CN108473943A - 用于从目标细菌系统中富集菌株的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种从目标细菌系统中富集至少一种菌种的方法，其包括：在下列条件下在单级恒化器中在培养基中培养目标细菌生态系统：(i)约5至约290小时的系统停留时间，(ii)约37℃的温度，(iii)约6.8‑7的pH，和(iv)维持恒化器的厌氧条件，时间为足以富集至少一种菌种；其中培养基包含制备的淀粉基质，其中目标细菌系统为从至少6个月内未用抗生素治疗的患者获得的粪源样品。

Description

用于从目标细菌系统中富集菌株的系统和方法

相关申请

本申请要求2015年8月24日提交的标题为“新型玉米淀粉对人类结肠微生物发酵的影响(INFLUENCE OF NOVEL MAIZE STARCHES ON HUMAN COLONIC MICROBIALFERMENTATION)”的第62/209,135号美国临时申请专利申请的优先权，出于所有目的通过引用将其全部内容并入本文。

技术领域

本发明的领域涉及治疗胃肠疾病的治疗方法。具体而言，本发明提供了用于从粪源细菌群落中富集至少一种细菌菌株的系统和方法。这些系统和方法可以用作治疗胃肠疾病的治疗方法。

背景技术

栖息在人体表面内部和外部的各种微生物构成了所谓的人类微生物群。据估计，这些微生物的数量是人类体细胞的10倍，包含比宿主基因组多150倍以上的基因，为宿主提供了执行各种功能的能力，而无需单独进化所需的基因。在包含>1014种微生物细胞的星球上，人类胃肠道(GIT)是最密集的生态系统之一，具有约500-1000种独特的物种，其中最密集的群落位于结肠中。婴儿出生时具有有无菌GIT；定殖在分娩过程中开始，并通过断奶向完全发育、复杂和稳定的微生物群发展。微生物群的发展是一个受内在因素(肠道pH、免疫应答和其他遗传决定因素)影响的复杂过程。诸如药物、饮食、母体微生物群和分娩方法等环境因素进一步影响了这一发展，宿主微生物与受体和信号分子的相互作用也影戏其发展。

已经提出肠道微生物群的功能类似于具有局部和全身作用的“虚拟器官”的功能。实例包括：营养物质的代谢，例如通过宿主酶难以消化或难以处理的多糖的代谢，提供额外的能量并合成维生素以供吸收。已显示微生物发酵占西方饮食中的日常能量供应的约10％。肠道微生物群也负责肠道上皮细胞的正常发育，肠道上皮细胞是肠腔和人体免疫细胞之间的物理屏障。这通过介导表面蛋白的适当糖基化、微绒毛的发育和调节细胞更新来完成。通过竞争营养物质和粘附位点抵抗定殖、产生抗微生物剂和调节肠内环境(例如降低的pH)来保护宿主免受潜在病原体的侵袭。最后，微生物群通过提供必需的刺激和诱导耐受机制来促进免疫系统的成熟。

如前所述，我们的结肠菌群的开发和维持是多因素的，饮食是用于调节的最简单因素。通过使用选择的益生元和益生菌，受控的饮食调整可以为各种健康问题提供治疗干预的可能手段。长期的饮食趋势表明饮食和肠道生态系统之间有很强的相关性；通常高脂肪/蛋白质的西方饮食与一种肠道生态系统有关，而第二种肠道生态系统与农业社会的高碳水化合物和单糖含量的饮食相关。短期饲养研究表明，高脂肪/低纤维和低脂肪/高纤维饮食之间的变化在24小时内引起可检测到的快速微生物变化。这些变化的量级很小，无法引起肠道生态系统转换；因此肠胃道疾病可能受长期影响，但不受短期饮食趋势的影响。

在迄今为止已经研究过的许多膳食基质中，抗性淀粉是哺乳动物酶难以消化的淀粉的一部分，作为肠道微生物群的重要调节剂而引人注目。因此增加饮食中抗性淀粉的量和类型提供了了有益地调节肠道菌群的可行而直接的方法。为了有针对性地做到这一点，首先了解各种形式的抗性淀粉对肠道微生物群的影响将是重要的。

附图说明

将参照附图进一步解释本发明，其中在全部几个视图中相同的结构由相同的数字表示。所示的附图不一定按比例绘制，而是通常将重点放在说明本发明的原理上。此外，一些特征可能被放大以显示特定组件的细节。

此外，附图中示出的任何尺寸、规格等旨在说明而非限制。因此，本文公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的，而仅仅是作为用于教导本领域技术人员以各种方式使用本发明的代表性依据。

图1A-F显示本发明的一些实施方案的方法中采用的序列比较。

图2A-F显示本发明的一些实施方案的方法中采用的序列比对图。

图3A-C显示本发明的一些实施方案的方法中所采用的用于比较的一些散点图。

图4A-D显示本发明的一些实施方案的方法中采用的用于鉴定菌种匹配的一些比较。

图5A-5H显示本发明的一些实施方案的方法中采用的用于鉴定代谢通路的KEGG通路图。

图6A-6H显示在本发明的一些实施方案的方法中使用的一种或多种菌种的代谢通路图。

图7A-7Q显示本发明的一些实施方案的方法中采用的代谢通路图。

图8A-8H显示本发明的一些实施方案的方法中采用的比较22种菌种的通路图。

图9和图10显示本发明的一些实施方案的方法中采用的单级恒化器容器。

图11显示在本发明的一些实施方案的方法中使用的六种淀粉基质的变性梯度凝胶电泳(DGGE)谱。

图12A-C显示在本发明的一些实施方案的方法中采用的接种有来自三个健康供体的粪便的恒化器运行的群落动态。

图13A-C显示基于DGGE谱的Pearson和非加权配对算术平均法(UPGMA)相关性的树状图，其比较本发明的一些实施方案的方法中使用的微生物群落。

图14A-C显示本发明的一些实施方案的方法中使用的非度量多维测度(NMDS)图。

图15显示基于DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较本发明的一些实施方案的方法中使用的微生物群落图。

图16显示由DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性产生的相似性矩阵的NMDS图，其比较本发明的一些实施方案的方法中使用的微生物群落。

图17显示基于DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较本发明的一些实施方案的方法中使用的微生物群落图。

图18显示由DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性产生的相似性矩阵的NMDS图，其比较本发明的一些实施方案的方法中使用的比较微生物群落。

图19显示基于DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较本发明的一些实施方案的方法中使用的微生物群落图。

图20显示由DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性产生的相似性矩阵的NMDS图，其比较本发明的一些实施方案的方法中使用的比较微生物群落。

图21显示基于DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较本发明的一些实施方案的方法中使用的微生物群落图。

图22A-F显示在本发明的一些实施方案的方法中采用的主成分分析数据。

图23显示在本发明的一些实施方案的方法中采用的主成分分析数据。

图24显示在本发明的一些实施方案的方法中采用的实验设计的流程图。

图25A和25B显示在本发明的一些实施方案的方法中采用的体外饲养试验的DGGE分析。

图26A和26B显示在本发明的一些实施方案的方法中采用的体外饲养试验的DGGE分析。

图27A-E显示基于DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较本发明的一些实施方案的方法中使用的微生物群落图。

图28A-E显示由DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性产生的相似性矩阵的NMDS图，其比较本发明的一些实施方案的方法中使用的比较微生物群落。

图29A-E显示基于DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较本发明的一些实施方案的方法中使用的微生物群落图。

图30A-E显示由DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性产生的相似性矩阵的NMDS图，其比较本发明的一些实施方案的方法中使用的比较微生物群落。

图31A-E显示在本发明的一些实施方案的方法中使用的发酵研究的结果。

图32A-E显示由DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性产生的相似性矩阵的NMDS图，其比较本发明的一些实施方案的方法中使用的比较微生物群落。

图33A-E显示基于DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较本发明的一些实施方案的方法中使用的微生物群落图。

图34显示来自本发明的一些实施方案的方法中使用的发酵实验的总离子色谱图。

发明内容

在一些实施方案中，本发明是从目标细菌系统富集至少一种菌种的方法，其包括：

在以下条件下在单级恒化器中在培养基中培养目标细菌生态系统：(i)约5至约290小时的系统停留时间，(ii)约37℃的温度，(iii)约6.8-7的pH，和(iv)维持恒化器的厌氧条件，时间为足以富集至少一种菌种；

其中培养基包含制备的淀粉基质，和

其中目标细菌系统为从至少6个月内未用抗生素治疗的患者获得的粪源样品。

在一些实施方案中，制备的淀粉基质包含：玉米(maize)基质、谷物(corn)基质、小麦基质、大麦基质、豆类基质、燕麦基质或其任何组合。在一些实施方案中，至少一种菌种包含：拟杆菌(Bacteroides spp.)、奇异菌(Atopobium spp.)、恶臭瘤胃球菌(Ruminococcusbromii)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)和吉氏副拟杆菌(Parabacteroidesdistasonis)。在一些实施方案中，制备的淀粉基质为玉米基质。在一些实施方案中，患者至少1年内未用抗生素治疗。在一些实施方案中，系统停留时间为约20-70小时。

在一些实施方案中，本发明是从目标细菌系统富集至少一种细菌菌株的方法，其包括：

在以下条件下在单级恒化器中在培养基中培养目标细菌生态系统：(i)约5至约290小时的系统停留时间，(ii)约37℃的温度，(iii)约6.8-7的pH，和(iv)维持恒化器的厌氧条件，时间为足以富集至少一种细菌菌株；

其中培养基包含制备的淀粉基质，和

其中目标细菌系统为从至少6个月内未用抗生素治疗的患者获得的粪源样品。

在一些实施方案中，制备的淀粉基质包含：玉米基质、谷物基质、小麦基质、大麦基质、豆类基质、燕麦基质或其任何组合。在一些实施方案中，至少一种细菌菌株包含：拟杆菌、奇异菌、恶臭瘤胃球菌、加氏乳杆菌和吉氏副拟杆菌。在一些实施方案中，制备的淀粉基质为玉米基质。在一些实施方案中，患者至少1年内未用抗生素治疗。在一些实施方案中，系统停留时间为约20-70小时。

具体实施方式

在已经公开的那些益处和改进中，从以下结合附图的描述，本发明的其他目的和优点将变得显而易见。本文公开了本发明的详细实施方案；然而，应当理解的是，所公开的实施方案仅仅是对可以以各种形式体现的本发明的说明。此外，结合本发明的各种实施方案给出的每个实施例旨在说明的而非限制。

在整个说明书中，除非上下文另有明确规定，否则以下术语采用在此明确关联的含义。如本文所使用的短语“在一个实施方案中”和“在一些实施方案中”，尽管其可以指代相同的实施方案，但不一定指代相同的实施方案。此外，本文使用的短语“在另一个实施方案中”和“在一些其他实施方案中”，尽管其可以指代不同的实施方案，并不一定指代不同的实施方案。因此，如下所述，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可以容易地组合本发明的各种实施方案。

此外，如本文所使用的，术语“或”是包含性的“或”操作符，并且除非上下文另有明确规定，否则等同于术语“和/或”。除非上下文另有明确规定，术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素。此外，在整个说明书中，“一个”，“一种”和“该”的含义包括复数引用。“中”的含义包括“中”和“上”。

如本文所用，术语“微生态失衡”是指个体肠道微生物组的失衡。

如本文所用，术语“微生物组”是指群落中的所有微生物。作为非限制性实例，人类肠道微生物组包括人类肠道中的所有微生物。

如本文所用，术语“化疗相关的微生态失衡”是指用于靶向导致个体的肠道微生物组失衡的个体的特定疾病的任何干预。

如本文所用，术语“粪便细菌疗法”是指将供体粪便注入受体的肠内以重新建立正常细菌微生物群的治疗。粪便细菌疗法在初步研究中已显示出令人鼓舞的结果，迄今已公布的100例患者中具有接近90％的成功率。不受理论的束缚，据信其是通过打破重复使用抗生素的循环，重新建立抑制艰难梭菌生长的平衡生态系统起作用的。

如本文所使用的，术语“关键菌种(keystone species)”是在人类粪便样品中始终存在的菌种。

如本文所用，术语“OTU”是指操作分类单位，其通过核酸序列中的相似性来定义一种菌种或一组菌种，该核酸序列包括但不限于16S rRNA序列。

在一些实施方案中，本发明是从目标细菌系统富集至少一种菌株的方法，其包括：

在以下条件下在单级恒化器中在培养基中培养目标细菌生态系统：(i)约5至约290小时的系统停留时间，(ii)约37℃的温度，(iii)约6.8-7的pH，和(iv)维持恒化器的厌氧条件，时间为足以富集至少一种菌株；

其中培养基包含制备的淀粉基质，和

其中目标细菌系统为从至少6个月内未用抗生素治疗的患者获得的粪源样品。

在一些实施方案中，制备的淀粉基质包含：玉米基质、谷物基质、小麦基质、大麦基质、豆类基质、燕麦基质或其任何组合。在一些实施方案中，至少一种菌株包含：拟杆菌、奇异菌、恶臭瘤胃球菌、加氏乳杆菌和吉氏副拟杆菌。在一些实施方案中，制备的淀粉基质为玉米基质。在一些实施方案中，患者至少1年内未用抗生素治疗。在一些实施方案中，系统停留时间为约20-70小时。

在一些实施方案中，系统停留时间为约5-250小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约5-200小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约5-150小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约5-100小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约5-90小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约5-80小时。在一些实施方案中，系统停留时间在大约5-70小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约5-60小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约5-50小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约5-40小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约5-30小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约5-20小时。

在一些实施方案中，系统停留时间为约20-250小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约30-250小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约40-250小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约50-250小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约60-250小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约70-250小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约80-250小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约90-250小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约100-250小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约150-250小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约200-250小时。

在一些实施方案中，系统停留时间为约20-200小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约50-150小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约50-100小时。在一些实施方案中，系统停留时间为约100-150小时。

该研究评估了人肠道微生物群落对6种不同玉米淀粉基质的体外小规模分批发酵之间的差异。来自3个供体的稳定粪便群落，在对远端结肠进行建模的恒化器中生长，被用作分批发酵的粪便接种物。使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)和气相色谱-质谱(GC-MS)来评估群落结构变化和每个粪便群落的诸如短链脂肪酸(SCFA)等的代谢产物的生成的变化。测试的淀粉基质促进每个供体的粪便群落的独特变化，表明个体的粪便微生物群以不同的方式发酵各种淀粉基质。GC-MS数据支持这些供体特异性结果，表明所有3个供体微生物群的丁酸产量显著增加，而仅在一个供体的微生物中观察到戊酸和丙酸的显著增加。尽管群落图谱根据发酵的淀粉基质表现变化，但没有观察到代谢物的明显差异。

缩略语表

ACF 异常隐窝

foci ae- 直链淀粉扩链剂(extender)

AMG 淀粉葡糖苷酶

BMI 体重指数

DGGE 变性梯度凝胶电泳

DP 聚合度

DVB/CAR/PDMS 二乙烯基苯/碳分子筛(carboxen)/聚二甲基硅氧烷

EI 电子碰撞

EMA 单叠氮化乙锭(Ethidium monoazide)

EPIC 欧洲癌症与营养前瞻性调查

FAAb 用5％去纤维蛋白的羊血补充的苛养厌氧菌琼脂

GBSS 颗粒束缚态淀粉合成酶

GC 气相色谱

GC-MS 气相色谱-质谱联用

GIT 胃肠道

GOPOD 葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂

HAMS 高直链玉米淀粉

HAMSB 丁酰化高直链玉米淀粉

HDL 高密度脂蛋白

HPLC 高压液相色谱

LAMS 低直链玉米淀粉

MDS 多维测度

NMDS 非度量多维测度

NMR 核磁共振

OPLS-DA 隐变量正交投影判别分析

PBS 磷酸盐缓冲液

PC 主成分

PCA 主成分分析

PTFE 聚四氟乙烯

RDS 易消化淀粉

RS 抗性淀粉

SBEIIb 淀粉分支酶IIb

SCFA 短链脂肪酸

SDS 慢消化淀粉

SI 相似指数

SPME 固相微萃取

SS 可溶性淀粉

SSIIa 淀粉合成酶IIa

su2 含糖2

TAE 三羟甲基氨基甲烷-乙酸盐-EDTA(Tris-acetate-EDTA)

TS 总淀粉

UPGMA 非加权配对算术平均法

VIP 变量对投影的影响

VOC 挥发性有机化合物

wx 蜡状的

Δt 变化率

粪源细菌群落

在一些实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述方法治疗患有微生态失衡的个体，其包括：确定患有微生态失衡的个体的第一代谢谱；通过向个体施用治疗有效量或在个体内进行细菌定植并将第一代谢谱改变为第二代谢谱所需的量的至少一种菌株以将个体的第一代谢谱改变为个体的第二代谢谱，该菌株选自由肠氨基酸球菌(Acidaminococcus intestinalis)14LG、卵形拟杆菌(Bacteriodes ovatus)5MM、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)20MRS、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、布劳特氏菌(Blautia sp.)27FM、梭菌(Clostridium sp.)21FAA、产气柯林斯菌(Collinsellaaerofaciens)、大肠杆菌(Escherichia coli)3FM4i、链状真杆菌(Eubacteriumdesmolans)48FAA、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)F1FAA、粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)13LG、普氏粪杆菌(Faecalibacterum prausnitzii)40FAA、裂果胶毛螺菌(Lachnospira pectinoshiza)34FAA、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)25MRS、吉氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)5FM、粪罗斯氏菌(Roseburia faecalis)39FAA、肠道罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)31FAA、瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)11FM、瘤胃球菌属(Ruminococcus species)、扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)30FAA及其任何组合；以及治疗个体以便使至少一种菌株充分定殖于个体；其中第一代谢谱为微生态失衡的结果，其中第二代谢谱治疗患有微生态失衡的个体。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括向个体施用治疗有效量的至少一种选自以下的菌株：16-6-I 21FAA 92％耳蜗形梭菌(Clostridium cocleatum)；16-6-I2MRS 95％luti布劳特氏菌(Blautia luti)；16-6-I 34FAA95％裂果胶毛螺菌(Lachnospirapectinoshiza)；32-6-I 30D6FAA 96％glycyrrhizinilyum梭菌(Clostridiumglycyrrhizinilyum)；32-6-I 28D6FAA94％乳酸发酵类梭菌(Clostridiumlactatifermentans)；及其任何组合。

在一些实施方案中，微生态失衡与胃肠炎症相关。在一些实施方案中，胃肠炎症为炎症性肠病、肠易激综合征、憩室病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病或不定型结肠炎。

在一些实施方案中，微生态失衡为艰难梭菌感染。在一些实施方案中，微生态失衡为食物中毒。在一些实施方案中，微生态失衡为化疗相关的微生态失衡。

在一些实施方案中，至少一种菌株和/或菌种公开于：“用于根除艰难梭菌感染的粪便替代移植治疗：RePOOPulating肠道”，佩洛夫等(2013)(‘Stool substitutetransplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection:‘RePOOPulating the gut’,by Petrof et al.(2013))中，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，至少一种菌种公开于：黑川郡等，“比较元基因组学显示人类肠道微生物群中通常富集的基因集”，(2007)DNA研究14:169-181(Kurokawa et al.,“Comparative metagenomics revealed commonly enriched gene sets in human gutmicrobiomes”,(2007)DNA Research 14:169-181)中，其通过引入本文全文参考。

在一些实施方案中，至少一种菌种公开于第20150044173号美国专利申请公开中。或者，在一些实施方案中，至少一种菌种公开于第20140363397号美国专利申请中。或者，在一些实施方案中，至少一种菌种公开于第20140086877号美国专利申请中。或者，在一些实施方案中，至少一种菌种公开于第8,906,668号美国专利中。

在一些实施方案中，本发明的方法可包括评估至少一种细菌，该评估按照乔木村等，(2016)“用于益生元的高通量评估的单批发酵系统模拟人类结肠道微生物群”，PLoSONE 11(8)：e0160533(Takagi et al.(2016)“A single-batch fermentation system tosimulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation ofprebiotics”PLoS ONE 11(8):e0160533)中公开的方法进行。

