CN104107194A

CN104107194A - 一种人体肠道微生态系统的制备方法

Info

Publication number: CN104107194A
Application number: CN201410139415.7A
Authority: CN
Inventors: 陈廷涛; 辛洪波; 王鑫
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2014-04-09
Filing date: 2014-04-09
Publication date: 2014-10-22

Abstract

一种人体肠道微生态系统的制备方法，是利用恒化器培养后的人肠道微生态系统预防和治疗感染性疾病：采用自制的恒化器培养三个月无任何抗生素史的健康志愿者，用于治疗恩诺沙星造成的感染性疾病。本发明的优点是：相较于单一或几种益生菌组合，本发明直接将健康志愿者整个微生态系统作为一个整体用于疾病的防治，其组成稳定、抗干扰能力强、治愈效果好；此外，由于使用的微生态系统来源于人体，因此培养后的微生态系统对人体安全、无毒副作用。

Description

一种人体肠道微生态系统的制备方法

技术领域

本发明涉及一种人体肠道微生态系统的制备方法。

背景技术

在家畜养殖过程中，大量抗生素的滥用导致其残留进入食品供应渠道，最终进入人体并引起传染性疾病。目前，中国、欧洲、澳大利亚和美国对抗生素使用的国标明确要求须对微生物菌群进行安全评价。但是，滥用抗生素药物的现象仍然存在。

恩诺沙星是一种广谱抗菌药剂。在中国，它被允许使用在家畜饲养上，主要通过对家畜进行皮下注射、肌肉注射或者口服等方式使用。而恩诺沙星残留会随着食品供应进入人体肠道并改变食用者体内肠道菌群数量和多样性，从而影响人体健康。

肠道微生物与人类健康密切相关，许多疾病的发生往往都伴随着肠道微生物的失衡，包括菌群的定植位置、数量和种类的变化。当由抗生素引起的胃肠道疾病发生时，我们会发现人类肠道微生物严重失调，并伴随着致病菌的疯长和益生菌(lactobacilli, bacteroides and bifidbacteria)的大量减少。同时，微生物失调会导致人体对营养吸收的能力降低、免疫力的下降和微生物对病原体的抗定植能力的减弱，使疾病恶化。因此，在很长一段时间，用包含益生微生物的产品来恢复肠道健康都是一种极重要的方式，而菌株的选择主要有lactobacilli和bifidbacteria，它们越来越多的被用于改善人类的健康。

然而，目前几乎没有人尝试将人体肠道微生物菌群作为一个整体研究其对外界病原体抵御能力的影响。本发明中，我们培养了健康人体肠道菌群，将活细胞计数法和DGGE法相结合，综合评价了恩诺沙星对肠道菌群多样性的影响并评价了健康人体肠道菌群微生态系统在预防感染中的良好效果。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种人体肠道微生态系统的制备方法。

本发明是利用健康人体肠道中存在的土著菌群抵抗外来致病菌，将在人体肠道微生物系统中占优势地位的肠道微生态主要优势菌群培养后直接给人或者通过体外模型模拟人体肠道来验证其抵抗机会致病菌的效果。

本发明所述制备方法包括下列步骤：

1、样品的收集和保存：收集志愿者早晨第1次排便样品，转人厌氧环境，加入甘油，其重量为粪便和甘油总重量的10％，旋涡振荡器混匀，-8O ℃保存；

2、恒化器的组装和使用：将储料罐，发酵罐，废液罐，橡胶塞，硅胶管，装NaOH的玻璃瓶及通气过滤器按顺序连接起来，置于工作台上，连接混合气体，蠕动泵，pH调节器，磁力搅拌器，废气排除装置；

3、恒化器内培养基的制备：按加入成分占终产物质量百分比加入如下成分：5‰可溶性淀粉，3‰牛乳酪蛋白，3‰蛋白胨，0.6‰果胶，0.6‰木聚糖，0.6‰阿拉伯半乳聚糖，0.6‰支链淀粉，0.4‰半胱氨酸, 0.01‰血红素，0.25‰胆固醇，0.25‰鹅脱氧胆酸，0.25‰胆酸，2‰磷酸二氢钾，10‰磷酸氢二钾，4.5‰氯化钠，0.5‰七水硫酸镁，0.45‰二水氯化钙，培养基经高压灭菌后用蠕动泵泵入储料罐内；

4、肠道微生态系统的制备：恒化器内通氮气保持厌氧，恒化器置于37℃水浴，罐内pH在线控制为6.5，运行体积500 mL，以35 mL／h稀释速率利用蠕动泵进泵出，待恒化器稳定后，按重量比接种10%在-8O ℃保存的粪便样品，连续培养8-16天后得到的的培养物即为健康人体肠道微生态系统。

