CN106434795B - 一种通过pH冲击来提高井冈霉素产量的方法 - Google Patents

一种通过pH冲击来提高井冈霉素产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种通过pH冲击来提高井冈霉素产量的方法，通过在一定发酵阶段在发酵培养基中添加适量的碱溶液来提高井冈霉素发酵产量。通过在发酵开始20h后向吸水链霉菌5008的发酵培养基中添加2mol/L的NaOH溶液调整发酵液的pH至8.0，其他工艺条件保持一样，利用pH冲击实现井冈霉素发酵产量的提高，使得最终产量达到14.44g/L，比未添加NaOH溶液的对照组发酵产量高27.3％。本发明所述的方法简单易行、能耗少，且获得较高的井冈霉素产量，降低了生产成本，可应用于工业化大规模生产。

Description

一种通过pH冲击来提高井冈霉素产量的方法
技术领域
本发明涉及一种生物化工领域的微生物发酵方法，具体的说，是一种通过pH冲击来提高井冈霉素产量的方法。
背景技术
井冈霉素，又称有效霉素A，是吸水链霉菌井冈变种5008产生的一种次级代谢产物，能有效防治水稻纹枯病等作物真菌性病害，是当今我国使用面积最广和产量最大的农用抗生素。本次所用的菌株是上海农药所报道的吸水链霉菌井冈变种5008菌株(Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis 5008)。井冈霉素有着安全、高效、廉价的优点，而且施用方便，易于推广，使用史至今已有50余年，只有数例病原菌耐药性的报道。此外，井冈霉素还是生产抗糖尿病临床用药阿卡波糖(拜糖平)和伏格列波糖(倍欣)的直接原料。
经过查阅文献发现，近年来，人们对井冈霉素生产的研究在生物活性机制、生物合成途径与生产工艺等方面取得大量进展，但在生产工艺方面的优化主要集中在补糖、加氧、加N+、温度调节等方面，发酵pH是影响发酵过程的一种重要因素。
在发酵过程中，随着发酵的进行，发酵体系的pH逐渐增大，井冈霉素产量也逐渐增多，经过相关性分析发现，pH与井冈霉素生产之间存在一定的关系，随着pH的增加，井冈霉素产量也增加。为此，本发明通过尝试pH冲击来找到提高井冈霉素产量的方法，以有助于降低工业化生产的成本。
发明内容
在现有的发酵技术基础上，本发明的目的在于提供一种基于pH冲击的井冈霉素优化发酵方法，通过向发酵液中添加碱性溶液对细胞进行pH冲击，刺激吸水链霉菌代谢，使其能更快利用营养物质，最终使井冈霉素发酵产量提高。该方法简单易行、能耗少，且获得较高的井冈霉素产量，降低了生产成本，本发明为提高井冈霉素产量提供了一种简单有效的方法，具有良好的工业应用前景。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过在吸水链霉菌井冈变种5008菌株的发酵培养阶段添加碱性溶液进行pH冲击实现井冈霉素产量提高。
本发明的方案具体如下：
一种通过pH冲击来提高井冈霉素产量的方法包括如下步骤：
第一步，将-80℃保存的吸水链霉菌井冈变种5008菌株的孢子悬浮液融化，将其涂布于含有固体培养基的平板上，然后将平板倒置，于37℃培养7-10d，待表面布满青灰色孢子时取出，制备孢子活化液；所述的吸水链霉菌井冈变种5008菌株，Streptomyceshygroscopicus var.Jinggangensis 5008，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC4.1026；
第二步，将孢子活化液与种子培养基按照体积比为1：1000的比例接种到种子培养基中，接种后于37℃，220rpm条件下培养20-28小时；
第三步，将种子培养液与发酵培养基按照体积比为1：10的比例接种到发酵培养基中，接种后以37℃，220rpm条件下培养12-24h后,加入碱溶液直到发酵体系pH达到7.5-8.5，继续发酵96-120h，发酵结束。
优选的，所述的碱溶液不含无机磷酸盐离子。
优选的，所述的碱溶液为KOH溶液、NaOH溶液或NH3·H2O溶液。
优选的，所述的碱溶液的滴加方式为缓慢沿壁逐滴滴加碱溶液，并迅速摇匀。
优选的，所述的碱溶液的浓度为2mol/L。
优选的，所述的步骤三中，,加入碱溶液前的培养时间为20h，加入碱溶液直到发酵体系pH达到8.0。
优选的，所述的固体培养基的组分为：黄豆饼粉20g/L、甘露醇20g/L以及琼脂20g/L，余量为自来水；所述的种子培养基的组分为：玉米粉30g/L、黄豆饼粉22g/L、酵母粉10g/L、NaCl 2g/L以及KH2PO4 0.8g/L，余量为蒸馏水；所述的发酵培养基的组分为：玉米粉100g/L、黄豆饼粉25g/L、酵母粉5g/L、NaCl 1g/L以及KH2PO4 1.5g/L，余量为去离子水。
