CN102071165A

CN102071165A - 一种添加谷氨酸提高乳酸菌在低pH条件下生物量的方法

Info

Publication number: CN102071165A
Application number: CN 201010581051
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 顾磊; 张娟; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2011-05-25

Abstract

本发明公开了一种添加谷氨酸提高乳酸菌在低pH条件下生物量的方法及其应用，属于生物工程技术领域。采用在培养基中添加谷氨酸的方法，提高了干酪乳杆菌CCTCCM2010163在极端pH条件下的生物量。本发明采用的方法简单、便于操作，可用于乳酸菌的发酵生产。

Description

一种添加谷氨酸提高乳酸菌在低pH条件下生物量的方法

技术领域

本发明涉及一种添加谷氨酸提高乳酸菌在低pH条件下生物量的方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

乳酸菌的生长特点是以产酸作为最终的发酵产品，产生的乳酸被释放并积累到细胞外环境中，有机酸在自然环境中能抑制其他微生物的生长，但在高密度发酵中却也极大地降低了其自身的活性；此外，乳酸菌在食用消化后在胃中又遇到了一个更强的无机酸环境，人体正常胃液的pH往往低于3.0，这与大部分乳酸菌5-9的最优生长pH相差甚远。两者结合，使得酸胁迫成为了乳酸菌单因素胁迫研究的重点。

一般认为由于酸能够通过细胞膜被动扩散进入细胞质，然后迅速解离成不能透出细胞膜的质子和相应极性基团。胞内质子的积累使得胞内pH下降，从而减少了跨膜的质子推动力，影响了细胞多种转膜机制的能量来源。内部的酸化条件也减少了对酸敏感的酶的活力并且对蛋白质和DNA造成永久性损害，伴随解离过程产生的阴离子的大量积累，也会对细胞生理造成有害影响。目前认为，乳酸菌酸适应能力增加至少有两个生理阶段：1）在对数生长期经过一个非致死性的酸性pH条件，能诱导L-ATR适应；2）在进入稳定期之后，通过一个不依赖于外界pH的general stress response(GSR)提高适应能力。而诸如FoF1ATP酶，K+-ATPase，精氨酸脱亚胺酶，脲酶被认为在帮助乳酸菌抵御外界酸胁迫过程中起到关键作用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种提高乳酸菌在低pH条件下生物量的方法，是在乳酸菌发酵培养基中加入谷氨酸。

本发明的另一个目的是提供一种将谷氨酸作为乳酸菌耐受低pH的保护剂，加入乳酸菌培养体系，降低极端pH条件对乳酸菌生长的影响。

所述谷氨酸的添加量为2-10 g/L，其中优选5 g/L。

菌株：干酪乳杆菌（Lactobacillus casei ）CCTCC M 2010163，该菌株已申请中国专利，申请号为201010238658.8。

种子培养方法：将甘油管保藏的益生菌接入MRS液体培养基，在37℃静置培养20 h至对数中后期，以2%接种量取-70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃静置培养20 h；

发酵培养方法：以5%的接种量将种子转入发酵培养基，初始pH设定为6.5，于37 ^oC、200 rpm条件下培养24 h；

种子培养基MRS (g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母浸出汁5，无水乙酸钠5，磷酸二氢钾2，柠檬酸三铵2，MgSO₄·7H₂O 0.2，MnSO₄·H₂O 0.05，Tween-80 1 mL L^-1，pH 5.5；

发酵培养基(g/L)为：葡萄糖21.9，酵母膏39.5，无水乙酸钠13.12，冰醋酸9.16 ml/L,吐温-80 5.15 ml /L，pH分用NaOH溶液调节至6.5；

细胞干重的测定方法：取一定量的菌悬液置于10 mL容量瓶中，加2 mL 盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，用去离子水定容至10 mL，摇匀；用UV 7500型可见分光光度计，于600 nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重；

