CN104250659A - 一种l-赖氨酸的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及发酵领域，特别涉及一种L-赖氨酸的发酵方法。本发明的发酵方法，包括以下步骤：将赖氨酸摇瓶种子接入赖氨酸一级种子培养基培养成熟后，再接入赖氨酸二级种子培养基培养，待达到赖氨酸二级种子成熟标准后，接入赖氨酸发酵培养基，在流加碳源和氮源的条件下，进行发酵培养至发酵终点；所述赖氨酸一级种子培养基、赖氨酸二级种子培养基和赖氨酸发酵培养基中的氮源为氯化铵，发酵培养过程中流加的氮源为氯化铵溶液。本发明提供的L-赖氨酸的发酵方法够显著提高终点赖氨酸含量、总酸量和糖酸转化率。
Description
技术领域
本发明涉及发酵领域，特别涉及一种L-赖氨酸的发酵方法。
背景技术
L-赖氨酸为碱性必需氨基酸，同时也是人体和动物所不能合成的八种必需氨基酸中最重要的一种，故常称为第一限制性氨基酸。人体必需通过日常饮食和补品获得赖氨酸，但由于食物中赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏，造成赖氨酸缺乏。
L-赖氨酸在医药工业、食品工业、畜牧饲料等领域都有着广泛的应用。在谷类为主的食品中添加一定量的L-赖氨酸，可提高其蛋白质的吸收率和营养价值；在饲料中添加L-赖氨酸能够提高饲料的利用率；在医药工业上，L-赖氨酸一般被用作氨基酸输液，可以作为治疗铅中毒的药物、利尿的辅助治疗剂、血栓预防剂。
赖氨酸多是通过微生物发酵来制备，具体方法为将赖氨酸发酵菌种接种至发酵罐中，并根据发酵罐发酵液的碳源和氮源的残留量，添加碳源和氮源，以发酵产生赖氨酸。
经检索发现，公开号为102533891A的发明专利公开了一种可提高终点赖氨酸含量、单罐供酸量和转化率，即提高赖氨酸产能的方法，所述方法具体包括将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵培养，在发酵培养15小时后，向发酵液中流加营养盐，所述营养盐包括氯化钾、硫酸镁和硫酸锰。
中国专利CN101104863A公开了一种赖氨酸发酵的方法，该方法包括如下步骤：将菌种从斜面试管到大种子瓶培养9-11小时后移到二级种子罐，种量为0.2-0.3％，培养温度为38-40℃，培养时间为15-17小时后移入三级种子罐，种量5-6％，培养9-11小时后移入发酵罐中进行发酵，在发酵罐接种后，连续流加糖、流加有机氮源，种量为14-18％，发酵底糖含量。
但目前赖氨酸制备方法的终点赖氨酸含量、总酸量和糖酸转化率低，生产成本居高不下。因此，需要开发一种新型的赖氨酸的制备方法，以提高赖氨酸的发酵效率，降低赖氨酸的生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种L-赖氨酸的发酵方法。
为达到上述的目的，采用如下的技术方案：一种L-赖氨酸的发酵方法，包括以下步骤：将赖氨酸摇瓶种子接入赖氨酸一级种子培养基培养成熟后，再接入赖氨酸二级种子培养基培养，待达到赖氨酸二级种子成熟标准后，接入赖氨酸发酵培养基，在流加碳源和氮源的条件下，进行发酵培养至发酵终点；所述赖氨酸一级种子培养基、赖氨酸二级种子培养基和赖氨酸发酵培养基中的氮源为氯化铵，发酵培养过程中流加的氮源为氯化铵溶液。
本发明中的赖氨酸摇瓶种子选自产赖氨酸大肠杆菌摇瓶种子、产赖氨酸黄色短杆菌摇瓶种子、产赖氨酸谷氨酸棒杆菌摇瓶种子中的一种或几种。
本发明的中的碳源选用现有技术中的所有碳源，例如木薯液化液、玉米液化液、葡萄糖溶液、蔗糖溶液、果糖溶液。优选的，以葡萄糖溶液作为碳源。更优选的，以质量体积浓度为50-60％葡萄糖溶液作为碳源。
具体的，本发明L-赖氨酸的发酵方法包括以下步骤：
(1)赖氨酸摇瓶种子接入赖氨酸一级种子培养基在一级种子罐中培养，一级种子罐中氯化铵的初始浓度为8-12g/L，当一级种子液中总糖浓度下降至8-15g/L时，停止培养，得成熟赖氨酸一级种子液；
(2)将成熟赖氨酸一级种子液接入赖氨酸二级种子培养基在二级种子罐中培养，二级种子罐中氯化铵的初始浓度为10-15g/L，当二级种子液中还原糖浓度下降至5-8g/L时，停止培养，得成熟赖氨酸二级种子液；
(3)将成熟赖氨酸二级种子液接入赖氨酸发酵培养基中，在流加葡萄糖溶液和氯化铵溶液的条件下，在发酵罐中发酵培养，发酵罐中的氯化铵初始浓度为9-14g/L，培养40-44小时，得L-赖氨酸。
本发明根据发酵后期不产酸或者产酸较慢来判断发酵终点，培养40-44小时可以达到发酵终点，优选培养42小时。
具体的，步骤(3)中流加葡萄糖溶液和氯化铵溶液的方法为：发酵培养过程中每2-4h取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至4-8g/L时，开始流加质量体积比为50-60％葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为4-8g/L，当发酵液中的氨氮浓度下降为1-2g/L时，开始流加质量体积比为25-28％氯化铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为1-2g/L。优选的，流加流加质量体积比为28％的氯化铵溶液。
上述L-赖氨酸的发酵方法中，总糖浓度、还原糖浓度、氨氮浓度的测定为本领域常规的技术手段，本发明对此不作限定。
