CN102399834A - 一种赖氨酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种赖氨酸的制备方法，所述方法包括将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养液中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵培养，其特征在于，所述赖氨酸发酵菌种含有在赖氨酸发酵培养条件下经8-30小时发酵培养的菌种。本发明方法使得转化率和单罐供酸量均有大幅度提高，且可使生产连续进行，提高了生产能力，从而降低了生产成本。

Description

一种赖氨酸的制备方法

技术领域

本发明涉及一种赖氨酸的制备方法。

背景技术

赖氨酸是人和动物营养的八种必需氨基酸之一。它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、促进生长发育均有重要作用。

目前主要用于医药、食品和饲料工业，从消费结构上看，赖氨酸在饲料中的消费占了近90％，而在食品及医药中间体的消费仅占10％。

赖氨酸多是通过微生物发酵来制备的，一般通过将赖氨酸发酵菌种接种至发酵罐中发酵产生赖氨酸。在工业生产中，发酵罐一般包括一个或多个并列的发酵罐，各个发酵罐的赖氨酸发酵菌种均由专门用于菌种培养的种子罐培养得到。但目前赖氨酸的制备方法的转化率和单罐供酸量低，且种子罐一旦染菌，就不能接入发酵罐，生产不能连续进行，影响生产能力。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中赖氨酸的制备方法的转化率和单罐供酸量低，和种子罐染菌后生产不能连续进行的缺陷，提供一种新的赖氨酸的制备方法。

本发明的发明人在研究中意外发现，将在赖氨酸发酵培养条件下经8-30小时发酵培养的赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养液中进行发酵培养，可提高转化率和单罐供酸量，并可避免种子罐染菌后生产不能连续进行。

因此，为了实现上述目的，本发明提供了一种赖氨酸的制备方法，所述方法包括将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养液中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵培养，其特征在于，所述赖氨酸发酵菌种含有在赖氨酸发酵培养条件下经8-30小时发酵培养的菌种。

优选地，所述培养液装载在一组或多组发酵罐中，每组发酵罐包括一个或多个发酵罐，且同一组发酵罐的赖氨酸发酵菌种来源于相同的组。

本发明方法通过将含有在赖氨酸发酵培养条件下经8-30小时发酵培养的赖氨酸发酵菌种接入培养液中进行发酵培养，使得转化率和单罐供酸量均有大幅度提高，且可使生产连续进行，提高了生产能力，从而降低了生产成本。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1是本发明方法的流程示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种赖氨酸的制备方法，该方法包括将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养液中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵培养，赖氨酸发酵菌种含有在赖氨酸发酵培养条件下经8-30小时发酵培养的菌种。

根据本发明，尽管将含有在赖氨酸发酵培养条件下经8-30小时发酵培养的菌种接入培养液中进行发酵培养即可实现本发明的目的，即提高转化率和单罐供酸量，并可使生产连续进行，但为了方便采集菌种且使经发酵培养的菌种得到充分利用，优选情况下，培养液装载在一组或多组发酵罐中，每组发酵罐包括一个或多个发酵罐，且同一组发酵罐的赖氨酸发酵菌种来源于相同的组。如图1所示，2#发酵罐和3#发酵罐为不同组发酵罐，且2#发酵罐和3#发酵罐各自分别包括一个或多个发酵罐。2#发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种为在1#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种和种子罐培养出的菌种，或者2#发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种仅为在1#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种；3#发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种为在2#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种和种子罐培养出的菌种，或者3#发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种为在1#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种、在2#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种和种子罐培养出的菌种(图中未示出)，或者3#发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种仅为在2#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种，或者3#发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种为在1#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种和在2#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种(图中未示出)。

当发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种既含有经8-30小时发酵培养的菌种又含有种子罐培养的菌种时，经8-30小时发酵培养的菌种和种子罐培养的菌种的比例无特殊要求，只要发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种含有经8-30小时发酵培养的菌种即可实现本发明的目的，但本领域技术人员应该理解的是，发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种中含有经8-30小时发酵培养的菌种的比例越高效果越好，即可使发酵罐的单罐供酸量和转化率越高。

当3#发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种既含有1#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种又含有2#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种时，1#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种和2#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种的比例无特殊要求，任意比例都可以实现本发明的目的，且只要经8-30小时发酵培养的菌种的总含量是固定的，1#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种和2#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种的任意比例的效果均相差无几。