在一些实施方案中，至少一种菌种来自健康患者。在一些实施方案中，至少一种菌种来源于根据第20140342438号美国专利申请公开中公开的方法的健康患者。

在一些实施方案中，至少一种菌种和/或菌株通过包括以下步骤的方法来源于患者：

a.获得新鲜排泄的(voided)粪便样品，并将样品置于厌氧培养室(在90％N₂、5％CO₂和5％H₂的气氛中)中；

b.通过将粪便样品在缓冲液中浸渍产生粪便浆液；和

c.通过离心去除食物颗粒，并保留上清液。

在一些实施方案中，按照美国公开号20140342438的方法用上清液在恒化器中接种。

本发明的一些实施方案的培养方法

用于确定患有微生态失衡的个体的第一代谢谱的方法的有效性可以受到以下因素的限制，例如，该方法的灵敏度(即，如果菌株存在于阈值水平以上，该方法仅能够检测特定的菌株)。

用于确定治疗个体的第二代谢谱的方法的有效性可能受到以下因素的限制，例如，该方法的灵敏度(即，如果菌株存在于阈值水平以上，该方法仅能够检测特定的菌株)。

在一些实施方案中，阈值水平取决于检测方法的灵敏度。因此，在一些实施方案中，取决于检测方法的灵敏度，需要更大量的至少一种菌种以确定个体是否充分定植。

在一些实施方案中，在恒化器容器中培养至少一种菌种和/或菌株。在一些实施方案中，至少一种菌株选自以下菌株：肠氨基酸球菌14LG、卵形拟杆菌5MM、青春双歧杆菌20MRS、长双歧杆菌、布劳特氏菌27FM、梭菌21FAA、产气柯林斯菌、大肠杆菌3FM4i、链状真杆菌48FAA、挑剔真杆菌F1FAA、粘液真杆菌13LG、普氏粪杆菌40FAA、裂果胶毛螺菌34FAA、干酪乳杆菌25MRS、吉氏副拟杆菌5FM、粪罗斯氏菌39FAA、肠道罗斯氏菌31FAA、瘤胃球菌11FM、瘤胃球菌属、扭链瘤胃球菌30FAA、以及其任何组合，并在恒化器容器中培养。

在一些实施方案中，至少一种菌种选自：16-6-I 21FAA 92％耳蜗形梭菌；16-6-I2MRS 95％luti布劳特氏菌；16-6-I 34FAA 95％裂果胶毛螺菌；32-6-I 30D6FAA 96％glycyrrhizinilyum梭菌；32-6-I 28D6FAA 94％乳酸发酵梭菌；以及其任何组合，并在恒化器容器中培养。在一些实施方案中，恒化器容器为第20140342438号美国专利申请中公开的容器。在一个实施方案中，恒化器容器为图10中描述的容器。

在一些实施方案中，通过封堵冷凝器并将氮气鼓泡通过培养物，将恒化器容器从发酵系统转化为恒化器。在一些实施方案中，压力迫使废物从设定高度处的金属管(以前称为采样管)出来，并且使得能够维持恒化器培养物的给定工作体积。

在一些实施方案中，通过将过滤的氮气鼓泡穿过恒化器容器来使恒化器容器保持厌氧。在一些实施方案中，自动控制并保持温度和压力。

在一些实施方案中，使用5％(v/v)HCl(σ)和5％(w/v)NaOH(σ)维持恒化器培养物的培养物pH。在一些实施方案中，pH为6.8-7。在一些实施方案中，pH为6.9-7。在一些实施方案中，pH为6.8-6.9。

在一些实施方案中，不断更换恒化器容器的培养基。在一些实施方案中，更换发生在与远端肠道的保留时间相等的时间段内。因此，在一些实施方案中，培养基以400mL/天(16.7mL/小时)的速率连续进料到恒化器容器中以产生24小时的保留时间，设定该值以模拟远端肠道的保留时间。替代的保留时间可以为65小时(约148mL/天，6.2mL/小时)。在一些实施方案中，保留时间可以短至12小时。

在一些实施方案中，培养基为第20140342438号美国专利申请公开中公开的培养基。

材料和方法

含抗性淀粉的基质的制备

来自六个玉米品系(line)(表2.1)的玉米粉进行体外消化和发酵。干玉米粒(maize kernel)从Michael Emes博士(安大略省圭尔夫大学)处获得并磨碎，使用旋风磨(UDY旋风式样品粉碎磨(UDY Cyclone Sample Mill))磨碎使的能够通过1mm筛，得到精细的玉米粉。将30g玉米粉悬浮于500ml磷酸盐缓冲液(20mM，pH6.9，Na₂HPO₄ 1.42gL^-1，KH₂PO₄1.36gL^-1，NaCl0.58gL^-1)中，在121℃高压处理30分钟，在磁力搅拌器上在搅拌下冷却至37℃，立即进行消化步骤。消化在无菌条件下进行。简而言之，将溶液在37℃下在磁力搅拌器上孵育，并且以以下方式逐步添加消化酶(均来自西格玛奥德里奇，奥克维尔，安大略省(Sigma Aldrich,Oakville,Ontario))：1)通过加入NaOH(20％(w/v))将pH调节至6.9±0.1，加入0.5mL人唾液α-淀粉酶溶液(10mg/mL，在CaCl₂中，1mM)并孵育15分钟；2)通过加入HCl(20％(v/v))和1.25mL猪胃蛋白酶悬浮液(1mgmL^-1，在NaCl 9gL^-1中)将pH调节至2.0±0.1，并孵育30分钟；3)通过加入碱(20％(w/v)NaOH)将pH调节至6.9±0.1，加入10mL胰酶(0.5mg/mL，在CaCl₂中25mM)和12g牛胆汁(西格玛奥德里奇)孵育3小时。使用具有12-14kDa的截留分子量的无菌透析管(Servapor 44146，Serva Feinbiochemica GmbH&Co.，海德堡，德国)，在4℃下在ddH₂O中持续搅拌24小时以通过透析去除消化产物。将渗余物转移到无菌的50mL锥形瓶中并冷冻干燥4天(12升冷干系统(12Liter FreezeDry System)，Labconco，MO，美国)。使用无菌技术，使用研钵和研杵将干燥的基质研磨并通过500μm筛以获得均匀的粒度。将制得的淀粉基质储存在-20℃直到用于体外小规模分批发酵。

表2.1在体外研究期间选择用于分析的玉米突变体

抗性淀粉测定：

使用Megazyme RS检测试剂盒(Megazyme International，爱尔兰)测定6种玉米品系的预消化和未处理的玉米粉中的抗性淀粉(RS)、可溶性淀粉(SS)和总淀粉(TS)的量。简而言之，将样品在含有淀粉葡糖苷酶(AMG)(3UmL^-1)的4ml胰α-淀粉酶(10mgmL^-1)存在下在37℃下连续摇动消化16小时。通过在3000g下离心将溶解的淀粉从未消化的抗性淀粉中分离，并用50％乙醇重复洗涤。RS颗粒通过在恒定搅拌下加入KOH(2M)调节pH而溶解。将SS和RS部分在50℃下分别用AMG 10μL(300UmL^-1)处理20分钟和用0.1mL(3300UmL^-1)处理30分钟。最后，将0.1mL等分的这些溶液与3mL葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂(GOPOD)合并，并在50℃孵育20分钟，然后对照试剂空白在510nm处测量吸光度。根据制造商的说明计算RS和SS；这些部分的总和等于TS。

恒化器操作

单级恒化器的制备

通过关闭冷凝器出口并将氮气鼓泡通过培养物将Infors Multifors生物反应器系统(Infors，瑞士)转化为恒化器，在容器内产生厌氧环境和正压，其将容器内容物保持在400mL的恒定体积。在实验过程中不断监测温度和pH，通过添加酸(5％(v/v)HCl)和碱(5％(w/v)NaOH)保持恒定的37℃和6.9-7.0的pH。不断搅拌容器并以400mL/天的速率向容器提供表2.2中详细描述的流量恒定的新鲜培养基，从而得到24小时的保留时间以模拟人远端结肠。在接种之前，将每个容器无菌取样并接种于用5％去纤维蛋白的羊血补充的苛养厌氧菌琼脂(Acumedia；兰辛，密歇根州)(Hemostat Laboratories；Dixon,加利福尼亚)(FAAb)，并在37℃下在有氧和厌氧条件下孵育以确保容器没有污染。

所使用的培养基基于先前使用恒化器模拟人类肠道的研究。培养基在4种独立的储备制剂(stock preparation)(表2.2)中制备，并在生物学安全工作橱中无菌地合并，以及将2.5mL消泡剂B有机硅乳液(J.T.Baker；Center Valley，宾夕法尼亚州)加入到每升制备的溶液中。在加入之前将制剂1和4高压处理，而制剂2和3通过0.22μm过滤器过滤。通过在FAAb上接种来检查培养基的无菌性，并且在使用前在4℃保存少于2周。

粪便接种物的收集和制备

圭尔夫大学的研究伦理委员会(Research Ethics Board of the University ofGuelph)批准了这项研究(REB#09AP011)。三名健康供体为这项工作提供了新的粪便样本：供体2(女性，42岁)、供体5(男性，44岁)和供体9(男性，25岁)。在本研究收集样品前的一年内，所有供体都没有慢性疾病史或抗生素治疗史。

进行粪便收集和制备。简而言之，将样品收集在附近洗手间的无菌带盖容器中，并在排泄后5-10分钟内将其转移到厌氧室(90％N₂、5％CO₂和5％H₂的气氛)中。使用匀质器(Tekmar Stomacher Lab Blender，苏厄德；沃辛，西萨塞克斯郡，英国)在50mL脱气的恒化器培养基中将粪便(5g)匀化1分钟，产生10％(w/v)粪便浆。在175xg下低速离心10分钟去除大颗粒。上清液在本研究中用作恒化器的粪便接种物。

通常的做法是在恒化器接种之前通过温和地离心粪便来去除大的食物颗粒。先前的研究表明，与原始粪便样品相比，低速离心不会向上清液的微生物群落引入明显偏差。

表2.2：用于单级恒化器模型的生长培养基组合物(每升制备的培养基)。上标表示化学品供应商：(a)西格玛奥德里奇(奥克维尔，安大略省)；(b)赛默飞世尔科技公司(渥太华，安大略省)；(c)BD(富兰克林湖，新泽西州)；(d)阿法埃莎(马萨诸塞州沃德希尔)；(e)BDH(拉德诺，宾夕法尼亚州)。

接种、操作和取样

通过向300mL无菌恒化器培养基中加入100mL 10％粪便接种物(inoculum)(第2.3.2节)来接种恒化器容器。接种后立即开启搅拌和pH控制，并在运行期间保持开启。使培养物在启动进料泵之前在容器内定殖(establish)24小时。恒化器容器的每日取样包括加入20滴消泡剂B有机硅乳液(J.T.Baker；Center Valley，宾夕法尼亚州)和通过容器取样口除去4mL培养物。将样品等分到2×2mL管中，并在-80℃下存档用于随后的DNA提取。

体外静态批量淀粉发酵

接种来自供体2、5和9的粪便的恒化器如先前所述(第2.3.3节)操作，来自这些恒化器的稳定的稳态群落用作所有后续发酵的接种源。按照先前研究的程序，在37℃厌氧培养箱中进行具有50mL工作体积的静态分批发酵。简而言之，将0.5g各种淀粉基质无菌转移至生物学安全工作橱中的100mL瓶中以达到10gL^-1的最终浓度。

紧接在加入恒化器培养物之前，向瓶中加入45mL无菌的预还原的基础培养基(pH6.9±0.1)(表2.3)。每瓶接种5mL新鲜恒化器培养物，终浓度为100mL/L。对照发酵含有50mL发酵缓冲液和0.5g各种淀粉(10gL^-1)或45mL含有5mL新鲜恒化器培养物(100mL/L)的发酵缓冲液。

静态分批发酵在37℃和无pH控制的条件下在厌氧培养箱内运行48小时。在接种后的0、4、8、24和48小时取两份2mL的样品，并在-80℃下冷冻以进行DNA和VOC分析。在这些实验中进行多种淀粉基质发酵，并且根据淀粉基质、生物复制(biological replicate)#、技术复制#(罗马数字)和样品时间点标记每种发酵。例如(Cg102 1i-48h)表示接种后48小时从含有淀粉基质Cg102的发酵的第一生物复制和第一技术复制中取样的样品。

恒化器饲养试验

标准恒化器培养基补充有预先消化的Hi-玉米260(高RS)(国家淀粉化学公司(National Starch and Chemical)，曼彻斯特，英国)或玉米淀粉(对照)(西格玛奥德里奇，奥克维尔，安大略省)以模拟在体内饲养试验期间的消耗的量，在消化前总共30g/天。根据先前描述的方法(第2.1节)稍作修改，将120g Hi-maize 260和玉米淀粉以30g批次消化。将淀粉在磷酸盐缓冲液(20mM，pH 6.9，Na₂HPO₄ 1.42gL^-1，KH₂PO₄ 1.36gL^-1，NaCl0.58gL^-1)中煮沸20分钟，在透析之后，将渗余物直接加入到恒化器培养基中(溶液1，表2.1)，在对溶液1进行高压处理之前，不进行冷冻干燥，如前所述制备其余培养基。

两对“双”恒化器容器(用相同接种物接种的两个相同恒化器容器)(D5-1和D5-2)和(D9-R1和D9-R2)在没有任何实验操作的情况下运行，直到容器达到稳定状态。在稳定状态建立之后，在容器D5-1(RS+)和D9-R1(RS+)上改变培养基以提供持续时间为4天的30g/天(消化前)的Hi-玉米260的的等效物。在提供相同体积30g/天(消化前)玉米淀粉4天的容器D5-2(CS+)和D9-R2(CS+)(对照容器)上的培养基类似地改变。在淀粉增加4天后，所有容器都返回到基础恒化器培养基并运行4天以提供终止实验前的清除期。在整个实验过程中如前所述对容器进行取样。

表2.3在小规模分批发酵中使用的基础培养基(每升制备的培养基)。上标表示化学品供应商：(a)西格玛奥德里奇(奥克维尔，安大略省)；(b)赛默飞世尔科技公司(渥太华，安大略省)；(c)BD(富兰克林湖，新泽西州)；(d)阿法埃莎(马萨诸塞州沃德希尔)。

DNA提取

利用珠磨法(bead-beating)和两种可商购试剂盒的组分的组合，根据修改方案从存档的样品中提取DNA。简而言之，将200mg玻璃珠、300μL SLX缓冲液(Omega Bio-TekStool DNA试剂盒；Norcross，乔治亚州)和10μL蛋白酶K(20mgmL^-1，在0.1mMCaCl₂中)加入到2mL螺旋盖管。在将200μL等分到螺旋盖紧的Eppendorf管中之前，将每个样品解冻并充分混合，然后将Eppendorf管置于珠磨器中并使用Disruptor Genie(Scientific Industries，波希米亚，NY)以3000rpm处理4分钟。将样品在70℃孵育10分钟，在95℃孵育5分钟，然后在冰上孵育2分钟。向管中加入100μL缓冲液P2(Omega Bio-TekStool DNA试剂盒；Norcross，乔治亚州)并涡旋处理30秒，随后在冰上再孵育5分钟。将样品以20450xg离心5分钟，并将上清液转移至具有200μL的HTR试剂(Omega Bio-TekStool DNA试剂盒；Norcross，乔治亚州)的新的1.5mL试管中，涡旋处理10秒并在室温下孵育2分钟。最后将样品以20450xg离心2分钟，将上清液转移至16DNA纯化试剂盒(Promega；麦迪逊，威斯康星州)中，根据Maxwell试剂盒说明完成剩余提取方案。

活/死细胞比较

使用PhAST Blue光激活系统(PhAST Blue，GenIUL，巴塞罗那，西班牙)测试选择的样品以确定群落动态的变化是否受源自死细胞群落的DNA存在的影响。使用单叠氮化乙锭(EMA)按照制造商的说明使来自死的(可渗透的)细胞的DNA失活。随后立即在0和48小时取样，使用微量移液管均质样品，并将200μL等分试样加入到提供的试剂管中并轻轻涡旋处理。将样品在冰水浴中孵育并在涡旋混合器上间歇混合10分钟并转移至无菌反应管中。使用预设的制造商设置(15分钟，100％强度)，并利用所提供的PhAST Blue系统设备(蓝光发生器)对样品进行光激活。将样品以20450xg离心5分钟，弃去上清液并将沉淀物重新悬浮于200μL无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后按照前述方案进行DNA提取。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析

在接种后0和48小时从所有分批发酵中提取DNA，并且每2天从恒化器容器中提取DNA，用于DGGE分析确定群落动态的相似性和变化。进行PCR、PCR纯化和浓缩、DGGE和凝胶分析。引物HDA1和HDA2-GC用于扩增16S rRNA基因的V3区(339-539bp，大肠杆菌编号)。循环条件为：92℃下保持2分钟、(92℃下保持1分钟，55℃下保持30秒，72℃下保持1分钟)×35个循环；72℃下保持10分钟。提取的DNA作为模板，每个样品在三个相同的PCR反应中扩增。通过琼脂糖凝胶电泳(2％琼脂糖w/v，在1x三羟甲基氨甲烷-乙酸盐-EDTA(TAE)中，80V下40分钟)分析PCR产物以确保PCR反应成功。

用EZ-10Spin柱式PCR产物纯化试剂盒(Spin Column PCR ProductsPurification Kit)(Biobasic；Markham，安大略省)按照略微修改的方案将相同的样品合并和浓缩。将样品在40μL HPLC级水中洗脱并与10μL DGGE加载染料(在HPLC级水中的0.05％(v/v)溴酚蓝；0.05％(v/v)二甲苯蓝；70％(v/v)甘油；Bio-Rad DCode手册)混合。在所有DGGE凝胶的外部和中部泳道上运行使用先前从室内可获得的人肠道细菌分离株提取的DNA开发的DGGE标准梯。包含在梯内的DNA样品来自以下细菌分离株：粪芽孢菌(Coprobacillus sp.)(1/2/53)、肠球菌(Enterococcaceae sp.)(30/1，亦称HMP#323)、韦荣球菌(Veillonella sp.)(5/2/43FAA)、梭菌(Clostridium sp.)(1/1/41A1FAA CT2，亦称HMP#174)和丙酸杆菌(Propionibacterium sp.)(7/6/55B FAA)。如前所述，使用HDA1和HDA2-GC引物通过扩增每种菌株的DNA来制备梯，并以相同的比率合并产物。

按照先前描述的方案，使用DCode系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，加利福尼亚)以6％(v/v)聚丙烯酰胺凝胶进行DGGE。利用由尿素和甲酰胺组成的30-55％变性梯度来分离纯化的PCR产物。凝胶在60℃下在1xTAE缓冲液中在120V下电泳5小时。将凝胶着色，然后分别在单叠氮化乙锭(100μl，1L 1xTAE)(西格玛奥德里奇，奥克维尔，安大略省)和ddH₂O中脱色10分钟。运行GeneSnap软件(版本6.08.04，Synoptics Ltd；剑桥，英国)的SynGene G-Box凝胶文档系统被用来捕获凝胶的图像。在捕获过程中，使用GeneSnap软件的自动曝光工具来使图像的饱和度标准化。

Syngene GeneTools软件(版本4.01.03，Synoptics Ltd)用于分析DGGE凝胶。通过计算Pearson相关系数值(相似性指数(SI)值)来分析样品图谱之间的DGGE带型(bandingpattern)的相似性，从而生成相似性矩阵。SI值为0-1；值为1表示两个图谱包含相同的带型，而值为0表示两个图谱之间没有共同的带型。将SI值乘以100以获得相关系数(％相似性指数(％SI)值)。使用非加权配对算术平均法利用％SI值来产生树状图。

通过比较条带(banding)图谱的相似性，使用相同DGGE凝胶内的相同梯样品来计算凝胶特异性“截止阈值”。理论上，相同的梯样品应该是100％相似的；然而，由于与DGGE相关的实验误差和贯穿整个凝胶的变性梯度的变化，％SI值总是小于100％。梯样品之间的％SI值定义为“截止阈值”，因此具有大于的“截止阈值”的％SI值的样品被认为是相同的，而％SI值在“截止阈值”的5％以内的被认为是相似的。