本发明利用碱性溶液对细胞的pH冲击，使细胞处于一种受胁迫的极端环境，并激活相关应激通路，促进相关基因的表达，刺激吸水链霉菌代谢，使吸水链霉菌加速分解和利用相关的营养物质，最终使井冈霉素发酵产量提高。本发明确定了最佳碱处理溶液为NaOH溶液，最佳碱处理时间为发酵开始20h，井冈霉素的产量从11.34g/L提高到了14.44g/L，降低了生产成本。
附图说明
图1为实施例中不同碱性溶液添加对井冈霉素发酵产量的影响图；
图2为实施例中碱性溶液添加时间对井冈霉素发酵产量的影响图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，但下述的实施例不用来限制本发明的保护范围。
实施例1
发酵培养基中添加碱性溶液进行pH冲击对井冈霉素产量的影响，选择三种碱性溶液：NaOH溶液、NH3·H2O溶液、带有磷酸盐缓冲液的KOH溶液，分别调整发酵液pH至8.0进行发酵实验。实施步骤和结果如下：
1.实施步骤
(1)菌种活化与平板培养
将保存于-80℃冰箱的甘油冻藏管取出，待其融化后，在超净工作台中用接种环取一环孢子液在灭菌后的产孢平板培养基(成分：黄豆饼粉2g、甘露醇2g，琼脂2g，自来水100mL)上划线接种。接种后将平板倒置培养于37℃恒温培养箱中7-10天后，观察到培养基表面长满了青色孢子，向平板中加入8mL左右25％甘油，用接种环将孢子刮下，使其悬浮于甘油中，将孢子悬浮液转移至灭菌后的2mL离心管中，置于-20℃保存，用于菌种活化及发酵接种。
(2)种子培养
将不锈钢弹簧卷曲后置于250mL三角瓶底部，装入50mL种子培养基(成分：玉米粉3g、黄豆饼粉2.2g、酵母粉1g、NaCl 0.2g，以及KH2PO4 0.08g，蒸馏水100mL)，灭菌。在超净工作台中，吸取0.1mL(1)中所制备的孢子悬浮液接种到已灭菌的种子培养基中，再将种子培养基置于恒温摇床中，在37℃，220rpm条件下培养20-28小时，每次准备3个平行。
(3)发酵培养
对照组：不锈钢弹簧卷曲后置于250mL三角瓶底部，装入50mL发酵培养基(成分：玉米粉10g、黄豆饼粉2.5g、酵母粉0.5g、NaCl 0.1g，以及KH2PO4 0.15g，去离子水100mL)，灭菌。转接时首先将三个平行种子液混和均匀，然后用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵培养基中，再将发酵培养基置于恒温摇床中，在37℃，220rpm条件下培养，准备3个平行。培养进行到24h、48h、72h、96h、120h，每个瓶分别取2mL发酵液进行井冈霉素检测。
NaOH溶液处理组：不锈钢弹簧卷曲后置于250mL三角瓶底部，装入50mL发酵培养基，灭菌。转接时首先将三个平行种子液混和均匀，然后用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵培养基中，再将发酵培养基置于恒温摇床中，以37℃，220rpm培养，准备4个平行。培养进行到24h时，取出一个摇瓶，缓慢沿壁滴加2mol/L NaOH溶液，迅速摇匀，用pH计测发酵液pH，至pH调整为8.0，记录加入NaOH溶液的剂量。将其他三组平行摇瓶取出置于超净台中，沿壁添加相同剂量的NaOH溶液，迅速摇匀，然后将三个平行放置于恒温摇床中，以37℃，220rpm继续培养。培养进行到48h、72h、96h、120h，每个瓶分别取2mL发酵液进行井冈霉素检测。
NH3·H2O溶液处理组：不锈钢弹簧卷曲后置于250mL三角瓶底部，装入50mL发酵培养基灭菌。转接时首先将三个平行种子液混和均匀，然后用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵培养基中，再将发酵培养基置于恒温摇床中，以37℃，220rpm培养，准备4个平行。培养进行到24h时，取出一个摇瓶，缓慢沿壁滴加2mol/L NH3·H2O溶液,迅速摇匀，用pH计测发酵液pH，至pH调整为8.0，记录加入NH3·H2O溶液的剂量。将其他三组平行摇瓶取出置于超净台中，沿壁添加相同剂量的NH3·H2O溶液，迅速摇匀，然后将三个平行放置于恒温摇床中，以37℃，220rpm继续培养。培养进行到48h、72h、96h、120h，每个瓶分别取2mL发酵液进行井冈霉素检测。
磷酸盐缓冲液处理组：不锈钢弹簧卷曲后置于250mL三角瓶底部，装入50mL发酵培养基灭菌。转接时首先将三个平行种子液混和均匀，然后用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵培养基中，再将发酵培养基置于恒温摇床中，以37℃，220rpm培养，准备4个平行。培养进行到24h时，取出一个摇瓶，缓慢沿壁滴加2mol/L KOH溶液,迅速摇匀，用pH计测发酵液pH，至pH调整为8.0，记录加入KOH溶液的剂量。将其他三组平行摇瓶取出置于超净台中，沿壁添加相同剂量的KOH溶液，迅速摇匀，然后将三个平行放置于恒温摇床中，以37℃，220rpm继续培养。培养进行到48h、72h、96h、120h，每个瓶分别取2mL发酵液进行井冈霉素检测。