为了方便操作且为了降低接种时染菌的风险，更优选情况下，多组发酵罐中的任意一组发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种含有经多组发酵罐中的其他任意一组发酵罐培养8-30小时的菌种。如图1所示，2#发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种为在1#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种和种子罐培养出的菌种，或者2#发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种仅为在1#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种；3#发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种为在2#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种和种子罐培养出的菌种，或者3#发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种仅为在2#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种。

为了进一步提高转化率和单罐供酸量，且为了操作更加方便，并进一步降低接种时染菌的风险，进一步优选情况下，多组发酵罐中的任意一组发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种为经多组发酵罐中的其他任意一组发酵罐培养8-30小时的菌种。如图1所示，2#发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种为在1#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种；3#发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种为在2#发酵罐中经8-30小时发酵培养的菌种。

本领域技术人员应该理解的是，在以上各种实施方式中，均可存在4#发酵罐、5#发酵罐、6#发酵罐等多组发酵罐。且在一组发酵罐包括多个发酵罐时，可以由该组发酵罐中的一个发酵罐提供所述赖氨酸发酵菌种，也可以由该组发酵罐中的多个发酵罐提供所述赖氨酸发酵菌种，只要为经过8-30小时发酵培养得到的菌种即可。

本发明中，以接种后且流加碳源和流加氮源之前发酵罐中的培养液为基准，赖氨酸发酵菌种的接种量为12-18体积％。流加碳源的量使培养液中还原性糖的浓度控制在5-10克/升，流加氮源的量使培养液中氮的浓度控制在0.35-0.8克/升。此处“流加碳源的量使培养液中还原性糖的浓度控制在5-10克/升，流加氮源的量使培养液中氮的浓度控制在0.35-0.8克/升”是指通过控制流加碳源和流加氮源的速度来使在整个发酵培养过程中培养液中还原性糖的浓度维持在5-10克/升，使培养液中氮的浓度维持在0.35-0.8克/升。

本领域技术人员应该理解的是，赖氨酸的发酵培养应该在空气中进行。为了有效利用发酵罐的产能，接种后且流加碳源和流加氮源之前发酵罐中的培养液的体积优选为发酵罐体积的40-60％，随着流加碳源和流加氮源，发酵罐中的培养液的体积逐渐增大，为了保证发酵罐中的空气量，优选为流加碳源和流加氮源至发酵罐体积的70-80％时放料，为了保证放料后发酵罐中的菌种数量，不影响放料后发酵罐中的发酵培养，放料体积优选为放料前发酵罐中培养液体积的5-10％。

本发明的发明人在实验中发现，连续流加比间歇流加的发酵效果好，因此，本发明中的流加优选为连续流加。

本发明中，优选发酵培养45-50小时后放罐。本发明中的放罐是指将发酵罐中的培养液全部从发酵罐中放出，即停止发酵。

本领域技术人员应该理解的是，为了得到纯度较高的赖氨酸产品，本发明方法还包括从放料或放罐的溶液中提取赖氨酸。对于提取赖氨酸的方法无特殊要求，可以采用本领域常用的各种方法，例如，采用连续离子交换分离提取方法，向放料或放罐的溶液中加入大量的浓硫酸调pH至2.0-3.0进行酸化，酸化后经过金属膜或陶瓷膜过滤除去菌体，得到赖氨酸膜滤液即赖氨酸清液，或将酸化后的赖氨酸发酵液经絮凝过滤除菌体后得到赖氨酸清液，除菌体后的赖氨酸清液采用强酸型阳离子交换树脂进行吸附交换，树脂吸附饱和后用稀氨水进行洗脱，洗脱下来的赖氨酸经浓缩、盐酸调节pH值、结晶、固液分离、烘干，得到赖氨酸盐酸盐成品；或者在放料或放罐的溶液中加入酸，使赖氨酸发酵液酸化，经过滤或离心等方法除去菌体。在除去菌体后的赖氨酸清液中加入氢氧化钙调节pH值至8.0-11.5，使赖氨酸清液中的盐、胶体等杂质生成不溶物，经固液分离后得到赖氨酸溶液，将赖氨酸溶液浓缩至每毫升赖氨酸溶液中赖氨酸的含量为0.6-0.8g，再经过过滤可以得到高纯度的赖氨酸溶液，然后经浓缩、盐酸调节pH值、结晶、固液分离、烘干，得到赖氨酸盐酸盐成品。

本发明中，对发酵培养的条件无特殊要求，可以采用本领域常用的条件，优选为：温度为35-38℃，压力为0.05-0.1MPa，pH值为6.7-7.0。

本发明中，对赖氨酸发酵菌种的种类无特殊要求，可以采用本领域常用的菌种，优选为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和黄色短杆菌中的至少一种。