本发明的有益效果：相较于单一或几种益生菌组合，本发明直接将健康志愿者整个微生态系统作为一个整体用于疾病的防治，稳定、抗干扰能力强、治愈效果好；此外，由于使用的微生态系统来源于人体，因此培养后的微生态系统对人体安全、无毒副作用。

附图说明

图1-1空白组中肠道微生态系统菌群数量监测；

图1-2 1.25μg/mL恩诺沙星对恒化器中肠道微生态系统菌群数量的影响；

图1-3 12.5μg/mL恩诺沙星对恒化器中肠道微生态系统菌群数量的影响；

图1-4 125μg/mL恩诺沙星对恒化器中肠道微生态系统菌群数量的影响；

图1-5 添加肠道微生态系统后对125μg/mL恩诺沙星造成肠道菌群数量紊乱的恢复效果；

图2肠道微生态系统抵抗机会致病菌白假丝酵母菌 SC5314效果图。

具体实施方式

实施例1：

人体肠道微生态系统的制备方法

1.收集志愿者早晨第1次排便样品，转人厌氧环境，加入甘油，其重量为粪便和甘油总重量的10％，旋涡振荡器混匀，-8O ℃保存。

2.恒化器的组装和使用：将储料罐，发酵罐，废液罐，橡胶塞，硅胶管，装NaOH的玻璃瓶及通气过滤器按顺序连接起来，置于工作台上，连接混合气体，蠕动泵，pH调节器，磁力搅拌器，废气排除装置

3.配制恒化培养的培养基，以总体积500毫升计，下列各成分质量百分比分别为：5‰可溶性淀粉，3‰牛乳酪蛋白，3‰蛋白胨，0.6‰果胶，0.6‰木聚糖，0.6‰阿拉伯半乳聚糖，0.6‰支链淀粉，0.4‰半胱氨酸, 0.01‰血红素，0.25‰胆固醇，0.25‰鹅脱氧胆酸，0.25‰胆酸，2‰磷酸二氢钾，10‰磷酸氢二钾，4.5‰氯化钠，0.5‰七水硫酸镁，0.45‰二水氯化钙。培养基经高压灭菌后用蠕动泵泵入储料罐内。

4.肠道微生态系统的制备：恒化器内通氮气保持厌氧，恒化器置于37℃水浴，罐内pH在线控制为6.5，运行体积500 mL，以35 mL／h稀释速率利用蠕动泵进泵出。待恒化器稳定后，按重量比接种10%在-8O ℃保存的粪便样品，具体流程为：将-80 ℃保存的样品室温解冻1 h后，用厌氧与还原稀释剂将粪便稀释，均匀悬浮：粪便厌氧与还原稀释比为1:4。在第1天、第3天、第5天，分别通过容器的盖子向总体积为50 mL的恒化器中接种注射50 mL含有的10 g粪便的悬浮液。连续培养8-16天后得到的的培养物即为健康人体肠道微生态系统。

实施例2：肠道微生态系统治疗恩诺沙星造成的感染性疾病的治疗效果

1.按实施例1中步骤1，步骤2，步骤3，步骤四构建恒化器，配制培养基并制作人体肠道微生态系统。

2.待恒化器运行23天稳定后，分别加入1.25μg/mL，12.5μg/mL，125μg/mL，125μg/mL恩诺沙星制造抗生素紊乱模型，同时以不加恩诺沙星的恒化器作为对照组。

3.自培养17-31天起，每天从个发酵罐取培养物10 mL，利用活菌计时方法分别计数培养物中微生物的数量变化；利用变性梯度凝胶电泳方法监测培养物种菌群种类的变化。活菌计数和变性梯度凝胶电泳具体操作如下：

活菌计数：样品无菌条件下取样，经十倍倍比稀释后，置于适宜条件下培养，数日后观察平皿菌落生长情况，取菌落数大于30小于300的平皿进行计数。根据平皿菌落总数按下列公式计算活菌数：活菌数(CFU／粒)= (3个平皿菌落数之和／3)×(10／粒数)×稀释度。培养基分别为培养总厌氧菌和总需氧菌的脑心浸液培养基、培养乳酸菌的MRS琼脂培养基、培养双歧杆菌的SBM培养基、培养大肠杆菌的BSM培养基和培养拟杆菌的BBE培养基。