(4)井冈霉素产量检测
样品处理：取2mL发酵液置于2mL离心管中，于10000g离心5min，吸取0.5mL上清液于新离心管中，再加入0.5mL氯仿，剧烈震荡至溶液形成乳浊液。室温静置15min后，12000g离心5min。小心吸取上清液，适当稀释至测量范围以内，以0.22μm的水系微孔滤膜过滤，作为HPLC上样样品。
井冈霉素标品处理：称取井冈霉素标准品粉末，配成10g/L母液，分别取100μL、200μL、300μL、400μL、500μL母液加水至l mL(浓度分别为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L，再乘以井冈霉素标品的纯度即为实际浓度)。
流动相处理：各流动相(超纯水、甲醇、磷酸盐缓冲液)分别进行抽滤并脱气处理30min。
液相色谱条件：以98％的磷酸盐缓冲液与2％的甲醇为流动相；流速l mL/min；检测波长210nm，使用Promosil C18色谱柱4.6mm×250mm/5μm，柱温为35℃；出峰时间约为7-9min。根据峰面积对比标准曲线得到井冈霉素含量，因样品处理时均稀释过，所以比对得到的含量乘以稀释倍数就得到井冈霉素的发酵产量。
2.实施结果分析
对照组与碱溶液添加组三种不同碱性溶液处理下井冈霉素最高产量为：对照组11.34g/L；带磷酸盐缓冲液的氢氧化钾处理组9.52g/L，氢氧化钠处理组13.21g/L，氨水处理组12.61g/L。在氢氧化钠和氨水的两个处理组，井冈霉素的产量与对照组相比均有增加(图1)，氢氧化钠处理组井冈霉素的产量有较大提高。经查阅文献知，过多的无机磷酸盐会阻碍次级代谢产物的产生，因此有磷酸盐缓冲液处理组反而比对照组井冈霉素的产量要低。因此我们又对对照作了改变，以磷酸盐缓冲液作为对照，以带磷酸盐缓冲液的氢氧化钾溶液处理作为试验组，结果发现井冈霉素产量相比于对照组也有很明显的增加(数据没有显示)。由此可见，碱性溶液处理可以提高井冈霉素的产量。由于吸水链霉菌5008在发酵的12-24h是代谢较为旺盛的对数生长期，所以在本实施例中我们选择24h作为碱性溶液处理的时间点。
进一步的实验表明，将终点PH调整在7.5-8.5的范围内，碱性溶液处理组与对照组相比，均可明显提高井冈霉素的最高产量。
实施例2
由实施例一可知，发酵培养基中添加NaOH溶液可促进井冈霉素产量提高且效果最好，接下来详细比较不同发酵阶段添加NaOH溶液进行pH冲击对井冈霉素产量的影响，选择6个时间点：发酵开始后4h，8h，12h，16h，20h，24h，分别调整发酵液pH至8.0进行发酵实验。实施步骤和结果如下：
1.实施步骤
(1)菌种活化与平板培养
同实施例1
(2)种子培养
同实施例1
(3)发酵培养
对照组：不锈钢弹簧卷曲后置于250mL三角瓶底部，装入50mL发酵培养基(成分：玉米粉10g、黄豆饼粉2.5g、酵母粉0.5g、NaCl 0.1g，以及KH2PO4 0.15g，去离子水100mL)，灭菌。转接时首先将三个平行种子液混和均匀，然后用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵培养基中，再将发酵培养基置于恒温摇床中，以37℃，220rpm培养，准备3个平行。培养进行到24h、48h、72h、96h、120h，每个瓶分别取2mL发酵液进行井冈霉素检测。
不同时间点处理组：不锈钢弹簧卷曲后置于250mL三角瓶底部，装入50mL发酵培养基灭菌。转接时首先将三个平行种子液混和均匀，然后用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵培养基中，再将发酵培养基置于恒温摇床中，以37℃，220rpm培养，每个时间点处理组4个平行。培养分别进行到4h、8h、12h、16h、20h、24h时，取出相应时间点处理组4个平行中的一个摇瓶，缓慢沿壁滴加2mol/L NaOH溶液,迅速摇匀，用pH计测发酵液pH，至pH调整为8.0，记录加入NaOH溶液的剂量。将其他三个平行摇瓶取出置于超净台中，沿壁添加相同剂量的NaOH溶液，迅速摇匀，然后将三个平行放置于恒温摇床中，以37℃，220rpm继续培养。培养进行到24h、48h、72h、96h、120h，每个瓶分别取2mL发酵液进行井冈霉素检测。
(4)井冈霉素产量检测
同实施例1
2.实施结果分析