更具体的，本发明的L-赖氨酸的发酵方法中，步骤(1)赖氨酸摇瓶种子的接种量为赖氨酸一级培养基体积的1-3‰，培养过程中控制溶氧30％-50％。可采用如下的控制手段：温度35-37℃，罐压0.05-0.07Mpa，通风比1:0.4-1:0.6，搅拌300-350rpm，pH6.6-6.8。
对赖氨酸一级种子培养基的灭菌处理可采用本领域常规的技术手段，本发明对此不作限定，例如可通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min。优选的，为了防止在较低pH情况下培养基物料会产生沉淀或不利于发酵的反应，在灭菌前用20％氢氧化钾调pH值为6.0-6.4。
步骤(1)中赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖20-40g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5g/L，氯化铵8-12g/L，酵母浸粉5-10g/L，苏氨酸0.4-0.6g/L，蛋氨酸0.4-0.6g/L，味精7-10g/L，丙酮酸钠0.5-0.8g/L。优选的，赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖35g/L，硫酸镁0.7g/L，磷酸二氢钾0.7g/L，氯化铵11g/L，酵母浸粉7g/L，苏氨酸0.6g/L，蛋氨酸0.46g/L，味精7g/L，丙酮酸钠0.5g/L。
本发明的L-赖氨酸的发酵方法中，步骤(2)成熟赖氨酸一级种子液的接种量为赖氨酸二级培养基体积的2-5％，培养过程中控制溶氧30％-50％。可采用如下的控制手段：温度35-37℃，罐压0.05-0.07Mpa，通风比1:0.4-1:0.6，搅拌300-350rpm，pH6.6-6.8。
对赖氨酸二级种子培养基的灭菌处理可采用本领域常规的技术手段，本发明对此不作限定，例如可通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min。优选的，在灭菌前用氨水调pH值为6.0-6.4。
步骤(2)中赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖60-80g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5g/L，氯化铵10-15g/L，玉米浆水解液1-1.5g/L，毛发水解液1-1.5g/L，甜菜糖蜜10-15ml/L，苏氨酸0.4-0.6g/L，蛋氨酸0.4-0.6g/L。优选的，赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖60g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化铵11g/L，玉米浆水解液1.3g/L，毛发水解液1.3g/L，甜菜糖蜜11ml/L，苏氨酸0.4g/L，蛋氨酸0.4g/L。
本发明的L-赖氨酸的发酵方法中，步骤(3)成熟赖氨酸二级种子液的接种量为赖氨酸发酵培养基体积的10-15％，培养过程中控制溶氧25％-40％。可采用如下的控制手段：温度35-37℃，罐压0.07-0.1Mpa，通风比1:0.3-1:0.5，搅拌350-450rpm，pH6.6-6.8。
对赖氨酸发酵培养基的灭菌处理可采用本领域常规的技术手段，本发明对此不作限定，例如可通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min。优选的，在灭菌前用氨水调pH值为6.0-6.4。
步骤(3)中赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖20-40g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸0.3-0.5ml/L，氯化铵9-14g/L，玉米浆水解液0.5-1g/L，毛发水解液0.5-1g/L，甜菜糖蜜10-15ml/L，甜菜碱0.5-0.8g/L。优选的，赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖30g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸0.3ml/L,氯化铵11g/L，玉米浆水解液1g/L，毛发水解液1g/L，甜菜糖蜜10ml/L，甜菜碱0.6g/L。
本发明提供的L-赖氨酸的发酵方法够显著提高终点赖氨酸含量、总酸量和糖酸转化率。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
在下述实施例和对比例中：
OD值测定：将取样的发酵液稀释25倍，采用7230G可见分光光度计，在波长562nm可见光下测定吸光值。
按照GB/T5009.7-2008的方法测定还原糖的浓度。
按照GB3595-83的方法测定铵根离子的浓度。
按照GB10794-89标准测定发酵液中的赖氨酸浓度(以赖氨酸盐酸盐计)。
总酸量＝(放罐的赖氨酸浓度×放罐体积+中间排料的赖氨酸浓度×排料体积)
