CN104928215A - 降胆固醇、耐氧动物双歧杆菌乳亚种bz11的发酵培养基 - Google Patents

降胆固醇、耐氧动物双歧杆菌乳亚种bz11的发酵培养基 Download PDF

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Abstract

降胆固醇、耐氧动物双歧杆菌乳亚种BZ11的发酵培养基，该培养基由如下组分组成：葡萄糖0.89g、麦芽糖1.08g、大豆蛋白胨0.89g、酵母提取物0.89g、胰蛋白胨0.51g、胡萝卜汁14.33mL、卷心菜汁17.78mL、半胱氨酸盐酸盐0.05g、盐溶液4mL、吐温-80 0.1mL，水100mL；所述盐溶液成分：CaCl2 0.2g、MgSO4·7H2O 0.48g、K2HPO4 1g、KH2PO4 1g、NaHCO3 10g、NaCl 2g、水1000mL。本发酵培养基是一种优化培养基，用于发酵培养BZ11，有效提高菌体生长量，提高降胆固醇能力，发酵条件温和，易于控制，有利于扩大生产。

Description

降胆固醇、耐氧动物双歧杆菌乳亚种BZ11的发酵培养基
技术领域
本发明涉及微生物的培养基，特别涉及降胆固醇、耐氧双歧杆菌乳亚种BZ11的发酵培养基。
背景技术
胆固醇是人类生存所必需的营养物质，对人体具有十分重要的生理功能。它既是构成细胞的主要成分，又能在人体内转化成类固醇激素，并且胆固醇还是合成胆汁酸的前体、维生素D3的原料。人体内的胆固醇主要来自于自身合成和日常食物中摄取，当饮食中胆固醇摄入量过高时血清中胆固醇含量会增高，而血清中胆固醇过高是引发冠心病、动脉粥样硬化、脑中风等心脑血管疾病的重要因素。研究发现与拥有正常血脂的人相比，高胆固醇血症的人患心脏病的风险是正常血脂人的3倍。目前，除了通过合理饮食以外，运用生物转化法，特别是用益生菌对胆固醇进行降解已成为研究的趋势。
具有高胆固醇去除率的菌株非常少，而筛选具有高胆固醇去除率的双歧杆菌菌株是未来的一个重要研究方向。双歧杆菌的筛选国内外均有报道，有从人源筛选的，有从动物源筛选的，也有从传统食品中筛选的。不过目前国内大多数研究单位开展的优良乳酸菌筛选来源十分有限，许多不同单位保藏和研究的菌株可能来源于同一出处，这不利于有效的开发新乳酸菌株。因而开辟新的菌种来源很重要，开辟新渠道很有可能筛选到新的优良的益生乳酸菌。而贵州特色资源香猪正是一个筛选益生乳酸菌的好资源，且香猪器官结构和功能与人体相似，从香猪中筛选出来的乳酸菌易于为人体接受和利用。为此，申请人已研究出《一株香猪源性降胆固醇、耐氧双 歧杆菌BZ11》，且申请了中国专利，申请号为201510018144.4，该申请件已于2015年5月公布。
目前中国专利数据库中，涉及杆菌培养基的申请件多达上百件，例如，ZL2010105960593号《一种副猪嗜血杆菌5型高密度发酵培养基及应用》、ZL201110099582X号《一种应用于微生物肥料的枯草芽孢杆菌深层发酵培养基》、ZL2012102784847号《一种苏云金芽胞杆菌乳化发酵培养基》、ZL2013100415664号《一种促进地衣芽孢杆菌BL63516生长的发酵培养基及发酵培养方法》和ZL2013101899388号《一种枯草芽孢杆菌发酵培养基》等。迄今为止，尚无涉及降胆固醇、耐氧动物双歧杆菌乳亚种BZ11的培养基的申请件。
发明内容
本发明旨在提供降胆固醇、耐氧动物双歧杆菌乳亚种BZ11的发酵培养基，使从香猪中筛选出来的动物双歧杆菌乳亚种BZ11通过该发酵培养基培养得以提高菌体生长量，进而提高该菌株的降胆固醇能力。
本发明的又一目的在于提供BZ11的培养方法，使前述的发酵培养基得以实际应用。
发明人提供的降胆固醇、耐氧动物双歧杆菌乳亚种BZ11的发酵培养基，是由如下组分组成的：葡萄糖0.89g、麦芽糖1.08g、大豆蛋白胨0.89g、酵母提取物0.89g、胰蛋白胨0.51g、胡萝卜汁14.33mL、卷心菜汁17.78mL、半胱氨酸盐酸盐0.05g、盐溶液4mL、吐温-800.1mL，水100mL；
所述盐溶液的成分为：CaCl20.2g、MgSO4·7H2O 0.48g、K2HPO41g、KH2PO41g、NaHCO310g、NaCl 2g、水1000mL。
上述降胆固醇、耐氧动物双歧杆菌乳亚种BZ11已于2014年12月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，该中心地址是：中 国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC NO.10224，简称为动物双歧杆菌乳亚种BZ11。
上述组分中，胡萝卜汁、卷心菜汁均是用常规方法制备的。