样品处理方法：5 mL 发酵液在10000 rpm 下离心10 min，取上清液移入试管中以备测pH使用。

由于乳酸菌不具备完整的三羧酸循环和呼吸链，其能量的产生主要来源于糖酵解途径。在此过程中，细胞将大部分碳源用于合成乳酸，只有约5%的碳源生成了细胞物质。这种分解代谢和合成代谢的严重不平衡，使得细胞在酸性条件下ATP合成能力严重匮乏，进一步影响了细胞的生物量和生理活性。添加外源物质通过乳酸菌本身机制快速中和胞内质子，促使胞内pH变化不因产酸而迅速降低，从而保证作为质子推动力的跨膜ΔpH，提高细胞的生物量和生理活性。

本发明提供的在培养基中添加谷氨酸后L. casei CCTCC M 2010163在低pH (pH≤4.5) 胁迫条件下，比对照组(未添加)具有更好的生长性能。本发明提供的方法，简单易行，对操作人员专业素质要求低，因此基于抗胁迫对降解菌生物量的研究，使用添加外源氨基酸策略提高菌体抗酸性能。

具体实施方式

实施例1谷氨酸添加量2 g/L

表1 菌体生物量及终止pH测定

当添加谷氨酸2 g/L，干酪乳杆菌CCTCC M 2010163的最终菌体浓度比对照组(未添加)提高了5%；终止pH也提高至4.4，抗酸能力有所提高。

实施例2谷氨酸添加量5 g/L

表2 菌体生物量及终止pH测定

当添加谷氨酸5 g/L，干酪乳杆菌CCTCC M 2010163的最终菌体浓度比对照组(未添加)提高了15%；终止pH也提高至4.6，缩短发酵对数生长期1h，抗酸能力显著提高。

实施例3谷氨酸添加量10 g/L

当添加谷氨酸10 g/L，干酪乳杆菌CCTCC M 2010163的最终菌体浓度比对照组(未添加)提高了9%；终止pH也提高至4.5，抗酸能力有所提高。

实施例4 pH为4.8时，干酪乳杆菌CCTCC M 2010163生长情况

以2%接种量取 -70℃甘油贮存液接种于添加MRS培养基中，37℃静置培养20 h至对数中后期。取37℃静置培养20 h（对数中后期）的发酵液，以5%的接种量分别接种至添加5 g/L谷氨酸的发酵培养基与未添加谷氨酸的发酵培养基中，pH调为4.8。发酵20h小时后，取样测定OD 600值，添加谷氨酸的样品OD值比为添加谷氨酸的样品提高了5%。

实施例5 pH为4.5时干酪乳杆菌CCTCC M 2010163生长情况

以2%接种量取 -70℃甘油贮存液接种于添加MRS培养基中，37℃静置培养20 h至对数中后期。取37℃静置培养20 h（对数中后期）的发酵液，以5%的接种量分别接种至添加5 g/L谷氨酸的发酵培养基与未添加谷氨酸的发酵培养基中，pH调为4.5。发酵20h小时后，取样测定OD 600值，添加谷氨酸的样品OD值比为添加谷氨酸的样品提高了9%。

实施例6 pH为4.3时干酪乳杆菌CCTCC M 2010163生长情况

以2%接种量取 -70℃甘油贮存液接种于添加MRS培养基中，37℃静置培养20 h至对数中后期。取37℃静置培养20 h（对数中后期）的发酵液，以5%的接种量分别接种至添加5 g/L谷氨酸的发酵培养基与未添加谷氨酸的发酵培养基中，pH调为4.3。发酵20h小时后，取样测定OD 600值，添加谷氨酸的样品OD值比为添加谷氨酸的样品提高了13%。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种提高乳酸菌在低pH条件下生物量的方法，是在乳酸菌发酵培养基中加入谷氨酸。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述乳酸菌为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei ）CCTCC M 2010163。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，谷氨酸添加量为2-10 g/L。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，谷氨酸添加量为5 g/L。

5.一种权利要求1所述方法的应用，是将谷氨酸作为乳酸菌耐受低pH的保护剂。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，乳酸菌培养体系中加入谷氨酸。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，谷氨酸添加量为5 g/L。