总耗糖量＝种子罐用糖重量+发酵罐用糖重量，其中发酵罐用糖重量包括，发酵培养基中添加的糖和发酵过程中流加的糖。
糖酸转化率(％)＝总酸量/总耗糖量×100％。
实施例1
本实施例中L-赖氨酸的发酵方法包括赖氨酸一级种子培养、赖氨酸二级种子培养和赖氨酸发酵培养三个步骤。每个步骤的具体操作如下：
1、赖氨酸一级种子培养
配制赖氨酸一级种子培养基。本实施例中赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，氯化铵9g/L，酵母浸粉5g/L，苏氨酸0.5g/L，蛋氨酸0.5g/L，味精7g/L，丙酮酸钠0.5g/L。
将配制好的赖氨酸一级种子培养基，用20％(体积比)氢氧化钾溶液调节pH值为6.0，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至36℃并维持恒定。开搅拌300rpm，按照通风比1：0.4通入无菌空气，调节罐压为0.05Mpa，并用氨水调节pH至6.7并维持恒定，校溶氧100％。
将产赖氨酸大肠杆菌摇瓶种子按赖氨酸一级种子培养基体积的1‰接到赖氨酸一级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧30-50％，培养10h后，每隔2h取样镜检并测总糖，当镜检菌体形态正常且总糖下降至10g/L时停止培养，得到赖氨酸成熟一级种子液。
2、赖氨酸二级种子培养
配制赖氨酸二级种子培养基。本实施例中赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖70g/L，硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化铵10g/L，玉米浆水解液1g/L，毛发水解液1g/L，甜菜糖蜜10ml/L，苏氨酸0.4g/L，蛋氨酸0.4g/L。
将配制好的赖氨酸二级种子培养基，用氨水调节其pH值为6.2，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅拌300rpm，按照通风比1：0.4通入无菌空气，调节罐压为0.05Mpa，用氨水调节pH值为6.6并维持恒定，校溶氧100％。将步骤(1)得到的成熟赖氨酸一级种子液按赖氨酸二级种子培养基体积的2％接到赖氨酸二级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧30-50％，培养10h后，每隔2h取样镜检并测还原糖，当镜检菌体形态正常且还原糖下降至8g/L时停止培养，得到赖氨酸成熟二级种子液。
3、赖氨酸发酵培养
配制赖氨酸发酵培养基。本实施例中赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸0.3/L,氯化铵9g/L，玉米浆水解液0.5g/L，毛发水解液0.5g/L，甜菜糖蜜10ml/L，甜菜碱0.5g/L。
将配制好的赖氨酸发酵培养基，用20％氢氧化钾调节其pH指为5.6，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至36℃并维持恒定。开搅拌400rpm，按照通风比1：0.3通入无菌空气，调节罐压为0.07Mpa，用氨水调节pH值为6.7并维持恒定，校溶氧100％。将步骤(2)得到的成熟赖氨酸二级种子液按赖氨酸发酵培养基体积的10％接到赖氨酸发酵培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧25-40％。
培养过程中每2h取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至4g/L时，开始流加60％(m/v)葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为4g/L左右，当发酵液中的氨氮浓度下降至1g/L时，开始流加28％(m/v)氯化铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为1g/L左右。赖氨酸发酵培养42h放罐时，测放罐赖氨酸含量和中间排料的赖氨酸含量，计算总酸量、总糖量和糖酸转化率见表1。
实施例2
本实施例中L-赖氨酸的发酵方法包括赖氨酸一级种子培养、赖氨酸二级种子培养和赖氨酸发酵培养三个步骤。每个步骤的具体操作如下：
1、赖氨酸一级种子培养
配制赖氨酸一级种子培养基。本实施例中赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖40g/L，硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，氯化铵10g/L，酵母浸粉8g/L，苏氨酸0.4g/L，蛋氨酸0.4g/L，味精9g/L，丙酮酸钠0.6g/L。
将配制好的赖氨酸一级种子培养基，用20％氢氧化钾调pH6.0，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅拌350rpm，按照通风比1：0.5通入无菌空气，调节罐压为0.05Mpa，并用氨水调节pH至6.7并维持恒定，校溶氧100％。