发明人提供的BZ11的培养方法是：先将动物双歧杆菌BZ11接种于种子培养基，于37℃，二氧化碳培养箱中培养2天制得发酵用种子液；接着将发酵种子液按照10％的接种量接种于上述发酵生产培养基中，在37℃、二氧化碳培养箱中培养2天，即得。
上述种子培养基(PTYG培养基)的各组分为：胰蛋白胨0.5g、大豆蛋白胨0.5g、酵母提取物1g、葡萄糖1g、半胱氨酸盐酸盐0.05g、盐溶液4mL、吐温-800.1mL、水100mL；制备方法是将培养基煮沸驱氧，于121℃下灭菌20min，即得；
所述盐溶液的成分为CaCl20.2g、MgSO4·7H2O 0.48g、K2HPO41g、KH2PO41g、NaHCO310g、NaCl 2g、水1000mL。
本发明的香猪源降胆固醇、耐氧动物双歧杆菌乳亚种BZ11的发酵生产培养基，是一种优化培养基，用于发酵培养动物双歧杆菌BZ11，可有效提高其菌体生长量，提高其降胆固醇能力，且发酵方法条件温和，易于控制，有利于扩大化生产。采用本优化培养基，发酵培养菌株2天后，采用平板涂布的方法进行活菌计数，其活菌数达到1011数量级，与优化前相比提高一个数量级；且采用邻苯二甲醛(OPA)法测其胆固醇去除率，其降胆固醇能力与优化前相比提高了8.26％。本发明适用于培养益生菌双歧杆菌。
附图说明
图1为麦芽糖和胰蛋白胨对菌体生长量(OD600值)的交互影响响应面图。
图2为麦芽糖和胰蛋白胨对菌体生长量(OD600值)的交互影响等高线 图。
图3为麦芽糖和胡萝卜汁对菌体生长量(OD600值)的交互影响响应面图。
图4为麦芽糖和胡萝卜汁对菌体生长量(OD600值)的交互影响等高线图。
图5为胰蛋白胨和胡萝卜汁对菌体生长量(OD600值)的交互影响响应面图。
图6为胰蛋白胨和胡萝卜汁对菌体生长量(OD600值)的交互影响等高线图。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但是本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1 BZ11培养基的制备 
(1)制备种子培养基(PTYG培养基)：取胰蛋白胨0.5g、大豆蛋白胨0.5g、酵母提取物1g、葡萄糖1g、半胱氨酸盐酸盐0.05g、盐溶液4mL、吐温-800.1mL、水100mL，煮沸驱氧，分装于50mL的具塞三角瓶，于121℃灭菌20min，即得种子培养基；所述盐溶液成分为Cacl20.2g、MgSO4·7H2O 0.48g、K2HPO41g、KH2PO41g、NaHCO310g、NaCl 2g、水1000mL；
(2)发酵种子液的制备：将平板培养的动物双歧杆菌接种于种子培养基中，在37℃下、二氧化碳培养箱中培养2天，即为发酵种子液；
(3)制备发酵培养基：同制备种子培养基的方法；
(4)发酵培养基中菌体浓度的测定：以菌体的OD值表示。将菌悬液按接种量10％(w/v)接种于发酵培养基中，放置于二氧化碳培养箱中，37℃培养2天，然后取出，用紫外分光光度计测其在600nm处的吸光值 (A600)，用空白培养基作为对照，即可测定菌体浓度；
(5)活菌数的测定：将纯化菌株菌悬液接入到优化后的培养基中，放置于二氧化碳培养箱中，37℃下培养2天后稀释到合适的梯度，进行平板涂布计数，用优化前的PTYG培养基作对照，即可测定活菌数；
(6)动物双歧杆菌降胆固醇能力的测定：将纯化菌株菌悬液接入到优化后的含有0.1mg/mL胆固醇的培养基中，放置于二氧化碳培养箱中，37℃培养2天，离心，取上清液用邻苯二甲醛(OPA)法测其胆固醇去除率，用优化前的PTYG培养基作对照，完成测定。
实施例2 Box-Behnken设计
Box-Behnken设计是一种通过采用多元二次回归方程的方法对2-5个因素进行优化。以PB实验筛选得到的对动物双歧杆菌乳亚种BZ11 CGMCC NO.10224的菌体生长量OD值影响显著的几个因素作为实验设计因素，以快速登高实验所得的浓度作为实验中心点，以菌体生长量OD值作为响应值，通过响应面来分析培养基成份，从而得到最优的培养基组成成份。实验设计见表1，实验结果见表2，实验结果分析见表3。
表1 Box-Behnken试验设计因素水平及其编码
表2 Box-Behnken响应面试验设计结果
利用Design-Expert软件对表2中的菌体OD600值以及3个因素进行统计分析，得到了每个因子的显著性，其结果见表3，并得到了菌体OD600值(Y)对自变量麦芽糖含量(A)，胰蛋白胨(B)和胡萝卜汁(C)的多元二次回归方程为:
Y＝+1.68-0.016A+0.026B+0.016C-0.022AB+0.039AC-(2.750E-003)BC-0.014A2-0.061B2-(1.650E-003)C2