群落动态和容器之间相似性

利用移动窗口相关性分析来说明群落动态，评估一段时间内群落内的变化。这些图用于确认群落达到稳定状态并评估响应体外饲养试验的群落稳定性。图上的每个点代表在第(x-2)天与第(x)天的源自同一容器的样品的DGGE谱之间的百分比变化(100-％SI)。使用％SI值确定“双容器”之间群落相似性的变化。图中的每个点表示在处理过程中在相同天的两个容器之间的％SI。相似性降低表示响应于不同处理的容器之间的群落结构的差异。

DGGE模式分析：非度量多维测度

非度量多维测度(NMDS)是一种排序(ordination)技术，旨在以图形方式总结数据集内的复杂关系。NMDS不需要变量之间的线性关系，并尝试保持样本之间相似度的排序顺序。因此，群落构成更相似的样本彼此之间的位置更加紧密。通过Pearson相关系数值的计算分析DGGE谱的相似性，使用XLstat(Addinsoft，hhttp://www.xlstat.com)生成用于为每个DGGE凝胶创建NMDS图的相似性矩阵。克鲁斯卡尔应力(Kruskal’s stress)公式1被用来确定图准确表示相似度矩阵的程度，应力值<0.1代表良好的排序，其得出错误的关于模式的结论的风险较低。值0.1<x<0.2，尽管接近0.2的值可能会产生误导并因此在得出有关结果的结论时应该保持谨慎，但仍然会产生一个可用的模型。所有NMDS图表都是小规模分批发酵的DGGE谱之间的关系的二维模型。

SPME-GC-MS参数

在接种后0和48小时，使用与气相色谱-质谱(GC-MS)结合的固相微萃取(SPME)从小规模分批发酵中提取并分析挥发性有机化合物(VOC)。根据稍微修改的用于粪便VOC分析的方案，测定淀粉基质发酵后存在的代谢物的变化。简而言之，将在-80℃下存档的样品在室温下解冻，充分混合，然后将1mL转移到10mL玻璃小瓶中，并用包含PTFE硅酮隔膜(MicroLiter Analytical Supplies,Inc.,GA,USA)的卷曲顶盖(crimp top lid)封盖。

使用配备有自动化SPME自动取样器的Bruker Scion 436GC仪器进行SPME-GC-MS法。分析柱为ZB-624(Phenomenex,Torrance,CA,USA)毛细管柱(30m×0.25mm；膜厚度1.40mm)。进样口设定在280℃。烘箱温度条件如下：从35℃的初始温度开始5分钟，以7℃min^-1的速率将温度升高至250℃并保持12分钟，总运行时间为47.71分钟。载气流量(氦气，纯度>99.999％)在恒流模式下保持在1.0mLmin^-1。将GC-MS编程为执行分流进样，样品以1:20分流比注入。SPME注射器参数如下：搅拌器温度75℃，样品预孵育时间15分钟，用纤维孵育的时间(提取时间)30分钟，解吸时间5分钟。使用由二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)(Supelco,Bellefonte,PA,USA)制成的SPME纤维束(fiber assembly)。

质谱仪(Scion TQ)配备有电子碰撞(EI)离子源。所有实验均以正离子模式进行。源温度设定为200℃，能量为70eV。乘法器电压设置为900V。数据以全扫描模式从30-300m/z以4次扫描/分钟的速率和4分钟的延迟获取。准备一个空的玻璃小瓶作为对照，并在与样品小瓶相同的条件下储存并按照相同的方案进行分析。通过与NIST质谱数据库(美国国家标准与技术研究所(National Institute of Standards and Technology)，Gathersburg，MD)的比较，对感兴趣的峰进行初步鉴定。

GC-MS数据处理和统计分析

使用mzXML转换实用程序(Bruker)将原始GC/MS数据转换为.xml格式，并且随后使用以R语言(版本2.15.3，用于统计计算的R-Foundation，www.Rproject.org)实现的XCMS软件包(版本1.36.1)对数据进行处理以使用先前描述的参数进行自动峰值检测和峰值对准。从R输出得到的以制表符分隔的表格被导入Microsoft Excel软件(Microsoft,Redmond,WA)，离子特征被归一化为总峰面积并且被安排在包含作为m/z保留时间对的质谱特征、样品名称和峰面积的表格，然后输入SIMCA-P+13.03(Umetrics，瑞典)以使用PCA和隐变量正交投影判别分析(OPLS-DA)进行统计分析。对于PCA和OPLS-DA，变量为的平均中心化的(mean-centered)和Pareto标度化的(pareto-scaled)，分析PCA得分图以确定使用来自3个供体的粪便接种物发酵的数据集的通用结构。OPLS-DA用于区分两类(0h和48h取样时间点)代谢物谱的差异；模型进行7次交叉验证，每轮验证随机排除1/7数据，并使用交叉验证残差的方差分析(CV-ANOVA)评估模型的可靠性。使用来自OPLS-DA模型的变量影响投影(VIP)值(高于统计明显阈值(VIP值>1))识别两个时间点分离的关键代谢物。使用Mann-Whitney-Wilcoxon测试，在GraphPad Prism(版本5，GraphPad software Inc，加利福尼亚州，美国)中分别评估满足VIP截止值(cut-off)的代谢物以获得两组之间的差异，如果P值<0.05，则认为样品显著不同。

通过相互比较48h发酵样品来确定每个供体的粪便微生物群对6种淀粉基质的发酵之间的代谢差异。如上所述产生PCA和OPLS-DA模型，分析PCA得分图以确定数据集的通用结构。将样品放入基于淀粉基质的6种确定的类别中，并且使用如前所述的OPLS-DA建模将其互相成对地进行比较。

基因组序列

本研究的数据包括表4中公开的33种菌株的草图基因组序列(以重叠群形式)。使用Illumina MiSeq平台对细菌基因组进行测序。通过全长16S rRNA基因的比较，根据最接近的匹配对菌种进行命名，其可能不能反映细菌的真实的菌种形成，为简单起见，在部分I中使用的细菌已被赋予菌株A或菌株B的不同身份，表1提供了这些菌株的真实身份。

研究设计

该研究包括三个阶段。第一阶段侧重于比较菌种的基因组，RepoOPulate研究(Petrof等人)(也称为“原始RepoOPulate原型”或“原始RepoOPulate生态系统”)中包含所述菌种的成对菌株。为了寻找冗余，将通过全长16S序列比对而严密匹配的六对菌种菌株的基因组进行比较。基于培养的细菌的形态和行为差异，最初选择这些细菌的多种菌株以包含在RePOOPulate生态系统中。该项目的这一部分的目标是确定多种菌株的使用是否冗余或者确定是否存在真实的遗传差异，该遗传差异可证实包含两种菌株对维持生态平衡具有生物学必要性。

该项目的第二阶段侧重于开发确定KEGG通路的遗传覆盖范围的广泛途径(pipeline)。KEGG代表“京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes)”，其是通路分析的常用资源，包含与通路、基因、基因组、化合物和反应信息相关的数据。本报告部分II将侧重于比较整个RepoOPulate生态系统的KEGG通路，寻找关键的菌种和通路以及可能在生物化学上冗余的菌种。

项目的第三阶段的侧重于确定包含在RePOOPulate中的细菌基因是否提供了必要的生物化学通路的充分覆盖而没有高水平的遗传冗余。报告部分III显示与“健康”的人类微生物群相比，KEGG通路的整个RepoOPulate群落的覆盖。这使得能够检查KEGG通路的总体覆盖范围，以确定RePOOPulate群落与人类肠道的真实微生物群的相似程度。

部分I：菌株对内的冗余

方法

Mauve比对

原始RepoOPulate原型生态系统包括六个菌种和两种单独的菌株，总共有十二个菌株。对这六种菌种的两种菌株的全基因组数据进行比较以测试冗余。使用基因组比对可视化工具Mauve的渐进Mauve功能比对和比较这些基因组对。生成的比对基础文件(backbone file)被加载到R中，使用程序包genoPlotR(伪代码提供)创建比Mauve提供的动态图像更多的动态图像(图2)。在比对之后，将每个菌种的菌株指定为菌株A或菌株B以简化比较结果的进一步分析(表1)。

图2显示mauve比对的序列比对图，显示了使用Mauve和R程序包genoPlotR产生的在部分I中分析的六种菌种的菌株对的比对。图2A显示菌株A与菌株B的青春双歧杆菌序列比较。图2B显示菌株A与菌株B的长双歧杆菌序列比较。图2C显示菌株A与菌株B的长链多利菌(Dorea longlcatena)序列比较。图2D显示干酪乳杆菌序列比较。图2E显示菌株A与菌株B的扭链瘤胃球菌序列比较。图2F显示菌株A与菌株B的卵形瘤胃球菌(Ruminococcus obeum)序列比较。

表1显示部分I的菌株名称，具体确定了菌株对内的冗余。对于原始RepoOPulate生态系统中包含其两种菌株的六种菌种的各自的成对比较，鉴定被称为菌株A和菌株B的菌株。表中的名称表示RAST服务器上给出的名称，括号内的数字表示RAST基因组ID号。

表1：

使用SEED查看器(viewer)进行比较

此分析中使用的草图基因组已被预先注释并存储在RAST服务器上。RAST使用基于子系统的注释，其识别蛋白质编码rRNA和tRNA基因，为基因分配功能，预测哪些子系统在基因组中表现出来，并使用这些信息重建代谢网络。子系统被定义为功能角色的集合，它们共同实现特定的生物过程或结构复合体。基于子系统的方法建立在以下原则之上：提高高通量注释技术的准确性的关键在于让专家在完整的基因组集合上注释单个子系统，而不是让注释专家试图注释单个基因组中所有基因。注释的基因组保持在SEED环境中，其支持比较分析。在基因组对比对和可视化之后，使用通过RAST服务器访问的SEED Viewer完成每个菌株对的功能比较和序列比较。

功能比较用于使用注释的草图序列识别基于子系统的差异。提供的功能比较输出由被识别的子系统的表格构成，该表格指示哪些子系统是共享的，哪些仅专属于一种菌株。六个比较中的每一个的结果都以制表符分隔的值表形式导出，并在Microsoft Excel中检查。然后使用SEED Viewer完成序列比较以检查蛋白质序列同一性并确定平均遗传相似性。图像输出以图形交换格式(gif)下载，将此比较的文本结果导出为制表符分隔的值表，并在Microsoft Excel中检查。在包含和不包含假设蛋白质数据的情况下检测蛋白质序列同一性。由于使用不同菌株时结果略有不同，因此使用菌株A作为参照和菌株B作为参照进行序列比较。在可能的情况下，还应将菌株与最接近的可用分类学相邻菌株(neighbor)进行比较，以便比较同一属或种内其他菌株中发现的蛋白质序列相似性(图4)。数据表明，基因组尺寸和重叠群的数量可能是序列比较结果中的混杂因素。这在R中使用线性建模来检查。表6中的数据被保存为逗号分隔值文件并加载到R。将两个线性模型拟合以比较平均百分比蛋白质序列同一性与基因组大小和重叠群数量(伪代码提供)。

图4显示最接近的可用菌种匹配的SEED查看器序列比较图。图4A显示参考青春双歧杆菌菌株A与菌株B(外环)与青春双歧杆菌(1680.3)(内环)的比较。图4B显示长双歧杆菌菌株A与菌株B(外环)与长双歧杆菌DjO10A(内环)的序列比较。图4C显示长链多利菌菌株A与菌株B(外环)与长链多利菌ATCC27755(中环)以及长链多利菌DSM 13814(内环)的序列比较。图4D显示干酪乳杆菌菌株B与干酪乳杆菌菌株A(外环)以及干酪乳杆菌ATCC 334(中环)和干酪乳杆菌BL23(内环)的序列比较。在SEED查看器上没有公开可用于比较的瘤胃球菌菌种。

表6显示在部分I中分析的菌株的汇总统计，显示菌株对内的冗余。表6包括以碱基对数目表示的基因组的尺寸、所用草图序列中重叠群的数量、与基于全长16S序列比对的最接近匹配序列的百分比相似性(从原始RePOOPulate文章推断)、使用SEED查看器鉴定的子系统的总数、编码序列的总数和RNA的总数以及使用从Seed查看器获得的数据在MicrosoftExcel中计算的平均百分比蛋白质序列同一性(列出的菌株为用于菌株对的比较的参考菌株)。

表6：

KEGG通路分析

使用KAAS(KEGG自动注释服务器)通过与KEGG GENES数据库中手工策划的一组直系同源组进行BLAST比较来提供草图基因组(重叠群)中的基因的功能注释。将部分I检查的12个基因组的氨基酸FASTA文件上传到KAAS，并使用原核生物基因数据集和为草图基因组数据推荐的双向最佳命中分配方法(bi-directional best hit assignment method)进行注释。结果包含KEGG Orthology(KO)分配和自动生成的KEGG通路。在Microsoft Excel中下载并比较KO分配(KO ID)的列表。使用Microsoft Excel电子数据表格创建了菌株对之间共享的KO ID列表以及一种菌株特有的而其他菌株没有的KO ID列表。然后使用这些列表创建KO ID的最终列表，其权重与KEGG直系同源分配的复制品数目相匹配，并通过是否共享ID来确定颜色(绿色表示共享，红色表示菌株A，蓝色表示菌株B)。然后将最终列表(六种菌种中的每一个都有一个最终列表)导入程序iPath2.0：交互式通路管理器(interactivepathway explorer)。iPath是一个基于网络的工具，用于各种通路图的可视化、分析和定制。目前的版本提供了三种不同的全局纵览图，包括：代谢通路图，使用146个KEGG通路构建，给出了生物系统中的完整代谢的概述；调控通路图，其包括22个KEGG调控通路；和次生代谢物的生物合成图，其包含58个KEGG通路。

在映射之前，将创建的KO ID列表与iPath2.0使用的内部列表相匹配；这会去除若干KO ID，因为iPath2.0在映射程序中不包含所有可用的KO ID。然后使用匹配的列表为六个菌株比较中的每一个创建自定义图谱。通过映射过程为每个菌株比较自动创建冲突列表，其中具有不同颜色或权重的KO ID属于同一通路。Ipath2.0程序通过随机选择自动解决这些冲突。这种解决方法对于这项研究设计并不理想；改为手动解决冲突。任何色彩冲突都解决为绿色，因为颜色冲突意味着该通路是共享的，因此不是独特的。在单个KO ID与相同权重的多个KO ID冲突的情况下，通过取平均权重(四舍五入到最接近的整数)或最小冲突权重来解决权重之间的任何冲突。然后分析最终的图谱和独特的KO ID列表，以确定哪条通路对一种菌株是独特的以及是否可以去除冗余。

结果

不同玉米品系的抗性淀粉测定

所有的淀粉基质都含有相当多的总淀粉；然而，在体外人消化后，所有样品的总淀粉含量降低。未消化的样品的总淀粉含量在61.38±0.54至74.21±2.88g/100g干固体的范围内，而消化的样品在52.89±2.08至66.20±0.08g/100g干固体的范围内(表3.1)。所有样品含有少于70％的总淀粉，这表明，如预期的那样，它们不是纯淀粉(样品由细磨玉米粒制备，除淀粉外，其还包含蛋白质、脂肪和细胞物质)。

Cg102ae1-ref和Cg102ae1-Elmore在消化之前含有最多的RS(分别为10.25±0.20和9.98±2.12g/100g干固体)。在体外消化后，这些相同的基因型还是含有最多的RS(分别为5.68±0.13和4.78±0.25g/100g干固体)。相比之下，Cg102wx在体外消化之前和之后都含有最低水平的RS(分别为0.13±0.003和0.03±0.0003g/100g干固体)(表3.1)。

尽管在体外消化期间采取步骤维持淀粉基质的无菌性，但所有制剂均导致一定程度的污染。图11显示在无菌厌氧基础培养基中0h和48h后六种淀粉基质对照的DGGE谱。针对每种淀粉基质，DGGE分析产生有限数量的条带。在含有粪便接种物的发酵中没有显著出现这些条带。成对的0h和48h样品的平均相似性为97.7％，这表明存在的污染对在小规模发酵过程中观察到的变化没有贡献(表3.2)。

图11显示比较在无菌厌氧基础培养基中0h和48小时后存在于六种预消化的淀粉基质对照中的微生物污染的DGGE谱。

表3.1使用Megazyme抗性淀粉测定试剂盒(Megazyme International，爱尔兰)对体外人消化前后的淀粉基质的抗性淀粉含量、可溶性淀粉含量和总淀粉含量进行定量。

表3.1：

表3.2：比较在无菌厌氧基础培养基中0小时和48小时后存在于六种预消化淀粉基质中的微生物污染的相关系数(％SI)。

小规模分批发酵-合理的

多年来小规模的体外分批发酵已被用于研究各种基质对肠道微生物群的影响。这种技术需要多次从健康供体收集新鲜粪便，这使得研究困难且耗时。将恒化器用作人类肠道的单级远端模型是培养粪便群落的有效手段，所述粪便群落可重现、稳定且保持与原始粪便接种物相似的高水平多样性。在这项研究中，我们使用恒化器模型来培养和维持来自健康供体的粪便群落，使得它们可以反复用作体外小规模分批发酵的储存器，由此不需要对供体粪便进行多次取样，并且确保没有批次间差异。

在单级远端肠道模型中建立稳态群落

使用三个独立的恒化器作为用于体外小规模分批发酵的粪便接种物源：1)用来自“供体2”的粪便接种的单个容器，单一捐献(donation)(V2-1)；2)用来自“供体5”的粪便接种的单个容器，单一捐献(V5-1)；3)用来自供体9的粪便接种的单个容器，第一捐献(V9-1)。分别分析V5-1和V9-1直到第40天和第41天，而分析V2-1直到第38天。

使用扩增的16S rRNA基因的DGGE谱和随后的采用移动窗口分析的图谱分析评估这三个恒化器运行的群落多样性的变化，以确认获得稳态平衡并且该群落适合用于在体外、小规模、分批发酵。使用类似的DGGE分析程序，该程序显示出最大变化率(Δt)值在0-18天之间发生，并随着稳态群落的建立，在第36天稳定。鉴于这一发现，从分析中省略每个恒化器运行的约前两周。需要不同的时间段以使每个容器的Δt值下降到单个凝胶特异性截止阈值(gel-specific cut-off threshold)以下，这表明已经获得稳定状态。然而，在第32天所有容器达到平衡(图12a、b、c)。达到稳定状态后，所有三个运行的Δt值都保持低于各自的凝胶特异性截止阈值或在各自的凝胶特异性截止阈值的5％以内，表明直到在第38天(V2-1)、40天(V5-1)和41天(V9-1)分析期结束每个容器内具有高度的群落相似性(图12a、b、c)。

图12显示接种来自三个健康供体(供体2、5和9)的粪便的恒化器运行的群落动态。每两天对样品进行分析，直到完成小规模分批发酵。利用移动窗口相关分析计算群落动态。a)供体2(第14-38天)，b)供体5(第18-40天)，c)供体9(第17-41天)。

^a表示高于凝胶特异性截止阈值的相关系数，表示具有相同群落图谱的样品，

^b表示相关系数在凝胶特异性截止阈值的5％以内，表示具有相似群落图谱的样品。

值为平均值±标准误差(约)

表3.3显示比较在接种后0小时和48小时后用来自供体2(V2-1)、供体5(V5-1)、供体9(V9-1)的恒化器材料接种的预消化淀粉基质的小规模分批发酵的微生物群落的平均相关系数(％SI)。

图13为DGGE谱的基于Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较用来自a)供体9(V9-1)、b)供体5(V5-l)、c)供体2(V2-1)的恒化器材料接种的Cg102ae1-ref的小规模分批发酵的微生物群落，其中在接种后0小时和48小时取样。黄色阴影样品代表0h样品簇，而蓝色阴影样品代表发酵48h后含有Cg102ae-ref的样品。

