JP2018525023A

JP2018525023A - 標的細菌系からの細菌株を富化するためのシステムおよび方法

Info

Publication number: JP2018525023A
Application number: JP2018511102A
Authority: JP
Inventors: − ヴァーコー、エマアレン
Original assignee: Nubiyota LLC
Current assignee: Nubiyota LLC
Priority date: 2015-08-24
Filing date: 2016-08-24
Publication date: 2018-09-06
Also published as: EP3341472A4; EP3341472A1; WO2017035191A1; CA2995714A1; US20180251725A1; CN108473943A

Abstract

本発明は、標的細菌系からの少なくとも１つの細菌種を富化する方法であって、標的細菌生態系を、単段階ケモスタット中の培地において、（ｉ）約５〜約２９０時間のシステム滞留時間、（ｉｉ）約３７℃の温度、（ｉｉｉ）約６．８〜７のｐＨ、および（ｉｖ）少なくとも１つの細菌種を富化するのに十分な時間のケモスタットに対する嫌気条件の維持の条件下で培養することを含み、培地が、調製されたデンプン基質を含み、標的細菌系が、抗生物質で少なくとも６か月間治療されていない患者から得られた糞便由来試料である、方法である。
【選択図】図２４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年８月２４日に出願され、「ＩＮＦＬＵＥＮＣＥＯＦＮＯＶＥＬＭＡＩＺＥＳＴＡＲＣＨＥＳＯＮＨＵＭＡＮＣＯＬＯＮＩＣＭＩＣＲＯＢＩＡＬＦＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮ」の表題が付いた、米国仮出願米国特許出願第６２／２０９，１３５号の優先権を主張し、その全体がすべての目的で本明細書に参照により組み込まれる。

本発明の分野は、胃腸障害を治療するための療法に関する。特に、本発明は、糞便由来細菌集団からの少なくとも１つの細菌株を富化するシステムおよび方法を提供する。これらのシステムおよび方法は、胃腸障害を治療するための療法として使用することができる。

ヒト体表面を内部および外部から阻害する様々な微生物は、ヒトマイクロバイオータとして知られているものを構成する。これらの微生物は、ヒト体細胞より１０倍数が多く、宿主ゲノムの１５０倍を超える遺伝子を含有すると推定され、必要な遺伝子を独立して進化させることなく、宿主に様々な機能を行う能力を提供している。ヒト胃腸管（ＧＩＴ）は、地球上で最も密度の高い生態系の１つであり、約５００〜１０００の固有の種を代表する＞１０１４の微生物細胞を含有し、最高密度は結腸にある。赤ちゃんは無菌ＧＩＴを持って生まれ、分娩プロセス中にコロニー形成を開始し、離乳までに完全に発達した複雑かつ安定なマイクロバイオータへと成長する。マイクロバイオータの発達は、内因子である腸ｐＨ、免疫応答、および他の遺伝的決定因子の影響を受ける複雑なプロセスである。薬物、食事、母体マイクロバイオータ、および分娩方法のような環境因子は、宿主−微生物の受容体およびシグナル伝達分子との相互作用と同様に、発達をさらに方向付ける。

腸内マイクロバイオータの機能は、局所および全身効果の両方を有する「バーチャル臓器」のそれに似ていることが提唱されている。例としては、宿主酵素により消化しにくいか、または到達しにくいかのいずれかである多糖類のような栄養素の代謝が挙げられ、追加のエネルギーを提供し、吸収のためのビタミンを合成する。微生物発酵は、西欧型の食事における１日のエネルギー供給量の約１０％を占めることが示されている。腸内マイクロバイオータは、腸上皮、腸管腔および体の免疫細胞間の物理的バリアの適切な発達も担っている。これは、表面タンパク質の適切なグリコシル化、微絨毛の発達を媒介し、細胞ターンオーバーを制御することにより達成される。栄養素および接着部位の取り合いによるコロニー形成耐性、抗微生物剤の産生、ならびに腸内環境の調節（例えば、ｐＨの低下）は、潜在的な病原体から宿主を保護する。最後に、マイクロバイオータは、不可欠の刺激を提供し、寛容メカニズムを誘発することにより、免疫系の成熟に寄与する。

前述のとおり、我々の結腸フローラの発達および維持は多因子的であり、食事が調節すべき最も単純な因子である。制御された食事調節は、選択されたプレバイオティクスおよびプロバイオティクスの使用を通した様々な健康上の懸念のための治療介入の可能な手段を提供し得る。長期食事傾向は、食事とエンテロタイプとの間の強い相関を示し、典型的には高脂質／タンパク質の西欧型の食事は、１つのエンテロタイプと関連付けられ、第２のエンテロタイプは、農耕社会に特有の高炭水化物および単糖類の食事と関連付けられた。短期供給研究は、高脂質／低繊維および低脂質／高繊維食間の変更が、２４時間以内に検出可能な急速な微生物変化を誘発したことを示した。これらの変化の大きさは小さく、エンテロタイプを切り替えることができなかったので、エンテロタイプは、短期ではなく、長期食事傾向により影響され得る。

これまで研究されてきた多くの食事基質の中でも、難消化性デンプン、哺乳類酵素により消化しにくい一部のデンプンは、腸内マイクロバイオータの重要な調節因子として際立っている。食事中の難消化性デンプンの量およびタイプを増加させることは、したがって、腸内マイクロバイオータを有益に調節する実現可能かつ簡単な方法を表す。これを標的化して行うためには、各種形態の難消化性デンプンが腸内マイクロバイオータに対して有する影響をまず理解することが重要となるだろう。

本発明は、いくつかの図全体を通して同様の構造が同様の記号により示される、添付の図面を参照してさらに説明される。示されている図面は、必ずしも縮尺通りではなく、それよりも本発明の原理を説明することを通常は重視している。さらに、いくつかの特徴は、特定の要素を詳細に示すために誇張される場合がある。

また、図面に示されているいずれの測定値、仕様等も制限ではなく、例示を目的としている。したがって、本明細書において開示されている特定の構造的および機能的詳細は、限定的ではなく、当業者に本発明を様々に使用することを教示するための単に代表的なものとして解釈されるべきである。

図１Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列比較を示す。図１Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列比較を示す。図１Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列比較を示す。図１Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列比較を示す。図１Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列比較を示す。図１Ｆは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列比較を示す。図２Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列アラインメント図を示す。図２Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列アラインメント図を示す。図２Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列アラインメント図を示す。図２Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列アラインメント図を示す。図２Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列アラインメント図を示す。図２Ｆは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる配列アラインメント図を示す。図３Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる比較のために使用されるいくつかの散布図を示す。図３Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる比較のために使用されるいくつかの散布図を示す。図３Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる比較のために使用されるいくつかの散布図を示す。図４Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる種の一致を確認するためのいくつかの比較を示す。図４Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる種の一致を確認するためのいくつかの比較を示す。図４Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる種の一致を確認するためのいくつかの比較を示す。図４Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる種の一致を確認するためのいくつかの比較を示す。図５Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。図５Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。図５Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。図５Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。図５Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。図５Ｆは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。図５Ｇは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。図５Ｈは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイを確認するのに使用されるＫＥＧＧパスウェイマップを示す。図６Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。図６Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。図６Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。図６Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。図６Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。図６Ｆは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。図６Ｇは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。図６Ｈは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる１つ以上の種の代謝パスウェイマップを示す。図７Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｆは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｇは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｈは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｉは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｊは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｋは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｌは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｍは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｎは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｏは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｐは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図７Ｑは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる代謝パスウェイマップを示す。図８Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。図８Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。図８Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。図８Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。図８Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。図８Ｆは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。図８Ｇは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。図８Ｈは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる２２の種を比較するためのパスウェイマップを示す。図９は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる単段階ケモスタット容器を示す。図１０は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる単段階ケモスタット容器を示す。図１１は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられる６つのデンプン基質の変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）プロファイルを示す。図１２Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような３人の健康なドナーからの糞便が播種されたケモスタット実施のコミュニティダイナミクスを示す。図１２Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような３人の健康なドナーからの糞便が播種されたケモスタット実施のコミュニティダイナミクスを示す。図１２Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような３人の健康なドナーからの糞便が播種されたケモスタット実施のコミュニティダイナミクスを示す。図１３Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよび非加重結合（ＵＰＧＭＡ）相関に基づく樹形図を示す。図１３Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよび非加重結合（ＵＰＧＭＡ）相関に基づく樹形図を示す。図１３Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよび非加重結合（ＵＰＧＭＡ）相関に基づく樹形図を示す。図１４Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような非計量多次元尺度構成法（ＮＭＤＳ）図を示す。図１４Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような非計量多次元尺度構成法（ＮＭＤＳ）図を示す。図１４Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような非計量多次元尺度構成法（ＮＭＤＳ）図を示す。図１５は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティ図を比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図１６は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスからのＮＭＤＳ図を示す。図１７は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図１８は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスからのＮＭＤＳ図を示す。図１９は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図２０は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスからのＮＭＤＳ図を示す。図２１は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図２２Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような主成分解析データを示す。図２２Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような主成分解析データを示す。図２２Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような主成分解析データを示す。図２２Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような主成分解析データを示す。図２２Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような主成分解析データを示す。図２２Ｆは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような主成分解析データを示す。図２３は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような主成分解析データを示す。図２４は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような実験デザインのフローチャートを示す。図２５Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるようなインビトロ供給試験のＤＧＧＥ解析を示す。図２５Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるようなインビトロ供給試験のＤＧＧＥ解析を示す。図２６Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるようなインビトロ供給試験のＤＧＧＥ解析を示す。図２６Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるようなインビトロ供給試験のＤＧＧＥ解析を示す。図２７Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図２７Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図２７Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図２７Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図２７Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図２８Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図２８Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図２８Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図２８Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図２８Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図２９Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図２９Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図２９Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図２９Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図２９Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図３０Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図３０Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図３０Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図３０Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図３０Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図３１Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような発酵研究からの結果を示す。図３１Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような発酵研究からの結果を示す。図３１Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような発酵研究からの結果を示す。図３１Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような発酵研究からの結果を示す。図３１Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような発酵研究からの結果を示す。図３２Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図３２Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図３２Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図３２Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図３２Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図を示す。図３３Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図３３Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図３３Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図３３Ｄは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図３３Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。図３４は、本発明のいくつかの実施形態に従った方法において用いられるような発酵実験からのトータルイオンクロマトグラムを示す。

いくつかの実施形態では、本発明は、標的細菌系からの少なくとも１つの細菌種を富化する方法であって、
標的細菌生態系を、単段階ケモスタット中の培地において、（ｉ）約５〜約２９０時間のシステム滞留時間、（ｉｉ）約３７℃の温度、（ｉｉｉ）約６．８〜７のｐＨ、および（ｉｖ）少なくとも１つの細菌種を富化するのに十分な時間のケモスタットに対する嫌気条件の維持の条件下で培養することを含み、
培地が、調製されたデンプン基質を含み、
標的細菌系が、抗生物質で少なくとも６か月間治療されていない患者から得られた糞便由来試料である、方法である。

いくつかの実施形態では、調製されたデンプン基質は、メイズ基質、コーン基質、コムギ基質、オオムギ基質、マメ基質、オートムギ基質、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、バクテロイデス属種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｓｐｐ．）、アトポビウム属種（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍｓｐｐ．）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｂｒｏｍｉｉ）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）、およびパラバクテロイデス・ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）を含む。いくつかの実施形態では、調製されたデンプン基質は、メイズ基質である。いくつかの実施形態では、患者は、抗生物質で少なくとも１年間治療されていない。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約２０〜７０時間である。

いくつかの実施形態では、本発明は、標的細菌系からの少なくとも１つの細菌株を富化する方法であって、
標的細菌生態系を、単段階ケモスタット中の培地において、（ｉ）約５〜約２９０時間のシステム滞留時間、（ｉｉ）約３７℃の温度、（ｉｉｉ）約６．８〜７のｐＨ、および（ｉｖ）少なくとも１つの細菌株を富化するのに十分な時間のケモスタットに対する嫌気条件の維持の条件下で培養することを含み、
培地が、調製されたデンプン基質を含み、
標的細菌系が、抗生物質で少なくとも６か月間治療されていない患者から得られた糞便由来試料である、方法である。

いくつかの実施形態では、調製されたデンプン基質は、メイズ基質、コーン基質、コムギ基質、オオムギ基質、マメ基質、オートムギ基質、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌株は、バクテロイデス属種、アトポビウム属種、ルミノコッカス・ブロミイ、ラクトバチルス・ガッセリ、およびパラバクテロイデス・ディスタソニスを含む。いくつかの実施形態では、調製されたデンプン基質は、メイズ基質である。いくつかの実施形態では、患者は、抗生物質で少なくとも１年間治療されていない。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約２０〜７０時間である。

開示されている利益および改良の中で、本発明の他の目的および利点は、添付の図面と併せて下記の説明から明らかとなるだろう。本発明の詳細な説明は、本明細書において開示されているが、開示されている実施形態は、様々な形態で具現化され得る本発明の単なる例示であることが理解されるべきである。また、本発明の様々な実施形態に関連して与えられる例の各々は、制限ではなく、例示を目的としている。