变性梯度凝胶电泳：按每种培养物取菌液1 mL计，提取基因组DNA：按体积比加入70%包含500毫摩氯化钠、50毫摩Tris-盐酸、0.5毫摩乙二胺四乙酸,和质量百分比4%十二烷基磺酸钠听的裂解缓冲液，30%酚/氯仿/异戊醇体积比为25：24：1的酚氯仿异戊醇和0.4 g玻璃珠，混匀，并将离心管置于涡旋振荡器上振荡10 分钟，20000转离心5 分钟后，向上清液中加入占总体积0.075%的 10 摩尔乙酸铵，DNA随即使用两次酚/氯仿/异戊醇提取和一次氯仿提取，异丙醇沉淀，体积比为70％乙醇洗涤，风干后，加入100 微升无菌水，加入2微升RNA酶在37℃孵育15分钟。扩增16S rDNA V3区引物为GC clamp-TACGGGAGGCAGCAG -3′，5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。扩增体系50 微升：包括100 纳克 DNA模板，1× EXTaq 缓冲液, 200 微摩脱氧核糖核苷三磷酸混合物, 200 纳摩各引物, 25微升PCR Mix。参照Muyzer等方法，GC 夹子序列为：clamp sequence: CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)。反应条件: 94 ℃，反应5 min；随后进行30个循环：94℃ 30 秒;56℃，30 秒;72℃，1 分钟；最后72℃延伸7分钟。

使用质量比8％聚丙烯酰胺凝胶，质量比35％～65％[100% 变性梯度定义为体积比40% 甲酰胺和7 M尿素的变性梯度。首先在220 V电压下预电泳10 分钟，随后在85 V的固定电压下电泳16 小时。电泳结束后，进行硝酸银染色。

4.从32天开始，向每个发酵罐中加入10⁸个白假丝酵母菌SC5314，基因号：NW_13个9422.1，按实施例2中活菌计数方法计数白假丝酵母菌SC5314数量的变化。

5.活菌计数结果如图1-1所示，在1.25 μg/mL 恩诺沙星的实验组，总厌氧菌、总需氧菌、乳酸菌、肠球菌、拟杆菌，但是双歧杆菌的数量下降了100倍，降到10⁴菌落数量单位(CFU)/mL。当加入12.5 μg/mL 恩诺沙星的实验组，乳酸菌、双歧杆菌、肠球菌和大肠杆菌在第27天约下降了10-100倍，但乳酸菌和大肠杆菌正在没加药物后可以恢复到稳定水平，但是双歧杆菌和肠球菌未恢复到正常水平。拟杆菌的数量在该浓度下影响很小。在125 μg/mL 恩诺沙星的浓度下所有的细菌都被影响。第25天，所有待测细菌都减少了，总厌氧菌、总需氧菌和大肠杆菌都大量增加，比没有药物的对照组要高，然而乳酸菌、双歧杆菌、肠球菌、脆弱拟杆菌都不能恢复到正常水平。在益生菌实验组中，隔了两天再加药物，以便大肠杆菌的生长和维持肠球菌的数量，结果表明，相较于125 μg /mL 恩诺沙星实验组，培养人类肠道菌群能帮助脆弱拟杆菌恢复到正常水平。在益生菌组和125 μg /mL ENR实验组，总厌氧菌和总需氧菌没有发现明显的改变。

图1-2中恒化器抵抗外来致病菌定植实验表明，12.5 μg/mL剂量组和空白组可抑制白假丝酵母菌SC5314在恒化器中的定植，而1.25 μg/mL和125 μg/mL组中紊乱的肠道菌群无法抵抗白假丝酵母菌SC5314的定植。与125 μg/mL组相比，添加肠道微生态系统的的益生菌组可明显抑制白假丝酵母菌SC5314定植，即可用于预防和治疗抗生素滥用造成的菌群紊乱。

序列表

Claims

1.一种人体肠道微生态系统的制备方法，其特征是：

A、样品的收集和保存：收集志愿者早晨第1次排便样品，转人厌氧环境，加入甘油，其重量为粪便和甘油总重量的10％，旋涡振荡器混匀，-8O ℃保存；

B、恒化器的组装和使用：将储料罐，发酵罐，废液罐，橡胶塞，硅胶管，装NaOH的玻璃瓶及通气过滤器按顺序连接起来，置于工作台上，连接混合气体，蠕动泵，pH调节器，磁力搅拌器，废气排除装置；

C、恒化器内培养基的制备：按加入成分占终产物质量百分比加入如下成分：5‰可溶性淀粉，3‰牛乳酪蛋白，3‰蛋白胨，0.6‰果胶，0.6‰木聚糖，0.6‰阿拉伯半乳聚糖，0.6‰支链淀粉，0.4‰半胱氨酸, 0.01‰血红素，0.25‰胆固醇，0.25‰鹅脱氧胆酸，0.25‰胆酸，2‰磷酸二氢钾，10‰磷酸氢二钾，4.5‰氯化钠，0.5‰七水硫酸镁，0.45‰二水氯化钙，培养基经高压灭菌后用蠕动泵泵入储料罐内；

D、肠道微生态系统的制备：恒化器内通氮气保持厌氧，恒化器置于37℃水浴，罐内pH在线控制为6.5，运行体积500 mL，以35 mL／h稀释速率利用蠕动泵进泵出，待恒化器稳定后，按重量比接种10%在-8O ℃保存的粪便样品，连续培养8-16天后得到的的培养物即为健康人体肠道微生态系统。