CN109112089A - 提高双歧杆菌培养浓度的传代培养方法 - Google Patents

提高双歧杆菌培养浓度的传代培养方法 Download PDF

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何腊平
邢书奇
李翠芹
张玲
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

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Abstract

本发明公开了一种提高双歧杆菌培养浓度的传代培养方法。本发明发现了双歧杆菌的生长惰性并通过有特点的传代培养方案，通过传代培养活细胞浓度提高了10倍以上，这对于制得高浓度的双歧杆菌发酵剂和益生菌制剂与推广其应用都具有重要的价值，同时对于满足人民对高品质食品需求也具有重要意义，其推广应用将具有良好的社会和经济效益。

Description

提高双歧杆菌培养浓度的传代培养方法
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，尤其是具体涉及到益生双歧杆菌高浓度培养的方法。
背景技术
双歧杆菌时人体最有益的益生菌，是肠内最有益的乳酸菌群，且肠道内的双歧杆菌与人的寿命有一定关系。然而，由于年龄的增长、亚健康或者生病，肠内的双歧杆菌会显著减少，所以学者和产业人员采取的对策是生产含双歧杆菌的食品或药品供使用，增加肠道内双歧杆菌的数量，以发挥双歧杆菌的抗衰老、防病之功效。不过双歧杆菌要在人体中发挥作用，其数量必须达到106个/mL以上。所以提高单位培养液的菌株浓度很关键，于是有不少学者通过传统的高密度发酵方法提高双歧杆菌浓度。不过这种方法工艺比较复杂，因此有必要开发新的方法提高其浓度。
发明内容
本发明的目的是：提供一种提高双歧杆菌培养浓度的传代培养方法
本发明是这样实现的：提高双歧杆菌培养浓度的传代培养方法，包括如下步骤：
1)将动物双歧杆菌菌株在改良的PTYG平板培养基培养基中反复划线纯化在体积百分比为20％CO2-80％空气的二氧化碳培养箱中划线培养2-3次，每次平板培养时间是48h，第三次划线获得的活化的纯的单菌落；
2)将纯的单菌落接种到装有种子培养基后在密闭条件下培养24h-48，获得种子液；
3)将种子液按体积百分比为2％接种量接入装有发酵培养基的容器中，然后密闭培养24-48h，获得第一代传代发酵培养液；
4)以后的每代的传代培养方法是，将上一代的传代发酵培养液进行一次平板划线、挑单菌落，然后将获得的单菌落按照步骤1)的方法进行种子液培养，再按照步骤2)的方法进行发酵培养。
所述的提高双歧杆菌培养浓度的传代培养方法，其特征在于：所述的平板培养基、种子培养基及发酵培养基均为改良PTYG培养基。
步骤2)及步骤3)所述的培养的环境均为37℃条件下培养；且双歧杆菌的液态培养都是密封培养，所有的接种工作都是在普通超净工作台进行。
由于采用了上述技术方案，本发明发现了双歧杆菌的生长惰性并通过上述传代培养活细胞浓度提高了10倍以上，这对于制得高浓度的双歧杆菌发酵剂和益生菌制剂与推广其应用都具有重要的价值，同时对于满足人民对高品质食品需求也具有重要意义，其推广应用将具有良好的社会和经济效益。
具体实施方式
本发明通过下面的实施例予以进一步说明，但实施例并不限定本发明的范围。
实施例：提高双歧杆菌培养浓度的传代培养方法，
包括如下步骤：
1)将自甘油保藏的动物双歧杆菌菌株BZ11、BZ25分别在平板培养基培养基中反复划线纯化3次，每次平板培养时间是48h，第三次划线获得的活化的纯的单菌落；
2)将纯的单菌落接种到装有20mL种子培养基的三角瓶中(三角瓶容积50mL)中培养24h，获得种子液；
3)将种子液(按体积百分比)2％接种量接入100mL发酵培养基中培养48h，获得第一代传代发酵培养液；
4)以后的每代的传代培养方法是，将上一代的传代发酵培养液进行一次平板划线、挑单菌落，然后将获得的单菌落按照步骤1)的方法进行种子液培养，再按照步骤2)的方法进行发酵培养。
所述的平板培养基、种子培养基及发酵培养基均为改良PTYG培养基。
步骤2)及步骤3)所述的培养的环境均为37℃和20％CO2-80％空气的二氧化碳培养箱条件下培养；且双歧杆菌的液态培养都是密封培养，所有的接种工作都是在普通超净工作台进行。
本实施例中进行了四代培养，每次在传代培养到20小时时取样测OD值和活菌计数，经过检测，从第一到第四代的检测的动物双歧杆菌乳亚种BZ25的活细胞浓度分别为3.5×108CFU/mL、6×108CFU/mL、6.5×109CFU/mL、1.5×109CFU/mL，这说明传代培养到第三代时，比第一代传代培养液提高了1个数量级；类似的从第一到第四代的检测的动物双歧杆菌乳亚种BZ11的活细胞浓度分别为6×108CFU/mL、7×108CFU/mL、6×109CFU/mL、5.5×108CFU/mL，也说明传代培养到第三代时，比第一代传代培养液也提高了1个数量级。这同时说明双歧杆菌存在生长惰性，但可以通过本发明的方法进行克服。
实施例采用的生物样品保藏：BZ11、BZ25已于2014年12月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，该中心地址是：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号分别为CGMCC NO.10224、CGMCC NO.10225，分别简称为动物双歧杆菌乳亚种BZ11和BZ25。本实施例仅以上述两种菌株作为实施例进行解释，但是，经试验证明，本申请对其它同类菌株也具有效果。
本实施例采用的改良PTYG培养基具体组成为：
胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母粉10g，葡萄糖10g，吐温80 1mL，L-半胱氨酸盐酸盐0.05g，低聚果糖5g，盐溶液4mL。将各成分加热溶解于1000mL蒸馏水中，过滤，调pH值至6.5，121℃灭菌15min后备用。
盐溶液成分和制备：无水CaCl2 0.2g,K2HPO4 1.0g,KH2PO4 1.0g,MgSO4·7H2O0.48g，NaCO3 10g,NaCl 2g。混合CaCl2和MgSO4·7H2O在300mL蒸馏水中直至溶解，加入500mL水，搅拌同时缓慢加入其他盐类，直至溶解。加入200mL蒸馏水，混合后贮存于4℃备用。