説明全体を通して、下記の用語は、特に文脈で明らかな指示がない限り、本明細書において明示的に関連した意味をとる。本明細書において使用されている「一実施形態では」および「いくつかの実施形態では」という句は、必ずしも同じ実施形態を指すわけではないが、そうであってもよい。さらに、本明細書において使用されている「別の実施形態では」および「いくつかの他の実施形態では」という句は、必ずしも異なる実施形態を指すわけではないが、そうであってもよい。よって、下に記載されているように、本発明の様々な実施形態は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、容易に組み合わされ得る。

また、本明細書において使用されている「または」という用語は、包括的「ｏｒ」演算子であり、特に文脈で明らかな指示がない限り、「および／または」という用語に等しい。「に基づく」という用語は、排他的ではなく、特に文脈で明らかな指示がない限り、記載されていない追加の要素に基づくことを可能にする。また、明細書全体を通して、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の意味は、複数の参照物を含む。「ｉｎ」の意味は、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。

本明細書において使用されている「腸内毒素症」という用語は、対象の腸内マイクロバイオームの不均衡を指す。

本明細書において使用されている「マイクロバイオーム」という用語は、コミュニティ中のすべての微生物を指す。非限定的な例として、ヒト腸内マイクロバイオームは、ヒトの腸内のすべての微生物を含む。

本明細書において使用されている「化学療法関連腸内毒素症」という用語は、対象の腸内マイクロバイオームの不均衡をもたらす、対象者の特定の疾患を標的として使用されるいずれかの介入を指す。

本明細書において使用されている「糞便細菌療法」という用語は、ドナーの便がレシピエントの腸内に注入され、正常細菌マイクロバイオータを再構築する治療を指す。糞便細菌療法は、予備研究において、これまでに発表された１００件の症例中９０％近い成功率で、有望な結果を示している。理論により縛られることなく、これは、反復的な抗生物質使用のサイクルを断ち、Ｃ・ディフィシルの成長を抑制する均衡のとれた生態系を再構築することによって作用すると考えられている。

本明細書において使用されている「キーストーン種」という用語は、ヒト便試料中に一貫して見られる細菌の種である。

本明細書において使用されている「ＯＴＵ」という用語は、これに限定されないが、１６ＳｒＲＮＡ配列を含む、核酸配列における類似性を介して種、または種の群を定義する、操作的分類単位を指す。

いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５〜２５０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５〜２００時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５〜１５０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５〜１００時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５〜９０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５〜８０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５〜７０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５〜６０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５〜５０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５〜４０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５〜３０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５〜２０時間である。

いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約２０〜２５０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約３０〜２５０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約４０〜２５０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５０〜２５０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約６０〜２５０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約７０〜２５０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約８０〜２５０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約９０〜２５０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約１００〜２５０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約１５０〜２５０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約２００〜２５０時間である。

いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約２０〜２００時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５０〜１５０時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約５０〜１００時間である。いくつかの実施形態では、システム滞留時間は、約１００〜１５０時間である。

この研究は、ヒト腸内マイクロバイオータによる６つの異なるメイズデンプン基質のインビトロ小規模バッチ発酵間の相違を評価した。遠位結腸をモデル化するケモスタット中で増殖された、３人のドナーからの安定な糞便コミュニティを、バッチ発酵における糞便接種源として使用した。各糞便コミュニティについてコミュニティ構造における変化および短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）のような代謝物の産生を評価するのに、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）およびガスクロマトグラフィ−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）を使用した。試験されたデンプン基質は、各ドナーの糞便コミュニティに対する固有の変化を促進し、個体の糞便マイクロバイオータが各種デンプン基質を異なる方法で発酵させることを示した。ＧＣ−ＭＳデータはこれらのドナー特異的な結果を支持し、３人のドナーすべてのマイクロバイオータについて酪酸の顕著な産生を示すが、ペンタン酸およびプロパン酸における顕著な増加は１人においてのみ観察された。コミュニティプロファイルは発酵されたデンプン基質に応じた変化を示したが、代謝物における明確な相違は観察されなかった。
略語のリスト

糞便由来細菌集団
いくつかの実施形態では、本発明は、腸内毒素症を有する対象を治療する方法であって、腸内毒素症を有する対象の第１の代謝プロファイルを決定することと、対象に、治療有効量または、対象にコロニーを形成し、第１の代謝プロファイルを第２の代謝プロファイルに変更するのに必要な量の、アシダミノコッカス・インテスティナリス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）１４ＬＧ、バクテロイデス・オヴァタス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓｏｖａｔｕｓ）５ＭＭ、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）２０ＭＲＳ、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ）、ブラウティア属種（Ｂｌａｕｔｉａｓｐ．）２７ＦＭ、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐ．）２１ＦＡＡ、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）３ＦＭ４ｉ、ユーバクテリウム・デスモランス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｅｓｍｏｌａｎｓ）４８ＦＡＡ、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｌｉｇｅｎｓ）Ｆ１ＦＡＡ、ユーバクテリウム・リモスム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｍｏｓｕｍ）１３ＬＧ、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｕｍｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）４０ＦＡＡ、ラクノスピラ・ペクチノシザ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｐｅｃｔｉｎｏｓｈｉｚａ）３４ＦＡＡ、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）２５ＭＲＳ、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）５ＦＭ、ロゼブリア・フェカリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａｆａｅｃａｌｉｓ）３９ＦＡＡ、ロゼブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）３１ＦＡＡ、ルミノコッカス属種（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）１１ＦＭ、ルミノコッカス属種（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐｅｃｉｅｓ）、ルミノコッカス・トルクエス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｔｏｒｑｕｅｓ）３０ＦＡＡ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つの細菌株を投与することにより、対象の第１の代謝プロファイルを対象の第２の代謝プロファイルに変更することと、対象を、対象の十分なコロニー形成をもたらすように、少なくとも１つの細菌株で治療することと、を含み、第１の代謝プロファイルが、腸内毒素症の結果であり、第２の代謝プロファイルが、腸内毒素症を有する対象を治療する、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、その方法は、対象に、治療有効量の、１６−６−Ｉ２１ＦＡＡ９２％クロストリジウム・コクレアタム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｃｌｅａｔｕｍ）、１６−６−Ｉ２ＭＲＳ９５％ブラウティア・ルティ（Ｂｌａｕｔｉａｌｕｔｉ）、１６−６−Ｉ３４ＦＡＡ９５％ラクノスピラ・ペクチノスチザ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｐｅｃｔｉｎｏｓｃｈｉｚａ）、３２−６−Ｉ３０Ｄ６ＦＡＡ９６％クロストリジウム・グリシルリジニリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎｉｌｙｔｉｃｕｍ）、３２−６−Ｉ２８Ｄ６ＦＡＡ９４％クロストリジウム・ラクタチフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌａｃｔａｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つの細菌株を投与することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、腸内毒素症は、胃腸炎に関連する。いくつかの実施形態では、胃腸炎は、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、憩室疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、または不確定大腸炎である。

いくつかの実施形態では、腸内毒素症は、クロストリジウム・ディフィシル感染症である。いくつかの実施形態では、腸内毒素症は、食中毒である。いくつかの実施形態では、腸内毒素症は、化学療法関連腸内毒素症である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌株および／または種は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、‘ＳｔｏｏｌｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｔｈｅｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：’ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｇｕｔ’，ｂｙＰｅｔｒｏｆｅｔａｌ．（２０１３）において開示されている。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓｒｅｖｅａｌｅｄｃｏｍｍｏｎｌｙｅｎｒｉｃｈｅｄｇｅｎｅｓｅｔｓｉｎｈｕｍａｎｇｕｔｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｓ”，（２００７）ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ１４：１６９−１８１において開示されている。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、米国特許出願公開第２０１５／００４４１７３号において開示されている。あるいは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、米国特許出願第２０１４／０３６３３９７号において開示されている。あるいは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、米国特許出願第２０１４／００８６８７７号において開示されている。あるいは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、米国特許第８，９０６，６６８号において開示されている。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｔａｋａｇｉｅｔａｌ．（２０１６）“Ａｓｉｎｇｌｅ−ｂａｔｃｈｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｔｏｓｉｍｕｌａｔｅｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｉｃｍｉｃｒｏｂｉｏｔａｆｏｒｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ”ＰＬｏＳＯＮＥ１１（８）：ｅ０１６０５３３において開示されている方法に従って少なくとも１つの細菌を評価することを含むことができる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、健康な患者から誘導される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種は、米国特許出願公開第２０１４／０３４２４３８号において開示されている方法に従って健康な患者から誘導される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種および／または株は、患者から、
ａ．排泄されたての便試料を入手し、試料を嫌気性チャンバ（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、および５％Ｈ２の雰囲気中）に配置することと、
ｂ．便試料をバッファに浸軟させることにより、糞便スラリーを生成することと、
ｃ．遠心分離により食品粒子を除去し、浮遊物を保持することと、を含む、方法により誘導される。

いくつかの実施形態では、米国公開第２０１４／０３４２４３８号の方法に従って、浮遊物を使用し、ケモスタットに播種する。

本発明のいくつかの実施形態に従った培養方法
腸内毒素症を有する対象の第１の代謝プロファイルを決定する方法の有効性は、例えば、方法の感度のような要素により限定され得る（すなわち、方法は、特定の細菌株が閾値レベルを超えて存在する場合のみ、その株を検出することができる）。

対象を治療する第２の代謝プロファイルを決定する方法の有効性は、例えば、方法の感度のような要素により限定され得る（すなわち、方法は、特定の細菌株が閾値レベルを超えて存在する場合のみ、その株を検出することができる）。

いくつかの実施形態では、閾値レベルは、検出方法の感度に依存している。よって、いくつかの実施形態では、検出方法の感度に応じて、対象に十分にコロニーが形成されているかを決定するのに、より大きな量の少なくとも１つの細菌種が必要となる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの細菌種および／または株は、ケモスタット容器中で培養される。いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス・インテスティナリス１４ＬＧ、バクテロイデス・オヴァタス５ＭＭ、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス２０ＭＲＳ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ブラウティア属種２７ＦＭ、クロストリジウム属種２１ＦＡＡ、コリンセラ・アエロファシエンス、エシェリキア・コリ３ＦＭ４ｉ、ユーバクテリウム・デスモランス４８ＦＡＡ、ユーバクテリウム・エリゲンスＦ１ＦＡＡ、ユーバクテリウム・リモスム１３ＬＧ、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ４０ＦＡＡ、ラクノスピラ・ペクチノシザ３４ＦＡＡ、ラクトバチルス・カゼイ２５ＭＲＳ、パラバクテロイデス・ディスタソニス５ＦＭ、ロゼブリア・フェカリス３９ＦＡＡ、ロゼブリア・インテスティナリス３１ＦＡＡ、ルミノコッカス属種１１ＦＭ、ルミノコッカス属種、ルミノコッカス・トルクエス３０ＦＡＡ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの細菌株は、ケモスタット容器中で培養される。

いくつかの実施形態では、１６−６−Ｉ２１ＦＡＡ９２％クロストリジウム・コクレアタム、１６−６−Ｉ２ＭＲＳ９５％ブラウティア・ルティ、１６−６−Ｉ３４ＦＡＡ９５％ラクノスピラ・ペクチノスチザ、３２−６−Ｉ３０Ｄ６ＦＡＡ９６％クロストリジウム・グリシルリジニリチカム、３２−６−Ｉ２８Ｄ６ＦＡＡ９４％クロストリジウム・ラクタチフェルメンタンス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの細菌種は、ケモスタット容器中で培養される。いくつかの実施形態では、ケモスタット容器は、米国特許出願公開第２０１４／０３４２４３８号において開示されている。ある実施形態では、ケモスタット容器は、図１０に記載されている容器である。

いくつかの実施形態では、ケモスタット容器は、凝縮器を遮断し、窒素ガスを培養物に通して発泡させることにより、発酵系からケモスタットに変換された。いくつかの実施形態では、圧力は、廃棄物を設定された高さで金属管（以前は試料採取管）から押し出し、ケモスタット培養物の所定の作業体積の維持を可能にする。

いくつかの実施形態では、ケモスタット容器は、濾過窒素ガスをケモスタット容器に通して発泡させることにより、嫌気的に保持される。いくつかの実施形態では、温度および圧力は、自動的に制御および維持される。

いくつかの実施形態では、ケモスタット培養物の培養ｐＨは、５％（体積／体積）ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）および５％（重量／体積）ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ）を使用して維持される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、６．８〜７である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、６．９〜７である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、６．８〜６．９である。

いくつかの実施形態では、ケモスタット容器の培地は頻繁に交換される。いくつかの実施形態では、交換は、遠位腸内の滞留時間に等しい一定の時間にわたって行われる。結果として、いくつかの実施形態では、培地は、４００ｍＬ／日（１６．７ｍＬ／時間）の割合で連続的にケモスタット容器に供給され、遠位腸内の滞留時間を模倣するように設定された値である２４時間の滞留時間が得られる。代替の滞留時間は、６５時間（約１４８ｍＬ／日、６．２ｍＬ／時間）とすることができる。いくつかの実施形態では、滞留時間は、１２時間と短くすることができる。