将产赖氨酸谷氨酸棒杆菌摇瓶种子按赖氨酸一级种子培养基体积的2‰接到赖氨酸一级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧30-50％，培养10h后，每隔2h取样镜检并测总糖，当镜检菌体形态正常且总糖下降至12g/L时停止培养，得到赖氨酸成熟一级种子液。
2、赖氨酸二级种子培养
配制赖氨酸二级种子培养基。本实施例中赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖80g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化铵10g/L，玉米浆水解液1.2g/L，毛发水解液1.2g/L，甜菜糖蜜12ml/L，苏氨酸0.5g/L，蛋氨酸0.5g/L。
将配制好的赖氨酸二级种子培养基，用氨水调pH至6.0，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅拌350rpm，按照通风比1：0.5通入无菌空气，调节罐压为0.05Mpa，用氨水调节pH至6.7并维持恒定，校溶氧100％。将步骤(1)得到的成熟赖氨酸一级种子液按赖氨酸二级种子培养基体积的2％接到赖氨酸二级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧30-50％，培养10h后，每隔2h取样镜检并测还原糖，当镜检菌体形态正常且还原糖下降至5g/L时停止培养，得到赖氨酸成熟二级种子液。
3、赖氨酸发酵培养
配制赖氨酸发酵培养基。本实施例中赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖20-40g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸0.3-0.5ml/L,氯化铵9-14g/L，玉米浆水解液0.5-1g/L，毛发水解液0.5-1g/L，甜菜糖蜜10-15ml/L，甜菜碱0.5-0.8g/L。
将配制好的赖氨酸发酵培养基，用20％氢氧化钾调pH至5.6，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅拌400rpm，按照通风比1：0.4通入无菌空气，调节罐压为0.08Mpa，用氨水调节pH至6.7并维持恒定，校溶氧100％。将步骤(2)得到的成熟赖氨酸二级种子液按赖氨酸发酵培养基体积的10％接到赖氨酸发酵培养基中进行培养。
培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧25-40％，培养过程中每4h取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至6g/L时，开始流加60％(m/v)葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为6g/L左右，当发酵液中的氨氮浓度下降至1.5g/L时，开始流加28％(m/v)氯化铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为1.5g/L左右。赖氨酸发酵培养44h放罐时，测放罐赖氨酸含量和中间排料的赖氨酸含量，计算总酸量、总糖量和糖酸转化率见表1。
实施例3
本实施例中L-赖氨酸的发酵方法包括赖氨酸一级种子培养、赖氨酸二级种子培养和赖氨酸发酵培养三个步骤。每个步骤的具体操作如下：
1、赖氨酸一级种子培养
配制赖氨酸一级种子培养基。本实施例中赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖35g/L，硫酸镁0.7g/L，磷酸二氢钾0.7g/L，氯化铵11g/L，酵母浸粉7g/L，苏氨酸0.6g/L，蛋氨酸0.46g/L，味精7g/L，丙酮酸钠0.5g/L。
将配制好的赖氨酸一级种子培养基，用20％氢氧化钾调pH6.3，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅拌300rpm，按照通风比1:0.6通入无菌空气，调节罐压为0.06Mpa，并用氨水调节pH至6.7并维持恒定，校溶氧100％。
将产赖氨酸黄色短杆菌摇瓶种子按赖氨酸一级种子培养基体积的2‰接到赖氨酸一级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧30-50％，培养10h后，每隔2h取样镜检并测总糖，当镜检菌体形态正常且总糖下降至9g/L时停止培养，得到赖氨酸成熟一级种子液。
2、赖氨酸二级种子培养
配制赖氨酸二级种子培养基。本实施例中赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖60g/L，硫酸镁0.5-g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化铵11g/L，玉米浆水解液1.3g/L，毛发水解液1.3g/L，甜菜糖蜜11ml/L，苏氨酸0.4g/L，蛋氨酸0.4g/L。
