中加入10μL10%SDS溶液并充分震荡，使细胞进一步裂解。放置5min，12000rpm离心10min，以浓度为0-100μg/mL的牛血清蛋白制作标准曲线，吸取上清液稀释25倍到测定范围，用考马斯亮蓝G250工作液染色，以Bradford法测定蛋白浓度。其中STE缓冲液组分为：1mol/LTris-HCl（pH8.0）2.5mL、0.5mol/LEDTA0.5mL、5mol/LNaCl5mL定容至250mL。

样品测定：分别取试管，其中一支加入1.0mL空白样，另外一支加入同体积的处理样，加入5mL考马斯亮蓝G250摇匀放置5min，595nm处吸光度，用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清蛋白的mg数，乘以稀释倍数（2×25）得蛋白量表征的生物量。

（6）发酵培养基残糖测定

参考培养基中各组分含糖量数据（玉米粉82.92%，黄豆饼粉24.57%，酵母粉25.89%），计算得出培养基初始糖浓度为90.35g/L。本研究以浓度为0-100mg/L的葡萄糖标准溶液制作标准曲线，采用苯酚-浓硫酸法测定残留可溶性还原糖含量。具体操作：

样品处理：取2mL发酵液加入到离心管中，10000rpm离心5min，吸取上清液。根据样品的发酵时间，72h前样品（包括72h）梯度稀释1000倍，96h后（包括96h）梯度稀释500倍。

标品处理：葡萄糖烘干1d，配制10g/L标品母液，稀释100倍（100mg/L），取200μL、400μL、600μL、800μL、1000μL加水至1mL（浓度：20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L），每个浓度3个平行。样品测定：加入5%苯酚溶液5mL，再与5mL浓H2SO4混合均匀，快速加入，边加边振荡，放置反应10min，冷却后在488nm下检测吸光值。比照标准曲线，分别乘以稀释倍数（1000或500）得残糖量。

2.实施结果分析

发酵液回添量在浓度较低的情况下，井冈霉素产量较对照组有一定的提高，但提高量较低，随着添加浓度的增加，产量提高逐渐增大（见图2）。12h添加0.01%组产量14.57g/L、12h添加0.05%组产量14.85g/L、12h添加0.10%组产量15.16g/L。根据生物量与残糖测定结果得知，在添加不同浓度发酵液情况下，发酵液处理组与对照组生物量与残糖量均没有显著差异，这表明单位细胞井冈霉素的产量有所提高，而并非添加发酵液后使细胞量提升而提高井冈霉素产量。

实施例3

发酵培养基中在12h添加发酵上清液可促进井冈霉素产量提高，接下来更加详细地比较了不同上清液添加量对井冈霉素产量的影响，选择3个相对较高的添加浓度：0.50%、1.0%、1.5%。实施步骤和结果如下：

1.实施步骤

（1）菌种活化与平板培养

同实施例1。

（2）种子培养

同实施例1。

（3）发酵培养

对照组：同实施例1。

发酵液添加组：发酵摇瓶选择放入弹簧的250mL锥形瓶，瓶内装入50mL发酵培养基。转接时首先将三个平行种子液混合均匀，然后用灭过菌的5mL移液管吸取5mL，种子液转移到发酵摇瓶中，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养。培养进行到12h时，将摇瓶取出，在超净台中加入不同剂量的处理好的发酵上清液（0.50%、1.0%、1.5%），每个剂量组至少设置三个平行样，然后将9个摇瓶放置摇床内按37℃、220rpm继续培养，培养再进行12h即达到24h取样点，依次在24h、48h、72h、96h、120h，每个摇瓶分别取出2mL培养液进行井冈霉素检测。

（4）井冈霉素产量检测

同实施例1。

（5）吸水链霉菌5008生物量检测

同实施例2。

（6）发酵培养基残糖测定

同实施例2。

2.实施结果分析

发酵液回添量在0.5%和1.0%时，井冈霉素产量较对照组有较大提高（见图2），0.5%较1.0%提高更大，再加大添加量到1.5%时，产量提高有所下降，因此得出最适添加量为0.5%。最高产量出现在添加0.5%发酵液处理组中，发酵96h时，井冈霉素产量由对照组的12.47g/L提高至16.39g/L，产量提高了31.5%左右。根据对生物量与残糖的测定结果来看，对照组与处理组之间的生物量与残糖量并无明显差异，证明单位细胞的井冈霉素产量有提高。由于细胞感应信号分子浓度达到一定阈值即会产生群体感应现象，信号分子浓度的不断提高并不能持续增加井冈霉素的产量，因此添加发酵上清液最适浓度有一定范围，在实际应用中的添加浓度也应严格控制。

Claims (1)

1.一种提高井冈霉素产量的发酵方法，其特征在于包括如下步骤：

第一步，将-80℃保存的吸水链霉菌井冈变种5008菌株的孢子悬浮液融化，将其涂布于含有固体培养基的平板上，然后将平板倒置，于37℃培养5-8d，待表面布满青灰色孢子时取出，制备孢子活化液；所述的吸水链霉菌井冈变种5008菌株，Streptomyceshygroscopicusvar.jinggangensis5008，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC4.1026；

所述的固体培养基的组分为：黄豆饼粉20g/L、甘露醇20g/L以及琼脂20g/L，余量为自来水;

第二步，将孢子活化液与种子培养基按照体积比为1：1000的比例接种到种子培养基中，接种后于37℃下培养，培养15-30h；所述的种子培养基的组分为：玉米粉30g/L、黄豆饼粉22g/L、酵母粉10g/L、NaCl2g/L以及KH₂PO₄0.8g/L，余量为蒸馏水;

第三步，将种子培养液与发酵培养基按照体积比为1：10的比例接种到发酵培养基中，接种后于37℃下培养72-120h后发酵结束，将发酵液6000-12000rpm离心10min，并用无菌滤膜过滤得到上清液后，于-20℃保存；所述的发酵培养基的组分为：玉米粉100g/L、黄豆饼粉25g/L、酵母粉5g/L、NaCl1g/L以及KH₂PO₄1.5g/L，余量为去离子水;

第四步，将种子培养液与发酵培养基按照体积比为1：10的比例接种到发酵培养基中，接种后于37℃下培养5-20h后，在发酵培养基中添加第三步得到的发酵上清液0.01-2.0%，继续培养到72-108h后发酵结束。