いくつかの実施形態では、培地は、米国特許出願公開第２０１４／０３４２４３８号において開示されている培地である。

材料および方法
難消化性デンプン含有基質の調製

６つのメイズ系統（表２．１）からのコーンミールにインビトロ消化および発酵を行った。乾燥メイズ穀粒を、Ｄｒ．ＭｉｃｈａｅｌＥｍｅｓ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｕｅｌｐｈ、オンタリオ州）から入手し、サイクロンミル（ＵＤＹＣｙｃｌｏｎｅＳａｍｐｌｅＭｉｌｌ）を使用して１ｍｍスクリーン通過を可能にするように粉砕し、微細なコーンミールをもたらした。３０ｇのコーンミールを５００ｍｌのリン酸バッファ（２０ｍＭ、ｐＨ６．９、Ｎａ２ＨＰＯ４１．４２ｇＬ−１、ＫＨ２ＰＯ４１．３６ｇＬ−１、ＮａＣｌ０．５８ｇＬ−１）に懸濁させ、３０分間１２１℃でオートクレーブし、消化手順の直前に、マグネチックスターラー上で撹拌しながら３７℃まで冷却した。消化は無菌条件下で行った。簡潔に、溶液をマグネチックスターラー上で３７℃でインキュベートし、消化酵素（すべてＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、オークビル、オンタリオ州から供給）を段階的に添加した。１）ＮａＯＨ（２０％（重量／体積））の添加でｐＨを６．９±０．１に調節し、０．５ｍＬのヒト唾液α−アミラーゼ溶液（１ｍＭのＣａＣｌ２中１０ｍｇｍＬ−１）を添加し、１５分間インキュベートし、２）ＨＣｌ（２０％（体積／体積））および１．２５ｍＬのブタペプシン懸濁液（９ｇＬ−１のＮａＣｌ中１ｍｇｍＬ−１）の添加でｐＨを２．０±０．１に調節し、３０分間インキュベートし、３）塩基（２０％（重量／体積）ＮａＯＨ）の添加でｐＨを６．９±０．１に調節し、１０ｍＬのパンクレアチン（２５ｍＭのＣａＣｌ２中０．５ｍｇｍＬ−１）および１２ｇのウシ胆汁（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を添加し、３時間インキュベートした。消化産生物を、４℃のｄｄＨ２Ｏ中で２４時間にわたって常に撹拌しながら１２〜１４ｋＤａの分子カットオフの無菌透析チューブ（Ｓｅｒｖａｐｏｒ４４１４６、ＳｅｒｖａＦｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａＧｍｂＨ＆Ｃｏ．、ハイデルベルク、ドイツ）を使用して、透析により除去した。残余物を無菌５０ｍＬコニカルに移し、４日間凍結乾燥させた（ＦｒｅｅＺｏｎｅ（登録商標）１２ＬｉｔｅｒＦｒｅｅｚｅＤｒｙＳｙｓｔｅｍ、Ｌａｂｃｏｎｃｏ、ミズーリ州、米国）。無菌技術を使用し、乾燥基質を、乳鉢および乳棒を使用して粉砕し、５００μｍ篩を通過させ、均一な粒子サイズを達成した。調製されたデンプン基質を、インビトロ小規模バッチ発酵に使用されるまで、−２０℃で保存した。

難消化性デンプン決定：

６つのメイズ系統の予備消化および未処理コーンミール中の難消化性デンプン（ＲＳ）、可溶性デンプン（ＳＳ）、および総デンプン（ＴＳ）の量を、ＭｅｇａｚｙｍｅＲＳアッセイキット（ＭｅｇａｚｙｍｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、アイルランド）を使用して決定した。簡潔に、試料を、アミログルコシダーゼ（ＡＭＧ）（３ＵｍＬ−１）を含有する４ｍｌの膵臓α−アミラーゼ（１０ｍｇｍＬ−１）の存在下、１６時間連続的に振盪しながら３７℃で消化した。可溶化デンプンを、消化されていない難消化性デンプンから、３０００ｇでの遠心分離および５０％エタノールでの繰り返し洗浄により分離した。ＲＳペレットを、常に撹拌しながらＫＯＨ（２Ｍ）の添加を通してｐＨを調節することにより溶解した。ＳＳおよびＲＳ画分の両方を、それぞれＡＭＧ１０μＬ（３００ＵｍＬ−１）で２０分および０．１ｍＬ（３３００ＵｍＬ−１）で３０分、５０℃で処理した。最後に、これらの溶液の０．１ｍＬアリコートを３ｍＬのグルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ試薬（ＧＯＰＯＤ）と組み合わせ、５０℃で２０分間インキュベートした後、吸光度を試薬ブランクに対して５１０ｎｍで測定した。ＲＳおよびＳＳを製造業者の指示に従って計算し、これらの画分の合計はＴＳに等しかった。

ケモスタット稼働

単段階ケモスタットの調製

ＩｎｆｏｒｓＭｕｌｔｉｆｏｒｓバイオリアクターシステム（Ｉｎｆｏｒｓ、スイス）を、凝縮器ベントを閉め、窒素ガスを培養物に通してを発泡させ、４００ｍＬの一定体積で容器内容物を維持した容器内で嫌気性環境および陽圧を形成することにより、ケモスタット稼働に変換した。温度およびｐＨを、実験の経過中に常に監視し、酸（５％（体積／体積）ＨＣｌ）および塩基（５％（重量／体積）ＮａＯＨ）の添加により、一貫して３７℃および６．９〜７．０のｐＨに維持した。容器を常に撹拌し、表２．２に詳述されている新鮮な培地を一定流量、４００ｍＬ／日の割合で供給し、２４時間の滞留時間とし、ヒト遠位結腸を模倣した。接種前に、各容器を無菌でサンプリングし、５％脱線維ヒツジ血液（ＨｅｍｏｓｔａｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ディクソン、カリフォルニア州）（ＦＡＡｂ）が補充された選好性嫌気性寒天（Ａｃｕｍｅｄｉａ、ランシング、ミシガン州）上に播種し、好気的および嫌気的の両方で３７℃でインキュベートし、容器が確実に汚染を含まないようにした。

使用される培地は、ケモスタットを使用してヒト腸内を模倣する以前の研究に基づいていた。培地を４つの別々のストック調製物（表２．２）で調製し、安全キャビネット中で無菌で組み合わせ、さらに２．５ｍＬの消泡Ｂシリコーンエマルジョン（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、センター・バレー、ペンシルバニア州）を調製された各リットルに添加した。添加前に、調製物１および４をオートクレーブし、調製物２および３を０．２２μｍ濾紙を通して濾過した。培地を、ＦＡＡｂ上に播種することにより無菌性について確認し、使用前に２週間未満４℃で保存した。

糞便接種源の回収および調製

ゲルフ大学の研究倫理委員会がこの研究を承認した（ＲＥＢ＃０９ＡＰ０１１）。３人の健康なドナー、ドナー２（女性、４２歳）、ドナー５（男性、４４歳）、およびドナー９（男性、２５歳）が、この研究のための新鮮な糞便試料を提供した。ドナーのいずれも、この研究のための試料の回収の前年に慢性疾患歴または抗生物質の治療はなかった。

糞便回収および調製を行った。簡潔に、試料を近くの手洗所で無菌蓋付き容器中に回収し、排泄の５〜１０分以内に嫌気性チャンバ（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、および５％Ｈ２の雰囲気）へ移した。糞便（５ｇ）を、５０ｍＬの脱気ケモスタット培地中で１分間、ストマッカー（ＴｅｋｍａｒＳｔｏｍａｃｈｅｒＬａｂＢｌｅｎｄｅｒ、Ｓｅｗａｒｄ、ワージング、ウエスト・サセックス、英国）を使用してホモジナイズし、１０％（重量／体積）糞便スラリーを産生した。大きな粒子を１０分間および１７５ｘｇの低速遠心分離で除去した。浮遊物は、この研究において、ケモスタットの糞便接種源として機能した。

ケモスタット接種前に便の穏やかな遠心分離により大きな食品粒子を除去することは、一般的に行われている。以前の研究は、低速遠心分離が浮遊物の微生物コミュニティに、元の糞便試料のそれと比較して、顕著なバイアスを導入しなかったことを示している。

接種、稼働、およびサンプリング
ケモスタット容器は、１００ｍＬの１０％糞便接種源（第２．３．２部）の３００ｍＬの無菌ケモスタット培地への添加で接種された。撹拌およびｐＨ制御を、接種直後に有効にし、実行中は有効なままにした。培養物を容器内で２４時間自己構築させた後、供給ポンプを開始した。ケモスタット容器の毎日のサンプリングは、２０滴の消泡Ｂシリコーンエマルジョン（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、センター・バレー、ペンシルバニア州）の添加および容器サンプリングポートを通した４ｍＬの培地の除去を含んだ。試料を、２×２ｍＬチューブにアリコートし、その後のＤＮＡ抽出のために−８０℃でアーカイブした。

インビトロ静的バッチデンプン発酵

ドナー２、５、および９からの糞便が播種されたケモスタットを前述（第２．３．３部）のとおり稼働させ、これらのケモスタットからの安定な定常状態のコミュニティをすべてのその後の発酵のためのすべての接種源として使用した。５０ｍＬの作業体積での静的バッチ発酵を、以前の研究からの手順に従って、３７℃嫌気性インキュベータにおいて行った。簡潔に、０．５ｇの各デンプン基質を安全キャビネット中の１００ｍＬボトルに無菌で移し、１０ｇＬ−１の最終濃度を達成した。

ケモスタット培養物の添加の直前に、４５ｍＬの無菌、予備還元、基本培地（ｐＨ６．９±０．１）（表２．３）をボトルに添加した。各ボトルに５ｍＬの新鮮なケモスタット培養物を接種し、最終濃度を１００ｍＬ／Ｌとした。対照発酵は、５０ｍＬの発酵バッファおよび０．５ｇの各デンプン（１０ｇＬ−１）または５ｍＬの新鮮なケモスタット培養物（１００ｍＬ／Ｌ）を含む４５ｍＬの発酵バッファのいずれかを含有した。

静的バッチ発酵を、４８時間、ｐＨ制御なし、３７℃、嫌気性インキュベータ内で実行した。重複２ｍＬ試料を、接種後０、４、８、２４、および４８時間で採取し、ＤＮＡおよびＶＯＣ解析のために−８０℃で凍結した。これらの実験中に複数のデンプン基質発酵を行い、各発酵にデンプン基質、バイオロジカルレプリケート＃、テクニカルレプリケート＃（ローマ数字）、およびサンプル時点に従って名前を付けた。例えば、（Ｃｇ１０２１ｉ−４８ｈ）は、デンプン基質Ｃｇ１０２を含有する発酵の第１のバイオロジカルおよび第１のテクニカルレプリケートから、接種後４８時間で採取された試料を表す。

ケモスタット供給試験

標準ケモスタット培地に、予備消化ハイメイズ２６０（高ＲＳ）（ＮａｔｉｏｎａｌＳｔａｒｃｈａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌ、マンチェスター、英国）またはコーンスターチ（対照）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、オークビル、オンタリオ州）を補充し、インビボ供給試験中に消費される量を模倣し、消化前の合計を３０ｇ／日とした。１２０ｇのハイメイズ２６０およびコーンスターチを、わずかな変更を加えた前述の方法（第２．１部）に従って、３０ｇバッチで消化した。デンプンを、リン酸バッファ（２０ｍＭ、ｐＨ６．９、Ｎａ２ＨＰＯ４１．４２ｇＬ−１、ＫＨ２ＰＯ４１．３６ｇＬ−１、ＮａＣｌ０．５８ｇＬ−１）中で２０分間沸騰させ、透析後、残余物をケモスタット培地（溶液１、表２．１）に凍結乾燥なしでそのまま添加した後、溶液１をオートクレーブし、培地の残部を前述のとおり調製した。

２対の「ツイン」ケモスタット容器（同じ接種源が接種された２つの同一のケモスタット容器）（Ｄ５−１とＤ５−２）および（Ｄ９−Ｒ１とＤ９−Ｒ２）を、いずれの実験操作もなしに、容器が定常状態に到達するまで稼働させた。定常状態の構築後、培地を容器Ｄ５−１（ＲＳ＋）およびＤ９−Ｒ１（ＲＳ＋）について変更し、３０ｇ／日（消化前）に等しいハイメイズ２６０を４日間提供した。培地をＤ５−２（ＣＳ＋）およびＤ９−Ｒ２（ＣＳ＋）について同様に変更し、３０ｇ／日（消化前）と等体積のコーンスターチを４日間提供した（対照容器）。４日のデンプン増加後、すべての容器を基本ケモスタット培地に戻し、４日間稼働させ、ウォッシュアウト期間を提供した後、実験を終了した。容器を、実験の経過全体を通して、前述のとおりサンプリングした。