将配制好的赖氨酸二级种子培养基，用氨水调pH至6.4，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅拌300rpm，按照通风比1:0.4入无菌空气，调节罐压为0.06Mpa，用氨水调节pH至6.7并维持恒定，校溶氧100％。将步骤(1)得到的成熟赖氨酸一级种子液按赖氨酸二级种子培养基体积的2％接到赖氨酸二级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧30-50％，培养10h后，每隔2h取样镜检并测还原糖，当镜检菌体形态正常且还原糖下降至6g/L时停止培养，得到赖氨酸成熟二级种子液。
3、赖氨酸发酵培养
配制赖氨酸发酵培养基。本实施例中赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖30g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸0.3ml/L,氯化铵11g/L，玉米浆水解液1g/L，毛发水解液1g/L，甜菜糖蜜10ml/L，甜菜碱0.6g/L。
将配制好的赖氨酸发酵培养基用20％氢氧化钾调pH至6.0，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅拌350rpm，按照通风比1：0.4通入无菌空气，调节罐压为0.08Mpa，用氨水调节pH至6.7并维持恒定，校溶氧100％。将步骤(2)得到的成熟赖氨酸二级种子液按赖氨酸发酵培养基体积的15％接到赖氨酸发酵培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧25-40％。
培养过程中每2h取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至8g/L时，开始流加60％(m/v)葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为8g/L左右，当发酵液中的氨氮浓度下降至2g/L时，开始流加28％(m/v)氯化铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为2g/L左右。赖氨酸发酵培养42h放罐时，测放罐赖氨酸含量和中间排料的赖氨酸含量，计算总酸量、总糖量和糖酸转化率见表1。
实施例4
本实施例中L-赖氨酸的发酵方法包括赖氨酸一级种子培养、赖氨酸二级种子培养和赖氨酸发酵培养三个步骤。每个步骤的具体操作如下：
1、赖氨酸一级种子培养
配制赖氨酸一级种子培养基。本实施例中赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖20g/L，硫酸镁0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，氯化铵8g/L，酵母浸粉9g/L，苏氨酸0.45g/L，蛋氨酸0.45g/L，味精7.5g/L，丙酮酸钠0.7g/L。
将配制好的赖氨酸一级种子培养基，用20％氢氧化钾调pH6.1，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅拌320rpm，按照通风比1:0.44通入无菌空气，调节罐压为0.05Mpa，并用氨水调节pH至6.7并维持恒定，校溶氧100％。将产赖氨酸大肠杆菌摇瓶种子按赖氨酸一级种子培养基体积的1.2‰接到赖氨酸一级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧30-50％，培养10h后，每隔2h取样镜检并测总糖，当镜检菌体形态正常且总糖下降至10g/L时停止培养，得到赖氨酸成熟一级种子液。
2、赖氨酸二级种子培养
配制赖氨酸二级种子培养基。本实施例中赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖60g/L，硫酸镁0.58g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，氯化铵11g/L，玉米浆水解液1g/L，毛发水解液1g/L，甜菜糖蜜13ml/L，苏氨酸0.4g/L，蛋氨酸0.4g/L。
将配制好的赖氨酸二级种子培养基，灭菌前用氨水调pH至6.1，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅拌350rpm，按照通风比1:0.4入无菌空气，调节罐压为0.05Mpa，用氨水调节pH至6.7并维持恒定，校溶氧100％。将步骤(1)得到的成熟赖氨酸一级种子液按赖氨酸二级种子培养基体积的2％接到赖氨酸二级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧30-50％，培养10h后，每隔2h取样镜检并测还原糖，当镜检菌体形态正常且还原糖下降至5g/L时停止培养，得到赖氨酸成熟二级种子液。
3、赖氨酸发酵培养
配制赖氨酸发酵培养基。本实施例中赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖25g/L，硫酸镁0.55g/L，磷酸0.34ml/L,氯化铵9g/L，玉米浆水解液0.5g/L，毛发水解液0.5g/L，甜菜糖蜜10-ml/L，甜菜碱0.7g/L。
