CN110387387A - 一种重组大肠杆菌产l-色氨酸的发酵工艺 - Google Patents

一种重组大肠杆菌产l-色氨酸的发酵工艺 Download PDF

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朱晓雯
王泽建
黎亮
吴杰群
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Abstract

本发明公开了一种重组大肠杆菌产L‑色氨酸的发酵工艺，包括如下步骤：将活化后的重组大肠杆菌菌种进行种子培养得到种子液，将种子液接种至装有初始发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，其中，发酵培养过程中间歇流加乙酸铵和玉米浆液到发酵罐中。本发明发酵工艺中，采用玉米浆和乙酸铵相结合的氮源间歇补加方式使得发酵色氨酸产量提高了35%，提高发酵产物L‑色氨酸的产量。

Description

一种重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺。
背景技术
色氨酸是一种重要的芳香族氨基酸，具有独特的吲哚侧链，含有三种异构体，分别是L-型、D-型、DL-型，较常见且研究最多的是L-色氨酸。L-色氨酸对人类和动物而言属于八大必需氨基酸中的第二必需氨基酸，在神经系统活动中起着重要的调节作用，广泛应用于医药、食品和动物饲料添加剂的制作加工业，主要用于食品添加剂，此外，因其与金属离子可以发生鳌合作用，具有抗氧化活性，可作为食品防腐剂和保鲜剂。所以对于色氨酸产能水平的进一步提升的探索意义重大。
L-色氨酸可通过生物转化、酶法和微生物发酵等途径得到，利用大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌发酵生产是目前使用最多的、综合效益较高的方法。除了菌株的选择，培养基的成分对发酵法生产而言至关重要，培养基的成分及配比合适与否，对微生物的生长，发酵产品的生物合成、提取，甚至最后对成品的产量、质量都会产生相当大的影响。
本发明对重组大肠杆菌发酵产L-色氨酸的发酵工艺基开展了研究，提升了单位菌体L-色氨酸的比合成速率，显著提高了L-色氨酸的产量。
发明内容
本发明的目的在于提高L-色氨酸的产量，提供一种重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，可显著缩短菌体生长延滞期，还能使发酵中后期的菌浓维持在较高的比生长速率，利于色氨酸的合成，提高产量。
为了实现上述目的，本发明提供了一种重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，包括如下步骤：将活化后的重组大肠杆菌菌种进行种子培养得到种子液，将种子液接种至装有初始发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，其中，发酵培养过程中间歇流加乙酸铵和玉米浆液到发酵罐中。
进一步，发酵培养24h时开始流加玉米浆液，发酵培养36h时开始流加所述乙酸铵。
进一步，所述玉米浆液的流加补率为1.5-2.5g/L·h，所述乙酸铵液的流加补率为5.5-6.5g/L·h。
进一步，所述发酵罐在接种种子液前，需要如下准备步骤：向发酵罐中加入初始发酵培养基，装液量为50%，然后温度将至35℃，以500r/min的转速搅拌，同时以3L/min的通气量通入空气，标定此状态下的溶氧为100%；标定饱和亚硫酸钠溶液的溶氧为0%。
进一步，发酵培养过程中，流加消泡剂、调整转速，以控制溶氧在20%以上。
进一步，发酵培养过程中，当溶氧降至最低开始回升时，流加质量浓度为60-70%的葡萄糖，起始流加速度1g/L，溶氧持续回升则增加补糖量，控制残糖浓度在0.005-0.015g/L范围。
进一步，所述种子液的接种量为8%（V/V）。
进一步，所述发酵培养的整个过程中，流加25-28%氨水，自动控制pH值为6.5。