使用供体5粪便微生物群的小规模分批发酵

分析使用来自供体5的恒化器粪便接种物在0h和48h的所有发酵的DGGE谱，以确保重复发酵之间的可重复性。含有Cg102ae1-ref和来自供体5的粪便接种物的淀粉基质发酵物在接种后0h和48h具有在凝胶特异性截止阈值的5％以内或大于凝胶特异性截止阈值的相关系数。平均而言，0h样品具有83.5±9.1％的相似性，48h样品具有86.2±7.5％的相似性(表3.3)。接种物对照复制品在0h和48h的相似性分别为85.4％和92.2％，二者均大于凝胶特异性截止阈值(表3.3)。接种(0h)后，淀粉基质和接种物对照发酵图谱按平均值共享大于凝胶特异性截止阈值的高度相似性(87.3±11.2％)。48小时后，平均图谱相似性低于凝胶特异性截止阈值(63.6±5.9％的相似性)(表3.3)。这表明所有的发酵接种了相同的粪便群落，响应于淀粉基质以可重现的方式对其调节。

在0小时和48小时使用其他5种淀粉基质的发酵物的平均相关系数的相似性分别在85.8±9.0％至92.4±3.2％和83.3±8.8％至94.0±2.1％的范围内，所有这些值均在凝胶特异性截止阈值的5％以内或大于凝胶特异性截止阈值(表3.3)。这表明小规模分批发酵在复制品之间始终可重现。与用Cg102ae1-ref观察到的结果相比，包含5种其余淀粉基质的样品在发酵开始时(0h)与接种物对照具有高度相似性，而在完成(48h)时，群落图谱与对照相比存在明显差异。在0h和48h淀粉基质发酵物与相应对照之间的平均相关系数相似性分别在88.9±2.5％至94.2±4.7％、50.1±2.6％至65.0±3.6％的范围内，0h样品在凝胶特异性截止阈值的5％以内或大于凝胶特异性截止阈值，而48小时样品一致地低于凝胶特异性截止阈值，表明接种物对照和淀粉基质发酵物图谱在发酵48小时后不再相似(表3.3)。

使用DGGE簇树分析，观察到在0h时源自Cg102ae1-ref发酵的所有样品(淀粉基质发酵物和接种物对照)均被归为一组。在发酵48小时后采集的样品与0小时的样品分别分组；其中淀粉基质发酵物聚集在一起，但与接种物对照分开(图13b)，表明样品图谱在发酵开始时高度相似并且响应于Cg102ae1-ref的发酵而改变。在其余5种淀粉基质发酵的树状图中也看到类似的趋势，发酵样品始终聚集在一起但发酵48小时后与所有其他样品分开(图29)。

对含有Cgx333的发酵物进行的分析显示一个48小时样品看起来是异常值(2i-48h)，对其相关DGGE谱的目测检查显示样品中仅存在少量条带，因此簇树分析将该样品与所有其他样品分开(图29)。当与所有其他样品比较时，Cgx333供体5 2i-48h的相关系数产生12.1％-25.5％的低％SI值。这一异常结果表明，该样本与其他所有样本非常不同，这可能是由于样本采集过程中的误差或DNA提取过程中的技术误差。因此在确定发酵重现性的所有计算中，将其排除在外(表3.3)。

用于所有小规模分批发酵的NMDS图是使用DGGE谱相似性矩阵创建的；从0h和48h时间点的样品很容易彼此区分，正如在例如Cg102ae1-ref(图14b)以及其他五种淀粉基质(图30)中所见。由不同时间点导致的样品DGGE谱的变化大于由不同样品复制品导致的样品DGGE谱的变化。此外，在淀粉基质发酵和接种物对照之间观察到DGGE谱的大的变化类似于在使用来自供体9的粪便微生物群的发酵物中观察到的结果。

图30显示由DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性产生的相似性矩阵的NMDS图，其比较在接种0小时和48小时后取样的使用接种有来自供体9的粪便微生物群的恒化器材料接种的小规模分批发酵的微生物群落，a)Cg102克鲁斯卡尔应力(1)＝0.056，b)Cg102wx克鲁斯卡应力(1)＝0.060，c)Cg102ae1-Elmore克鲁斯卡尔应力(1)＝0.078，d)Cgx333克鲁斯卡应力(1)＝0.089，e)Cgx333Su2克鲁斯卡尔应力1)＝0.084。

图14为由DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性产生的相似性矩阵的NMDS图，其比较在使用来自以下供体的恒化器材料接种0和48小时后取样的、来自Cg102ae1-ref的小规模分批发酵的微生物群落：a)来自供体9(V9-1)，克鲁斯卡尔应力(1)＝0.073，b)来自供体5(V5-1)克鲁斯卡尔应力(1)＝0.121，c)来自供体2(V2-1)克鲁斯卡尔应力(1)＝0.083。

小规模分批发酵的恒化器接种物的重现性

用于发酵的三种恒化器中的每一种的取样周期为第26-36天(V2-1)、第27-36天(V5-1)和第31-37天(V9-1)(图12)。为了评估作为体外小规模分批发酵的接种物源的恒化器培养物的重现性，通过DGGE和随后的分析比较每个淀粉基质和粪便供体的所有复制样品的0h和48h时间点。

供体9粪便微生物群的小规模分批发酵

使用来自供体9的粪便微生物群孵育的Cg102ae1-ref的所有生物和技术复制品的图谱在刚刚接种后都具有平均91.3±4.1％的相似性，在48小时后的相似性为90.6±5.5％。这两个值都高于凝胶特异性截止阈值，表明复制样品是相同的(表3.3)。在接种对照的生物复制品之间观察到类似程度的相似性：0小时为94.7％的相似性，48小时为88.2％的相似性(表3.3)。比较Cg102ae1-ref发酵物和接种物对照图谱，其在刚刚接种(0h)后具有95.5±2.4％的相似性，高于凝胶特异性截止阈值(表3.3)。48小时后，供体9的接种物对照与含有Cg102ae1-ref的发酵物具有平均53.6±18.7％的相似性，这远低于凝胶特异性截止阈值，表明用Cg102ae1-ref发酵对群落动态具有明显影响(表3.3)。DGGE簇树分析显示在0小时时所有样品(淀粉基质发酵物和接种物对照)被归为一组，表明样品在发酵前高度相似。48h样品被分别分组，含Cg102ae1-ref的样品聚集在一起但与接种物对照分开，这进一步支持了群落动态响应于Cg102ae1-ref发生了独特变化(图13a)。

DGGE簇树分析和相关系数揭示了使用接种有来自供体9的粪便微生物群的恒化器材料的其余5种淀粉基质的发酵具有类似趋势。比较处理复制品的平均相关系数在凝胶特异性截止值的5％以内或大于凝胶特异性截止值，且在0小时具有87.5±7.9％至95.4±2.2％的相似性，在48小时具有80.6±15.7％至94.6±3.1％的相似性，表明复制品的群落动态在所有淀粉基质发酵的开始和完成时分别非常相似(表3.3)。与Cg102ae1-ref类似，在发酵开始时(0h)，所有其他淀粉基质发酵显示与它们各自的接种物对照高度相似；平均相关系数值的相似性在91.8±4.0％至97.0±2.7％的范围内(表3.3)。由于在48小时后平均相关系数值均低于凝胶特异性截止阈值并且相似性在53.4±3.9％至70.3±4.1％的范围内(表3.3)，所以观察到其余5种淀粉在淀粉基质发酵和接种物对照之间的群落动态的变化。DGGE簇树分析显示的趋势与用Cg102ae1-ref观察到的相当：0h样品归为一组，而48h淀粉基质发酵和对照样品彼此分开聚集并且也与0h时间点的样品分开聚集(图27)。

图27显示基于DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较在接种后0和48小时取样的、接种有来自供体9(V9-1)的恒化器材料的淀粉基质的复制品小规模分批发酵的微生物群落。a)包含Cg102的发酵，b)包含Cg102wx的发酵，c)包含Cg102ae1-Elmore的发酵，d)包含Cgx333的发酵，e)包含Cgx333Su2的发酵。以黄色阴影的样品代表0h样品的簇，而以蓝色阴影的样品代表在发酵48h后含有淀粉基质的样品。

使用相似性矩阵来为所有小规模分批发酵创建非度量多维测度(NMDS)图。Cg102ae1-ref发酵0h和48h的DGGE谱很容易彼此区分(图14a)。由时间点导致的DGGE图谱的变化大于由样品复制品导致的DGGE图谱的变化。此外，在淀粉基质发酵和对照之间观察到DGGE谱的大的变化。对于比较其余5种淀粉基质的DGGE谱的NMDS图，观察到类似的趋势(图28)。

图28显示由DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性产生的相似性矩阵的NMDS图，其比较在接种0和48小时后取样的使用接种有来自供体9的粪便微生物群的恒化器材料接种的小规模分批发酵的微生物群落，a)Cg102克鲁斯卡尔应力(1)＝0.041，b)Cg102wx克鲁斯卡尔应力(1)＝0.065，c)Cg102ae1-Elmore克鲁斯卡尔应力(1)＝0.041，d)Cgx333克鲁斯卡尔应力(1)＝0.084，e)Cgx333Su2克鲁斯卡尔应力应力(1)＝0.064。

用供体5粪便微生物群的小规模分批发酵

分析使用来自供体5的恒化器粪便接种物的所有发酵在0h和48h的DGGE谱，以确保重复发酵之间的可重复性。含有Cg102ae1-ref和来自供体5的粪便接种物的淀粉基质发酵物在接种后0h和48h具有在凝胶特异性截止阈值的5％以内或大于凝胶特异性截止阈值的相关系数。0h样品具有平均83.5±9.1％的相似性，48h样品具有平均86.2±7.5％的相似性(表3.3)。在0h和48h的接种物对照复制品分别具有85.4％和92.2％的相似性，均大于凝胶特异性截止阈值(表3.3)。接种(0h)后，淀粉基质和接种物对照发酵图谱平均具有大于凝胶特异性截止阈值的高度相似性(87.3±11.2％)。48小时后，平均图谱相似性低于凝胶特异性截止阈值(63.6±5.9％的相似性)(表3.3)。这表明所有的发酵接种了相同的粪便群落，响应于淀粉基质以可重现的方式对发酵进行调节。

在0h和48h使用其他5种淀粉基质的发酵的平均相关系数分别具有85.8±9.0％至92.4±3.2％的相似性和83.3±8.8％至94.0±2.1％的相似性，所有这些值均在凝胶特异性截止阈值的5％以内或大于凝胶特异性截止阈值(表3.3)。这表明小规模分批发酵在复制品之间始终可重现。与用Cg102ae1-ref观察到的结果相比，包含其余5个淀粉基质的样品在发酵开始时(0h)与接种物对照物具有高度相似性，而在完成(48h)后，群落图谱与对照相比存在明显差异。在0h和48h淀粉基质发酵与相应对照之间的平均相关系数的相似性分别为88.9±2.5％至94.2±4.7％和50.1±2.6％至65.0±3.6％，0h样品在凝胶特异性截止阈值的5％以内或大于凝胶特异性截止阈值，而48小时样品一致地低于凝胶特异性截止阈值，这表明在发酵48小时后接种物对照和淀粉基质发酵图谱不再相似(表3.3)。

使用DGGE簇树分析，观察到来自Cg102ae1-ref发酵的所有样品(淀粉基质发酵物和接种物对照)在0h归为一组。在发酵48小时后采集的样品与0小时时采集的样品分开分组；其中淀粉基质发酵物聚集在一起但与接种物对照分开(图13b)，这表明样品谱在发酵开始时高度相似并且响应于Cg102ae1-ref的发酵而改变。在其余5种淀粉基质发酵的树状图中也看到类似的趋势，发酵样品一致地聚集在一起但与发酵48小时后所有其他样品分开(图29)。

包含Cgx333的发酵物的分析表明，一个48小时的样品看起来是异常值(2i-48h)，对其相关DGGE谱的目测检查显示该样品中仅存在少量条带，因此将簇树分析显示该样品与所有其他样品分开(图29)。当与所有其他样品比较时，Cgx333供体5 2i-48h的相关系数产生12.1％-25.5％的低％SI值。这一异常结果表明，该样本与其他所有样本非常不同，可能是由于样本采集过程中的误差或DNA提取过程中的技术误差。因此在确定发酵重现性的所有计算中，将其排除在外(表3.3)。

图29A-E显示基于DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较在接种0和48小时后取样的接种有来自供体5(V5-1)的恒化器材料的淀粉基质的平行小规模分批发酵的微生物群落。a)包含Cg102的发酵，b)包含Cg102wx的发酵，c)包含Cg102ae1-Elmore的发酵，d)包含Cgx333的发酵，e)包含Cgx333Su2的发酵。以黄色阴影的样品代表0h样品的簇，而以蓝色阴影的样品代表在发酵48h后含有淀粉基质的样品。

用于所有小规模分批发酵的NMDS图是使用DGGE谱相似性矩阵创建的；来自0h和48h时间点的样品很容易彼此区分，正如在例如Cg102ae1-ref(图14b)以及其他五种淀粉基质(图30)中所见。由时间点导致的样品的DGGE谱的变化大于由样品重复品导致的样品的DGGE谱的变化。此外，在淀粉基质发酵和接种物对照之间观察到DGGE谱的大的变化，这类似于使用来自供体9的粪便微生物群发酵观察到的结果。

用供体2粪便微生物群的小规模分批发酵

对在0h和48h的使用由来自供体2的粪便微生物群接种的恒化器材料的发酵谱进行的分析表明与接种有来自供体5和9的粪便微生物群的等同样品相比，在生物复制品之间发酵物具有低得多的相似性。当只对技术复制品进行比较时，在0h时的包含Cg102ae1-ref的发酵的DGGE谱具有高于凝胶特异性截止阈值的平均相关系数(95.9％相似)。所有含有Cg102ae1-ref的发酵复制品之间的平均图谱相似性为48.9±36.5％，表明在发酵开始时生物复制品的差异很大(表3.3)。比较在0小时的生物复制品的接种物对照谱时观察到相同的结果，相关系数仅显示25.1％的相似性，低于凝胶特异性截止阈值(表3.3)。这些低相似性指数表明接种物在发酵过程中发生了变化。因此，粪便接种物的差异可能会掩盖发酵过程中淀粉基质的影响。

用Cg102ae1-ref发酵48小时后，技术复制品具有平均97.6±2.5％的相似性，其高于凝胶特异性截止阈值。在发酵48小时后，生物复制品之间的相似性增加至84.6±0.5％(在凝胶特异性截止阈值的5％以内)，而对48小时时接种物对照谱的比较保持低于凝胶特异性截止阈值，相似性为26.5％。所有复制品发酵之间的平均相关系数在48h内增加至88.9±6.8％(凝胶特异性截止阈值的5％以内)(表3.3)。这表明Cg102ae1-ref的发酵使了微生物组成发生了类似的变化，并且在48小时的发酵期间增加了样品相似性。与使用来自供体5和9的粪便接种物的发酵不同，在接种(0h)后立即观察到淀粉基质与接种物对照发酵图谱之间的低的相似度。图谱的相似性平均为61.1±38.1％，低于凝胶特异性截止阈值。48小时后，平均相似性仍低于截止值，为63.4±36.0％(表3.3)。

DGGE簇树分析进一步支持了这些结果，用Cg102ae1-ref进行的发酵以不同于之前观察到的方式聚集(图13c)。例如，来自两个生物复制品中的每一个的三个0h样品(2个淀粉基质发酵物，1个接种对照)聚集在一起，但与另一个生物复制品分开。48h淀粉基质发酵样品通过技术复制分组到两组配对中，与在使用供体5和9粪便微生物群的发酵中观察到的聚集不同。这表明在比较群落图谱时，接种物的差异比淀粉基质发酵的作用更明显。

在分析使用其余5种淀粉基质的发酵时观察到类似的结果。当比较0h样品谱时，所有发酵相似性都很低，平均相关系数的相似性在66.1±21.1％至81.4±10.2％的范围内，均低于凝胶特异性截止阈值(表3.3)。除了Cg102ae1-Elmore外，在发酵48小时后，所有淀粉基质发酵的相关系数都增加。除Cg102ae1-Elmore的值降至74.7±16.5％外，其他的值在78.6±11.6％至90.0±4.7％的范围内(表3.3)。这表明响应于淀粉基质大部分谱图的相似性增加，反映了对Cg102ae1-ref发酵的观察结果。每种淀粉基质的生物复制品之间的接种物对照的比较显示与使用Cg102ae1-ref观察到的结果相似的结果。0h和48h相关系数分别低于凝胶特异性截止阈值或在凝胶特异性截止阈值的5％以内，分别为37.3％-81.2％的相似性和48.0％-83.2％的相似性(表3.3)。这再次表明生物复制品之间的接种物的变化与使用Cg102ae1-ref观察到的变化类似。在用供体2粪便微生物群接种的发酵的树状图内观察到的聚集与使用其他供体粪便微生物群的发酵不一致。在所有情况下，0h样品产生代表原生物复制品的两个簇。尽管48h样品根据生物复制品被分成两组并且簇集更接近来自第一生物复制的0h样品(图31A-E)。

通常，这些结果表明在容器取样期间恒化器运行(V2-1)的群落动态发生变化，产生用于接种发酵的生物复制品的不同群落。移动窗口相关分析显示V2-1的Δt在第28天和第32天之间增加到凝胶特异性截止阈值以上(图12c)，落在取样周期的中间，表明容器的群落动态的快速变化。恒化器的群落结构的这种快速而显著的变化与之间观察到的组成差异相对应。

使用采用来自供体2的粪便接种物的发酵的DGGE谱相似性矩阵产生的NMDS图与使用来自供体9和5的粪便接种物观察到的那些迥然不同。来自使用例如Cg102ae1-ref的0h和48h时间点的发酵的样品很容易相互区分，生物复制品也是如此(图14c)。DGGE谱的这种增加的可变性也见于其他五种淀粉基质(图32)。这些结果一致地显示相对于淀粉基质对群落的影响，所用的两个生物复制品的接种物引起的群落图谱变化更大。

图32显示由DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性产生的相似性矩阵的NMDS图，其比较在接种0和48小时后取样的用接种有来自供体9的粪便微生物群的恒化器材料接种的小规模分批发酵的微生物群落，a)Cg102克鲁斯卡尔应力(1)＝0.086，b)Cg102wx克鲁斯卡尔应力(1)＝0.110，c)Cg102ae1-Elmore克鲁斯卡尔应力(1)＝0.072，d)Cgx333克鲁斯卡尔应力(1)＝0.068，e)Cgx333Su2克鲁斯卡尔应力(1)＝0.114。

响应于淀粉基质的粪便微生物群的调节

通过使用三种不同的恒化器运行评估6种玉米基质对调节粪便群落动态的影响：1)用供体2的粪便(V2-1)接种的单管；2)用供体5(V5-1)的粪便接种的单管；和3)用供体9(V9-1)的粪便接种的单管。从第26-36天(V2-1)、第27-36天(V5-1)和第31-37天(V9-1)开始对单管进行取样。用各淀粉基质发酵的群落动态显示在生物学和技术复制品之间具有高度可重现性。因此，分别针对每个供体在0小时和48小时通过DGGE将使用所有淀粉基质的发酵的群落图谱相互比较。

来自供体9的粪便微生物群的调节

除了具有74.8％的相关系数的Cg102之外，与接种物对照相比，所有淀粉基质发酵的图谱在发酵开始(0h)时为凝胶特异性截止阈值的5％以内(表3.4)。六种淀粉基质发酵物互相具有平均86.9±6.2％的相似性，表明来自所有发酵的微生物群落在开始时非常相似。供体对照和6种淀粉基质发酵之间的平均相关系数在48小时后远低于凝胶特异性截止阈值，为49.1％-66.0％的相似性，表明群落动态响应于所有淀粉基质发生显著变化(表3.4)。每种淀粉基质发酵物的DGGE谱比较使得在48h后相关系数高于凝胶特异性截止阈值(相似性为89.1％-95.4％)，表明在复制品之间发生相同的群落变化(表3.5)。这些观察结果支持了之前在3.4.1节报告的结果，证实了用恒化器材料接种的发酵的可重现性。