ＤＮＡ抽出

ＤＮＡを、変更を加えたプロトコルに従ってアーカイブ試料から、ビードビーティングおよび２つの市販キットの成分の組み合わせを利用して抽出した。簡潔に、２００ｍｇのガラスビーズ、３００μＬのＳＬＸバッファ（ＯｍｅｇａＢｉｏ−ＴｅｋＥ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）ＳｔｏｏｌＤＮＡキット、ノークロス、ジョージア州）、および１０μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇｍＬ−１、０．１ｍＭのＣａＣｌ２中）を２ｍＬスクリューキャップチューブに添加した。各試料を解凍し、十分に混合した後、２００μＬをスクリューキャップエッペンドルフチューブにアリコートし、これをビードビーターに入れ、ＤｉｓｒｕｐｔｏｒＧｅｎｉｅ（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ボヘミア、ニューヨーク州）を使用して４分間３０００ｒｐｍで加工した。試料を１０分間７０℃で、５分間９５℃で、次に２分間氷上でインキュベートした。１００μＬのバッファＰ２（ＯｍｅｇａＢｉｏ−ＴｅｋＥ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）ＳｔｏｏｌＤＮＡキット、ノークロス、ジョージア州）をチューブに添加し、３０秒間ボルテックスした後、５分間氷上で追加のインキュベーションを行った。試料を２０４５０ｘｇで５分間遠心分離し、浮遊物を、２００μＬのＨＴＲ試薬（ＯｍｅｇａＢｉｏ−ＴｅｋＥ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）ＳｔｏｏｌＤＮＡキット、ノークロス、ジョージア州）を含む新たな１．５ｍＬチューブに移し、１０秒間ボルテックスし、室温で２分間インキュベートした。最後に、試料を２０４５０ｘｇで２分間遠心分離し、浮遊物をＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ＤＮＡ精製キットカートリッジ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコシン州）に移し、抽出プロトコルの残部をＭａｘｗｅｌｌキットの指示に従って完了した。

生／死細胞比較

ＰｈＡＳＴＢｌｕｅ光活性化システム（ＰｈＡＳＴＢｌｕｅ、ＧｅｎＩＵＬ、バルセロナ、スペイン）を使用して、選択試料を試験し、コミュニティダイナミクスにおける変化が死細胞集団に由来するＤＮＡの存在により影響を受けたかを決定した。製造業者の指示に従って、死（透過性）細胞からのＤＮＡを、エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）を使用して不活性化した。０および４８時間でのサンプリング直後に、マイクロピペットを使用して試料をホモジナイズし、提供されている試薬チューブに２００μＬアリコートを添加し、穏やかにボルテックスした。試料を、ボルテックスミキサー上で１０分間、間欠混合しながら氷水浴中でインキュベートし、無菌反応チューブに移した。試料を、提供されているＰｈＡＳＴＢｌｕｅシステム装置（青色発光器）で、予め設定されている製造業者設定（１００％強度で１５分）を使用して光活性化した。

試料を２０４５０ｘｇで５分間回転させ、浮遊物を廃棄し、ペレットを２００μＬの無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させた後、前述のプロトコルに従ってＤＮＡ抽出を行った。

変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）解析

ＤＮＡを、すべてのバッチ発酵から接種後０および４８時間で、ならびにケモスタット容器から２日毎に、類似性およびコミュニティダイナミクスにおける変化を決定するＤＧＧＥ解析のために抽出した。ＰＣＲ、ＰＣＲ精製および濃縮、ＤＧＧＥ、ならびにゲル解析を行った。プライマーＨＤＡ１およびＨＤＡ２−ＧＣを使用し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ３領域（３３９−５３９ｂｐ、エシェリキア・コリ番号付け）を増幅した。サイクリング条件は、９２℃で２分間、（９２℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間）×３５サイクル、７２℃で１０分間とした。抽出されたＤＮＡはテンプレートとして機能し、各試料は３つの同一のＰＣＲ反応において増幅されている。ＰＣＲ産生物をアガロースゲル電気泳動（２％アガロース重量／体積、１倍トリス−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）中、８０Ｖで４０分）により解析し、ＰＣＲ反応が成功したことを確認した。

わずかな変更を加えたプロトコルに従って、ＥＺ−１０ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎＰＣＲＰｒｏｄｕｃｔｓＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｂｉｏｂａｓｉｃ、マーカム、オンタリオ州）で、同一の試料をプールおよび濃縮した。試料を４０μＬのＨＰＬＣグレード水に溶出し、１０μＬのＤＧＧＥローディング色素（０．０５％（体積／体積）ブロモフェノールブルー、０．０５％（体積／体積）キシレンシアノール、ＨＰＬＣグレード水中７０％（体積／体積）グリセロール、Ｂｉｏ−ＲａｄＤＣｏｄｅＭａｎｕａｌ）と混合した。社内で入手可能なヒト腸内細菌単離物から以前抽出されたＤＮＡを使用して開発されたＤＧＧＥ標準ラダーを、すべてのＤＧＧＥゲルの外側および中央レーン上で実行した。ラダー内に含まれるＤＮＡ試料は、次の細菌単離物、コプロバチルス属種（Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）（１／２／５３）、エンテロコッカス科属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅｓｐ．）（３０／１、ＨＭＰ＃３２３としても知られる）、ベイロネラ属種（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｓｐ．）（５／２／４３ＦＡＡ）、クロストリジウム属（１／１／４１Ａ１ＦＡＡＣＴ２、ＨＭＰ＃１７４としても知られる）、およびプロピオニバクテリウム属種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）（７／６／５５ＢＦＡＡ）に由来した。前述のとおりＨＤＡ１およびＨＤＡ２−ＧＣプライマーを使用して各株のＤＮＡを増幅し、産生物を等比でプールすることにより、ラダーを調製した。

前述のプロトコルに従って、ＤＣｏｄｅＳｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を使用し、６％（体積／体積）ポリアクリルアミドゲルでのＤＧＧＥを行った。尿素およびホルムアミドからなる３０〜５５％の変性剤濃度勾配を利用し、精製されたＰＣＲ産生物を分離した。ゲルに、６０℃で１倍ＴＡＥバッファ中５時間１２０Ｖでの電気泳動を行った。ゲルを、各１０分間、それぞれ臭化エチジウム（１Ｌの１倍ＴＡＥ中１００μｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、オークビル、オンタリオ州）およびｄｄＨ２Ｏで、染色した後、脱染色した。ＧｅｎｅＳｎａｐソフトウェア（バージョン６．０８．０４、ＳｙｎｏｐｔｉｃｓＬｔｄ、ケンブリッジ、英国）を実行するＳｙｎＧｅｎｅＧ−Ｂｏｘゲルドキュメンテーションシステムを利用し、ゲルの画像をキャプチャした。キャプチャ中、ＧｅｎｅＳｎａｐソフトウェアの自動露出ツールを使用し、画像を飽和について正規化した。

ＳｙｎｇｅｎｅＧｅｎｅＴｏｏｌｓソフトウェア（バージョン４．０１．０３、ＳｙｎｏｐｔｉｃｓＬｔｄ）を使用し、ＤＧＧＥゲルを解析した。試料プロファイル間のＤＧＧＥバンドパターンを、類似性マトリックスを生成するピアソン相関係数値（類似性指数（ＳＩ）値）の計算を通して、類似性について解析した。ＳＩ値は０〜１の範囲内であり、１の値は２つのプロファイルが同一のバンドパターンを含有したことを示し、０の値は２つのプロファイル間に共通のバンドがないことを示した。ＳＩ値を１００倍し、相関係数（類似性指数％（ＳＩ％）値）を得た。ＳＩ％値を利用し、非加重結合（ＵＰＧＭＡ）法を使用する樹形図を生成した。

同じＤＧＧＥゲル内の同一のラダー試料を使用し、バンドプロファイルの類似性を比較することにより、ゲル特異的「カットオフ閾値」を計算した。理論では、同一のラダー試料は１００％類似であるべきであるが、ＳＩ％値は、ＤＧＧＥに関連する実験誤差およびゲル全体を通した変性剤濃度勾配のばらつきによって、常に１００％未満である。ラダー試料間のＳＩ％値は「カットオフ閾値」を定義し、したがって「カットオフ閾値」より大きなＳＩ％値を有する試料を同一とみなし、「カットオフ閾値」の５％以内のＳＩ％値を類似とみなした。

コミュニティダイナミクスおよび容器間類似性

コミュニティダイナミクスを移動窓相関解析で示し、一定の時間にわたるコミュニティ内の変化を評価した。これらの図を使用し、コミュニティが定常状態に到達したことを確認し、インビトロ供給試験に応じてコミュニティ安定性を評価した。図上の各点は、第（ｘ−２）対（ｘ）日目の同じ容器に由来する試料のＤＧＧＥプロファイル間の変化パーセント（１００−ＳＩ％）を表す。「ツイン容器」間のコミュニティ類似性における変化を、ＳＩ％値を使用して決定した。図上の各点は、治療経過の同一の日数での２つの容器間のＳＩ％を表す。類似性の低下は、異なる治療に応じた容器間のコミュニティ構造における相違を表す。

ＤＧＧＥパターン解析：非計量多次元尺度構成法

非計量多次元尺度構成法（ＮＭＤＳ）とは、データセット内の複雑な関係を図表で要約することを目的とする序列化技術である。ＮＭＤＳは、変数間の線形関係を必要とせず、試料間の類似性の順位を保存しようと試みる。したがって、より類似したコミュニティ組成を有する試料は、互いにより近くに配置される。ＤＧＧＥプロファイルを、ピアソン相関係数値の計算を通して類似性について解析し、ＸＬｓｔａｔ（Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ、ｈｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｘｌｓｔａｔ．ｃｏｍ）を使用して各ＤＧＧＥゲルについてのＮＭＤＳ図を作成するのに使用される類似性マトリックスを生成した。クラスカルのストレス式１を使用し、図が類似性マトリックスを正確に表す程度を決定し、ストレス値＜０．１は、パターンについて誤った結論に達するリスクが低い、良好な序列化を表す。０．１＜ｘ＜０．２の値は依然として使用可能なモデルを生成するが、０．２に近い値は誤解を招く恐れがあり、結果について結論を出す際には注意するべきである。すべてのＮＭＤＳ図を、小規模バッチ発酵のＤＧＧＥプロファイル間の関係の二次元モデルとして表す。

ＳＰＭＥ−ＧＣ−ＭＳパラメータ

固相微量抽出（ＳＰＭＥ）結合ガスクロマトグラフィ−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）を使用して、接種後０および４８時間で小規模バッチ発酵から揮発性有機化合物（ＶＯＣ）を抽出および解析した。デンプン基質の発酵後に存在する代謝物における変化を、糞便ＶＯＣの解析のためのわずかな変更を加えたプロトコルに従って決定した。簡潔に、−８０℃でアーカイブされた試料を室温で解凍し、十分に混合した後、１ｍＬを１０ｍＬガラスバイアルに移し、ＰＴＦＥシリコーンセプタムを含有するクリンプトップの蓋をした（ＭｉｃｒｏＬｉｔｅｒＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｕｐｐｌｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ジョージア州、米国）。

ＳＰＭＥオートサンプラを備えたＢｒｕｋｅｒＳｃｉｏｎ４３６ＧＣ装置を使用してＳＰＭＥ−ＧＣ−ＭＳ法を実施した。解析カラムは、ＺＢ−６２４（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、トーランス、カリフォルニア州、米国）キャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ、膜厚１．４０ｍｍ）とした。インジェクタポートを２８０℃に設定した。オーブン温度条件は次のとおり、５分間３５℃の初期温度で開始し、温度を７℃分−１の速度で２５０℃まで上昇させ、１２分間保持し、合計実行時間を４７．７１分とした。担体ガス（ヘリウム、純度＞９９．９９９％）の流量を一定流量モードで１．０ｍＬ分−１に維持した。ＧＣ−ＭＳをスプリット注入を行うようにプログラムし、試料を１：２０のスプリット比を使用して注入した。ＳＰＭＥインジェクタパラメータは次のとおり、アジテータ温度７５℃、試料プレインキュベーション時間１５分、繊維でのインキュベーション時間（抽出時間）３０分、脱離時間５分とした。ジビニルベンゼン／カルボキセン／ポリジメチルシロキサン（ＤＶＢ／ＣＡＲ／ＰＤＭＳ）からなるＳＰＭＥ繊維アセンブリ（Ｓｕｐｅｌｃｏ、ベルフォンテ、ペンシルバニア州、米国）を使用した。

質量分析計（ＳｃｉｏｎＴＱ）は電子衝撃（ＥＩ）イオン源を備えた。すべての実験を陽イオンモードで実施した。源温度を２００℃に設定し、エネルギーを７０ｅＶとした。マルチプライヤ電圧を９００Ｖに設定した。データを、４分の遅延を含む４スキャン／分の速度で３０〜３００ｍ／ｚのフルスキャンモードで取得した。空のガラスバイアルを対照として用意し、試料バイアルと同一の条件下で保存し、同じプロトコルに従って解析した。ＮＩＳＴ質量スペクトルデータベース（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｔａｎｄａｒｄｓａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ゲイザースバーグ、メリーランド州）との比較により、対象のピークの仮同定を行った。