对照组与不同时间点氢氧化钠处理组井冈霉素最高产量为：对照组11.34g/L；4h添加氢氧化钠处理组10.06g/L，8h添加氢氧化钠处理组12.47g/L，12h添加氢氧化钠处理组12.92g/L，16h添加氢氧化钠处理组12.76g/L，20h添加氢氧化钠处理组14.44g/L，24h添加氢氧化钠处理组13.21g/L。在4h-24h间不同时间点添加氢氧化钠溶液，使得井冈霉素产量有一定的增加，随着时间点的推迟，井冈霉素产量越来越高，在20h添加氢氧化钠溶液时井冈霉素产量达到最高(图2)。经试验结果分析发现，在发酵初期添加氢氧化钠溶液，此时细胞还在刚开始生长的阶段，碱性溶液的刺激在一定程度上阻碍的细胞的生长，所以发酵初期添加氢氧化钠溶液对井冈霉素产量的提高效果不明显甚至降低了井冈霉素的产量。随着发酵的进行，细胞生长基本完成，添加氢氧化钠溶液对细胞生长的影响减小，对代谢的影响增大，刺激次级代谢的进行，从而使井冈霉素的产量提高。
虽然上文中已经用一些说明和具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以作适当修改或者改进，这对本领域技术人员是显而易见的。因此，在不偏离本发明的基础上所作的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种通过pH冲击来提高井冈霉素产量的发酵方法，其特征在于包括如下步骤：
第一步，将-80℃保存的吸水链霉菌井冈变种（Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis）5008菌株的孢子悬浮液融化，将其涂布于含有固体培养基的平板上，然后将平板倒置，于37℃培养7-10 d，待表面长满青灰色孢子时取出，制备孢子活化液；所述的吸水链霉菌井冈变种（Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis）5008菌株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC 4.1026；
第二步，将孢子活化液与种子培养基按照体积比为1：1000的比例接种到种子培养基中，接种后于37℃，220 rpm条件下培养20-28小时，得到种子培养液；
第三步，将种子培养液与发酵培养基按照体积比为1：10的比例接种到发酵培养基中，接种后于37 ℃，220 rpm条件下培养12-24 h后，加入碱溶液直到发酵体系pH达到7.5-8.5，继续发酵96-120 h，发酵结束；所述的碱溶液为NaOH溶液；所述的碱溶液的滴加方式为缓慢沿壁逐滴滴加碱溶液，并迅速摇匀。
2. 根据权利要求1所述的通过pH冲击来提高井冈霉素产量的发酵方法，其特征在于所述的碱溶液的浓度为2 mol/L。
3. 根据权利要求1所述的通过pH冲击来提高井冈霉素产量的发酵方法，其特征在于所述的第三步中，加入碱溶液前的培养时间为20 h，加入碱溶液直到发酵体系pH达到8.0。
4.根据权利要求1所述的通过pH冲击来提高井冈霉素产量的发酵方法，其特征在于所述的固体培养基的组分为：黄豆饼粉20 g/L、甘露醇20 g/L以及琼脂20 g/L，余量为自来水；所述的种子培养基的组分为：玉米粉30 g/L、黄豆饼粉22 g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 2g/L以及KH2PO4 0.8 g/L，余量为蒸馏水；所述的发酵培养基的组分为：玉米粉100 g/L、黄豆饼粉25 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 1 g/L以及KH2PO4 1.5 g/L，余量为去离子水。
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The two-component PhoR-PhoP system controls both primary metabolism and secondary metabolite biosynthesis in Streptomyces lividans;Sola-Landa A 等;《PNAS》;20030502;第100卷(第10期);第6133页左栏第1-2段，第6137页"Discussion"部分 *
井冈霉素发酵过程研究;魏振华;《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20150515(第5期);A006-64，第1-105页 *
井冈霉素的研究进展;徐利剑 等;《中国农学通报》;20150805;第31卷(第22期);第195页第7节，第196页第7.2节 *
流加补氨水代替碳酸钙在井冈霉素生物发酵中的研究;刘义雄 等;《化学与生物工程》;20131125;第30卷(第11期);摘要，第24页第1.3.2节，第26页第3节 *
碱性pH冲击对井冈霉素发酵的影响及其机制探讨;蒋晶;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20170915(第9期);B016-69，第1-88页 *

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