^a表示高于凝胶特异性截止阈值的相关系数，代表具有相同群落图谱的样品，

^b表示相关系数在凝胶特异性截止阈值的5％以内，代表具有相似群落图谱的样品。

表3.4在接种后0小时和48小时将来自接种有由供体9粪便微生物群(V9-1)接种的恒化器材料的预消化淀粉基质的小规模分批发酵的微生物群落与接种物对照的微生物群落进行比较的平均相关系数(％SI)

^a表示高于凝胶特异性截止阈值的相关系数，代表具有相同群落图谱的样品，

^b表示相关系数在凝胶特异性截止阈值的5％以内，代表具有相似群落图谱的样品。

表3.5在接种48小时后对来自接种有由供体9的粪便微生物群(V9-1)接种的恒化器材料的预消化淀粉基质的小规模分批发酵的微生物群落进行比较的平均相关系数(％SI)。

DGGE簇树分析显示，所有发酵和接种物对照在刚刚接种(0h)后聚集在一起。发酵48小时后，接种物对照与所有其他样品分开聚集，而淀粉基质发酵根据淀粉基质成对聚集(图15)。在48小时后，Cg102ae1-ref和Cg102ae1-Elmore更密切地聚集在一起，并与其余4个淀粉基质分开(图15)。Cg102ae1-ref和Cg102ae1-Elmore样品之间的平均相关系数比凝胶特异性截止阈值高94.4％，因此这两种不同的淀粉基质对群落动态具有相似的影响(表3.5)。与Cg102ae1-ref和Cg102ae1-Elmore相比，Cg102、Cg102wx、Cgx333和Cgx333Su2均具有低于凝胶特异性截止阈值的相关系数，表明了群落的差异性(表3.5)。Cg102和Cg102wx聚集在一起，Cgx333和Cgx333Su2同样聚集在一起，具有高于凝胶特异性截止阈值的相关系数，分别为88.17％和92.47％(图15)。这四种淀粉一起形成了较大的簇，其相关系数具有82.7％至92.5％的相似性，在凝胶特异性截止阈值的5％以内或大于凝胶特异性截止阈值，表明四种淀粉基质的发酵产生具有相似图谱的群落。

图15基于DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较在接种0和48小时后取样的用接种有来自供体9的粪便微生物群的恒化器材料接种的小规模分批发酵的微生物群落。黄色阴影的样品代表0h样品，而蓝色阴影的样品代表发酵48h后含有淀粉基质的样品。

在NMDS图中观察到，来自6个淀粉基质的发酵的DGGE谱在48小时后容易彼此区分(图16)。样品以与树状图中观察到的类似的方式聚类在NMDS图上。尽管观察到由取样时间点引起的图谱变化最大，但淀粉基质引起的图谱的变化大于发酵复制品引起的的变化。在NMDS图中观察到4个簇与在树状图中观察到的簇相似：一个包含全部0h样品；剩余的3个簇含有48h淀粉基质发酵样品。这些簇包含：1)Cg102ae1-ref和Cg102ae1-Elmore，2)Cg102和Cg102wx，以及3)Cgx333和Cgx333Su2。

图16由DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性产生的相似性矩阵的NMDS图，其比较在接种0和48小时后取样的用接种有来自供体9的粪便(V9-1)的恒化器材料接种的淀粉基质的小规模分批发酵的微生物群落，克鲁斯卡尔应力(1)＝0.105。

来自供体5的粪便微生物群的调节

在0小时和48小时比较淀粉基质发酵图谱和接种物对照图谱以确定响应于各种淀粉基质是否发生独特的变化。比较来自所有发酵的接种(0h)后立即采集的样品的DGGE谱，在0h六种测试淀粉的图谱相互具有平均95.4±2.2％的相似性，其高于凝胶特异性截止阈值。这表明所有淀粉基质发酵都用相同的微生物群落接种。

发酵48小时后，与接种物对照相比，六种淀粉基质发酵的图谱具有36.5％-61.8％的相似性的平均相关系数，远低于凝胶特异性截止阈值(表3.6)。因此，与对照相比，所有的淀粉基质发酵都会引起微生物群落的显著变化。比较发酵48小时后每种淀粉的两种生物复制品；除Cgx333外，所有淀粉基质的相关系数均高于凝胶特异性截止阈值，为86.2％-96.7％(表3.7)。Cgx333的生物复制品之间的相关系数为18.6％的相似性，低于凝胶特异性截止阈值。这是由于Cgx333 2i-48h，其在DGGE凝胶上显示出很少的条带(图17)。因此，如3.4.2节所述，此样品被视为异常值，可能是由技术误差引起的，并在其他发酵之间的比较中被排除在外。

表3.6：

对在接种后0小时和48小时的来自接种有由供体5的粪便微生物群(V5-1)接种的恒化器材料的预消化淀粉基质的小规模分批发酵的微生物群落与接种物对照的微生物群落进行比较的平均相关系数(％SI)

表3.7：

^a表示相关系数大于凝胶特异性截止阈值，表示具有相同群落图谱的样品的，

^b表示相关系数在凝胶特异性截止阈值的5％内，表示具有相似群落图谱的样品。

*Cgx333 2i-48h的DGGE谱几乎没有条带，结果在48小时的两个Cgx333发酵样品的比较产生非常低的相关系数。因此，来自与Cgx3332i-48h比较的相关系数值未被用于表中其余部分的计算方法。

表3.7显示在接种48小时后的来自接种有由供体5的粪便微生物群(V5-1)接种的恒化器材料的预消化淀粉基质的小规模分批发酵的微生物群落的平均相关系数(％SI)。

DGGE簇树分析显示，基于取样时间(0h或48h)，所有淀粉基质发酵一起聚集成两组。接种物对照样品(0h和48h)聚集在一起，并且比48h组更接近淀粉基质的0h组。包含48h样品的组被分成两个亚组，一个亚组由Cg102、Cg102wx、Cg102ae1-ref和Cg102ae1-Elmore组成，另一个亚组包括Cgx333和Cgx333Su2(图17)。

图17基于DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较在接种0和48小时后取样的用接种有来自供体5的粪便(V5-1)的恒化器材料接种的6种淀粉的小规模分批发酵的微生物群落。黄色阴影样品代表0h样品，而蓝色阴影样品代表发酵48h后含有淀粉基质的样品。

表3.7中记载了48小时后比较淀粉基质发酵之间的谱相似性的平均相关系数。来自包含Cg102、Cg102wx、Cg102ae1-ref和Cg102ae1-Elmore的组的图谱的比较具有的平均相关系数在85.6％至96.1％相似性的范围内，而Cgx333和Cgx333Su2之间的平均相关系数为92.0％的相似性，均高于凝胶特异性截止阈值(表3.7)。相比之下，用Cgx333/Cgx333Su2进行的发酵和用其他四种淀粉基质进行的发酵之间的图谱比较产生的相关系数为71.8％-89.2％的相似性(表3.7)。来自表3.7的相关系数表明，与具有低于凝胶特异性截止阈值的相关系数的Cg102和Cg102wx相比，Cgx333和Cgx333Su2的图谱与具有大于凝胶特异性截止阈值的相关系数的Cg102ae1-ref和Cg102ae1-Elmore更相似。

在NMDS图中观察到，来自6个淀粉基质的发酵的DGGE谱在48小时后容易彼此区分(图18)。样品以与树状图中观察到的类似的方式聚集在NMDS图上。尽管在不同的取样时间点之间观察到的变化最大，但由淀粉基质引起的图谱变化大于发酵复制品引起的变化。

图18由DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性产生的相似性矩阵的NMDS图，其比较在接种0和48小时后取样的用接种有来自供体5的(V5-1)粪便的恒化器材料接种的淀粉基质的小规模分批发酵的微生物群落，克鲁斯卡尔应力(1)＝0.038。

来自供体2的粪便微生物群的调节

在0h的淀粉基质发酵与接种物对照之间的DGGE谱比较产生26.9％-61.0％的相似性的相关系数，低于凝胶特异性截止阈值，表明在发酵的开始时样品与接种物对照几乎不共享相似性。在48小时后，淀粉基质发酵和接种物对照之间的相似性进一步降低，相关系数为21.0％-32.8％的相似性(表3.8)。将淀粉基质发酵图谱彼此比较的相关系数表明，淀粉基质发酵在刚刚接种后(0h)相互具有平均62.9±20.0％的相似性，低于凝胶特异性截止阈值。当48小时后比较每种淀粉基质的生物复制品的DGGE谱时，相关系数低于大多数淀粉基质的凝胶特异性截止阈值，为62.4％至78.9％的相似性。Cgx333Su2是个例外，其相关系数为98.7％(表3.9)。因此，在发酵开始时，所有淀粉基质发酵都是不同的，发酵结束时各淀粉基质的生物复制品也是如此，与先前报道的结果类似(第3.4.3节)。

与使用来自供体5和9的粪便接种物的先前发酵所看到的不同，DGGE簇树分析显示没有明显的簇将供体2的0h和48h样品分离。相反，所有样品似乎以随机方式聚集，与采样时间点、淀粉类型或起源的生物复制品之间没有联系(图19)对相互比较不同淀粉基质发酵的相关系数值进行分析时，观察到相似的趋势。在48小时后所有两种淀粉基质之间的比较都不具有高于凝胶特异性截止阈值的相关系数，表明没有两种淀粉基质发酵之间是彼此相似的(表3.9)。

从使用Pearson相关系数值产生的NMDS图得到与树状图所看到的类似的结果。虽然NMDS图是具有低应力的可靠的数据模型(克鲁斯卡尔应力(1)＝0.113)，但由于数据似乎随机散布在整个图中，因此无法得出任何结论(图20)。

图20由DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性产生的相似性矩阵的NMDS图，其比较在接种0和48小时后取样的用接种有来自供体2的粪便(V2-1)的恒化器材料接种的淀粉基质的小规模分批发酵的微生物群落，克鲁斯卡尔应力(1)＝0.133。

表3.8比较在接种48小时后来自接种有由供体2的粪便微生物群(V2-1)接种的恒化器材料的预消化淀粉基质的小规模分批发酵的微生物群落与接种物对照的平均相关系数(％SI)。

表3.8：

PhAST Blue-活/死细胞DNA标记

由于源自死细胞的DNA的存在，这可能已经影响了对小规模分批发酵中存在的微生物群落的分析的准确性。因此，我们决定用PhAST BLUE系统处理后分析使用供体9粪便接种物的发酵的群落图谱。PhAST BLUE是一种商业化的试剂盒，它利用了包含单叠氮化乙锭(EMA)的DNA不能被扩增的性质。来自微生物群落的样本可能含有死亡或即将死亡的细胞，这些细胞的DNA可能会影响结果的准确性。在gDNA提取和随后的扩增之前用EMA处理样品并随后用强蓝光固定减少了对微生物群落分析实验的准确性的影响。不幸的是，pHAST BLUE系统仅在项目结束时才可用，因此只有用供体9的粪便接种物发酵的第二种生物复制品是用该技术分析的。该系统的局限性在于EMA处理/光固定步骤必须在新鲜获得的样品上进行，不会因冷冻或其他保存方法而受损。

对于6种淀粉基质发酵中的每种发酵，在使用EMA处理和不使用EMA处理的情况下将0小时和48小时的样品的DGGE谱进行比较。在0h的来自Cg102ae1-ref发酵和接种物对照的图谱比较的相关系数平均为97.4％的相似性，用EMA处理的相同样品具有平均相似性为96.3％的图谱(表3.10)。EMA处理和未处理的样品在0h的平均相似性为26.5％(表3.11)。发酵48小时后，含有Cg102ae1-ref的EMA处理的样品的图谱为96.7％的相似性，且与用EMA处理的接种物对照具有平均29.3％的相似性(表3.10)。在接种48小时后在没有EMA处理的Cg102ae1-ref发酵之间的图谱为97.5％相似，并且在48小时后与接种物对照平均为52.3％相似(表3.10)。成对的48h Cg102ae1-ref发酵样品(EMA处理与未处理)的DGGE谱的比较平均具有23.5％的相似性(表3.11)。这些结果表明，PhAST BLUE系统可重复地使来自死细胞中的DNA失活，因为在0h和48h的复制品高于凝胶特异性截止阈值，因此在EMA处理和不用EMA处理时均相同。此外，在0小时和48小时的时间点均观察到在用EMA处理样品之后群落图谱之间存在实质性差异；这表明来自死细胞的DNA对图谱有显著贡献。除48小时接种物对照(经EMA处理和未经EMA处理)外，DGGE簇树分析产生了基于样品时间点和EMA处理的四个不同簇，其均单独的聚集，并与所有其他样品分开(图21)。

表3.10比较来自接种有供体9恒化器材料(V9-1)的预消化淀粉基质的平行小规模分批发酵的微生物群落的再现性的平均相关系数(％SI)。在接种后0和48小时取样，给出了用(阴影)或不用EMA处理的数值。

表3:10：

灰色部分表示经EMA处理的样品

表3:11来自用供体9恒化器材料(V9-1)接种的预消化淀粉基质的小规模分批发酵的平均相关系数(％SI)，其比较在用或不用EMA处理的情况下接种后0和48小时获得的微生物群落之间的以(％SI)值表示的相似性。

用其余五种淀粉基质观察到的趋势与用Cg102ae1-ref观察到的趋势相当，因为EMA处理始终中和来自死细胞的DNA。这导致复制样品的DGGE谱在0h和48h时均保持高水平的相似性，正如用未处理的样品所观察到的(表3.10)。在(表3.11)中记载了对在0小时和48小时的用EMA处理和未用EMA处理的DGGE谱进行比较的平均相关系数。五种淀粉的DGGE簇树分析结果与用Cg102ae1-ref观察到的聚集模式类似(图33)。

图33A-E基于DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较在EMA处理之前和之后的微生物群落。接种后0和48小时从接种有恒化器材料供体9(V9-1)的淀粉基质的平行小规模分批发酵中取样。a)包含Cg102的发酵，b)包含Cg102wx的发酵，c)包含Cg102ae1-Elmore的发酵，d)包含Cgx333的发酵，e)包含Cgx333Su2的发酵。

表3.9对接种48小时后用供体2恒化器材料(V2-1)接种的预消化淀粉基质的小规模分批发酵的微生物群落进行比较的平均相关系数(％SI)。

^a表示高于凝胶特异性截止阈值的相关系数，代表具有相同群落图谱的样品，

^b表示相关系数在凝胶特异性截止阈值的5％以内，代表具有相似群落图谱的样品。

图19基于DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较在接种0和48小时后取样的来自接种有由供体2粪便(V2-1)的恒化器材料接种的6个淀粉基质的小规模分批发酵的微生物群落。黄色阴影样品代表0h样品，而蓝色阴影样品代表发酵48h后含有淀粉基质的样品。

GC-MS数据分析

GC/MS色谱图的目测检查显示0h和48h淀粉基质发酵样品之间的差异(图34)。使用接种有来自三个供体各自的粪便微生物群的发酵的GC/MS数据构建PCA模型以显现数据中的趋势并识别异常值。PCA模型主要沿第一主成分(PC)t[1]始终将0小时样品与48小时淀粉基质发酵样品分开(图22a-c)。此外，在所有三种PCA模型中48h接种物对照样品均单独聚集。在用来自供体5的粪便接种物发酵的数据集中鉴定出单个异常值Cgx333(2i-48h)，并且由于它与0h样品聚集在一起，而与48h样品相对，因此在所有随后的分析中省略Cgx333(2i-48h)。构建OPLS-DA模型以识别在0h和48h样品类别之间不同的潜在变量，去除对照样品以更好地识别受淀粉基质发酵影响的变量(图32d-f)。PCA是一种无监督技术，其中点仅通过数据集内的方差分开；或者OPLS-DA是一种利用类别标识的监督技术，在这种情况下取样时间在Y矩阵中，并将其与从GC-MS分析获得的数据相关联。区分这两种限定的类别的数据被强制进入第一PC，而对分类不起作用的数据被放入连续的正交成分中。从三个供体的数据组构建的OPLS-DA模型沿着第一PC将所有0h发酵样品与48h样品分离。

图34显示在0h和48h时间点使用来自供体9的粪便微生物群接种的恒化器材料的Cg102ae1-ref的发酵的总离子色谱图。红色的色谱代表0h的时间点，而绿色的色谱代表48h的时间点。

VIP图用于鉴定负责组分离的变量。使用VIP统计学(VIP>1)将变量确定为对两种类别的分离的影响最大，使用对归一化峰面积的Mann-Whitney-Wilcoxon检验证实所识别的变量的0h和48h时间点之间的统计学显著差异。在表3.12、3.13和3.14中分别记载了针对使用供体9、5和2的粪便微生物群的发酵的每个变量的结果以及推测代谢物鉴定和倍数变化。在0h和48h样品之间鉴定为不同的大多数代谢物在发酵期间显示减少。由于这项研究的目的是确定粪便微生物群产生的代谢物，这些代谢物可能被宿主吸收，所以在这项研究中没有特别关注与减少相关的代谢物，因此不再进一步讨论。

在用来自所有供体的粪便接种物发酵48小时后观察到丁酸的统计学显著增加。此外，48小时后，来自供体9的粪便接种物的发酵导致戊酸和丙酸的显著增加(表3.12、3.13和3.14)。被鉴定为对每个供体的粪便接种物的样品类别(时间点)的分离具有显著影响的代谢物的差异表明个体的微生物群在宿主的代谢产物的生产和有效性中起关键作用。

为了评估3个供体粪便微生物群对6种淀粉基质是否具有独特的反应，在先前分析的数据集的子集上完成了进一步的分析。基于淀粉基质将仅与48h样品相关的GC-MS数据分成6类，并使用PCA和OPLS-DA模型进行分析。针对使用源于供体9的粪便接种物的发酵的PCA模型表明沿第一PC分离6个淀粉基质的趋势(图23)；然而这种趋势在其他两个供体的PCA模型中未观察到(数据未显示)，并且没有进行进一步的分析。生成OPLS-DA模型用于分析供体9的48小时发酵样品，同时比较两种淀粉基质。当比较淀粉基质的所有可能成对组合之间的差异时，通过OPLS-DA没有得到显著的模型。生成的所有模型生产低R2Y(cum)和Q2(cum)值，CV-ANOVA p值>0.05(数据未显示)，因此模型过度拟合数据并且由于高的CV-ANOVA p值同样是无效的。这表明针对每个供体的粪便微生物群由淀粉基质引起的差异比观察到的由0h和48h时间点引起的差异小得多。因此，未能鉴定到有特定的代谢物在不同的淀粉基质之间显著不同。

图21基于DGGE谱的Pearson和UPGMA相关性的树状图，其比较EMA处理前后的微生物群落。接种后0和48小时从接种有恒化器材料供体9(V9-1)的Cg102ae1-ref的平行小规模分批发酵取样。

图22从使用来自供体9(小图a和d)、供体5(小图b和e)和供体2(小图c和f)的恒化器材料的淀粉基质发酵获得的GC/MS数据的PCA模型(小图a-c)和OPLS-DA模型(小图d-f)。变量被平均中心化和pareto标度化，对于OPLS-DA模型，0h和48h时间点被用作识别Y矩阵。模型特征如下：(a)R²X(cum)0.902、Q²(cum)0.825和9种重要的PC；(b)R²X(cum)0.933，Q²(cum)0.82以及7种重要的PC；(c)R²X(cum)0.84，Q²(cum)0.762以及3种重要的PC；(d)重要组分1+1，R²X(cum)0.802，R²Y(cum)0.998，Q²(cum)0.995，CV ANOVA 0；(e)重要组分1+1，R²X(cum)0.826，R²Y(cum)0.997，Q²(cum)0.995，CV ANOVA 0；(f)重要组分1+1，R²X(cum)0.7，R²Y(cum)0.995，Q²(cum)0.992，CV ANOVA 0。图的关键：绿色圆圈为0h发酵样品，蓝色方块为48h发酵样品。