ＧＣ−ＭＳデータ処理および統計解析

生のＧＣ／ＭＳデータを、ｍｚＸＭＬＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎＵｔｉｌｉｔｙ（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して．ｘｍｌフォーマットに変換し、その後、前述のパラメータを使用する自動ピーク検出およびピークアラインメントのためのＲ言語（バージョン２．１５．３、統計計算のためのＲ−Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ｗｗｗ．Ｒｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）で実装されたＸＣＭＳソフトウェアパッケージ（バージョン１．３６．１）を使用して処理した。Ｒから出力されて得られたタブ区切り表をＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、レドモンド、ワシントン州）にインポートし、イオン特性を合計ピーク面積に対して正規化し、ｍ／ｚ保持時間ペア、試料名、およびピーク面積として質量スペクトル特性を含有する表に配置し、その後、ＰＣＡおよび潜在的構造に対する直交射影による判別解析（ＯＰＬＳ−ＤＡ）を使用する統計解析のためにＳＩＭＣＡ−Ｐ＋１３．０３（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ、

、スウェーデン）にインポートした。変数をＰＣＡおよびＯＰＬＳ−ＤＡについて平均中心化およびパレート尺度化し、ＰＣＡスコア図を解析し、３人のドナーからの糞便接種源を使用する発酵からのデータセットの一般構造を決定した。ＯＰＬＳ−ＤＡを使用して２つのクラス（０時間および４８時間サンプリング時点）間の代謝物プロファイルにおける相違を区別し、モデルを７回交差検証し、検証の各回についてデータの１／７はランダムに省略し、モデルの信頼性を、交差検証残差の分散（ＣＶ−ＡＮＯＶＡ）の解析を使用して評価した。２つの時点の分離にとって重要な代謝物を、統計的に有意な閾値を上回ったＯＰＬＳ−ＤＡモデルからの射影における変数重要度（ＶＩＰ）値（ＶＩＰ値＞１）を使用して同定した。ＶＩＰカットオフを満たす代謝物を、マン−ホイットニー−ウィルコクソン検定を使用してＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ５、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ、カリフォルニア州、米国）において２つのグループ間の相違について個別に評価し、Ｐ値が＜０．０５であった場合、試料を有意に異なるとみなした。

各ドナーの糞便マイクロバイオータについての６つのデンプン基質の発酵間の代謝の相違を、４８時間発酵試料を互いに比較することにより決定した。ＰＣＡおよびＯＰＬＳ−ＤＡモデルを前述のとおり生成し、ＰＣＡスコア図を解析してデータセットの一般構造を決定した。試料をデンプン基質に基づき定義された６つのクラスに入れ、前述のとおりＯＰＬＳ−ＤＡモデル化を使用してペアとして互いに比較した。

ゲノム配列

この研究のデータは、３３の細菌株のドラフトゲノム配列（コンティグ形態）を含み、これは表４に開示されている。細菌ゲノムは、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑプラットフォームを使用して配列決定された。種は、全長１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の比較による最も近い一致に従って名付けられ、細菌の真の種分化を反映しない場合があり、簡潔に第Ｉ部において使用される細菌には株Ａまたは株Ｂとは別の同一性が与えられており、表１はこれらの株の真の同定を提供する。

研究デザイン

この研究は３つの段階を含む。第１の段階は、どの株ペアがＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ研究（Ｐｅｔｒｏｆｅｔａｌ．）（「元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅプロトタイプ」または「元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系」とも称される）に含まれていたか、種のゲノムを比較することに重点を置いた。全長１６Ｓ配列アラインメントによりぴったりと一致した６つの種株ペアのゲノムを、冗長性を探すために比較した。これらの細菌の複数の株が、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系に含めるために、培養細菌における形態および挙動の相違に基づき、まず選択された。プロジェクトのこの部分の目標は、複数の株の使用は冗長であったか、または生態的均衡の維持のために両方の株を含める生物学的必要性を確証する真の遺伝的な相違があるかを決定することであった。

プロジェクトの第２の段階は、ＫＥＧＧパスウェイの遺伝的カバレッジを決定するための広域なパイプラインを開発することに重点を置いた。ＫＥＧＧとは、京都遺伝子ゲノム百科事典を表し、パスウェイ解析に一般的に使用されているリソースであり、パスウェイ、遺伝子、ゲノム、化合物、および反応情報に関連するデータを含有する。レポートの第ＩＩ部は、キーストーン細菌種およびパスウェイ、ならびに生化学的に冗長であり得る種を探して、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系全体のＫＥＧＧパスウェイを比較することに焦点を合わせる。

プロジェクトの第３の段階は、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅに含まれる細菌遺伝子が、高レベルの遺伝的冗長性なく、必要な生化学パスウェイの十分なカバレッジを提供するかを決定することに重点を置いた。レポートの第ＩＩＩ部は、「健康な」ヒトマイクロバイオームのそれと比較した、ＫＥＧＧパスウェイのＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅコミュニティ全体のカバレッジを示す。これは、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅコミュニティがヒト腸内の真のマイクロバイオータをどれくらい忠実に模倣するかを決定する、ＫＥＧＧパスウェイの全体的なカバレッジの調査を可能にした。

第Ｉ部：株ペア内の冗長性
方法
Ｍａｕｖｅアラインメント
元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅプロトタイプ生態系は、２つの別の株を有する６つの細菌種、合計１２の細菌株を含んでいた。これらの６つの細菌種の両方の株についての全ゲノムデータを比較し、冗長性を試験した。ゲノムアラインメント可視化ツールＭａｕｖｅの漸進的Ｍａｕｖｅ機能を使用して、ゲノムのペアを整列および比較した。得られたアラインメント骨格ファイルをＲにロードし、パッケージｇｅｎｏＰｌｏｔＲ（疑似コードが提供されている）を使用して、Ｍａｕｖｅにより提供されるものよりダイナミックな画像を作成した（図２）。アラインメント後、各種の株を、比較結果のさらなる解析を簡略化するために、株Ａまたは株Ｂのいずれかに割り当てた（表１）。

図２は、第Ｉ部において解析された６つの種についての株ペアのアラインメントを示し、ＭａｕｖｅおよびＲパッケージｇｅｎｏＰｌｏｔＲを使用して作成された、Ｍａｕｖｅアラインメントの配列アラインメント図を示す。図２Ａは、株Ａ対株Ｂのビフィドバクテリウム・アドレッセンティス配列比較を示す。図２Ｂは、株Ａ対株Ｂのビフィドバクテリウム・ロンガム配列比較を示す。図２Ｃは、株Ａ対株Ｂのドレア・ロンギカテナ配列比較を示す。図２Ｄは、株Ａ対株Ｂのラクトバチルス・カゼイ配列比較を示す。図２Ｅは、株Ａ対株Ｂのルミノコッカス・トルクエス配列比較を示す。図２Ｆは、株Ａ対株Ｂのルミノコッカス・オベウム配列比較を示す。図２は、第Ｉ部において解析された６つの種についての株ペアのアラインメントを示し、ＭａｕｖｅおよびＲパッケージｇｅｎｏＰｌｏｔＲを使用して作成された、Ｍａｕｖｅアラインメントの配列アラインメント図を示す。図２Ａは、株Ａ対株Ｂのビフィドバクテリウム・アドレッセンティス配列比較を示す。図２Ｂは、株Ａ対株Ｂのビフィドバクテリウム・ロンガム配列比較を示す。図２Ｃは、株Ａ対株Ｂのドレア・ロンギカテナ配列比較を示す。図２Ｄは、株Ａ対株Ｂのラクトバチルス・カゼイ配列比較を示す。図２Ｅは、株Ａ対株Ｂのルミノコッカス・トルクエス配列比較を示す。図２Ｆは、株Ａ対株Ｂのルミノコッカス・オベウム配列比較を示す。

表１は、特に株ペア内の冗長性を決定する、第Ｉ部についての株指定を示す。６つの種のペアワイズ比較の各々について株Ａおよび株Ｂと称される株の同定について、２つの株は元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系に含まれていた。表中の名称はＲＡＳＴサーバー上で与えられる名称を示し、括弧内の数字はＲＡＳＴゲノムＩＤ番号を示す。

ＳＥＥＤビューアを使用する比較
この解析において使用されるドラフトゲノムは、以前アノテートされ、ＲＡＳＴサーバー上に保存されていた。ＲＡＳＴは、サブシステムベースのアノテーションを使用し、これは、タンパク質コード化、ｒＲＮＡ、およびｔＲＮＡ遺伝子を同定し、機能を遺伝子に割り当て、ゲノムにおいてどのサブシステムが示されるかを予測し、この情報を使用して代謝ネットワークを再構築する。サブシステムは、共に特定の生物学的プロセスまたは構造的複合体を実現する、機能的役割の集合体として定義される。サブシステムベースのアプローチは、ハイスループットアノテーション技術における精度向上への鍵は、一人のアノテーション熟練者に単一のゲノム中のすべての遺伝子をアノテートしようとさせるのではなく、複数の熟練者にゲノムの完全な集合体にわたる単一のサブシステムを各々アノテートさせることであるという原理に基づく。アノテートされたゲノムは、比較解析をサポートするＳＥＥＤ環境中に維持される。ゲノムペアアラインメントおよび可視化後、各株ペアの機能および配列比較は、ＲＡＳＴサーバーを通してアクセスされるＳＥＥＤビューアを使用して完了した。

機能比較を使用し、アノテートされたドラフト配列を使用してサブシステムベースの相違を確認した。提供される機能比較出力は、どのサブシステムが共有され、どれが一方の株のみに固有であったかを示す、確認されたサブシステムの表で構成される。６つの比較の各々の結果を、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌにおいてタブ区切り形式の表にエクスポートし、考察した。次に、ＳＥＥＤビューアを使用して、タンパク質配列同一性を調査し、平均遺伝的類似性を決定し、配列比較を完了した。画像出力は、グラフィックス・インターチェンジ・フォーマット（ｇｉｆ）でダウンロードし、この比較のテキスト形式の結果は、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌにおいてタブ区切り形式の表としてエクスポートし、考察した。タンパク質配列同一性を、仮想タンパク質データを含む場合および含まない場合の両方で調査した。異なる株が使用された場合に結果がわずかに異なったため、配列比較は、参照としての株Ａおよび参照としての株Ｂの両方を使用して完了した。可能な場合、株は、タンパク質配列類似性を同じ属または種内の他の細菌株において見られるものと比較するために、入手可能な最も近い分類学的近隣種とも比較した（図４）。データは、ゲノムサイズおよびコンティグ数が、配列比較の結果において交絡因子となり得ることを示した。これを、Ｒでの線形モデルを使用して調査した。表６中のデータを、コンマ区切り形式のファイルとして保存し、Ｒにロードした。２つの線形モデルを当てはめ、平均タンパク質配列同一性をゲノムサイズおよびコンティグ数と比較した（疑似コードが提供されている）。

図４は、入手可能な最も近い種の一致についてのＳＥＥＤビューア配列比較図を示す。図４Ａは、参照ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス株Ａ対株Ｂ（外輪）およびビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（１６８０．３）（内円）の比較を示す。図４Ｂは、ビフィドバクテリウム・ロンガム株Ａ対株Ｂ（外輪）およびビフィドバクテリウム・ロンガムＤｊＯ１０Ａ（内輪）の配列比較を示す。図４Ｃは、ドレア・ロンギカテナ株Ａ対株Ｂ（外輪）、ドレア・フォルミシゲネランス（Ｄｏｒｅａｆｏｒｍｉｃｉｇｅｎｅｒａｎｓ）ＡＴＣＣ２７７５５（中輪）、およびドレア・ロンギカテナＤＳＭ１３８１４（内輪）の配列比較を示す。図４Ｄは、ラクトバチルス・カゼイ株Ｂ対ラクトバチルス・カゼイ株Ａ（外輪）、ラクトバチルス・カゼイＡＴＣＣ３３４（中輪）、およびラクトバチルス・カゼイＢＬ２３（内輪）の配列比較を示す。ＳＥＥＤビューア上での比較目的に公然と利用可能なルミノコッカス属種はなかった。

表６は、株ペア内の冗長性を示す、第Ｉ部において解析された株についての要約統計を示す。表６は、塩基対数でのゲノムサイズ、使用されるドラフト配列中のコンティグ数、全長１６Ｓ配列アラインメントに基づく最も近い一致に対する類似性パーセント（ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ原著論文から推測）、ＳＥＥＤビューアを使用して確認されるサブシステム、コード配列、およびＲＮＡの合計数、ならびにＳＥＥＤビューアから得られるデータを使用してＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌにおいて計算される平均タンパク質配列同一性パーセントを含む（挙げられている株は、株ペアの比較のための参照株である）。