本发明中，碳源优选为淀粉质原料糖化清液。淀粉质原料糖化清液既可以采用干法制糖工艺制备，也可以采用湿法制糖工艺制备。从工艺简单、设备投资少，生产成本较低的方面考虑，优选通过干法制糖工艺制备。干法制糖工艺是指淀粉质原料不经浸泡直接进行破碎和酶解。

干法制糖工艺可以包括：将淀粉质原料粉碎，将淀粉质原料粉碎后的产物调浆，并加入淀粉酶对淀粉进行第一次水解；对第一次水解产物进行固液分离，并在得到的液相组分中加入糖化酶进行第二次水解，得到淀粉质原料糖化清液。优选地，粉碎使淀粉质原料过30目筛的通过率大于75％，更优选过30目筛的通过率为100％。调浆的方法为本领域技术人员所熟知，但优选地，调浆的方法可以包括将淀粉质原料粉碎后的产物加入到水中混合均匀，水的加入量使得到的浆液的波美度可以为9-17Bé°。术语“波美度”是表示溶液浓度的一种方法，是通过波美比重计检测溶液得到的度数。

根据本发明，在第一次水解中，以每克粉碎后的产物的干重计，淀粉酶的用量可以为10-30酶活力单位，酶解的温度可以为88-92℃，酶解的时间可以为90-120分钟，酶解的pH值可以为5.5-6.0。固液分离的条件没有特别的限定，优选地，固液分离的条件使得到的液相组分中的固含量为19-22重量％，更优选为20-21重量％。

根据本发明，在第二次水解中，以每克液相组分计，糖化酶的用量可以为110-130酶活力单位，酶解的温度可以为55-65℃，酶解的时间可以为420-600分钟，酶解的pH值可以为4.0-4.5。

本发明酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原性糖所需的酶量为一个酶活力单位。

淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶。

α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。

β-淀粉酶又称淀粉1，4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1，4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。

根据本发明，优选使用α-淀粉酶。

根据本发明，糖化酶优选为α-1，4-葡萄糖水解酶。

按照本发明，淀粉质原料可以为本领域公知的各种可以用于酶解、发酵制备赖氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或几种。

本发明中，氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，可以为铵盐。当氮源为铵盐时，培养液中氮的浓度以铵根离子的浓度表示，氮的浓度控制在0.35-0.8克/升，则铵根离子的浓度控制在0.5-1.0克/升。

本发明中，培养液的成分无特殊要求，可以采用本领域常用的赖氨酸发酵培养液，例如，培养液可以含有淀粉质原料糖化清液、糖蜜、玉米浆、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、苏氨酸、蛋氨酸和谷氨酸。根据本发明，所述培养液中各组分的含量可以在很大范围内改变，优选情况下，每升培养液中，淀粉质原料糖化清液的含量可以为40-60克，糖蜜的含量可以为30-50克，玉米浆的含量可以为20-40克，硫酸铵的含量可以为20-40克，磷酸氢二钾的含量可以为0.5-1.5克，硫酸镁的含量可以为0.4-0.6克，苏氨酸的含量可以为0.1-0.3克，蛋氨酸的含量可以为0.1-0.3克，谷氨酸的含量可以为0.2-0.4克。

本领域技术人员应该理解的是，赖氨酸发酵菌种在被接种至发酵培养液中之前，采用常规方法将赖氨酸发酵菌种经过种子罐培养，然后再将菌种接入发酵培养液中。在种子罐培养的培养程度可以通过取样显微镜镜检、OD(optical density)值测定对产赖氨酸微生物的生长进行观察，当通过上述方法观察菌体形态正常、测定OD值达到0.75以上时停止培养，然后再将种子罐的种子液接入发酵培养液中。种子罐培养可以采用一级种子罐培养也可以采用二级种子罐培养，一级种子罐培养即将赖氨酸发酵菌种在一个种子罐中一直培养到所需的培养程度；二级种子罐培养即先将赖氨酸发酵菌种在一个种子罐中培养一段时间后再转入另一个种子罐继续培养，培养到所需的培养程度。二级种子罐培养在各个种子罐的培养时间没有具体限定，只要最终能培养到所需的培养程度即可。为了操作方便，本发明的种子罐培养优选采用一级种子罐培养。

由于赖氨酸发酵菌种个体微小，数量不易统计，而种子液的OD值为被测种子液吸收的光密度，可以反映种子液中赖氨酸微生物的数量，因此，本领域中一般均采用OD值来表示种子液中赖氨酸微生物的数量，本发明也沿用本领域的采用OD值来表示种子液中赖氨酸微生物的数量的习惯。且本发明中，OD值用722N可见光分光光度计测定。