表3.12使用SPME-GC/MS鉴定的在48小时期间的来自使用供体9恒化器材料的淀粉基质的发酵的代谢变化的质量保留时间对

表3.12显示负的倍数变化，表示在0h和48h之间的浓度降低，而没有记载的倍数变化值表明在两个时间点中的一个时间点未检测到代谢物。代谢产物只是假定分配的；通过与NIST质谱数据库比较进行鉴定。值为±标准误差，n＝24，统计有效性水平通过Mann-Whitney-Wilcoxon测试确定：*表示p值<0.05。

表3.13使用SPME-GC/MS鉴定的在48小时期间的来自使用供体5恒化器材料的淀粉基质的发酵的代谢变化的质量保留时间对

表3.13显示负的倍数变化，表示在0h和48h之间的浓度降低，而没有记载的倍数变化值表明在两个时间点中的一个时间点未检测到代谢物。代谢产物只是假定分配的；通过与NIST质谱数据库比较进行鉴定。值为±标准误差，n＝24，统计有效性水平通过Mann-Whitney-Wilcoxon测试确定：*表示p值<0.05。

表3.14使用SPME-GC/MS鉴定的在48小时期间的来自使用供体2恒化器材料的淀粉基质的发酵的代谢变化的质量保留时间对

表3.14显示负的倍数变化，表示在0h和48h之间的浓度降低，而没有记载的倍数变化值表明在两个时间点中的一个时间点未检测到代谢物。代谢产物只是假定分配的；通过与NIST质谱数据库比较进行鉴定。值为±标准误差，n＝24，统计有效性水平通过Mann-Whitney-Wilcoxon测试确定：*表示p值<0.05。

恒化器饲养试验

在该实验中，由于人体试食(human feeding trial)的复杂性质，因此开发使用恒化器作为替代方案：先前已经证明恒化器研究是模拟人类远端结肠的有效手段。在容器中制备用于恒化器试食的富含淀粉的培养基，使基础培养基配方(2L)(表2.2)富含120g预消化的Hi-Maize 260(+RS)或玉米淀粉(+CS)使得该容器每天被提供额外～30克的预消化淀粉并持续4天(细节见第2.5节)。

在该研究中分析了两个独立的恒化器运行：1)用来自供体9的新鲜粪便接种双容器并且用富含淀粉的培养基试食4天，然后恢复到基础培养基持续4天(V9-R1和V9-R2)；和2)用供体5个粪便接种双容器并且用富含淀粉的培养基试食4天，然后恢复到基础培养基持续4天(V5-1和V5-2)。来自接种有供体5的粪便微生物群的恒化器运行的一个容器被用于另一个不相关的实验，因为这样，双容器中的每一个的试食试验开始于不同的日子。进行了其他分析以确保在不同试食试验开始之间的七天期间V5-2没有发生显著变化。图24概述了试食试验实验的时间线和工作流程。

通过DGGE分析来自两个不同的恒化器运行的双容器，以确定与含有预消化的玉米淀粉(+CS)的富含淀粉的培养基相比，含有预消化的抗性淀粉(+RS)的富含淀粉的培养基是否影响模拟的远端肠道群落的群落动态和稳定性。

V9-R1和V9-R2的移动窗口相关性分析的结果是第22天至第38天之间两个容器的可重现的变化速率(Δt)值低于的凝胶特异性截止阈值(图25a)。在36天至第47天之间V5-1的可重复的Δt值保持低于凝胶特异性截止阈值，而在第34天至第40天之间V5-2的Δt值保持低于凝胶特异性截止阈值(图3.16a)。这表明所有4个容器在开始试食试验之前达到稳定状态。

在第22天至第38天之间，V9-R1和V9-R2DGGE相关系数保持在它们的凝胶界定的截止阈值之上(图25a)，除了在第36和第38天其DGGE相关系数在凝胶特异性阈值的5％以内之外，这表明容器具有高度相似性并且支持在开始试食试验之前达到稳定状态的结果。在第34天、第36天和第38天，对V5-1和V5-2进行比较的DGGE相关系数在50.6％-55.7％相似性的范围内，低于凝胶特异性截止阈值(表3.15)。为了补偿RS+和CS+试食试验开始的7天的分离，将第40-45天的V5-2与第38天的V5-1进行比较，得到的相关系数在52.3％-55.6％的相似性的范围内，低于凝胶特异性截止阈值(表3.15)。因此，在第40-45天的V5-2的双容器之间容器相似性没有发生显著变化。这是预期的，因为移动窗口相关分析得到的在此时间段内的V5-2的Δt值低于凝胶特异性截止阈值，反过来表明容器已经达到稳定状态。V5-1和V5-2相关系数在试食试验之前的时期内保持低于凝胶特异性截止阈值，表明容器不具有相似性。这表明虽然两个容器都达到稳定状态，但微生物群落组成在建立稳定状态的过程中变得不同。

开始试食试验后，V9-R1(RS+)和V9-R2(CS+)相关系数在第38-41天(试食试验的第1-4天)降低至低于凝胶特异性截断值阈值，为52.0％，表明相对于玉米淀粉对照，抗性淀粉对群落组成具有独特的影响。在洗出(wash-out)期间，相关系数在第45天(试食试验的第8天)增加至72.2％，这反过来表明两个群落变得更相似并且可能正在恢复到处理前群落组成的过程中(表3.16，图25b)。这些结果反映在整个试食试验(第37-45天)的移动窗口相关性分析中，V9-R1(RS+)和V9-R2(CS+)的Δt值发生变化，但始终高于凝胶特异性截止阈值，这表明群落不是稳定的，而是响应于补充淀粉的培养基迅速变化(图25a)。在试食试验V5-1(RS+)和V5-2(CS+)的过程中观察到供体5的类似结果；Δt值在前4天内升高至高于凝胶特异性截止阈值，这表明该群落对添加的淀粉基质有反应并且不再处于稳定状态(图3.16a)。V5-1(RS+)Δt值保持在凝胶特异性截止阈值以上，直到分析的最后一天(第48天)该值下降到截止阈值的5％以内，这表明趋向稳态。在第51-55天，V5-2(CS+)Δt值在凝胶特异性截止阈值的5％以内(图3.16a)，再次表明趋向回到稳态。V5-1和V5-2的相关系数在试食试验的前3天内每天下降，下降至26.0％的相似性，然后持续上升直至第8天的试食试验结束，最终相似性为54.3％(表3.16，图3.16b)。这些巨大的变化意味着富含淀粉的培养基(RS+和CS+)对粪便微生物群落的群落结构具有显著但不同的影响。此外，在修饰培养基终止后，群落开始恢复到处理前的状态。

表3.15体外试食试验之前的时期内对接种有来自供体5(V5-1和V5-2)的粪便的恒化器群落进行比较的相关系数(％SI)。

表3.16在模拟体外试食试验期间对接种有来自供体9(V9-R1和V9-R2)或供体5(V5-1和V5-2)的粪便的恒化器群落进行比较的相关系数(％SI)。第1-4天：使用富含淀粉的培养基的体外试食试验，第5-8天：使用基础培养基的洗出期。

图23显示在48小时从使用来自供体9的恒化器材料的淀粉基质发酵获得的GC/MS数据的PCA模型(小图a)和OPLS-DA模型(小图b)。变量被平均中心化(mean-centered)和pareto标度化(pareto-scaled)，模型特征如下：R²X(cum)0.691，Q²(cum)0.604以及两种重要的PC。图的关键：圆形Cg102，正方形Cgx333，三角形Cg102ae1-Elmore，菱形Cg102ae1-ref，五边形Cgx333Su2，星形Cg102wx。

图24在该研究中使用的体外恒化器试食的实验设计的流程图

图25体外试食试验的DGGE分析，其评估了富含淀粉的培养基对用来自供体9(V9-R1和V9-R2)的粪便接种的恒化器群落的影响。小图a)利用移动窗口相关分析计算群落动态。小图b)比较在相同时间点的双容器的图谱相似性的相关系数(以百分比表示)。

图26体外试食试验的DGGE分析，其评估了富含淀粉的培养基对用来自供体5(V5-1和V5-2)的粪便接种的恒化器群落的影响。小图a)利用移动窗口相关分析计算群落动态。小图b)比较在相同时间点的双容器的图谱相似性的相关系数(以百分比表示)。

Mauve比对

比对使得重叠群数量和菌种菌株之间相似性能够被很好地可视化。基于比对的可视化，青春双歧杆菌菌株和干酪乳杆菌菌株似乎非常相似。比对可视化还显示了早期的迹象，该迹象表明卵形瘤胃球菌菌株比检查的其他五种菌种更加不同。的比对差异可能反映真实的菌株差异，但也可能是不正确排序的重叠群的结果，其显示为基因组重排。比对图示于图2中。

使用SEED查看器进行功能比较

表2显示SEED查看器功能比较结果。基于子系统注释对来自六种不同菌种的菌株对进行功能比较的总结；数字表示被鉴定存在于菌株A而非菌株B中、存在于菌株B而非菌株A中、或存在于两种菌株中的子系统作用的数量，以及每种菌种比较鉴定的子系统作用的总数量。

表2：

对具有两种不同菌株的六种菌种进行的菌株对的功能比较显示：三种菌种中功能冗余非常高，两种菌种中功能冗余高，一种菌种中功能冗余低。在干酪乳杆菌对的比较中看到使用基于子系统的比较方法的功能冗余的最高水平。功能子系统中仅有的差异被鉴定为存在于菌株B而非菌株A中，并且涉及乳糖和半乳糖摄取(表3)。在卵形瘤胃球菌菌株对的比较中看到冗余的最低水平，其中在子系统和类别的较宽的范围中鉴定了247种功能子系统作用的差异。扭链瘤胃球菌菌株对的比较和青春双歧杆菌菌株对的比较分别显示了菌株之间的仅五种和六种差异，冗余水平相当高(表3)。长双歧杆菌菌株对的比较显示略少的冗余，其中菌株A和菌株B之间存在19种功能子系统作用的差异，其中14种作用存在于长双歧杆菌菌株A而非菌株B中，仅有5种存在于菌株B而非菌株A中。长链多利菌(Dorealongicatena)菌株对的比较显示了存在于菌株A而非菌株B中的8个子系统作用和存在于菌株B和非菌株A中的17个子系统。对于长双歧杆菌菌株对和长链多利菌菌株对的功能子系统的比较中的差异的完整列表可在表8中获得。

表8显示SEED查看器功能比较的总结。(A)显示了长双歧杆菌。(B)长链多利菌。在对于长双歧杆菌和长链多利菌的菌株A和菌株B之间的基于子系统的功能差异的总结中，显示了所鉴定的类别、子类别、子系统和作用。标题为“噬菌体、前噬菌体、转位因子和质粒”的行中显示的部分表示与噬菌体要素有关的差异。

表3显示SEED查看器功能比较的总结。对于干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和扭链瘤胃球菌的菌株A和菌株B之间的基于子系统的功能差异的总结，显示了所鉴定的类别、子类别、子系统和作用。以灰色突出显示的部分表示与噬菌体要素有关的差异。

表3：

需要注意的关键要素是与比较中存在的噬菌体有关的大量噬菌体相关蛋白和作用(在表3和表8中以灰色文本突出显示)。对于长双歧杆菌和长链多利菌，噬菌体相关蛋白存在于一种菌株中，但不存在于另一个菌株中，但噬菌体相关蛋白在长双歧杆菌和长链多利菌的两个菌株中均存在，但具有不同的作用。这些要素可以帮助解释这些菌株对之间的差异。如果一种菌株感染了噬菌体，而另一种菌株保持不受影响，或者菌株感染了不同的噬菌体，这可能会导致本次分析中报告的一些基因和功能差异。由于噬菌体是关键的水平基因转移(HGT)介质，并且是将基因导入人类肠道微生物组的重要通路，因此这是对菌株趋异性(divergence)的极好解释。

使用SEED查看器的序列比较

其中两种菌株已被包括在原始RePOOPulate生态系统中的菌种的菌株对的序列比较显示了与功能比较相似的结果。检查的六种菌种中的五种在它们的蛋白质序列中显示出高至非常高的冗余。青春双歧杆菌、长双歧杆菌、长链多利菌、干酪乳杆菌和扭链瘤胃球菌的菌株对的比较均显示95％或更高的平均百分比蛋白质序列同一性(见表7)。相比之下，卵形瘤胃球菌菌株比较的平均百分比蛋白质序列同一性低得多，为45％-62％，取决于比较中是否包含假设蛋白质以及哪种菌株被用作参考菌株。蛋白质序列之间的差异在图1中可清楚地可视化，图1显示当使用六种菌种中的每一种的菌株A作为参照时，相同菌种的菌株B的蛋白质序列同一性百分比。对于大多数鉴定的蛋白质序列，前五种菌种明显处于90％或更大范围内，而卵形瘤胃球菌菌株的序列出现在更接近50-60％的范围。

表7显示针对来自六种不同菌种的菌株对的基于蛋白质序列同一性百分比的SEED查看器序列比较的总结；括号中的数字表示假设蛋白质被去除的情况下的比较。表格包括所鉴定的蛋白质的总数、双向命中和单向命中的数量、未命中的蛋白质的总数(0％)、具有完美序列匹配的蛋白质的总数(100％)，具有高蛋白质序列同一性(95％-99％)的蛋白质的数量，具有低蛋白质序列同一性(50％以下，不包括未命中的蛋白质)的蛋白质的数目以及平均百分比蛋白质序列同一性。(A)总结了菌株A作为参考菌株的序列比较。(B)总结了菌株B作为参考菌株的序列比较。

图1A和1B显示菌株对的SEED观察器序列比较图。图表显示作为参考序列的菌株A于菌株B之间的比较。A)菌株A与菌株B的青春双歧杆菌序列比较。B)菌株A与菌株B的长双歧杆菌序列比较。C)菌株A与菌株B的长链多利菌序列比较。D)菌株A与菌株B的干酪乳杆菌序列比较。E)菌株A与菌株B的扭链瘤胃球菌序列比较。F)菌株A与菌株B的卵形瘤胃球菌序列比较。

表7：

拟合用于平均百分比蛋白质同一性与基因组大小和重叠群数量的比较的线性模型表明这两个因素可能已经将SEED序列比较的结果混淆到一定水平。用于基因组大小与平均百分比蛋白质序列同一性的比较的线性模型具有0.006的p值，表明显著的线性关系。重叠群数量与平均百分比蛋白质序列同一性之间的线性关系也是显著的，p值为0.016。描绘这些关系的散点图可在图3中找到。

图3显示用于使用R的比较的散点图。使用以下给出的伪代码的变体(variation)在R中创建图。

用于线性模型的伪代码

Setwd(“/Users/folder/”)

Table<-read.table(file＝“table.csv”,sep＝“,”,header＝TRUN)

LM1<-1m(PercentProteinID～GenomeSize,data＝Table)

summary(LM1)

plot(Table$GenomeSize,Table$PercentProteinID)

abline(LM1)

图3A显示在部分I中分析的12种细菌基因组的基因组大小对平均百分比蛋白质序列同一性的散点图，线条显示了两者之间的线性相关性。线性模型的p值为0.006144。图3B显示在部分I中分析的12个细菌基因组的重叠群数量与平均百分比蛋白质序列同一性的散点图，线条显示了两者之间的线性相关性。线性模型的p值为0.01629。图3C显示所有33种细菌基因组的基因组大小与重叠群数量的散点图。异常值为直肠真杆菌(Eubacteriumrectale)18FAA，其在测序中似乎有错误。

KEGG通路分析

KEGG通路结果证实了使用SEED查看器的功能和序列比较的结果。对于青春双歧杆菌的KEGG直系同源的比较，在ID匹配至内部iPath2.0列表和冲突解决之后，仅显示存在于菌株B中而不存在于菌株A中的通路的三个关键差异。长双歧杆菌KEGG比较最初显示菌株A和B之间的40种KO IDS差异，然而在匹配和冲突解决之后，发现菌株A特有的5种KO ID、菌株B特有的3种KO ID、以及菌株A中的4种具有较高复制次数的KO ID和菌株B中的2种具有较高复制次数的KO ID。干酪乳杆菌KEGG通路比较显示只有一种差异，即菌株B特有的KO ID。这与本研究中观察到的干酪乳杆菌菌株之间的冗余水平高度一致。长链多利菌比较显示了菌株A特有的2种KO ID和菌株B特有的6种KO ID。扭链瘤胃球菌的KEGG比较发现每种菌株只有2种特有的KO ID。这5种菌种的KEGG直系同源分配的差异的完整列表以及它们所映射的通路要素可以在表9种找到。表9基于KEGG通路分析的卵形瘤胃球菌菌株的比较显示了与前述部分相同的结果。比较发现菌株A特有的43种ID和菌株B特有的32种ID，以及菌株A中具有较多复制(replication)的5种ID和菌株B中具有较多复制的3种ID(图5)。这与SEED查看器比较中看到的冗余的低水平一致，表明卵形瘤胃球菌菌株的必要性。当这些结果与SEED查看器比较的结果相结合时，表明青春双歧杆菌、干酪乳杆菌和长链多利菌的菌株A以及长双歧杆菌和扭链瘤胃球菌的菌株B似乎是功能冗余的，并且可以从生态系统中去除而不会导致生态失衡。

图5A-B显示用于比较卵形瘤胃球菌的KEGG通路图。图5A显示代谢通路图。图5B显示调控通路图。使用ipath2.0产生KEGG通路图，用于比较卵形瘤胃球菌菌株A与菌株B。绿色线代表共享的通路，红色线代表菌株A特有的通路或在菌株A中具有较多复制的通路，蓝色线代表菌株B特有的通路或在菌株B中具有较多复制的通路。线条粗细由KO ID的重复次数确定。

表9显示在部分I中比较的五种菌种的KEGG通路的差异的总结。表9包括KO ID、图谱名称(包括次生代谢物的生物合成，Sec.Biosynth.)和一种菌株所特有的特定通路要素。蓝色部分表示不是一种菌株特有的但在所示菌株中具有较高复制次数的KO ID和要素。

表9：

部分II：RepoOPulate生态系统内的冗余

方法

以与上述KEGG通路比较几乎相同的方式但在更大的范围内检查RePOOPulate生态系统内的冗余。使用KAAS(KEGG自动注释服务器)以提供在部分I中未包含的草图基因组中的基因的功能注释(21个其他基因组)。下载每个基因组的KO分配列表(KO ID)，并在Microsoft Excel的表格中比较。从Microsoft Excel表格创建原始RepoOPulate生态系统中所有33种菌种中发现的KO ID列表，以及在整个生态系统中发现的KO ID的次数计数列表。然后使用这些列表创建KEGG ID的最终列表，其权重与KEGG直系同源分配(KO ID)的复制次数相匹配。然后将KO ID列表导入到程序iPath2.0：交互式通路探针，并在映射之前将其匹配到iPath2.0使用的内部列表；这从列表中删除几种KO ID。部分III中使用了所有33种菌种的最终匹配清单。

在去除在该研究的部分I中发现冗余的八种菌种菌株后，接下来创建更新的列表(表4)。第二列表只包括二十五种不同的细菌。创建这个较小生态系统的匹配的KO ID列表，以及单种菌种特有的、由两种菌种共享的、由三种菌种共享的、由四种菌种共享的和由五个或更多菌种共享的KO ID列表。还创建了每种KO ID的复制次数的计数列表。对1、2、3、4、和5或更多菌种共享的KO ID列表分别进行颜色编码(分别为紫色、蓝色、绿色、红色和黑色)并导入到iPath2.0中。颜色之间的冲突被解析为冲突中菌种数量最多的颜色，即如果通路在红色(4种)和蓝色(2种)之间存在冲突，则会解析为红色。检查最终的代谢通路图(图6)，并计数每种颜色之间共享的节点数量。图中的节点对应于各种化学化合物，边缘代表一系列酶促反应或蛋白质复合物。还分别为1、2、3和4种菌种创建图谱以获得其KO ID所映射到的通路要素(边缘)的数量(表10)。