ＫＥＧＧパスウェイ解析
ＫＡＡＳ（ＫＥＧＧ自動アノテーションサーバー）を使用し、ＫＥＧＧＧＥＮＥＳデータベース中の手動でキュレートされたオーソロググループのセットに対するＢＬＡＳＴ比較により、ドラフトゲノム（コンティグ）中の遺伝子の機能アノテーションを提供した。第Ｉ部において調査された１２のゲノムについてのアミノ酸ＦＡＳＴＡファイルをＫＡＡＳにアップロードし、ドラフトゲノムデータについて推奨されている、原核生物遺伝子データセットおよび双方向ベストヒット割り当て法を使用してアノテートした。結果は、ＫＥＧＧオーソロジー（ＫＯ）割り当ておよび自動生成されたＫＥＧＧパスウェイを含有する。ＫＯ割り当て（ＫＯＩＤ）のリストをダウンロードし、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌにおいて比較した。株ペア間で共有されるＫＯＩＤのリストおよび一方の株のみに特異的なＫＯＩＤのリストを、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌスプレッドシート表を使用して作成した。次にこれらのリストを使用し、ＫＥＧＧオーソロジー割り当ての複製物の数と一致した太さ、およびＩＤが共有されているかどうかにより決定された色（緑は共有、赤は株Ａ、青は株Ｂ）で、ＫＯＩＤの最終リストを作成した。最終リスト（６つの種の各々に１つ）を次にプログラムｉＰａｔｈ２．０：インタラクティブ・パスウェイ・エクスプローラにインポートした。ｉＰａｔｈは、各種パスウェイマップの可視化、解析、およびカスタマイズのためのウェブベースのツールである。現行バージョンは、１４６ＫＥＧＧパスウェイを使用して構築され、生物系における完全な代謝の概要をもたらす代謝パスウェイのマップ、２２ＫＥＧＧ制御パスウェイを含む制御パスウェイマップ、および５８ＫＥＧＧパスウェイを含有する二次代謝物の生合成マップを含む、３つの異なる包括的な概要マップを提供する。

作成されたＫＯＩＤのリストを、マッピング前に、ｉＰａｔｈ２．０により使用される内部リストと一致させ、ｉＰａｔｈ２．０はマッピングプログラムにおいて利用可能なすべてのＫＯＩＤを含むわけではないため、これによっていくつかのＫＯＩＤが除去された。次に一致リストを使用し、６つの株比較の各々についてカスタムマップを作成した。異なる色または太さを有するＫＯＩＤが同じパスウェイに含まれた競合のリストを、各株比較についてのマッピングプロセスを通して自動的に作成した。ｉＰａｔｈ２．０プログラムは、ランダム選択により、これらの競合を自動的に解決する。この解決方法はこの研究デザインにとっては理想的ではなく、代わりに競合を手動で解決した。色の競合は、パスウェイが共有され、したがって固有のものではないことを意味したので、いずれの色競合も緑にするように解決した。いずれの太さの競合も、単一のＫＯＩＤが同じ太さの複数のＫＯＩＤと競合する場合、平均太さ（最も近い整数に切り上げ）または最も競合の少ない太さをとることにより解決した。固有のＫＯＩＤの最終マップおよびリストを次に分析し、どのパスウェイが一方の株に固有であったか、および冗長性が除去され得るかを決定した。

結果
異なるメイズ系統における難消化性デンプン決定
すべてのデンプン基質はかなりの量の総デンプンを含有したが、総デンプン含有量はインビトロでのヒト消化後にすべての試料について減少した。未消化試料の総デンプン含有量は、６１．３８±０．５４〜７４．２１±２．８８ｇ／乾燥固体１００ｇの範囲内であり、消化試料について、これは５２．８９±２．０８〜６６．２０±０．０８ｇ／乾燥固体１００ｇの範囲内であった（表３．１）。すべての試料は７０％未満の総デンプンを含有し、予測どおり、それらが純粋なデンプンではなかったことを示した（試料は、デンプンと同様にタンパク質、脂質、および細胞物質を含有する、微細に粉砕されたメイズ穀粒から調製された）。

Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆおよびＣｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅは、消化前に最も多くのＲＳ（それぞれ１０．２５±０．２０および９．９８±２．１２ｇ／乾燥固体１００ｇ）を含有した。インビトロ消化後に、これらの同じ遺伝子型は、再び最も多くのＲＳ（それぞれ５．６８±０．１３および４．７８±０．２５ｇ／乾燥固体１００ｇ）を含有した。対照的に、Ｃｇ１０２ｗｘは、インビトロ消化前および後に最も低いレベルのＲＳ（それぞれ０．１３±０．００３および０．０３±０．０００３ｇ／乾燥固体１００ｇ）を含有した（表３．１）。

インビトロ消化中にデンプン基質の無菌性を維持するステップを行ったが、すべての調製物でいくらかのレベルの汚染が生じた。図１１は、無菌嫌気性基本培地における０時間および４８時間後の６つのデンプン基質対照のＤＧＧＥプロファイルを示す。ＤＧＧＥ解析は、各デンプン基質について限られた数のバンドをもたらした。これらのバンドは、糞便接種源を含有する発酵では顕著に現れなかった。ペアとした０時間および４８時間試料は平均で９７．７％類似であり、存在する汚染が小規模発酵中に観察された変化に寄与しなかったことを示した（表３．２）。

図１１は、無菌嫌気性基本培地における０時間および４８時間後の６つの予備消化デンプン基質対照中に存在する微生物汚染を比較するＤＧＧＥプロファイルを示す。

表３．１Ｍｅｇａｚｙｍｅ難消化性デンプンアッセイキット（ＭｅｇａｚｙｍｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、アイルランド）を使用して定量化される、インビトロヒト消化前および後のデンプン基質の難消化性、可溶性、および総デンプン含有量。

表３．２：無菌嫌気性基本培地における０時間および４８時間後の６つの予備消化デンプン基質中に存在する微生物汚染を比較する相関係数（ＳＩ％）。

小規模バッチ発酵−合理的

各種基質が腸内マイクロバイオータに対して有する効果を研究するのに、小規模インビトロバッチ発酵が長年使用されている。この技術は、健康なドナーからの新鮮な糞便の複数回の回収を必要とし、研究を困難かつ時間のかかるものにしている。ヒト腸内の単段階遠位モデルとしてのケモスタットの使用は、再現可能かつ安定な糞便コミュニティを培養し、元の糞便接種源と同様の高レベルの多様性を維持する効果的な手段である。この研究では、我々はケモスタットモデルを使用し、健康なドナーからの糞便コミュニティを、それらをインビトロ小規模バッチ発酵のためのリザーバーとして繰り返し使用することができるように、培養および維持し、これにより糞便ドナーを複数回サンプリングする必要性を解消し、バッチ間のばらつきのなさを確保した。

単段階遠位腸内モデルにおける定常状態コミュニティの構築
３つの別々のケモスタットランを、インビトロ小規模バッチ発酵のための糞便接種源として使用した。１）「ドナー２」からの糞便が接種された単一容器、単一のドネーション（Ｖ２−１）、２）「ドナー５」からの糞便が接種された単一容器、単一のドネーション（Ｖ５−１）、３）ドナー９からの糞便が接種された単一容器、第１のドネーション（Ｖ９−１）。ランＶ５−１およびＶ９−１を、それぞれ４０および４１日目まで解析し、Ｖ２−１を３８日目まで解析した。

定常状態平衡が得られ、コミュニティがインビトロ小規模バッチ発酵における使用に適していたことを確認するために、これらの３つのケモスタットランを、増幅１６ＳｒＲＮＡ遺伝子プロファイルのＤＧＧＥおよびその後の移動窓解析を使用するプロファイルの解析を使用して、コミュニティ多様性における変化について評価した。同様のＤＧＧＥ解析手順を使用し、０〜１８日目の間で最も大きな変化率（Δｔ）が発生し、定常状態コミュニティの構築が起こるのに伴って３６日目までに安定したことを示した。この所見を考慮し、各ケモスタットランの最初の約２週間は解析から省略した。各容器についてΔｔ値が減少して個別のゲル特異的カットオフ閾値を下回り、定常状態が得られたことを示すのに必要な時間は変動した。しかしながら、すべての容器について、３２日目までには平衡が達成された（図１２ａ、ｂ、ｃ）。定常状態に到達後、すべての３つのランのΔｔ値は、独立したゲル特異的カットオフ閾値を下回った、またはその５％以内のままであり、３８（Ｖ２−１）、４０（Ｖ５−１）、および４１（Ｖ９−１）日目に解析期間が終わるまで各容器内で高度の類似性を示した（図１２ａ、ｂ、ｃ）。

図１２は、３人の健康なドナー（ドナー２、５、および９）からの糞便が播種されたケモスタットランのコミュニティダイナミクスを示す。試料を小規模バッチ発酵の完了まで２日毎に解析した。コミュニティダイナミクスを、移動窓相関解析を使用して計算した。ａ）ドナー２（１４〜３８日目）、ｂ）ドナー５（１８〜４０日目）、ｃ）ドナー９（１７〜４１日目）。

表３．３は、接種後０および４８時間でのドナー２（Ｖ２−１）、ドナー５（Ｖ５−１）、ドナー９（Ｖ９−１）からのケモスタット物質が接種された予備消化デンプン基質の小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較する平均相関係数（ＳＩ％）を示す。

図１３接種後０および４８時間でサンプリングされた、ａ）ドナー９（Ｖ９−１）、ｂ）ドナー５（Ｖ５−１）、ｃ）ドナー２（Ｖ２−１）からのケモスタット物質が接種されたＣｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆの小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図。黄色で網掛けされた試料は、０時間試料のクラスタを表し、青色で網掛けされた試料は、発酵の４８時間後にＣｇ１０２ａｅ−ｒｅｆを含有する試料を表す。

ドナー５糞便マイクロバイオータでの小規模バッチ発酵

ドナー５からのケモスタット糞便接種源を使用する０時間および４８時間でのすべての発酵についてのＤＧＧＥプロファイルを解析し、レプリケート発酵間の反復性を確認した。Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆおよびドナー５からの糞便接種源を含有するデンプン基質発酵は、接種後０および４８時間でゲル特異的カットオフ閾値の５％以内またはこれを上回る相関係数を有した。平均で、０時間試料は８３．５±９．１％類似であり、４８時間試料は８６．２±７．５％類似であった（表３．３）。０時間および４８時間での接種源対照レプリケートは、それぞれ８５．４％および９２．２％類似であり、共にゲル特異的カットオフ閾値を上回った（表３．３）。接種（０時間）後、デンプン基質および接種源対照発酵プロファイルは、平均でゲル特異的カットオフ閾値を上回る高度の類似性（８７．３±１１．２％）を共有した。４８時間後、平均プロファイル類似性はゲル特異的カットオフ閾値を下回った（６３．６±５．９％類似）（表３．３）。これは、すべての発酵に、デンプン基質に応じて再現可能に調節された、同一の糞便コミュニティが接種されたことを示した。

０時間および４８時間での他の５つのデンプン基質での発酵についての平均相関係数は、それぞれ８５．８±９．０％〜９２．４±３．２％類似および８３．３±８．８％〜９４．０±２．１％類似の範囲内であり、これらの値はすべてゲル特異的カットオフ閾値の５％以内またはこれを上回るものであった（表３．３）。これは、小規模バッチ発酵がレプリケート間で一貫して再現可能であったことを示した。Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆで観察された結果と同等に、５つの残ったデンプン基質を含有する試料は、発酵の開始時（０時間）に接種源対照との高い類似性を共有し、完了時（４８時間）には、対照と比較してコミュニティプロファイル間にかなりの相違があった。０時間および４８時間でのデンプン基質発酵と各対照との間の平均相関係数は、それぞれ８８．９±２．５％〜９４．２±４．７％類似および５０．１±２．６％〜６５．０±３．６％類似の範囲内であり、０時間試料はゲル特異的カットオフ閾値の５％以内またはこれを上回るものであり、４８時間試料は一貫してゲル特異的カットオフ閾値を下回り、接種源対照およびデンプン基質発酵プロファイルが発酵の４８時間後には類似でなくなったことを示した（表３．３）。

ＤＧＧＥクラスタツリー解析を使用して、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆの発酵からのすべての試料（デンプン基質発酵および接種源対照）が０時間で共にグループ化したことが観察された。発酵の４８時間後に採取された試料は、０時間のものとは別々にグループ化し、デンプン基質発酵は共に、接種源対照から離れてクラスタ化し（図１３ｂ）、試料プロファイルが発酵の開始時に高度に類似し、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆの発酵に応じて変化したことを示した。残った５つのデンプン基質での発酵の樹形図において同様の傾向が見られ、発酵試料は発酵の４８時間後に一貫して共に、すべての他の試料から離れてクラスタ化した（図２９）。

Ｃｇｘ３３３を含有する発酵の解析は、１つの４８時間試料が外れ値（２ｉ−４８ｈ）とみなされたことを明らかにし、関連ＤＧＧＥプロファイルの目視検査は、試料中に存在するほんの少数のみのバンドを明らかにし、結果として、クラスタツリー解析はこの試料をすべての他の試料から離れて配置した（図２９）。Ｃｇｘ３３３ドナー５２ｉ−４８ｈについての相関係数は、すべての他の試料と比較した場合、１２．１％〜２５．５％の低いＳＩ％値をもたらした。この例外的な結果は、この試料が、おそらく試料回収中のエラーまたはＤＮＡ抽出中の技術的エラーによって、すべての他のものとは非常に異なっていたことを示した。このようなものとして、これは発酵の再現性を決定するすべての計算から除外した（表３．３）。