种子罐培养基中各组分的含量可以在很大范围内改变，优选情况下，每升培养基中，淀粉质原料糖化清液的含量可以为30-40克，玉米浆(干重为20-50重量％)的含量可以为70-90克，磷酸氢二钾的含量可以为0.5-1.5克，硫酸镁的含量可以为0.4-0.6克，苏氨酸的含量可以为0.1-0.3克，蛋氨酸的含量可以为0.1-0.3克，谷氨酸的含量可以为0.2-0.4克。

本发明中，以接种后且流加碳源和流加氮源之前发酵罐中的培养液为基准，赖氨酸发酵菌种的接种量为12-18体积％。当将种子罐的种子液接入发酵罐时，接种量指的是接入发酵罐的种子液占接种后且流加碳源和流加氮源之前发酵罐中的培养液的12-18体积％；当将经发酵罐发酵培养一定时间的培养液接入其他发酵罐时，接种量指的是接入其他发酵罐的经一定时间发酵培养的培养液占接种后且流加碳源和流加氮源之前其他发酵罐中的培养液的12-18体积％。

根据本发明方法的一种具体实施方式，如图1所示，本发明的方法包括将菌种接入种子罐中培养18-28小时后接种到1#发酵罐中，在流加碳源和流加氮源的条件下进行发酵培养，发酵培养8-30小时后将一部分培养液接入2#发酵罐中，1#发酵罐中的剩余培养液继续进行发酵培养，发酵培养45-50小时后放罐，经1#发酵罐发酵培养8-30小时后的一部分培养液接入2#发酵罐中后，在流加碳源和流加氮源的条件下进行发酵培养，发酵培养8-30小时后将一部分培养液接入3#发酵罐中，2#发酵罐中的剩余培养液继续进行发酵培养，发酵培养45-50小时后放罐，经2#发酵罐发酵培养8-30小时后的一部分培养液接入3#发酵罐中后，在流加碳源和流加氮源的条件下进行发酵培养，本领域技术人员应该理解的是，还可以存在4#发酵罐、5#发酵罐等多组发酵罐，重复上述步骤依次进行下去。

另外，本领域技术人员应该理解的是，接入种子罐进行培养的菌种为经过活化后进行增殖培养后的菌种。活化和增殖培养为本领域的公知常识，在此不再赘述。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

实施例

以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。

在下述实施例和对比例中：

OD值测定：将取样的发酵液进行26倍稀释，采用722N可见光分光光度计，在波长562纳米可见光下测定吸光值。

按照GB/T5009.7-2008的方法测定发酵液中还原性糖的浓度。

按照GB3595-83的方法测定发酵液中铵根离子的浓度。

按照GB10794-89标准检测培养液中的赖氨酸浓度(以赖氨酸盐酸盐计)。

单罐供酸量＝(放罐的赖氨酸浓度×放罐体积+中间放料赖氨酸浓度×中间放料体积)。

转化率(％)＝单罐供酸量/总糖的重量×100％，其中总糖的重量包括种子罐用糖重量和发酵罐用糖重量。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的制备方法。

(1)将收获的100重量份玉米通过机械加工将玉米颗粒粉碎，使玉米粉过30目筛的通过率为80％。

(2)将粉碎后的产物加水调浆至12Bé°，相对于每克粉碎产物的干重，加入20个酶活力单位的淀粉酶(诺维信公司，α-淀粉酶)，在90℃、pH为5.5的条件下酶解100分钟，得到酶解产物。其中，将酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液(固含量为20重量％)；之后加入115个酶活力单位的糖化酶(α-1，4-葡萄糖水解酶，诺维信公司)，在60℃、pH为4.5的条件下酶解420分钟，得到淀粉质原料糖化清液。

(3)使用步骤(2)得到的淀粉质原料糖化清液配制种子罐培养基，具体组成为：相对于每升的培养基，淀粉质原料糖化清液的含量为35克，玉米浆(干重为35重量％)的含量为80克，磷酸氢二钾的含量为1.0克，硫酸镁的含量为0.5克，苏氨酸的含量为0.2克，蛋氨酸的含量为0.2克，谷氨酸的含量为0.3克。将培养基加热到121℃消毒，维持20分钟后降温至37℃并保持恒定。开启搅拌，调节罐压为0.1MPa，按照通风量与培养基1∶0.5体积比通入无菌空气，用氨水调节pH至6.8并保持恒定。然后按照图1所示工艺流程将黄色短杆菌菌种(菌株原种FB42购自江南大学)活化和增殖后接入种子罐中进行培养，培养过程中每隔120分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体形态正常且OD值达到0.8时停止培养。