进一步，所述重组大肠杆菌活化的具体方法为：在无菌条件下，将甘油保种管内的重组大肠杆菌菌种接至种子平板活化培养基上，加入浓度为40ppm的四环素，在35-38℃下培养15-17h，得到活化后的重组大肠杆菌。
进一步，所述种子培养的方法为：向容器中加入种子培养基，装液量为20-30%（V/V），加入浓度为40ppm的四环素，接种活化后的重组大肠杆菌，采用6-10层纱布封口，后置巡回式摇床上，以200-250r/min的转速在35-38℃下振荡培养10-12h，得到种子液。
进一步，所述种子平板活化培养基，其成分包括：蛋白胨8-12g/L、酵母提取物4-6g/L、氯化钠8-11g/L、琼脂粉18-22g/L，pH为7.0。
进一步，所述种子培养基，其成分包括：葡萄糖28-32g/L、硫酸铵4-6g/L、磷酸氢二钾22-26g/L、磷酸二氢钾9.3-9.8g/L、酵母提取物14.5-15.5g/L、七水硫酸镁1-1.2g/L，pH为7.0。
进一步，所述初始发酵培养基，其成分包括：葡萄糖4-6g/L、硫酸铵2.0-2.5g/L、磷酸二氢钾10-11g/L、一水柠檬酸2.5-3.0g/L、七水硫酸镁2.6-3.0g/L、酵母提取物1-2g/L，pH为6.5。
进一步，所述初始发酵培养基还添加了微量元素，包括成分：七水合硫酸亚铁8-11g/L、无水亚硫酸钠2-3g/L、一水合硫酸锰0.6-0.65g/L、七水合硫酸锌0.72-0.75g/L、五水硫酸铜0.07-0.09g/L、六水氯化钴0.35-0.45g/L。
本发明中的重组大肠杆菌菌种由浙江工业大学微生物菌种保藏室提供。
本发明的优点在于：
本发明采取中后期间歇流加玉米浆、乙酸铵补入到发酵液中，这种方法不仅能够大大缩短菌体生长的延滞期，还能使发酵中后期的菌浓维持在较高的比生长速率，色氨酸合成速率也得到显著提升，有利于色氨酸的合成，提升了发酵效能。由于乙酸对菌的生长有抑制作用，在中后期流加乙酸铵可避免前期高浓度乙酸的存在而造成菌体延滞期较长的问题；菌体在缓慢利用完基础培养基中葡萄糖后，会启动乙醛酸支路，此时开始消耗发酵液中的乙酸，且大肠杆菌在外源乙酸的存在下会倾向于避免自身乙酸的生成，对发酵后期的产物合成速率的维持有较高的帮助。
通过本发明实验数据可知，单位菌体的色氨酸产量高达282mg/OD，玉米浆和乙酸铵相结合的氮源间歇补加方式使得发酵色氨酸产量提高了35%，糖酸转化率最高达到了14.25%，比对照组（11.26%）提高了27%，采用本发明发酵工艺能够显著提升发酵性能，提高发酵产物L-色氨酸的产量。
附图说明
图1为本发明实施例1与对比例1-3的菌浓参数对比图。
图2为本发明实施例1与对比例1-3的L-色氨酸产量参数对比图。
图3为本发明实施例1与对比例1-3的乙酸含量参数对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，包括如下步骤：将活化后的重组大肠杆菌菌种进行种子培养得到种子液，将种子液接种至装有初始发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，其中，发酵培养过程中间歇流加乙酸铵和玉米浆液到5L发酵罐中；其中，发酵培养24h时开始流加玉米浆液，发酵培养36h时开始流加所述乙酸铵；所述玉米浆液的流加补率为2g/L·h，所述乙酸铵液的流加补率为6g/L·h，流加了7.5g的玉米浆和9.75g的乙酸铵；
所述发酵罐在接种种子液前，需要如下准备步骤：向5L发酵罐中加入初始发酵培养基，装液量为2.5L，然后温度将至35℃，以500r/min的转速搅拌，同时以3L/min的通气量通入空气，标定此状态下的溶氧为100%；标定饱和亚硫酸钠溶液的溶氧为0%；发酵培养过程中，流加消泡剂、调整转速，以控制溶氧在20%以上；发酵培养过程中，当溶氧降至最低开始回升时，流加质量浓度为65%的葡萄糖，起始流加速度1g/L，溶氧持续回升则增加补糖量，控制残糖浓度在0.005-0.015g/L范围；所述种子液的接种量为8%（V/V）；所述发酵培养的整个过程中，流加25%氨水，自动控制pH值为6.5；