将配制好的赖氨酸发酵培养基，用20％氢氧化钾调pH至5.6，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅450rpm，按照通风比1：0.4通入无菌空气，调节罐压为0.08Mpa，用氨水调节pH至6.7并维持恒定，校溶氧100％。将步骤(2)得到的成熟赖氨酸二级种子液按赖氨酸发酵培养基体积的14％接到赖氨酸发酵培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧25-40％。
培养过程中每3h取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至8g/L时，开始流加50％(m/v)葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为6g/L左右，当发酵液中的氨氮浓度下降至2g/L时，开始流加27％(m/v)氯化铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为1g/L左右。赖氨酸发酵培养43h放罐时，测放罐赖氨酸含量和中间排料的赖氨酸含量，计算总酸量、总糖量和糖酸转化率见表1。
实施例5
本实施例中L-赖氨酸的发酵方法包括赖氨酸一级种子培养、赖氨酸二级种子培养和赖氨酸发酵培养三个步骤。每个步骤的具体操作如下：
1、赖氨酸一级种子培养
配制赖氨酸一级种子培养基。本实施例中赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖20g/L，硫酸镁0.6g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，氯化铵8.5g/L，酵母浸粉6g/L，苏氨酸0.55g/L，蛋氨酸0.55g/L，味精7g/L，丙酮酸钠0.55g/L。
将配制好的赖氨酸一级种子培养基，用20％氢氧化钾调pH6.0，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅拌300rpm，按照通风比1:0.48通入无菌空气，调节罐压为0.05Mpa，并用氨水调节pH至6.7并维持恒定，校溶氧100％。将产赖氨酸大肠杆菌摇瓶种子按赖氨酸一级种子培养基体积的1‰接到赖氨酸一级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧30-50％，培养10h后，每隔2h取样镜检并测总糖，当镜检菌体形态正常且总糖下降至8g/L时停止培养，得到赖氨酸成熟一级种子液。
2、赖氨酸二级种子培养
配制赖氨酸二级种子培养基。本实施例中赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖80g/L，硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，氯化铵15g/L，玉米浆水解液1.5g/L，毛发水解液1.5g/L，甜菜糖蜜15ml/L，苏氨酸0.6g/L，蛋氨酸0.6g/L。
将配制好的赖氨酸二级种子培养基，用氨水调pH至6.0，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅拌350rpm，按照通风比1:0.4入无菌空气，调节罐压为0.05Mpa，用氨水调节pH至6.7并维持恒定，校溶氧100％。将步骤(1)得到的成熟赖氨酸一级种子液按赖氨酸二级种子培养基体积的4％接到赖氨酸二级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧30-50％，培养10h后，每隔2h取样镜检并测还原糖，当镜检菌体形态正常且还原糖下降至8g/L时停止培养，得到赖氨酸成熟二级种子液。
3、赖氨酸发酵培养
配制赖氨酸发酵培养基。本实施例中赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖40g/L，硫酸镁1.5g/L，磷酸0.5ml/L,氯化铵14g/L，玉米浆水解液1g/L，毛发水解液1g/L，甜菜糖蜜15ml/L，甜菜碱0.8g/L。
将配制好的赖氨酸发酵培养基，用20％氢氧化钾调pH至6.0，通水蒸气将培养基升温至121℃，灭菌20min，开循环水降温至37℃并维持恒定。开搅拌450rpm，按照通风比1：0.4通入无菌空气，调节罐压0.08Mpa，用氨水调节pH至6.7并维持恒定，校溶氧100％。将步骤(2)得到的成熟赖氨酸二级种子液按赖氨酸发酵培养基体积的15％接到赖氨酸发酵培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧25-40％。
培养过程中每2h取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至7g/L时，开始流加60％(m/v)葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为7g/L左右，当发酵液中的氨氮浓度下降至2g/L时，开始流加28％(m/v)氯化铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为2g/L左右。赖氨酸发酵培养42h放罐时，测放罐赖氨酸含量和中间排料的赖氨酸含量，计算总酸量、总糖量和糖酸转化率见表1。
对比例1