表10显示由1、2、3或4种菌种共享的ipath2.0KEGG比较通路的要素计数。去除部分A的冗余的菌株后RePOOPulate菌种的比较结果总结(包括25种菌种)，查看1、2、3、4种菌种共享的通路。包括在每个树形图上选择的通路要素的数量，以及代谢图的独特节点和共享节点的数量的计数(图8)。如果节点只是包含所示菌种数量的通路的一部分，则计算独特节点；如果一条或多条彩色线和黑色线共享一个节点，则计数由大于4(>4)种菌种共享的节点；在两条不同颜色的线共享节点的情况下，计数由1/2/3/4种菌种共享的节点，即蓝色(两种菌种)和绿色(三种菌种)。

图6显示由1、2、3或4种菌种共享的通路的ipath 2.0KEGG比较的代谢通路图。去除部分I的冗余的菌株后的RePOOPulate菌种的比较的全代谢通路图(包括25种菌种)，显示了由1、2、3或4种菌种共享的代谢通路。紫色线对应于单一菌种共享的独特通路，蓝色线对应于两种菌种共享的代谢通路，绿色线对应于三种菌种共享的通路，红色线对应于四种菌种共享的通路，而黑色线为系统中所有其他通路(>4种菌种)。为便于可视化，选择了线条粗细，并不反映KEGG直系同源ID的复制的数量。

表10：

单种菌种特有的KO ID列表显示25种包含的细菌中仅有22种具有独特的KO ID，包括三种明显冗余的菌株：长链多利菌42FAA、直肠真杆菌29FAA和凸腹真杆菌47FAA。这三种菌种被去除并且复制计数被更新以反映这三种菌种的去除。接下来使用单种菌种特有的匹配的KO ID列表来手动创建色彩键(color key)，该色彩键匹配具有不被任何其他菌种共享的KO ID的每种菌种的独特颜色。然后使用色彩键创建KO ID和匹配颜色的列表，黑色用于共享的KO ID，不同颜色用于具有独特的KO ID的每种菌种。将此列表导入到iPath2.0中，并用于创建自定义图谱。这创建了颜色冲突列表。任何颜色冲突都解决为黑色，因为这意味着该通路并不是单一细菌所特有的。唯一的例外是与长双歧杆菌(K00129)特有的KO ID的冲突，进一步调查发现该冲突只影响KO ID所映射到的六条通路之一，该冲突不是以黑色解决，而是以与长双歧杆菌的特定颜色解决。

在冲突解决之后，使用黑色线用于共享的通路以及不同颜色的线用于具有独特KOID的每种菌种来创建最终图谱(图7)。对次生代谢物的代谢和生物合成图谱进行分析，以获得独特节点的数量和连接节点的最高数量。由于细菌中存在大量未知的生化和代谢通路，因此检查这些论点(theses)；因此这些要素计数可能会比单独检查边缘使可能的潜在通路得到更好的理解(表11)。

表11显示ipath2.0KEGG通路分析的要素计数。部分II：RepoOPulate生态系统中的冗余结果的总结包括：具有独特KO ID的22种菌种的名称，这三个图谱中每个图谱的KO ID所映射到的独特通路要素的数量(独特通路)，以及次生代谢物的代谢和生物合成图谱的独特节点的数量和连接节点的最高数量。如果节点仅为独特通路的一部分，并且不被其他通路共享，则计算独特节点。括号中的数字为共享节点的数量，这些节点也是独特通路的一部分。连接的节点被计数为由独特通路要素连接的独特节点的最高数量。如果包括也是独特通路的一部分的共享节点，则括号中的数字为由独特通路要素连接的节点的最高数量。

图7显示RepoOPulate群落比较的KEGG通路图。图7A显示来自原始RepoOPulate生态系统的25种菌种(去除冗余菌株)的比较的完整代谢通路图，显示单一菌株所特有的所有通路。图7B显示来自原始RepoOPulate生态系统的所有25种(去除冗余菌株)的比较的完整调控通路图，显示单一菌株所特有的所有通路。左边的颜色图例指示哪种颜色与哪些菌种相关。为便于可视化，选择了线条粗细，并不反映KEGG ID的拷贝数。

表11：

使用仅包含具有独特KO ID和匹配颜色代码的22种菌种的独特KO ID的最终列表来创建仅显示独特通路的图谱(图8)。分析这些图以帮助确定关键菌种和通路(表12)。将22种菌种的所有KO ID的最终清单与原始33种菌种的KO ID的清单进行比较，以确定该过程中是否有任何KO ID丢失。在本研究的部分III中，再次使用了具有反映KO ID拷贝数的权重列表的最终22种菌种的KO ID列表。还对数据进行了简单的质量检查，以确定测序和基因组组装中是否存在明显的错误。使用R中创建的散点图比较基因组大小和所有33个基因组的重叠群数量(图3C)。先前已经注意到的直肠真杆菌18FAA中的错误是明显的，并且所有其他基因组似乎是正常的。

表12显示RePOOPulate生态系统的独特KEGG通路的总结。在去除部分I中发现的冗余菌株后，对具有独特KO ID的22种菌种的代谢通路和调控通路以及次生代谢物的生物合成的总结包括匹配和冲突解决后具有独特KO ID的菌种的名称、它们特有的KO ID和他们映射到的通路。颜色反映了用于代谢和调控通路图的颜色图例(图7)。红色的KO ID(3)为在部分II中去除长链多利菌42FAA、直肠真杆菌29FAA和凸腹真杆菌47FAA后才发现的独特ID。蓝色的KO ID(14)也见于Kurokawa等人的数据集。括号中的数字表示KO ID所映射的三个图谱中每一个图谱内的要素数量。

图8显示来自原始RePOOPulate生态系统的22种菌种(去除冗余菌株)的比较的调控通路图，显示单一菌株特有的调控通路。左边的颜色图例表示哪种颜色与哪些菌种相关。为便于可视化，选择了线条粗细，其并不反映KO ID的拷贝数。

表4：

表4.RepoOPulate菌种的总结。表格包括RAST服务器上通过名称列出的原始RepoOPulate原型中包含的所有33种菌种。根据部分I和部分II的分析，菌种分为三类。在去除了部分I中发现的冗余菌株后，发现具有独特KEGG通路的22种菌种位于前两列中，在该研究的部分I中发现是冗余的8种菌种菌株和在部分II中发现是冗余的3种菌种在最后一列中。以黑体列出的9种菌种为具有独特KO ID的菌种，也存在于Kurokawa等人的数据中，括号内的数字表示KO ID的数量。

结果

由1、2、3或4种菌种或菌株共享的独特和几乎独特的通路和节点的比较显示了几种有趣的模式。为了反映生态系统中不容易去除的冗余，对2、3或4种菌种共享的通路进行比较(因为该通路在整个生态系统中是罕见的，但不是唯一的)。在删除部分I中冗余菌种后，细菌群落中剩余的25种菌种的KEGG直系分配比较显示了三种菌种(长链多利菌42FAA、直肠真杆菌29FAA和凸腹真杆菌47FAA)，所述三种菌种没有独特的KO ID且似乎为生态系统内的其他冗余。当检查这三种菌种的几乎独特的通路时，也只有少量的几乎独特的通路。当分别比较由2、3或4种菌种共享的KO ID时，直肠真杆菌29FAA具有3、1和3个共享的KO ID，长链多利菌42FAA具有3、5和3个共享的KO ID，并且凸腹真杆菌47FAA具有3、7和6个共享的KOID。这表明这三种菌种在生态系统中并不重要，可能可以在不破坏生态平衡的情况下被去除。

几乎独特的KO ID的比较还显示了在生态系统内可能是关键菌种的四种菌种的重要性。拉乌尔菌属6BF7、卵形拟杆菌5MM、大肠杆菌3FM4i和吉氏副拟杆菌5FM均具有高水平的几乎独特的通路，其中大多数在这四种菌种之间共享。当查看两种菌种共享的KO ID时，拉乌尔菌属6BF7和大肠杆菌3FM4i尤其共享非常多的KO ID。当检查由四种菌种共享的KOID时，卵形拟杆菌5MM和吉氏副拟杆菌5FM、拉乌尔菌属6BF7和大肠杆菌3FM4i共享大量的KOID。这表明这四种菌种可能在生态系统中相互作用并发挥关键作用。几种菌种也被鉴定为具有低水平的几乎独特的通路，2、3或4种菌种的比较中具有3个以下共享的KO ID(表5)。在所有三种的比较中，普氏粪杆菌40FAA、裂果胶毛螺菌34FAA和直肠真杆菌29FAA具有低水平的共享的KO ID。产气柯林斯菌和长链多利菌42FAA在三个比较中的两个中也具有低KO ID。这表明这五种菌种在必然的低水平冗余中可能不起主要作用。

表5是2、3或4种菌种共享的KEGG直系同源分配的比较的总结。表5总结了被发现具有低水平的几乎独特的通路的菌种，其具有三个以下的在2、3或4种菌种之间共享的KO ID。在两个以上的比较中，以黑体文字突出显示的菌种属于此类别。括号中的数字表示共享的KO ID的数量(冲突解决之前)。

表5：

最终通路分析的结果是33种初始细菌中仅有22种具有未被RePOOPulate系统内的任何其他细菌覆盖的独特通路。在表4可找到更新后的模型中包含的最后22种菌种的列表。显示这22种关键菌种的独特通路的KEGG通路图可见于图7和8，在表12中可找到列出了这些KO ID所映射的通路的图表。考虑到菌株特有的通路所穿过的每个菌株的节点数量，可以更好地了解目前可能存在的独特未知通路，并且通过观察连接的节点的最高数量，我们获得了通路相关性的一些想法，因为连接的节点数越多，通路重要性的可能性就越高。对这些数据的检查显示，细菌卵状体5MM和裂果胶毛螺菌34FAA具有比大多数其他菌种更高数量的独特节点(分别为12和8)，然而两者的连接的节点的最高数量都只为2。这表明可能涉及未知通路。最相关的菌种似乎为拉乌尔菌属6BF7，其具有46个独特节点，连接的通路的最高数量为15。这是连接的节点的数量次高的菌种的五倍，该菌种为肠道罗斯氏菌31FAA，其具有3个全部连接的独特节点(表11)。

将22种关键菌种的最终KO ID列表与原始33种菌种的KO ID列表相比的比较显示了因去除在部分I中发现是冗余的8种菌株而导致的两个KO ID(K07768和K11695)的丢失。直肠真菌18FAA的去除导致第一个KO ID可能丢失。这是独特的似乎在基因组组装过程中出现错误的菌种或菌株，而且相对较小的基因组尺寸具有过多的重叠群(图3C)。需要进一步的研究以确定这种菌株的真正重要性。似乎被丢失的KO ID(K07768)映射到用于信号转导的双组分系统内的三个调控通路，然而其中两条通路也由另一个KO ID(K07776)所映射，该KO ID仍存在于最终22种菌种生态系统的KO ID列表中。这表明只有一个小的通路丢失，其可能不会影响生态平衡。在冗余去除过程中丢失的第二个KO ID(K11695)映射到肽聚糖生物合成的单一代谢通路，并且为映射到该通路的独特KO ID。该KO ID丢失是由长双歧杆菌4FM的去除导致的。目前尚不清楚该通路的丢失是否会对生态系统的可持续性产生负面影响，需要进一步的研究以确定这种菌株是否是必要的。

22种菌种的独特通路的仔细研究表明菌种数量的进一步优化是可能的。显示独特通路的图谱揭示具有非常少的独特通路的四种菌株包括：链状真杆菌48FAA、普氏粪杆菌40FAA、瘤胃球菌属(菌株A)和瘤胃球菌11FM，每个只映射到一个图谱要素和一个或两个通路(表12)。该证据与比较由2、3或4种菌种所共享的通路所获得的信息(表5)的结合表明，链状真杆菌48FAA和普氏粪杆菌40FAA可能被去除而不会导致生态系统的失衡。裂果胶毛螺菌34FAA和产气柯林斯菌也显示出极少的几乎独特的通路(表5)，并且仅具有很少的独特的KOID和通路要素(表12；分别为3个KO IDS6个要素和2个KO ID 2个要素)。需要进一步的研究以确定这四种菌种的必要性，以判断它们被去除或包含在新的RepoOPulate生态系统原型。

表12：

表12(续)：

表12(续)：

部分III：KEGG通路覆盖率的比较

方法

在部分II中创建的RePOOPulate生态系统内的通过KO ID复制次数确定权重的所有33种菌种的KO ID列表被加载到ipath2.0中，并用于创建具有蓝色线条和由每个KO ID的复制次数确定的权重的自定义图谱。使用iPath2.0在冲突权重之间随机选择的自动化方法解决权重冲突。完成KO ID列表的相同过程，并且更新由具有独特KO ID的22种菌种组成的优化的生态系统的权重；此图谱的线条颜色为黑色。用于比较的“健康的”人类肠道微生物组取自Kurokawa等人的研究，其全部内容通过引用并入本文，iPath网站上提供了完整的具有权重的KO ID列表。Kurokawa等人研究的目标是为了鉴定人类肠道微生物组的共同和可变的基因组特征。该研究包括对来自13名不同年龄的(包括尚未断奶的婴儿)健康日本个体的粪便样品进行的大规模比较元基因组分析。先前已将这项研究中的数据用于iPath2.0的开发中，作为其功能的演示，并且由于在时间限制下的易用性而被选择用于此比较。使用自定义图谱功能和提供的列表创建Kurokawa等人的数据的iPath2.0图谱。此列表的线条颜色为红色。然后以便携式文档格式(PDF)下载所有三个数据集的自定义图谱。

将这三个PDF图像作为单独的层加载到GIMP 2.8.10(GNU图像操作程序)中，并且通过着色至α通道来操纵透明度，使得Kurokawa等人的数据和两套RepoOPulate通路都可以被可视化。这样做是为了直观地比较每个RepoOPulate生态系统与自然人肠道微生物组的实例的匹配程度以及相互之间的匹配程度，以确定KEGG通路的覆盖率(图9)。还使用Microsoft Excel电子数据表格比较KEGG ID的三个列表(每个图谱一个)以及部分II中发现的独特KEGG ID列表。为了优化此过程，将Kurokawa等人的KO ID与内部iPath列表相匹配，以去除没有以与部分II中其他列表匹配的方式相同的方式映射到iPath2.0通路的任何KO ID。

图9显示RepoOPulate数据与健康微生物群的比较。A)对优化前后整个RepoOPulate群落与来自Kurokawa等人研究的数据进行比较的代谢通路图。B)对优化前后整个RepoOPulate群落与来自Kurokawa等人研究的数据进行比较的调控通路图。红线代表Kurokawa等人的数据，蓝线代表包含所有33种基因组的原始RepoOPulate数据，黑线代表仅包含21种基因组的优化的RePOOPulate数据。

结果

将完整的33种RepoOPulate生态系统的KO ID的匹配列表与Kurokawa等人的KO ID的匹配列表进行比较，其显示了在RepoOPulate数据集中发现而不在Kurokawa等人的数据中的635个KO ID，以及在Kurokawa等人的数据中发现但不在RepoOPulate中的86个KO ID。在优化过程中去除的两个KO ID不在Kurokawa等人的数据集。Kurokawa等人的数据特有的KO ID或Repoopulate特有的KO ID中的63个KO ID具有与另一个数据集特有的通路共享的通路。Kurokawa等人的数据的27个独特的KO ID与RePOOPulate的独特的KO ID至少有一个重叠通路，并且36个独特的RePOOPulate KO ID中至少有一个与来自Kurokawa数据的独特的KO ID共享的通路。需要进一步的分析以更仔细地检查从RepoOPulate生态系统中丢失但应该存在以维持健康的肠道微生物组的确切通路。

还将优化的生态系统的22种菌种中单一菌种特有的KO ID列表与匹配的Kurokawa等人的数据集进行比较。在117个经鉴定的独特的KO ID中，只有14个也在Kurokawa et al的数据中，在表12中将这些KO ID以蓝色突出显示。在仅9种菌种中发现14个单一菌种特有的并且与Kurokawa等的数据匹配的KO ID，表明这些菌种可能为生态系统中最重要的菌种(见表4)。

具有33种菌种或22种菌种的两个RePOOPulate版本的直观比较显示KO ID的复制次数仅有微小差异，没有明显的数据损失。RepoOPulate数据与Kurokawa等人的数据的直观比较显示当与Kurokawa等人的数据相比时，RepoOPulate数据中少数代谢通路的复制次数存在一些明显差距。在存在的大量细菌中，可能都是这种情况，因为上述事件的大多数出现在生命必需的区域代谢中，并因此存在于所有菌种中，并且对于更多种类的菌种将具有更高数量的复制。调控通路图中还有几个区域似乎在RePOOPulate生态系统中覆盖率不足或缺乏。这些包括氨酰基-tRNA生物合成通路、ABC转运蛋白通路、双组分系统和尤其是细菌分泌系统的区域。为了确定RepoOPulate系统是否需要进一步修改以将能够调控通路的菌种并入，需要进行进一步的工作以了解这些丢失要素的重要性。

讨论

本研究的目的是阐明关于通过在淀粉生物合成通路中的突变产生的新型玉米淀粉的潜在健康益处的新信息。淀粉分析包括评估RS含量和其对通过人粪便微生物群进行的体外发酵的影响，以确定淀粉基质的潜在益生元性质。试验显示从粪便接种物接种的经恒化器培养的微生物群落为用于小规模分批发酵的有用的、可再现的接种物。体外发酵导致粪便微生物群的独特变化，该变化取决于淀粉基质，并且试验显示在不同的粪便供体之间这些变化是不同的。在使用来自不同供体的材料接种的容器的发酵谱中观察到代谢物产生的差异；然而，在使用来自同一供体的材料的情况下，响应于不同的淀粉基质代谢物图谱的没有发生明显改变。

消化

之所以选择在该研究中使用的六种玉米品系是由于淀粉生物合成通路中的突变导致的其淀粉结构的差异，所述淀粉生物合成通路中的突变使直链淀粉:支链淀粉比例发生变化；这反过来又被证明会影响RS的量。使用Megazyme抗性淀粉测定试剂盒进行的RS测定显示Cg102ae1-ref、Cg102ae1-Elmore和Cgx333Su2在体外消化之前和之后都含有最大量的抗性淀粉，而Cg102wx含有的抗性淀粉最少。这是预料之中的，因为前3个玉米品系的淀粉生物合成通路中的突变导致淀粉结构的改变，从而增加RS含量，而Cg102wx则相反。在大多数情况下，淀粉基质的RS、SS和TS含量在体外消化后下降，这是由于蒸煮使淀粉糊化(gelatinize)使淀粉更容易消化。在大多数诸如蒸煮和烘烤的烹饪应用中，RS不会糊化。然而，与常规蒸煮相比，高压处理可达到高得多的温度和压力，并且高压处理对淀粉基质进行灭菌以用于随后发酵，该过程可能导致RS部分的部分糊化。有趣的是消化过程后Cgx333Su2的RS含量增加。玉米品系Cg102和Cgx333的遗传背景的显著差异可能是对消化步骤具有不同反应的部分原因，导致Cgx333Su2的RS增加。

发酵实验中的无菌淀粉底物基质是最初的目标，使得肠道微生物群的淀粉发酵不会受到与玉米粒相关的环境微生物的影响。因此，采取步骤生产无菌淀粉基质，但是发现所有样品都具有一定程度的污染。然而，发现这种污染不会影响小分批发酵。淀粉基质对照在0h和48h显示DGGE谱没有变化(图3.1)。淀粉基质被制备好并在有氧条件下消化，因此污染物可能是严格需氧菌，它们无法在用于肠道微生物发酵的厌氧环境中存活。这也许可以解释为什么以前的研究没有在预消化过程中注意维持无菌状态。由于确保淀粉基质的无菌性对于评估通过肠道微生物群的发酵看起来不重要，因此蒸煮而不是高压灭菌淀粉应该足以用于这类研究，并且具有更类似于淀粉的日常烹饪过程的益处，提供更生理相关的基质。此外，由于RS显示对SCFA生产的剂量依赖性响应，与玉米粉相比，纯淀粉的分离可能是最佳的。