所述重组大肠杆菌活化的具体方法为：在无菌条件下，将甘油保种管内的重组大肠杆菌菌种接至种子平板活化培养基上，加入浓度为40ppm的四环素，在37℃下培养16h，得到活化后的重组大肠杆菌；
所述种子培养的方法为：向500毫升圆底三角瓶中加入种子培养基，装液量为100毫升，加入浓度为40ppm的四环素，接种活化后的重组大肠杆菌，采用8层纱布封口，后置巡回式摇床上，以220r/min的转速在35℃下振荡培养12h，得到种子液；
所述种子平板活化培养基，其成分包括：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉20g/L，pH为7.0；
所述种子培养基，其成分包括：葡萄糖30g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾24g/L、磷酸二氢钾9.6g/L、酵母提取物15.2g/L、七水硫酸镁1g/L，pH为7.0；
所述初始发酵培养基，其成分包括：葡萄糖5g/L、硫酸铵2.2g/L、磷酸二氢钾10.5g/L、一水柠檬酸2.8g/L、七水硫酸镁2.8g/L、酵母提取物2g/L，pH为6.5；
所述初始发酵培养基还添加了微量元素，包括成分：七水合硫酸亚铁10g/L、无水亚硫酸钠2.8g/L、一水合硫酸锰0.63g/L、七水合硫酸锌0.74g/L、五水硫酸铜0.08g/L、六水氯化钴0.4g/L。
实施例2
一种重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，包括如下步骤：将活化后的重组大肠杆菌菌种进行种子培养得到种子液，将种子液接种至装有初始发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，其中，发酵培养过程中间歇流加乙酸铵和玉米浆液到5L发酵罐中；其中，发酵培养24h时开始流加玉米浆液，发酵培养36h时开始流加所述乙酸铵；所述玉米浆液的流加补率为2.5g/L·h，所述乙酸铵液的流加补率为5.5g/L·h，流加了7.5g的玉米浆和9.75g的乙酸铵；
所述发酵罐在接种种子液前，需要如下准备步骤：向5L发酵罐中加入初始发酵培养基，装液量为2.5L，然后温度将至35℃，以500r/min的转速搅拌，同时以3L/min的通气量通入空气，标定此状态下的溶氧为100%；标定饱和亚硫酸钠溶液的溶氧为0%；发酵培养过程中，流加消泡剂、调整转速，以控制溶氧在20%以上；发酵培养过程中，当溶氧降至最低开始回升时，流加质量浓度为70%的葡萄糖，起始流加速度1g/L，溶氧持续回升则增加补糖量，控制残糖浓度在0.005g/L范围；所述种子液的接种量为8%（V/V）；所述发酵培养的整个过程中，流加25%氨水，自动控制pH值为6.5；
所述重组大肠杆菌活化的具体方法为：在无菌条件下，将甘油保种管内的重组大肠杆菌菌种接至种子平板活化培养基上，加入浓度为40ppm的四环素，在38℃下培养15h，得到活化后的重组大肠杆菌；
所述种子培养的方法为：向500毫升圆底三角瓶中加入种子培养基，装液量为100毫升，加入浓度为40ppm的四环素，接种活化后的重组大肠杆菌，采用10层纱布封口，后置巡回式摇床上，以200r/min的转速在38℃下振荡培养10h，得到种子液；
所述种子平板活化培养基，其成分包括：蛋白胨12g/L、酵母提取物4g/L、氯化钠11g/L、琼脂粉18g/L，pH为7.0；
所述种子培养基，其成分包括：葡萄糖32g/L、硫酸铵4g/L、磷酸氢二钾26g/L、磷酸二氢钾9.3g/L、酵母提取物15.5g/L、七水硫酸镁1g/L，pH为7.0；
所述初始发酵培养基，其成分包括：葡萄糖6g/L、硫酸铵2.0g/L、磷酸二氢钾11g/L、一水柠檬酸2.5g/L、七水硫酸镁3.0g/L、酵母提取物1g/L，pH为6.5；
所述初始发酵培养基还添加了微量元素，包括成分：七水合硫酸亚铁11g/L、无水亚硫酸钠2g/L、一水合硫酸锰0.65g/L、七水合硫酸锌0.72g/L、五水硫酸铜0.09g/L、六水氯化钴0.35g/L。
实施例3