按照实施例1的方法制备赖氨酸，不同的是，赖氨酸种子罐和发酵罐培养基中的氮源均为硫酸铵，发酵培养过程中流加的氮源为硫酸铵溶液。赖氨酸发酵培养42h放罐时，测放罐赖氨酸含量和中间排料的赖氨酸含量，计算总酸量、总糖量和糖酸转化率见表1。
表1发酵终点的总酸量、总糖量和糖酸转化率
从表1可以看出，采用本发明方法发酵生产赖氨酸，能够显著提高终点赖氨酸含量、总酸量和糖酸转化率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种L-赖氨酸的发酵方法，包括以下步骤：将赖氨酸摇瓶种子接入赖氨酸一级种子培养基培养成熟后，再接入赖氨酸二级种子培养基培养，待达到赖氨酸二级种子成熟标准后，接入赖氨酸发酵培养基，在流加碳源和氮源的条件下，进行发酵培养至发酵终点；所述赖氨酸一级种子培养基、赖氨酸二级种子培养基和赖氨酸发酵培养基中的氮源为氯化铵，发酵培养过程中流加的氮源为氯化铵。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)赖氨酸一级种子培养：赖氨酸摇瓶种子接入赖氨酸一级种子培养基在一级种子罐中培养，一级种子罐中氯化铵的初始浓度为8-12g/L，当一级种子培养基中总糖浓度下降至8-15g/L时，停止培养，得成熟赖氨酸一级种子液；
(2)赖氨酸二级种子培养：将成熟赖氨酸一级种子液接入赖氨酸二级种子培养基在二级种子罐中培养，二级种子罐中氯化铵的初始浓度为10-15g/L，当二级种子培养基中还原糖浓度下降至5-8g/L时，停止培养，得成熟赖氨酸二级种子液；
(3)赖氨酸发酵培养：将成熟赖氨酸二级种子液接入赖氨酸发酵培养基中，在流加葡萄糖溶液和氯化铵溶液的条件下，在发酵罐中发酵培养，发酵罐中的氯化铵初始浓度为9-14g/L，培养40-44小时，得L-赖氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于：赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖20-40g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5g/L，氯化铵8-12g/L，酵母浸粉5-10g/L，苏氨酸0.4-0.6g/L，蛋氨酸0.4-0.6g/L，味精7-10g/L，丙酮酸钠0.5-0.8g/L。
4.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于：赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖60-80g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5g/L，氯化铵10-15g/L，玉米浆水解液1-1.5g/L，毛发水解液1-1.5g/L，甜菜糖蜜10-15ml/L，苏氨酸0.4-0.6g/L，蛋氨酸0.4-0.6g/L。
5.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于：赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖20-40g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸0.3-0.5ml/L,氯化铵9-14g/L，玉米浆水解液0.5-1g/L，毛发水解液0.5-1g/L，甜菜糖蜜10-15ml/L，甜菜碱0.5-0.8g/L。
6.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：步骤(3)流加葡萄糖溶液和氯化铵溶液的方法为：发酵培养过程中每2-4h取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至4-8g/L时，开始流加质量体积浓度为50-60％葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为4-8g/L，当发酵液中的氨氮浓度下降为1-2g/L时，开始流加质量体积浓度为25-28％氯化铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为1-2g/L。
7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：流加质量体积浓度为28％的氯化铵溶液。
8.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：步骤(1)赖氨酸摇瓶种子的接种量为赖氨酸一级培养基体积的1-3‰，培养过程中控制溶氧30％-50％。
9.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：步骤(2)成熟赖氨酸一级种子液的接种量为赖氨酸二级培养基体积的2-5％，培养过程中控制溶氧30％-50％。
10.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：步骤(3)成熟赖氨酸二级种子液的接种量为赖氨酸发酵培养基体积的10-15％，培养过程中控制溶氧25％-40％。
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