(4)使用步骤(2)得到的淀粉质原料糖化清液配制发酵培养液，具体组成为：相对于每升的培养液，淀粉质原料糖化清液的含量为50克，糖蜜(产地新疆)的含量为40克，玉米浆(干重为35重量％)的含量为30克，硫酸铵的含量为30克，磷酸氢二钾的含量为1.0克，硫酸镁的含量为0.5克，苏氨酸的含量为0.2克，蛋氨酸的含量为0.2克，谷氨酸的含量为0.3克。培养液加热到121℃消毒30分钟后降温至37℃并保持恒定，用氨水调节pH至6.9。

(5)在1#发酵罐(为1个发酵罐)中装入步骤(4)配制好的培养液，培养液体积为1#发酵罐体积的50％。使用步骤(3)所得的种子液，接入1#发酵罐的培养液中进行发酵培养，以接种后的培养液为基准，步骤(3)所得的种子液的接种量为15体积％。接种后连续流加步骤(2)得到的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加步骤(2)得到的淀粉质原料糖化清液的量使培养液中还原性糖的浓度控制在6-8克/升，流加硫酸铵的量使培养液中铵根离子的浓度控制在0.6-0.8克/升，将罐压控制为0.1MPa，发酵温度控制为37℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养液/分钟，并用液氨调节pH维持在6.9进行发酵培养，流加步骤(2)得到的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的75％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的8％，培养15小时后1#发酵罐中的培养液记为A，将该A培养液一部分取出用作2#发酵罐的赖氨酸发酵菌种，另一部分在1#发酵罐中继续上述连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵以及放料的步骤进行发酵培养，直至发酵培养48小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度(即终点赖氨酸含量，下同)和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

(6)在2#发酵罐(为1个发酵罐)中装入步骤(5)配制好的培养液，培养液体积为2#发酵罐体积的50％。将步骤(5)得到的A培养液一部分接入2#发酵罐的培养液中进行发酵培养，以接种后的培养液为基准，A培养液的接种量为15体积％。接种后连续流加步骤(2)得到的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加步骤(2)得到的淀粉质原料糖化清液的量使培养液中还原性糖的浓度控制在6-8克/升，流加硫酸铵的量使培养液中铵根离子的浓度控制在0.6-0.8克/升，将罐压控制为0.1MPa，发酵温度控制为37℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养液/分钟，并用液氨调节pH维持在6.9进行发酵培养，流加步骤(2)得到的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的75％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的8％。培养15小时后2#发酵罐中的培养液记为B，将该B培养液一部分取出用作3#发酵罐的赖氨酸发酵菌种，另一部分在2#发酵罐中继续上述连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵以及放料的步骤进行发酵培养，直至发酵培养48小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

(7)在3#发酵罐(为1个发酵罐)中装入步骤(4)配制好的培养液，培养液体积为3#发酵罐体积的50％。将步骤(6)得到的B培养液一部分接入3#发酵罐的培养液中进行发酵培养，以接种后的培养液为基准，B培养液的接种量为15体积％。接种后连续流加步骤(2)得到的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加步骤(2)得到的淀粉质原料糖化清液的量使培养液中还原性糖的浓度控制在6-8克/升，流加硫酸铵的量使培养液中铵根离子的浓度控制在0.6-0.8克/升，将罐压控制为0.1MPa，发酵温度控制为37℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养液/分钟，并用液氨调节pH维持在6.9进行发酵培养，流加步骤(2)得到的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的75％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的8％。发酵培养48小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的制备方法。

淀粉质原料糖化清液的制备方法、种子罐培养基配方、发酵罐培养液配方均与实施例1相同。

在种子罐中接入活化和增殖后的黄色短杆菌菌种(菌株原种FB42购自江南大学)进行培养，培养过程中每隔120分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体形态正常且OD值达到0.8时停止培养。

1#发酵罐中的培养液体积为1#发酵罐体积的40％。将种子罐培养后的种子液接入1#发酵罐的培养液中进行发酵培养，以接种后的培养液为基准，种子液的接种量为12体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使培养液中还原性糖的浓度控制在5-7克/升，流加硫酸铵的量使培养液中铵根离子的浓度控制在0.5-0.7克/升，将罐压控制为0.08MPa，发酵温度控制为35℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养液/分钟，并用液氨调节pH维持在6.7进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的70％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的5％，培养8小时后1#发酵罐中的培养液记为A，将该A培养液一部分取出用作2#发酵罐的赖氨酸发酵菌种，另一部分在1#发酵罐中继续上述连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵以及放料的步骤进行发酵培养，直至发酵培养45小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