表3 Box-Behnken响应面试验方差分析
注：**极显著水平(P＜0.01)；*显著水平(P＜0.05)。
由表3的方差分析结果可知，方程模型的P＝0.0015＜0.01，表明该方程模型极显著，也表明方程能很好的拟合试验结果。从二次多项回归模型方程可以看出，方程中因变量(菌体生长量)与自变量A(麦芽糖含量)和B(胰蛋白胨含量)之间的线性关系明显，且回归方程中的一次项、交互项及二次项项系数较小，这说明在响应面分析中所选的3个因素之间其交互效应较显著。从上述方差分析表中还可以看出，回归方程的一次项中B极显著，说明发酵液中胰蛋白胨含量(B)对菌体生长量影响显著；方程中二次项A与C不显著，B为极显著；交互项中AC极显著，说明麦芽糖含量(A)与胡萝卜汁含量(C)对菌体生长量有明显的交互作用。
利用Design-Expert软件对所得到的回归模型进行了响应面分析，得到各响应面的立体分析图(图1-6)。并对回归方程的最值求解，得到了模型极值点，即麦芽糖、胰蛋白胨、胡萝卜汁的含量分别为1.08％、0.51％、14.33％时，响应值Y值达到最大，即菌体生长量OD600达到最大为1.714。
实施例3 动物双歧杆菌乳亚种BZ11的培养
将保藏的菌株从-80℃超低温冰箱中拿出放入37℃水浴锅中迅速溶解，然后用移液枪吸取100ul菌液涂布于PTYG琼脂培养基上，放置于二氧化碳培养箱中，37℃培养2天。再用接种环挑取单菌落接种于PTYG琼脂培养基上，放置于二氧化碳培养箱中，37℃培养2天，反复纯化3次、镜检。将纯化好的菌株按接种量10％(w/v)接种于PTYG液体培养基中进行富集培养，放置于二氧化碳培养箱中，37℃培养2天，作为种子液菌悬液。
然后将种子液菌悬液按接种量10％(w/v)接种于利用Design-Expert软件设计的17组实验中(培养基为发酵培养基)，放置于二氧化碳培养箱 中，37℃培养2天，然后取出，用紫外分光光度计测其在600nm处的吸光值(A600)，用空白培养基作为对照。每组实验做三个平行。
以上实施方式仅是本发明的具体例子，显然本发明的实现并不受上述方式的限制。只要采用本发明的方法构思和技术方案进行的非实质性改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.降胆固醇、耐氧动物双歧杆菌乳亚种BZ11的发酵培养基，其特征在于该培养基，是由如下组分组成的：葡萄糖0.89g、麦芽糖1.08g、大豆蛋白胨0.89g、酵母提取物0.89g、胰蛋白胨0.51g、胡萝卜汁14.33mL、卷心菜汁17.78mL、半胱氨酸盐酸盐0.05g、盐溶液4mL、吐温-80 0.1mL，水100mL；
所述盐溶液的成分为：CaCl2 0.2g、MgSO4·7H2O 0.48g、K2HPO4 1g、KH2PO4 1g、NaHCO3 10g、NaCl 2g、水1000mL。
2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于所述降胆固醇、耐氧动物双歧杆菌乳亚种BZ11已于2014年12月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），该中心地址是：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC NO.10224，简称为动物双歧杆菌乳亚种BZ11。
3.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于所述组分中，胡萝卜汁、卷心菜汁均是用常规方法制备的。
4.用权利要求1所述的发酵培养基培养BZ11的方法，其特征在于先将动物双歧杆菌BZ11接种于种子培养基，于37℃，二氧化碳培养箱中培养2天制得发酵用种子液；接着将发酵种子液按照10％的接种量接种于上述发酵生产培养基中，在37℃、二氧化碳培养箱中培养2天，即得。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述种子培养基（PTYG培养基）的各组分为：胰蛋白胨0.5g、大豆蛋白胨0.5g、酵母提取物1g、葡萄糖1g、半胱氨酸盐酸盐0.05g、盐溶液4mL、吐温-80 0.1mL、水100mL；制备方法是将培养基煮沸驱氧，于121℃下灭菌20min，即得；
其中，所述盐溶液的成分为CaCl2 0.2g、MgSO4 ·7H2O 0.48g、K2HPO4 1g、KH2PO4 1g、NaHCO3 10g、NaCl 2g、水1000mL。
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