一种重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，包括如下步骤：将活化后的重组大肠杆菌菌种进行种子培养得到种子液，将种子液接种至装有初始发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，其中，发酵培养过程中间歇流加乙酸铵和玉米浆液到5L发酵罐中；其中，发酵培养24h时开始流加玉米浆液，发酵培养36h时开始流加所述乙酸铵；所述玉米浆液的流加补率为1.5g/L·h，所述乙酸铵液的流加补率为6.5g/L·h，流加了7.5g的玉米浆和9.75g的乙酸铵；
所述发酵罐在接种种子液前，需要如下准备步骤：向5L发酵罐中加入初始发酵培养基，装液量为2.5L，然后温度将至35℃，以500r/min的转速搅拌，同时以3L/min的通气量通入空气，标定此状态下的溶氧为100%；标定饱和亚硫酸钠溶液的溶氧为0%；发酵培养过程中，流加消泡剂、调整转速，以控制溶氧在20%以上；发酵培养过程中，当溶氧降至最低开始回升时，流加质量浓度为60%的葡萄糖，起始流加速度1g/L，溶氧持续回升则增加补糖量，控制残糖浓度在0.015g/L范围；所述种子液的接种量为8%（V/V）；所述发酵培养的整个过程中，流加25%氨水，自动控制pH值为6.5；
所述重组大肠杆菌活化的具体方法为：在无菌条件下，将甘油保种管内的重组大肠杆菌菌种接至种子平板活化培养基上，加入浓度为40ppm的四环素，在35℃下培养17h，得到活化后的重组大肠杆菌；
所述种子培养的方法为：向500毫升圆底三角瓶中加入种子培养基，装液量为100毫升，加入浓度为40ppm的四环素，接种活化后的重组大肠杆菌，采用6层纱布封口，后置巡回式摇床上，以250r/min的转速在35℃下振荡培养12h，得到种子液；
所述种子平板活化培养基，其成分包括：蛋白胨8g/L、酵母提取物6g/L、氯化钠8g/L、琼脂粉22g/L，pH为7.0；
所述种子培养基，其成分包括：葡萄糖28g/L、硫酸铵6g/L、磷酸氢二钾22g/L、磷酸二氢钾9.8g/L、酵母提取物14.5g/L、七水硫酸镁1.2g/L，pH为7.0；
所述初始发酵培养基，其成分包括：葡萄糖4g/L、硫酸铵2.5g/L、磷酸二氢钾10g/L、一水柠檬酸3.0g/L、七水硫酸镁2.6g/L、酵母提取物2g/L，pH为6.5；
所述初始发酵培养基还添加了微量元素，包括成分：七水合硫酸亚铁8g/L、无水亚硫酸钠3g/L、一水合硫酸锰0.6g/L、七水合硫酸锌0.75g/L、五水硫酸铜0.07g/L、六水氯化钴0.45g/L。
对比例1
对比例1与实施例1相比，区别仅在于：对比例1中的发酵过程中不流加乙酸铵和玉米浆液，其他条件完全相同。
对比例2
对比例2与实施例1相比，区别仅在于：对比例2中的发酵过程中不流加乙酸铵和玉米浆液，但其初始发酵培养基中包含乙酸铵3.9g/L、玉米浆3g/L，其他条件完全相同。
对比例3
对比例3与实施例1相比，区别仅在于：实施例1在发酵中后期流加乙酸铵和玉米浆液，而对比例3中仅仅流加乙酸铵，其他条件完全相同。
以本发明中的实施例1和对比例1-3作为实验组进行对比实验，分别观察各个实验组在5L发酵罐中的发酵参数，并记录下来，得到图1-3和表1，如下所示。
表1不同实验组的发酵参数对比
参见图1-3和表1的发酵参数，在中后期流加乙酸铵和玉米浆的发酵工艺，可有效缩短发酵菌体的延滞期，大大改善了由于高浓度乙酸铵的存在使菌延滞期长的问题，同时还有利于色氨酸的合成。