Claims (3)

1.一种提高双歧杆菌培养浓度的传代培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将动物双歧杆菌菌株在改良的PTYG平板培养基培养基中反复划线纯化在体积百分比为20％CO2-80％空气的二氧化碳培养箱中划线培养2-3次，每次平板培养时间是48h，最后一次划线获得的活化的纯的单菌落；
2)将纯的单菌落接种到装有种子培养基后在密闭条件下培养24h-48，获得种子液；
3)将种子液按体积百分比为2％接种量接入装有发酵培养基的容器中，然后密闭培养24-48h，获得第一代传代发酵培养液；
4)以后的每代的传代培养方法是，将上一代的传代发酵培养液进行一次平板划线、挑单菌落，然后将获得的单菌落按照步骤1)的方法进行种子液培养，再按照步骤2)的方法进行发酵培养。
2.根据权利要求1所述的提高双歧杆菌培养浓度的传代培养方法，其特征在于：所述的平板培养基、种子培养基及发酵培养基均为改良PTYG培养基。
3.根据权利要求1或2所述的提高双歧杆菌培养浓度的传代培养方法，其特征在于：步骤2)及步骤3)所述的培养的环境均为37℃下培养；且双歧杆菌的液态培养及接种后都是密封培养，所有的接种工作都是在普通超净工作台进行。
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