2#发酵罐中的培养液体积为2#发酵罐体积的40％。将A培养液一部分接入2#发酵罐的培养液中进行发酵培养，以接种后的培养液为基准，A培养液的接种量为12体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使培养液中还原性糖的浓度控制在5-7克/升，流加硫酸铵的量使培养液中铵根离子的浓度控制在0.5-0.7克/升，将罐压控制为0.08MPa，发酵温度控制为35℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养液/分钟，并用液氨调节pH维持在6.7进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的70％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的5％。培养8小时后2#发酵罐中的培养液记为B，将该B培养液一部分取出用作3#发酵罐的赖氨酸发酵菌种，另一部分在2#发酵罐中继续上述连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵以及放料的步骤进行发酵培养，直至发酵培养45小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

3#发酵罐中的培养液体积为3#发酵罐体积的40％。将B培养液一部分接入3#发酵罐的培养液中进行发酵培养，以接种后的培养液为基准，B培养液的接种量为12体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使培养液中还原性糖的浓度控制在5-7克/升，流加硫酸铵的量使培养液中铵根离子的浓度控制在0.5-0.7克/升，将罐压控制为0.08MPa，发酵温度控制为35℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养液/分钟，并用液氨调节pH维持在6.7进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的70％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的5％。发酵培养45小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的制备方法。

淀粉质原料糖化清液的制备方法、种子罐培养基配方、发酵罐培养液配方均与实施例1相同。

在种子罐中接入活化和增殖后的黄色短杆菌菌种(菌株原种FB42购自江南大学)进行培养，培养过程中每隔120分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体形态正常且OD值达到0.8时停止培养。

1#发酵罐中的培养液体积为1#发酵罐体积的60％。将种子罐培养后的种子液接入1#发酵罐的培养液中进行发酵培养，以接种后的培养液为基准，种子液的接种量为18体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使培养液中还原性糖的浓度控制在8-10克/升，流加硫酸铵的量使培养液中铵根离子的浓度控制在0.8-1.0克/升，将罐压控制为0.05MPa，发酵温度控制为38℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养液/分钟，并用液氨调节pH维持在7.0进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的80％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的10％，培养30小时后1#发酵罐中的培养液记为A，将该A培养液一部分取出用作2#发酵罐的赖氨酸发酵菌种，另一部分在1#发酵罐中继续上述连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵以及放料的步骤进行发酵培养，直至发酵培养50小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

2#发酵罐中的培养液体积为2#发酵罐体积的60％。将A培养液一部分接入2#发酵罐的培养液中进行发酵培养，以接种后的培养液为基准，A培养液的接种量为18体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使培养液中还原性糖的浓度控制在8-10克/升，流加硫酸铵的量使培养液中铵根离子的浓度控制在0.8-1.0克/升，将罐压控制为0.05MPa，发酵温度控制为38℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养液/分钟，并用液氨调节pH维持在7.0进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的80％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的10％。培养30小时后2#发酵罐中的培养液记为B，将该B培养液一部分取出用作3#发酵罐的赖氨酸发酵菌种，另一部分在2#发酵罐中继续上述连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵以及放料的步骤进行发酵培养，直至发酵培养50小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

3#发酵罐中的培养液体积为3#发酵罐体积的60％。将B培养液一部分接入3#发酵罐的培养液中进行发酵培养，以接种后的培养液为基准，B培养液的接种量为18体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使培养液中还原性糖的浓度控制在8-10克/升，流加硫酸铵的量使培养液中铵根离子的浓度控制在0.8-1.0克/升，将罐压控制为0.05MPa，发酵温度控制为38℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养液/分钟，并用液氨调节pH维持在7.0进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的80％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的10％。发酵培养50小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的制备方法。

淀粉质原料糖化清液的制备方法、种子罐培养基配方、发酵罐培养液配方均与实施例1相同。

在种子罐中接入活化和增殖后的黄色短杆菌菌种(菌株原种FB42购自江南大学)进行培养，培养过程中每隔120分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体形态正常且OD值达到0.8时停止培养。