本发明在5L发酵罐上实施了乙酸铵和玉米浆流加控制工艺，发酵培养24h时菌体长起来后开始流加玉米浆，发酵36h时开始流加乙酸铵。根据实验结果可知，本发明的工艺能够大大缩短菌体生长的延滞期，在发酵中后期，依然能够维持较高的比生长速率，色氨酸合成速率也显著提升，玉米浆和乙酸铵相结合的氮源补加方式能促使色氨酸产量提高35%，糖酸转化率最高达到14.25%，比对比例1的糖酸转化率提高了27%，发酵性能的提升效果显著，因此，本发明的发酵工艺是有利于色氨酸的合成的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，其特征在于，包括如下步骤：将活化后的重组大肠杆菌菌种进行种子培养得到种子液，将种子液接种至装有初始发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，其中，发酵培养过程中间歇流加乙酸铵和玉米浆液到发酵罐中。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，其特征在于，在发酵时间为24小时时开始流加玉米浆液，发酵培养36小时时开始流加所述乙酸铵。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述玉米浆液的流加补率为1.5-2.5克/升·小时，所述乙酸铵液的流加补率为5.5-6.5克/升·小时。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述发酵罐在接种种子液前，需要如下准备步骤：向发酵罐中加入初始发酵培养基，装液量为50%，然后温度将至35℃，以500转/分钟的转速搅拌，同时以3升/分钟的通气量通入空气，标定此状态下的溶氧为100%；标定饱和亚硫酸钠溶液的溶氧为0%。
5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，其特征在于，发酵培养过程中，流加消泡剂、调整转速，以控制溶氧在20%以上；当溶氧降至最低开始回升时，流加质量浓度为60-70%的葡萄糖，起始流加速度1克/升，溶氧持续回升则增加补糖量，控制残糖浓度在0.005-0.015克/升范围。
6.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述种子液的接种量为8%。
7.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述发酵培养的整个过程中，流加25-28%氨水，自动控制pH值为6.5。
8.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述重组大肠杆菌活化的具体方法为：在无菌条件下，将甘油保种管内的重组大肠杆菌菌种接至种子平板活化培养基上，加入浓度为40ppm的四环素，在35-38℃下培养15-17小时，得到活化后的重组大肠杆菌；
所述种子培养的方法为：向容器中加入种子培养基，装液量为20-30%，加入浓度为40ppm的四环素，接种活化后的重组大肠杆菌，采用6-10层纱布封口，后置巡回式摇床上，以200-250转/分钟的转速在35-38℃下振荡培养10-12小时，得到种子液。
9.根据权利要求8所述的重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述种子平板活化培养基，其成分包括：蛋白胨8-12克/升、酵母提取物4-6克/升、氯化钠8-11克/升、琼脂粉18-22克/升，pH为7.0；
所述种子培养基，其成分包括：葡萄糖28-32克/升、硫酸铵4-6克/升、磷酸氢二钾22-26克/升、磷酸二氢钾9.3-9.8克/升、酵母提取物14.5-15.5克/升、七水硫酸镁1-1.2克/升，pH为7.0；
所述初始发酵培养基，其成分包括：葡萄糖4-6克/升、硫酸铵2.0-2.5克/升、磷酸二氢钾10-11克/升、一水柠檬酸2.5-3.0克/升、七水硫酸镁2.6-3.0克/升、酵母提取物1-2克/升，pH为6.5。
10.根据权利要求9所述的重组大肠杆菌产L-色氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述初始发酵培养基还添加了微量元素，包括成分：七水合硫酸亚铁8-11克/升、无水亚硫酸钠2-3克/升、一水合硫酸锰0.6-0.65克/升、七水合硫酸锌0.72-0.75克/升、五水硫酸铜0.07-0.09克/升、六水氯化钴0.35-0.45克/升。
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