すべての小規模バッチ発酵についてのＮＭＤＳ図を、ＤＧＧＥプロファイル類似性マトリックスを使用して作成し、０時間および４８時間時点からの試料は、例えばＣｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆ（図１４ｂ）および他の５つのデンプン基質（図３０）で見られるように、容易に互いに区別された。試料のＤＧＧＥプロファイルにおけるばらつきは、試料レプリケート間よりも時点間で大きかった。さらに、ドナー９からの糞便マイクロバイオータを使用する発酵で観察された結果と同様に、デンプン基質発酵と接種源対照との間でＤＧＧＥプロファイルにおける大きなばらつきが観察された。

図３０は、接種後０および４８時間でサンプリングされたドナー９からの糞便マイクロバイオータが播種されたケモスタット物質が接種された小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図ａ）Ｃｇ１０２クラスカルのストレス（１）＝０．０５６、ｂ）Ｃｇ１０２ｗｘクラスカルのストレス（１）＝０．０６０、ｃ）Ｃｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅクラスカルのストレス（１）＝０．０７８、ｄ）Ｃｇｘ３３３クラスカルのストレス（１）＝０．０８９、ｅ）Ｃｇｘ３３３Ｓｕ２クラスカルのストレス（１）＝０．０８４を示す。

図１４ａ）ドナー９（Ｖ９−１）クラスカルのストレス（１）＝０．０７３、ｂ）ドナー５（Ｖ５−１）クラスカルのストレス（１）＝０．１２１、ｃ）ドナー２（Ｖ２−１）クラスカルのストレス（１）＝０．０８３からのケモスタット物質での接種後０および４８時間でサンプリングされたＣｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆの小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図。

小規模バッチ発酵のケモスタット接種源の再現性

発酵に使用される３つのケモスタットの各々のサンプリング期間は、２６〜３６日目（Ｖ２−１）、２７〜３６日目（Ｖ５−１）、および３１〜３７日目（Ｖ９−１）とした（図１２）。インビトロ小規模バッチ発酵の接種源としてのケモスタット培養の再現性を評価するために、各デンプン基質および糞便ドナーのすべてのレプリケートの０時間および４８時間時点を、ＤＧＧＥおよびその後の解析により比較した。

ドナー９糞便マイクロバイオータでの小規模バッチ発酵

ドナー９からの糞便マイクロバイオータでインキュベートされたＣｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆのすべてのバイオロジカルおよびテクニカルレプリケートについてのプロファイルは、平均で、接種直後に９１．３±４．１％類似、および４８時間後に９０．６±５．５％類似であった。これらの値の両方はゲル特異的カットオフ閾値を上回り、レプリケート試料が同一であったことを示した（表３．３）。接種源対照のバイオロジカルレプリケート間では、０時間９４．７％および４８時間８８．２％類似という、同程度の類似性が観察された（表３．３）。Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆ発酵および接種源対照プロファイルの比較は、接種直後（０時間）に、ゲル特異的カットオフ閾値を上回り、平均で９５．５±２．４％類似であった（表３．３）。４８時間後、ドナー９についての接種源対照は、平均で、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆを含有する発酵で５３．６±１８．７％類似であり、これはゲル特異的カットオフ閾値をはるかに下回り、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆでの発酵がコミュニティダイナミクスに対して異なる効果を有したことを示した（表３．３）。ＤＧＧＥクラスタツリー解析は、０時間ですべての試料（デンプン基質発酵および接種源対照）一緒のグループ化を示し、試料が発酵前に高度に類似していたことを示した。４８時間試料は別々にグループ化し、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆを含有する試料は接種源対照から離れてクラスタ化し、コミュニティダイナミクスに対する固有の変化がＣｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆに応じて起こったことをさらに支持した（図１３ａ）。

ＤＧＧＥクラスタツリー解析および相関係数は、ドナー９からの糞便マイクロバイオータが接種されたケモスタット物質を使用する残った５つのデンプン基質での発酵について同様の傾向を明らかにした。治療レプリケートを比較する平均相関係数は、ゲル特異的カットオフ閾値の５％以内またはこれを上回るものであり、０時間で８７．５±７．９％〜９５．４±２．２％類似および４８時間で８０．６±１５．７％〜９４．６±３．１％類似の範囲内であり、レプリケートのコミュニティダイナミクスがすべてのデンプン基質発酵の開始時および完了時で個別に非常に類似していたことを示した（表３．３）。Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆと同様に、すべての他のデンプン基質発酵は、発酵の開始時（０時間）にそれらの各接種源対照との高い類似性を示し、平均相関係数値は９１．８±４．０％〜９７．０±２．７％類似の範囲内であった（表３．３）。残った５つのデンプンについて、デンプン基質発酵と接種源対照との間のコミュニティダイナミクスに対する変化が観察され、平均相関係数値は、すべてゲル特異的カットオフ閾値を下回り、４８時間後に５３．４±３．９％〜７０．３±４．１％類似の範囲内であった（表３．３）。ＤＧＧＥクラスタツリー解析は、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆで見られたものと同等の傾向を示し、０時間試料は共にグループ化し、４８時間デンプン基質発酵および対照試料は互いおよび０時間時点とは別々にクラスタ化した（図２７）。

図２７は、接種後０および４８時間でサンプリングされたドナー９（Ｖ９−１）からのケモスタット物質が接種されたデンプン基質のレプリケート小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。ａ）Ｃｇ１０２を含有する発酵、ｂ）Ｃｇ１０２ｗｘを含有する発酵、ｃ）Ｃｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅを含有する発酵、ｄ）Ｃｇｘ３３３を含有する発酵、ｅ）Ｃｇｘ３３３Ｓｕ２を含有する発酵。黄色で網掛けされた試料は、０時間試料のクラスタを表し、青色で網掛けされた試料は、発酵の４８時間後にデンプン基質を含有する試料を表す。

類似性マトリックスを使用し、すべて小規模バッチ発酵について非計量多次元尺度構成法（ＮＭＤＳ）図を作成した。０時間および４８時間でのＣｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆの発酵からのＤＧＧＥプロファイルは、容易に互いに区別された（図１４ａ）。ＤＧＧＥプロファイルにおけるばらつきは、試料レプリケート間よりも時点間で大きかった。さらに、デンプン基質発酵と対照との間でＤＧＧＥプロファイルにおける大きなばらつきが観察された。残った５つのデンプン基質のＤＧＧＥプロファイルを比較するＮＭＤＳ図について、同様の傾向が観察された（図２８）。

図２８は、接種後０および４８時間でサンプリングされたドナー９からの糞便マイクロバイオータが播種されたケモスタット物質が接種された小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図ａ）Ｃｇ１０２クラスカルのストレス（１）＝０．０４１、ｂ）Ｃｇ１０２ｗｘクラスカルのストレス（１）＝０．０６５、ｃ）Ｃｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅクラスカルのストレス（１）＝０．０４１、ｄ）Ｃｇｘ３３３クラスカルのストレス（１）＝０．０８４、ｅ）Ｃｇｘ３３３Ｓｕ２クラスカルのストレス（１）＝０．０６４を示す。

ドナー５糞便マイクロバイオータでの小規模バッチ発酵

図２９Ａ〜Ｅは、接種後０および４８時間でサンプリングされたドナー５（Ｖ５−１）からのケモスタット物質が接種されたデンプン基質のレプリケート小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図を示す。ａ）Ｃｇ１０２を含有する発酵、ｂ）Ｃｇ１０２ｗｘを含有する発酵、ｃ）Ｃｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅを含有する発酵、ｄ）Ｃｇｘ３３３を含有する発酵、ｅ）Ｃｇｘ３３３Ｓｕ２を含有する発酵。黄色で網掛けされた試料は、０時間試料のクラスタを表し、青色で網掛けされた試料は、発酵の４８時間後にデンプン基質を含有する試料を表す。

ドナー２糞便マイクロバイオータでの小規模バッチ発酵

ドナー２からの糞便マイクロバイオータが接種されたケモスタット物質を使用する０時間および４８時間での発酵プロファイルの解析は、発酵が、バイオロジカルレプリケート間で、ドナー５および９からの糞便マイクロバイオータが接種された同等試料よりもかなり低い類似性を有したことを示した。０時間でＣｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆを含有する発酵のＤＧＧＥプロファイルは、テクニカルレプリケートのみを比較した場合、ゲル特異的カットオフ閾値を上回る平均相関係数（９５．９％類似）を有した。Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆでのすべての発酵レプリケート間の平均プロファイル類似性は、４８．９±３６．５％類似であり、バイオロジカルレプリケートが発酵の開始時にかなり異なっていたことを示した（表３．３）。０時間でのバイオロジカルレプリケートの接種源対照プロファイルを比較して同じ結果が観察され、相関係数は、ゲル特異的カットオフ閾値を下回る、２５．１％のみの類似性を示した（表３．３）。これらの低い類似性指数は、接種源が発酵の経過中に変化したことを示した。よって糞便接種源における相違は、発酵中のデンプン基質の効果を見劣りさせ得る。

Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆでの発酵の４８時間後、テクニカルレプリケートは平均で９７．６±２．５％類似であり、これはゲル特異的カットオフ閾値を上回っていた。バイオロジカルレプリケート間の類似性は、発酵の４８時間後に、ゲル特異的カットオフ閾値の５％以内の８４．６±０．５％まで増加したが、４８時間での接種源対照プロファイルの比較は、２６．５％類似で、ゲル特異的カットオフ閾値を下回ったままであった。すべてのレプリケート発酵間の平均相関係数は、４８時間にわたって、ゲル特異的カットオフ閾値の５％以内の８８．９±６．８％まで増加した（表３．３）。これは、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆの発酵が微生物組成に対する同様の変化を引き起こし、４８時間の発酵にわたって試料類似性を増加させたことを示す。ドナー５および９からの糞便接種源での発酵とは異なり、接種直後（０時間）に、デンプン基質および接種源対照発酵プロファイル間で低度の類似性が観察された。平均でプロファイルは６１．１±３８．１％類似であり、これはゲル特異的カットオフ閾値を下回っていた。４８時間後、平均類似性は６３．４±３６．０％で、カットオフを下回ったままであった（表３．３）。

これらの結果は、ＤＧＧＥクラスタツリー解析によりさらに支持され、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆでの発酵は、以前に観察されたものとは異なってクラスタ化した（図１３ｃ）。例えば、２つのバイオロジカルレプリケートの各々からの３つの０時間試料（２つのデンプン基質発酵、１つの接種源対照）は共に、他のバイオロジカルレプリケートとは別々にクラスタ化した。ドナー５および９糞便マイクロバイオータを使用する発酵で観察されたクラスタ化とは異なり、４８時間デンプン基質発酵試料は共に、テクニカルレプリケートにより、２セットのペアにグループ化した。これは、接種源における相違が、コミュニティプロファイルを比較する場合、デンプン基質発酵の効果より明らかであることを示す。

残った５つのデンプン基質での発酵の解析について、同様の結果が観察された。すべての発酵は、０時間試料プロファイルを比較する場合、低い類似性を有し、平均相関係数は６６．１±２１．１％〜８１．４±１０．２％類似の範囲内であり、これらはすべてゲル特異的カットオフ閾値を下回っていた（表３．３）。相関係数は、発酵の４８時間後、Ｃｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅを除くすべてのデンプン基質発酵について増加した。その値は、７４．７±１６．５％まで減少したＣｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅを除き、７８．６±１１．６％〜９０．０±４．７％の範囲内であった（表３．３）。これは、ほとんどのプロファイルでデンプン基質に応じて類似性が増加し、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆの発酵についての観察を反映したことを示した。各デンプン基質についてのバイオロジカルレプリケート間の接種源対照の比較は、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆで観察されたものと同様の結果を示した。０時間および４８時間相関係数は、ゲル特異的カットオフ閾値を下回るもの、またはその５％以内であり、それぞれ３７．３％〜８１．２％類似および４８．０％〜８３．２％類似の範囲内であった（表３．３）。これは重ねて、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆで見られたものと同様の、バイオロジカルレプリケート間の接種源における変化を示した。ドナー２糞便マイクロバイオータが接種された発酵の樹形図内で観察されたクラスタ化は、他のドナーの糞便マイクロバイオータを使用する発酵よりも一貫性がなかった。すべての場合において、０時間試料は、元のバイオロジカルレプリケートを表す２つのクラスタを形成した。一方、４８時間試料は、バイオロジカルレプリケートに応じて２つのグループに分離され、第１のバイオロジカルレプリケートからの０時間試料のより近くにクラスタ化した（図３１Ａ〜Ｅ）。

一般に、これらの結果は、ケモスタットラン（Ｖ２−１）のコミュニティダイナミクスが容器のサンプリング期間中に変化し、発酵のバイオロジカルレプリケートに接種するのに使用される異なるコミュニティをもたらしたことを示す。移動窓相関解析は、Ｖ２−１についてのΔｔが２８〜３２日目の間に増加してゲル特異的カットオフ閾値を上回り（図１２ｃ）、容器のコミュニティダイナミクスにおける急速な変化率を示すサンプリング期間の最中であったことを示した。ケモスタットのコミュニティ構造におけるこの急速かつ顕著な変化は、レプリケート間で観察される組成の相違に対応する。