1#发酵罐中的培养液体积为1#发酵罐体积的40％。将种子罐培养后的种子液接入1#发酵罐的培养液中进行发酵培养，以接种后的培养液为基准，种子液的接种量为12体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使培养液中还原性糖的浓度控制在5-7克/升，流加硫酸铵的量使培养液中铵根离子的浓度控制在0.5-0.7克/升，将罐压控制为0.08MPa，发酵温度控制为35℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养液/分钟，并用液氨调节pH维持在6.7进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的70％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的5％，培养8小时后1#发酵罐中的培养液记为A，将该A培养液一部分取出用作2#发酵罐的赖氨酸发酵菌种，另一部分在1#发酵罐中继续上述连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵以及放料的步骤进行发酵培养，再培养8小时(即培养16小时)后1#发酵罐中的培养液记为A1，将该A1培养液一部分取出用作3#发酵罐的赖氨酸发酵菌种，另一部分在1#发酵罐中继续上述连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵以及放料的步骤进行发酵培养，直至发酵培养45小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

2#发酵罐中的培养液体积为2#发酵罐体积的40％。将A培养液一部分接入2#发酵罐的培养液中进行发酵培养，以接种后的培养液为基准，A培养液的接种量为12体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使培养液中还原性糖的浓度控制在5-7克/升，流加硫酸铵的量使培养液中铵根离子的浓度控制在0.5-0.7克/升，将罐压控制为0.08MPa，发酵温度控制为35℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养液/分钟，并用液氨调节pH维持在6.7进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的70％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的5％。培养8小时后2#发酵罐中的培养液记为B，将该B培养液一部分取出用作3#发酵罐的赖氨酸发酵菌种，另一部分在2#发酵罐中继续上述连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵以及放料的步骤进行发酵培养，直至发酵培养45小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

3#发酵罐中的培养液体积为3#发酵罐体积的40％。将A1培养液一部分和B培养液一部分接入3#发酵罐的培养液中进行发酵培养，A1培养液一部分和B培养液一部分的体积比为1∶1，以接种后的培养液为基准，A1培养液和B培养液的总的接种量为12体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使培养液中还原性糖的浓度控制在5-7克/升，流加硫酸铵的量使培养液中铵根离子的浓度控制在0.5-0.7克/升，将罐压控制为0.08MPa，发酵温度控制为35℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养液/分钟，并用液氨调节pH维持在6.7进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的70％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的5％。发酵培养45小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的制备方法。

淀粉质原料糖化清液的制备方法、种子罐培养基配方、发酵罐培养液配方均与实施例1相同。

在种子罐中接入活化和增殖后的黄色短杆菌菌种(菌株原种FB42购自江南大学)进行培养，培养过程中每隔120分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体形态正常且OD值达到0.8时停止培养。

1#发酵罐中的培养液体积为1#发酵罐体积的50％。将种子罐培养后的种子液接入1#发酵罐的培养液中进行发酵培养，以接种后的培养液为基准，种子液的接种量为15体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使培养液中还原性糖的浓度控制在6-8克/升，流加硫酸铵的量使培养液中铵根离子的浓度控制在0.6-0.8克/升，将罐压控制为0.1MPa，发酵温度控制为37℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养液/分钟，并用液氨调节pH维持在6.9进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的75％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的8％，培养15小时后1#发酵罐中的培养液记为A，将该A培养液一部分取出用作2#发酵罐的赖氨酸发酵菌种，另一部分在1#发酵罐中继续上述连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵以及放料的步骤进行发酵培养，直至发酵培养48小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

2#发酵罐中的培养液体积为2#发酵罐体积的50％。将A培养液一部分接入2#发酵罐的培养液中进行发酵培养，以接种后的培养液为基准，A培养液的接种量为15体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使培养液中还原性糖的浓度控制在6-8克/升，流加硫酸铵的量使培养液中铵根离子的浓度控制在0.6-0.8克/升，将罐压控制为0.1MPa，发酵温度控制为37℃，通气量为0.7立方米空气/立方米的培养液/分钟，并用液氨调节pH维持在6.9进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的75％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的8％。发酵培养48小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

对比例1

按照实施例5的方法制备赖氨酸，不同的是，将在1#发酵罐中发酵培养5小时后的培养液记为A，将该A培养液一部分取出用作2#发酵罐的赖氨酸发酵菌种接入2#发酵罐中。分别测定1#发酵罐和2#发酵罐的放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，分别计算1#发酵罐和2#发酵罐的单罐供酸量和转化率见表1。

对比例2

按照实施例5的方法制备赖氨酸，不同的是，将在1#发酵罐中发酵培养40小时后的培养液记为A，将该A培养液一部分取出用作2#发酵罐的赖氨酸发酵菌种接入2#发酵罐中。分别测定1#发酵罐和2#发酵罐的放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，分别计算1#发酵罐和2#发酵罐的单罐供酸量和转化率见表1。