小规模分批发酵再现性

恒化器可用于可再现地开发和维持源自于人类粪便样品的复杂群落。我们使用三个不同的试验在小规模分批发酵模型中研究的6种淀粉基质的发酵谱，其中所述三个不同的试验接种有三个不同供体的粪便作为稳定的接种源。据我们所知，这是使用稳定的恒化器模型作为分批发酵的接种物源的第一实例。相对于从供体反复收集粪便，这种方法具有优势，因为恒化器可以在较长时间内提供一致的群落，并且可以在需要时进行取样。相比之下，由于肠内暂时性菌种的存在，反复的粪便捐献会引起粪便微生物群的与时间有关的变化。最后，当培养粪便群落时发生体内到体外的转变，分批发酵中观察到的变化可能被这种转变曲解。在已经发生转变的情况下，使用稳定的恒化器培养物使得平行发酵之间的比较更简单，因为群落中的变化可以直接归因于处理的效果。

这些实验中使用的体外恒化器模型先前已经得到验证。尽管不会产生与接种物材料相同的粪便群落，但是群落仍然是稳定且多样的群落，这些群落在很大程度上代表了体内发现的群落，并且可以用于实验。在这项研究中，使用分子指纹技术DGGE分析了微生物群落结构和恒化器运行的动态以及小规模分批发酵。另外，使用SPME GC-MS分析分批发酵过程中的代谢变化。

因为这是第一次使用恒化器培养物而不是新鲜粪便样品作为分批发酵的接种源的研究，所以我们的第一个目的是验证发酵的可重现性。发酵导致技术复制物之间几乎相同的群落组成。生物复制物之间的重现性取决于所使用的恒化器的稳定性。接种有来自供体9的粪便的恒化器在取样前达到稳定状态，并在整个取样周期内保持较低的变化率(图12c)。因此，重复发酵具有高％SI，表明在刚刚接种后所有6个测试的淀粉基质具有相同的群落谱图。接种有来自供体5的粪便的恒化器的分批发酵获得了类似的结果。此外，使用来自供体5和9的粪便接种物的发酵以可重现的方式进行，48小时后复制品保持相同的群落动态。然而，这项研究表明，绝对要求恒化器在取样之前达到稳定状态，以便在分批发酵中用作接种源以获得可重现的结果。在容器内仍存在快速变化的期间，对接种有来自供体2的粪便微生物群的恒化器容器进行取样，与供体5和9的那些相反(图12a)。在技术复制品中在0h和48h都观察到高％SI值，高％SI值表明相同的群落，但在生物复制品之间没有观察到，这表明接种物之间存在差异。因此，可以得出结论，稳态恒化器可用于以高度重现性接种小规模分批发酵，以研究不同基质对微生物群的影响。该方法也可能能够检测小变化，该小变化可能在使用传统分批发酵方法中由于在体内向体外转换期间发生显著的群落变化而被遗漏。

对淀粉基质的响应

簇树分析和DGGE谱相似性的NMDS的结果是在使用供体9的粪便微生物群发酵后淀粉基质被分为3组，而只有2组对于使用来自供体5的粪便微生物群发酵是明显的。不能得出关于来自供体2的粪便微生物群的发酵的任何结论，因为取样前恒化器中尚未达到稳态，因此这些结果将不再进一步讨论。

作为Cgx333和Cgx333Su2发酵结果的样品聚集在一起并且与使用来自供体5和9的粪便的微生物群的所有其他淀粉基质发酵分开聚集，表明Cgx333和Cgx333Su2与其他淀粉进行不同的发酵。虽然Cgx333Su2含有与野生型(Cgx333)相比数量增加的RS，但两者对来源于供体5和9的微生物群落均产生类似效果。这表明Cgx333Su2中的突变(其导致支链淀粉合成减少)没有提供对粪便群落本身的更大的益生作用。由Cg102ae1-ref和Cg102ae1-Elmore系衍生的淀粉含有支链减少的较长的支链淀粉链，类似于直链淀粉的结构，因此增加了RS含量。这些淀粉基质与野生型Cg102不同，对群落动态具有显著影响，产生独特的群落图谱。结合从所有发酵中观察到的效果，结果支持这样的假设：不同的突变改变了淀粉基质刺激不同组的结肠细菌的发酵特性。类似的研究已经评估了粪便微生物群响应于具有修饰结构的淀粉基质的变化；然而，我们的研究通过分析群落水平变化采取了更全面的方法。相比之下，大多数其他研究仅检查一小部分具有良好特性的益生菌菌种，因此会遗漏仅在评估整个粪便群落时能够看到的其他显著变化。

例如，通过对高直链淀粉玉米淀粉(HAMS)进行差异化处理产生的两种RS多晶型物显示在发酵24小时后在粪便群落中引起独特的生态变化。一种多晶型物导致拟杆菌菌种和奇异菌属菌种的增加，而另一个多晶型物刺激双歧杆菌属(Bifidobacterium)菌种的生长。大鼠模型用于观察粪便微生物群响应于添加有两种独特的低直链玉米淀粉(LAMS)、HAMS或丁酰化HAMS(HAMSB)的饮食的变化。这些作者报道两种高RS饮食均独立导致微生物群的独特变化，而在两种LAMS之间没有看到差异。HAMS饮食诱导恶臭瘤胃球菌样细菌的增加，而HAMSB饮食增加了加氏乳杆菌和吉氏副拟杆菌的群落。

此外，对于使用从供体9获得的粪便微生物群的发酵，观察到在不同的淀粉基质之间肠道微生物群发生独特变化，并且对于供体5观察到程度较低。这表明个体的微生物群的初始组成对特定基质的效果具有显著影响，并支持个体的肠道菌群对新型玉米淀粉作出不同反应的假设。在10个食用富含RS饼干的个体之间的个体反应报道了类似的结果。在被鉴定为明显受到RS消耗影响的类群中，在所有10个个体中没有一个表现出类似的反应。这些不同的反应可能是由于多种因素造成的，例如基质利用率的菌株水平差异、给定个体肠道中特定菌种的具体丰度或给定个体肠道中缺乏特定菌种。同样，宿主生理因素在形成个体肠道微生物群中发挥重要作用。例如，不同的肠道转运时间、消化速率和pH都影响结肠环境和其中的微生物群。更好地理解肠道微生物群落间的这些个体间差异将是为个性化健康定制益生元的关键。

代谢产物生产

一贯报道膳食纤维的发酵会增加SCFA的产量，这又对宿主的整体健康有显著影响。通过碳水化合物发酵在人体结肠内产生的总SCFA的90-95％为乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐，因此，RS和其他膳食纤维的研究通常使用靶向方法来研究这些代谢物的变化。我们在这项研究中使用了一种非靶向的代谢组学方法，该方法以前用于鉴别在健康肠道的个体和患病(菌群失调)肠道的个体之间粪便VOC的差异。这种非靶向的方法被用于捕获给定样品中的大量代谢物，以期鉴定由淀粉基质发酵产生的新型生物标志物以及SCFA。

我们观察到对于通过所有供体来源的粪便微生物群发酵的所有淀粉基质，丁酸(丁酸盐)产量的一致地增加。有趣的是，在任何样品中都没有检测到乙酸盐，这是令人惊讶的，因为与其他SCFA相比，其他研究中报道乙酸盐的研究的数量最高。然而，已经表明，丁酸盐的产生依赖于乙酸盐，约80％的丁酸盐产生归因于乙酸盐通过丁酰CoA:乙酰CoA转移酶通路的细胞外转化。由于只分析了48小时时间点的SCFA产量的变化，可能这些样品中的大部分乙酸盐已被微生物群转化为丁酸盐。因此，可能有必要查看较早的时间点来阐明乙酸盐产生和消耗的动力学。

仅在用来自供体9的粪便微生物群发酵中检测到丙酸和戊酸的产生。已经提出，个体间粪便微生物群的不同导致不同的功能能力，这可能是对为什么在本研究中使用的3个粪便供体产生不同的代谢物集合的合理解释。先前已经报道了类似的结果；一项研究表明，肥胖小鼠的从食物中获取能量的能力增加，这与其粪便微生物群的组成有关。肥胖可能使发酵产生的SCFA的能力增强，SCFA被宿主吸收并用作能量来源。这可以解释在3种粪便供体之间观察到的产生的代谢物方面的一些不同结果。

在该研究中，尽管使用能够检测多种代谢物的技术，但未检测到独特的、以前未报道的发酵代谢物。然而，观察到的结果支持该假设，因为在个体之间产生了独特的发酵谱。此外，在使用PCA进行测定时，似乎在不同的淀粉基质之间存在所产生的代谢物方面的差异，但无法用统计学有效的OPLS-DA模型证实。因此，确定微生物群样品响应于不同淀粉基质产生的发酵图谱的进一步工作可能受益于使用更简单(尽管包容性较小)的靶向代谢组学技术的分析。靶向方法也可以提供更多可定量的结果，并且可以更好地阐明由不同淀粉基质发酵产生的代谢物之间的显著差异；在本研究中使用GC-MS的非靶向分析未检测到任何此类差异。

PhAST Blue

DNA的DGGE分析揭示了发酵48小时后群落动态的相当大的变化，所述DAN源自由稳定的单级恒化器培养物获得的粪便群落的小规模分批发酵。由于分批发酵是封闭系统，所观察到的变化的准确性可能受到源自死细胞的DNA的扩增的影响。解决这个问题的一种方法是使用来自活细胞的DNA的差异扩增。在PCR扩增之前使用单叠氮化乙锭(EMA)处理环境样品防止了样品中细胞外DNA的扩增以及来自即将死亡并因此允许EMA摄取的细胞的DNA扩增，然而保护活细胞中的DNA免受化学品的影响。PhAST Blue试剂盒在临近研究结束时才可供使用，因此仅简要评估了该技术作为在分子分析前处理粪便群落的手段的可再现性。在这项研究中，与未处理的样品相比，PCR扩增之前的EMA处理显示在DGGE凝胶上一些条带中信号一致减少，而在DGGE凝胶上其他条带的强度增加，同时仍保持复制品之间的相似性程度(图21)。因此，这表明这种方法是标记源自死细胞的DNA的可靠的可重复的方法。这与另一项分析来自蓄水池的成熟生物膜的研究中观察到的结果类似。然而，本文的作者提到，在分析这些结果时必须谨慎，因为必须完成更多的研究以确保这一方法可以适用于范围广泛的微生物菌种而不引入偏差。然而，可以证明EMA处理是微生物生态学中一种非常有价值的方法，通过提供简单的预处理从而仅靶向活细胞群，在分析微生物群落中的变化时提高分子技术的敏感性。未来的研究应该将这种技术用于分析短期分批发酵和长期恒化器研究，因为它可以更准确地揭示容器内发生的群落水平变化。

恒化器试食试验

模拟远端结肠的双容器单级恒化器已被证明是可重复研究肠道微生物群中响应于各种应激物的扰动的有效手段。已经使用各种连续培养模型研究益生元基质的发酵特性。然而，许多这些实验缺乏对照容器以确保观察到的变化不是由于群落适应体外模型(容器基线被用作其自身对照)或者未能在实验之前建立足够的稳态群落所致。在这项研究中，我们旨在确认使用接种有粪便微生物群落的双容器、单级恒化器作为复杂人类试食试验的替代方案。据我们所知，这是首次将预消化的基质用于补充体外模型的培养基以模拟体内试食试验。

在启动经修饰的培养基(RS+和CS+)之后，双容器、单级恒化器显示来自两个供体(5和9)的粪便群落的群落变化。在模拟试食试验过程中，双容器的％SI下降表明两种淀粉基质对粪便群落有不同的影响。在恢复到基础培养基饲料时，双容器的％SI开始增加，可能表明容器正在恢复到在开始试食试验时的基础状态。

在用供体5粪便接种的双容器之间观察到的低相似性可能是由在建立稳定状态期间群落中的趋异性导致的，因为观察到在整个试验过程中V5-2需要以比V5-1更高的速率添加碱。然而，尽管稳态群落存在差异，观察到的群落动态趋势与在接种有来自供体9的粪便微生物群的双容器中观察到的趋势类似。

发现使用双容器式单级恒化器与传统的分批培养发酵相比具有明显的优势，因为前者使粪便群落在暴露于被测试的基质之前能够转变为稳定的体外状态。此外，双容器单级恒化器使人们能够研究不同基质数量和处理时间周期的影响，与之相反的是批量培养，其只有很短的实验窗口。因此，双容器单级恒化器可以有效地用于受控实验，以研究食用益生元或向肠道微生物生态系统引入其他扰动的影响，与宿主无关。

结论和其他实施方案

RS是经证实的益生元，其具有通过调节粪便微生物群来改善人类健康的重要潜力。不同种类的RS来源于多种富含淀粉的食物，在个体的粪便微生物群内以及不同个体的微生物群之间均显示出不同的益生元效果。这里完成的研究为筛选和鉴定具有增加的益生元潜力的改性淀粉基质提供了基础。DGGE清楚地区分了不同淀粉基质之间的群落图谱变化。虽然试图使用SPME GC-MS扩大可检测的代谢物谱，但始终只观察到SCFA(尤其是丁酸盐)的增加。这表明未来试图确定不同淀粉基质之间的差异应该测量代谢物的变化，特别关注SCFAs，并且可以使用定量靶向代谢方法而不是非靶向方法来更好地完成。

其他实施方案

将检查对改性淀粉的益生元潜力的进一步评估，特别是Cg102ae1-ref和Cg102ae1-Elmore，因为这些品系含有最大量的RS，并且似乎对粪便微生物群具有最大影响。对有需要的患者施用Cg102ae1-ref和Cg102ae1-Elmore可促进肠道微生物群中至少一种菌株的生长。

此外，可以使用16S rRNA群落分析来阐明响应于淀粉基质而发生的群落组成变化。就具有与针对宿主和新生微生物群落的有益效果相关的生物化学过程的富集分类群而言，这将有助于进一步鉴定具有更大益生元潜力的基质。此外，来自几个个体的粪便群落的个体间响应涵盖了广泛的饮食生活方式，可以更好地表征比较有可能使给定淀粉基质得到最佳利用的群落结构。

另一种探讨的可能途径可能是这些益生元如何影响患有肠道菌群失调(dysbiotic guts)的个体，例如那些患有IBD或溃疡性结肠炎的个体。由于“微生态失衡”是一个定义不明确的术语，描述了一种在微生物生态学方面尚未得到很好了解的情况，本研究中开发的方法可能有助于更好地理解给定生态系统无法有效利用基质的微生物失衡的潜在机制。

尽管本文中描述的模型模拟体内环境，但它们不能容易地模拟宿主响应。未来将进行人体或动物模型研究，以确定潜在益生元基质的益生性质。然而，粪便分批发酵和恒化器模型可以用于以经济有效的方式筛选候选淀粉和其他基质的益生元潜力。对限定一个人的粪便微生物群及其功能能力的因素的持续研究以及对淀粉生物合成和影响消化率的因素了解的增加的将继续向前推动这项研究，带来个性化健康和营养的新时代。

细菌群落

本报告中概述的研究设计存在若干限制。可能的错误的主要来源之一是数据集的高水平的手动操作，其会导致其自身人为错误的引入。选择的解决冲突和分类数据的方法并不理想；未来一种更自动化的、基于编程的方法将消除许多这些可能的误差来源并提高结果的有效性。

本研究设计中的第二个主要问题是普遍缺乏关于细菌的代谢和生物化学通路的知识。可能的重要未知细菌通路的问题使其本身无法正确识别重要菌种以及冗余的错误识别。试图通过检查分析中的节点和通路来纠正这个错误源，然而这不能解释所有可能的未知。同样，使用程序iPath2.0也引入了未知的某个要素，因为该程序不包含所有可能的通路或没有对所有已知的KEGG直系同源分配做出解释。本项目中KEGG直系同源分配的比较仅着重于iPath2.0程序中的使用，既简单又易于理解。然而，这意味着在RepoOPulate生态系统的33个基因组中鉴定的4210个KO ID中只有1536个被包括在比较中，有2674个KO ID在该分析中未被探讨。

因此，当我们对细菌的代谢和生物化学通路的理解得到改善时，关于这些通路的这些信息将被并入本发明的实施方案中。

本报告部分II中概述的分析显示了33种原始菌株中仅有22种细菌映射到独特的通路。这表明这些菌种中的一些或全部可能是生态系统内的“关键”菌种，而其他菌种可能是冗余的。这种分析没有考虑到这样一个事实，即可能需要生态系统内一定程度的冗余，未检查的某些细菌的相互作用可能是生态必需的，或未知的细菌通路可能在群落的生态平衡中发挥作用。还必须提及的是，这些菌种中仅有9种具有同样在“健康”微生物群落的实例中发现的独特的KO ID。需要进一步的工作以明确界定人类肠道生态系统内平衡所需的“关键”菌种和通路。

用于寻找RePOOPulate生态系统内的冗余的最终比较被设计为着眼于与RepoOPulate项目的人工群落相比的天然“健康的”人类肠道细菌群落。这被证明一个挑战，因为“健康”细菌的种群尚未明确界定。由于时间限制，选择了所述的被选择用于代表“健康”人类肠道微生物组的研究数据；数据很容易获得，并且已经是本研究中使用的通路分析程序的正确格式。然而，数据来源并不理想，因为它仅包含13个个体的数据，所有个体均为日本血统，数据来源还包括尚未断奶的婴儿的数据，这可能是一个误差的来源，这是由于在发育早期阶段肠道微生物组的动态本质导致的。由于缺乏人类受试体多样性以及日本人独特的饮食习惯，所有粪便样本均来自日本个体的事实也可能是数据误差的来源。以前的研究表明，由于日本饮食中高水平的海藻，需要肠道细菌来分解该食物来源，日本人具有较高丰度的海洋细菌来源的基因。这些引入的海洋细菌基因可能会影响数据集中的通路。如果时间允许，更好的数据来源将是人类微生物群计划(Human Microbiome Project)或欧洲发起的MetaHit(European initiative MetaHit)，这将提供更能代表北美肠道微生物组(North American gut microbiome)的数据来源。

实施例：创建细菌群落

在优化RePOOPulate生态系统的过程中的接下来的步骤涉及在培养中实际建立所建议的细菌群落，以查看在去除明显冗余的菌种和菌株后是否保持了生态平衡。本研究中使用的元基因组学方法无法告诉我们所鉴定的基因是否表达以及在何种水平上表达，因此群落的实际功能活性也应该通过元转录组学(metatranscriptomics)方法进行检查。元转录组学使用已被转换为互补DNA的从群落中分离出的信使RNA，并在高通量平台上测序。该方法允许在微生物生态系统中表征基因表达，并且可以更好地整体理解群落的相互作用。因此，一旦创建这样的细菌群落，细菌群落将被施用于患有微生态失衡(例如但不限于IBD、IBS、UC、癌症相关的微生态失衡等)的患者，并且患者的胃肠病将得到改善。

结论

本研究的部分I概述的证据清楚地显示了在六种被检查菌种中的五种中的冗余。部分II概述的证据不太清楚，但有迹象表明在RepoOPulate生态系统中可以找到几个其他的冗余菌种。部分III的最后分析表明，RepoOPulate群落非常接近模拟健康人类肠道微生物组的代谢和调控通路。这种比较还表明，由22种而不是原始33种菌种组成的生态系统可能会产生更经济的人造细菌群落而不丧失功能或生态平衡。需要进一步的细菌培养研究以检验这一理论。

Claims (6)

1.一种从目标细菌系统富集至少一种菌种的方法，其包括：

在以下条件下在单级恒化器中在培养基中培养目标细菌生态系统：(i)约5至约290小时的系统停留时间，(ii)约37℃的温度，(iii)约6.8-7的pH，和(iv)维持恒化器的厌氧条件，时间为足以富集至少一种菌种；

其中培养基包含制备的淀粉基质，以及

其中目标细菌系统为从至少6个月内未用抗生素治疗的患者获得的粪源样品。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述制备的淀粉基质包含：玉米基质、谷物基质、小麦基质、大麦基质、豆类基质、燕麦基质或它们的任何组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述制备的淀粉基质为玉米基质。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种菌种包含：拟杆菌(Bacteroidesspp.)、奇异菌(Atopobium spp.)、恶臭瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)和吉氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者至少1年内未用抗生素治疗。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述系统停留时间为约20-70小时。