对比例3

按照实施例5的方法制备赖氨酸，不同的是，仅有1#发酵罐，没有2#发酵罐，1#发酵罐发酵培养48小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

表1

将实施例5中的2#发酵罐分别与对比例1和对比例2中的2#发酵罐进行比较可以看出，接入2#发酵罐中的赖氨酸发酵菌种在1#发酵罐中的发酵培养时间过短或过长均不利于2#发酵罐的单罐供酸量和转化率的提高；将实施例5中的2#发酵罐与对比例3中的1#发酵罐进行比较可以看出，采用经8-30小时发酵培养的菌种接入赖氨酸发酵培养液中进行发酵培养虽然对终点赖氨酸含量没有较大影响，但却可明显提高单罐供酸量和转化率。

将实施例5中的2#发酵罐分别与实施例1-3中的3#发酵罐进行比较可以看出，按照本发明方法连续进行多组发酵罐的发酵培养，每组发酵罐的效果相差无几，因此，采用本发明方法可以无限进行下去。

将实施例4中的3#发酵罐分别与实施例1-3中的3#发酵罐进行比较可以看出，3#发酵罐中的赖氨酸发酵菌种来自1#和2#发酵罐与3#发酵罐中的赖氨酸发酵菌种来自2#发酵罐的效果相差无几，说明只要采用经8-30小时发酵培养的菌种接入赖氨酸发酵培养液中进行发酵培养即可实现本发明的目的。

本发明方法发酵得到的赖氨酸的终点赖氨酸含量略有提高，单罐供酸量和转化率则有大幅度提高。终点赖氨酸含量表明发酵结束时单位体积发酵液内产生的赖氨酸(以赖氨酸盐酸盐计)的量，是衡量单位体积发酵液中所含赖氨酸量的指标。发酵相同时间放罐，终点赖氨酸含量高，则说明发酵产酸速率高。单罐供酸量是衡量罐批之间赖氨酸生产总量的指标。转化率是衡量单罐耗糖与供酸的关系，即供给与产出的关系，转化率高说明生产成本降低。由此可见，本发明的方法通过将在赖氨酸发酵培养条件下经8-30小时发酵培养的菌种接入赖氨酸发酵培养液中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵培养，虽然对发酵产酸速率没有明显影响，但却可以大幅度提高赖氨酸的生产总量，并可以极大地降低生产成本。

Claims (14)

1.一种赖氨酸的制备方法，所述方法包括将赖氨酸发酵菌种接入赖氨酸发酵培养液中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵培养，其特征在于，所述赖氨酸发酵菌种含有在赖氨酸发酵培养条件下经8-30小时发酵培养的菌种。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养液装载在一组或多组发酵罐中，每组发酵罐包括一个或多个发酵罐，且同一组发酵罐的赖氨酸发酵菌种来源于相同的组。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述多组发酵罐中的任意一组发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种含有经所述多组发酵罐中的其他任意一组发酵罐培养8-30小时的菌种。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述多组发酵罐中的任意一组发酵罐中接入的赖氨酸发酵菌种为经所述多组发酵罐中的其他任意一组发酵罐培养8-30小时的菌种。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，以接种后且流加碳源和流加氮源之前的培养液为基准，所述赖氨酸发酵菌种的接种量为12-18体积％。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述流加碳源的量使培养液中还原性糖的浓度控制在5-10克/升，所述流加氮源的量使培养液中氮的浓度控制在0.35-0.8克/升。

7.根据权利要求2-6中任意一项所述的方法，其中，接种后且流加碳源和流加氮源之前发酵罐中的培养液的体积为发酵罐体积的40-60％，流加碳源和流加氮源至发酵罐体积的70-80％时放料，放料体积为放料前发酵罐中培养液体积的5-10％。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述流加为连续流加。

9.根据权利要求2-8中任意一项所述的方法，其中，发酵培养45-50小时后放罐。

10.根据权利要求7或9所述的方法，其中，所述方法还包括从所述放料或所述放罐的溶液中提取赖氨酸。

11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中，所述发酵培养的条件为：温度为35-38℃，压力为0.05-0.1MPa，pH值为6.7-7.0。

12.根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中，所述赖氨酸发酵菌种为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和黄色短杆菌中的至少一种。

13.根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其中，所述碳源为淀粉质原料糖化清液。

14.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其中，所述氮源为铵盐。

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