ドナー２からの糞便接種源での発酵のＤＧＧＥプロファイル類似性マトリックスを使用して作成されたＮＭＤＳ図は、ドナー９および５からの糞便接種源を使用して観察されたものとは非常に異なっていた。例えばＣｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆでの発酵の０時間および４８時間時点からの試料は、バイオロジカルレプリケートと同様に、容易に互いに区別可能であった（図１４ｃ）。このＤＧＧＥプロファイルにおけるばらつきの増加は、他の５つのデンプン基質についても見られた（図３２）。これらの結果は一貫して、コミュニティに対するデンプン基質の効果とは対照的に、２つのバイオロジカルレプリケートに使用される接種源間のコミュニティプロファイルにおけるより大きなばらつきを示した。

図３２は、接種後０および４８時間でサンプリングされたドナー９からの糞便マイクロバイオータが播種されたケモスタット物質が接種された小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスのＮＭＤＳ図ａ）Ｃｇ１０２クラスカルのストレス（１）＝０．０８６、ｂ）Ｃｇ１０２ｗｘクラスカルのストレス（１）＝０．１１０、ｃ）Ｃｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅクラスカルのストレス（１）＝０．０７２、ｄ）Ｃｇｘ３３３クラスカルのストレス（１）＝０．０６８、ｅ）Ｃｇｘ３３３Ｓｕ２クラスカルのストレス（１）＝０．１１４を示す。

デンプン基質に応じた糞便マイクロバイオータの調節

６つのメイズ基質が糞便コミュニティのダイナミクスの調節に対して有する効果を、３つの異なるケモスタットラン、１）ドナー２糞便が接種された単一容器、（Ｖ２−１）、２）ドナー５糞便が接種された単一容器、（Ｖ５−１）、および３）ドナー９糞便が接種された単一容器、（Ｖ９−１）の使用で評価した。容器のサンプリングは、２６〜３６日目（Ｖ２−１）、２７〜３６日目（Ｖ５−１）、および３１〜３７日目（Ｖ９−１）から行った。各デンプン基質での発酵のコミュニティダイナミクスは、バイオロジカルおよびテクニカルレプリケート間で高度に再現可能であることが示された。よって、すべてのデンプン基質での発酵のコミュニティプロファイルを別々に、各ドナーについてのＤＧＧＥにより、０時間および４８時間で互いに比較した。

ドナー９からの糞便マイクロバイオータの調節

接種源対照と比較したすべてのデンプン基質発酵のプロファイルは、発酵の開始時（０時間）に、７４．８％の相関係数を有したＣｇ１０２を例外として、ゲル特異的カットオフ閾値の５％以内であった（表３．４）。平均で６つのデンプン基質発酵は互いに８６．９±６．２％類似であり、すべての発酵からの微生物コミュニティが開始時に非常に類似していたことを示した。ドナー対照および６つのデンプン基質発酵間の平均相関係数は、４８時間後にゲル特異的カットオフ閾値をはるかに下回り、４９．１％〜６６．０％類似の範囲内であり、すべてのデンプン基質に応じてコミュニティダイナミクスに対するかなりの変化が起こったことを示した（表３．４）。デンプン基質発酵の各々についてのＤＧＧＥプロファイル比較は、４８時間後にゲル特異的カットオフ閾値を上回る相関係数（８９．１％〜９５．４％の範囲内の類似性）をもたらし、レプリケート間で同一のコミュニティ変化が起こったことを示した（表３．５）。これらの観察は、第３．４．１部において以前報告された結果を支持し、ケモスタット物質が接種された発酵の再現性を確認した。

^ａは、同一のコミュニティプロファイルを有する試料を表すゲル特異的カットオフ閾値を上回る相関係数を示し、

ｂは、類似のコミュニティプロファイルを有する試料を表すゲル特異的カットオフ閾値の５％以内の相関係数を示す。

表３．４接種後０および４８時間で接種源対照に対してドナー９糞便マイクロバイオータ（Ｖ９−１）が播種されたケモスタット物質が接種された予備消化デンプン基質の小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較する平均相関係数（ＳＩ％）

同一のコミュニティプロファイルを有する試料を表すゲル特異的カットオフ閾値を上回る相関係数を示し、

表３．５接種後４８時間でドナー９糞便マイクロバイオータ（Ｖ９−１）が播種されたケモスタット物質が接種された予備消化デンプン基質の小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較する平均相関係数（ＳＩ％）。

ＤＧＧＥクラスタツリー解析は、すべての発酵および接種源対照が接種直後（０時間）に共にクラスタ化したことを示した。発酵の４８時間後、接種源対照はすべての他の試料とは別々にクラスタ化し、デンプン基質発酵はデンプン基質に応じてペアでクラスタ化した（図１５）。Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆおよびＣｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅは、４８時間後、共により近くに、残った４つのデンプン基質から離れてクラスタ化した（図１５）。Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆおよびＣｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅ試料間の平均相関係数は、ゲル特異的カットオフ閾値を上回る９４．４％であり、よって２つの異なるデンプン基質は、コミュニティダイナミクスに対して同様の効果を有した（表３．５）。Ｃｇ１０２、Ｃｇ１０２ｗｘ、Ｃｇｘ３３３、およびＣｇｘ３３３Ｓｕ２は、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆおよびＣｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅの両方と比較した場合、すべてゲル特異的カットオフ閾値を下回った相関係数を有し、コミュニティの非類似性を示した（表３．５）。Ｃｇ１０２およびＣｇ１０２ｗｘは、Ｃｇｘ３３３と同様に、共にクラスタ化し、Ｃｇｘ３３３Ｓｕ２は、ゲル特異的カットオフ閾値を上回る相関係数、それぞれ８８．１７％および９２．４７％を有した（図１５）。これらの４つのデンプンは共に、ゲル特異的カットオフ閾値の５％以内またはこれを上回る、８２．７％〜９２．５％類似の範囲内の相関係数でより大きなクラスタを形成し、４つのデンプン基質の発酵が同様のプロファイルを有するコミュニティをもたらしたことを示した。

図１５接種後０および４８時間でサンプリングされたドナー９糞便（Ｖ９−１）が播種されたケモスタット物質が接種された６つのデンプン基質の小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図。黄色で網掛けされた試料は、０時間試料を表し、青色で網掛けされた試料は、発酵の４８時間後にデンプン基質を含有する試料を表す。

ＮＭＤＳ図では、６つのデンプン基質の発酵からのＤＧＧＥプロファイルが、４８時間後、容易に互いに区別可能であったことが観察された（図１６）。試料は、樹形図において観察されたものと同様に、ＮＭＤＳ図上でクラスタ化した。プロファイルにおけるばらつきは、発酵レプリケート間よりもデンプン基質間で大きかったが、最も大きなばらつきは、サンプリング時点間で観察された。樹形図において観察されたものと同様に、４つのクラスタがＮＭＤＳ図において観察され、１つはすべての０時間試料を含有し、残った３つのクラスタは４８時間デンプン基質発酵試料を含有した。クラスタは、１）Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆおよびＣｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅ、２）Ｃｇ１０２およびＣｇ１０２ｗｘ、ならびに３）Ｃｇｘ３３３およびＣｇｘ３３３Ｓｕ２を含有した。

図１６ドナー９糞便（Ｖ９−１）クラスカルのストレス（１）＝０．１０５が播種されたケモスタット物質の接種後０および４８時間でサンプリングされたデンプン基質の小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスからのＮＭＤＳ図。

ドナー５からの糞便マイクロバイオータの調節

デンプン基質発酵プロファイルおよび接種源対照プロファイルを、０時間および４８時間で比較し、各種デンプン基質に応じて固有の変化が起こったかを決定した。すべての発酵からの接種直後（０時間）に採取された試料からのＤＧＧＥプロファイルを比較し、６つの試験デンプンのプロファイルは、０時間で互いに平均で９５．４±２．２％類似であり、これはゲル特異的カットオフ閾値を上回っていた。これは、すべてのデンプン基質発酵に同一の微生物コミュニティが接種されていたことを示した。

発酵の４８時間後、接種源対照と比較した場合、６つのデンプン基質発酵のプロファイルは、ゲル特異的カットオフ閾値をはるかに下回る、３６．５％〜６１．８％類似の範囲内の平均相関係数を有した（表３．６）。したがって、すべてのデンプン基質発酵は、対照と比較して、微生物コミュニティにおける顕著な変化を引き起こした。各デンプン基質についての２つのバイオロジカルレプリケートを発酵の４８時間後に比較し、相関係数は、８６．２％〜９６．７％の範囲内のＣｇｘ３３３を除くすべてのデンプン基質について、ゲル特異的カットオフ閾値を上回っていた（表３．７）。Ｃｇｘ３３３のバイオロジカルレプリケート間の相関係数は、ゲル特異的カットオフ閾値を下回る、１８．６％類似であった。これは、ＤＧＧＥゲル上でほとんどバンドを示さなかった、Ｃｇｘ３３３２ｉ−４８ｈに起因していた（図１７）。このようなものとして、この試料は、第３．４．２部において前述のとおり、技術的エラーにより引き起こされた可能性がある外れ値として処理し、他の発酵間の比較から除外した。

接種後０および４８時間で接種源対照に対してドナー５ケモスタット物質（Ｖ５−１）が接種された予備消化デンプン基質の小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較する平均相関係数（ＳＩ％）

表３．７は、接種後４８時間でドナー５ケモスタット物質（Ｖ５−１）が接種された予備消化デンプン基質の小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較する平均相関係数（ＳＩ％）を示す。

ＤＧＧＥクラスタツリー解析は、すべてのデンプン基質発酵が共に、サンプリング時間（０時間または４８時間）に基づき２つのグループにクラスタ化したことを示した。接種源対照試料（０時間および４８時間）は共に、かつデンプン基質の４８時間クラスタよりも０時間クラスタの近くにクラスタ化した。４８時間試料を含有するクラスタは２つのサブグループに分けられ、一方はＣｇ１０２、Ｃｇ１０２ｗｘ、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆ、およびＣｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅからなり、他方はＣｇｘ３３３およびＣｇｘ３３３Ｓｕ２を含有した（図１７）。

図１７接種後０および４８時間でサンプリングされたドナー５糞便（Ｖ５−１）が播種されたケモスタット物質が接種された６つのデンプン基質の小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図。黄色で網掛けされた試料は、０時間試料を表し、青色で網掛けされた試料は、発酵の４８時間後にデンプン基質を含有する試料を表す。

４８時間後のデンプン基質発酵間のプロファイル類似性を比較する平均相関係数を表３．７に示す。Ｃｇ１０２、Ｃｇ１０２ｗｘ、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆ、およびＣｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅを含有するクラスタからのプロファイルの比較は、８５．６％〜９６．１％類似の範囲内の平均相関係数を有し、Ｃｇｘ３３３とＣｇｘ３３３Ｓｕ２との間の平均相関係数は９２．０％類似であり、これらはすべてゲル特異的カットオフ閾値を上回っていた（表３．７）。対照的に、Ｃｇｘ３３３／Ｃｇｘ３３３Ｓｕ２および４つの他のデンプン基質での発酵間のプロファイル比較は、７１．８％〜８９．２％類似の範囲内の相関係数をもたらした（表３．７）。表３．７からの相関係数は、Ｃｇｘ３３３およびＣｇｘ３３３Ｓｕ２のプロファイルが、ゲル特異的カットオフ閾値を下回る相関係数を有するＣｇ１０２およびＣｇ１０２ｗｘよりも、ゲル特異的カットオフ閾値を上回る相関係数を有するＣｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆおよびＣｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅと類似していたことを示す。

ＮＭＤＳ図では、６つのデンプン基質の発酵からのＤＧＧＥプロファイルが、４８時間後、容易に互いに区別可能であったことが観察された（図１８）。試料は、樹形図において観察されたものと同様に、ＮＭＤＳ図上でクラスタ化した。プロファイルにおけるばらつきは、発酵レプリケート間よりもデンプン基質間で大きかったが、最も大きなばらつきは、サンプリング時点間で観察された。

図１８ドナー５糞便（Ｖ５−１）クラスカルのストレス（１）＝０．０３８が播種されたケモスタット物質の接種後０および４８時間でサンプリングされたデンプン基質の小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスからのＮＭＤＳ図。

ドナー２からの糞便マイクロバイオータの調節

０時間でのデンプン基質発酵と接種源対照との間のＤＧＧＥプロファイル比較は、ゲル特異的カットオフ閾値を下回る、２６．９％〜６１．０％類似の範囲内の相関係数をもたらし、試料が発酵の開始時に接種源対照との類似性をほとんど共有しなかったことを示した。４８時間後、デンプン基質発酵と接種源対照との間の類似性はさらに減少し、相関係数は２１．０％〜３２．８％類似の範囲内であった（表３．８）。デンプン基質発酵プロファイルを互いに比較する相関係数は、平均でデンプン基質発酵が接種直後（０時間）に互いに、ゲル特異的カットオフ閾値を下回る、６２．９±２０．０％類似であったことを示した。各デンプン基質についてのバイオロジカルレプリケートのＤＧＧＥプロファイルを４８時間後に比較した場合、相関係数は、６２．４％〜７８．９％類似の範囲内であり、ほとんどのデンプン基質についてゲル特異的カットオフ閾値を下回っていた。例外はＣｇｘ３３３Ｓｕ２であり、これは９８．７％の相関係数を有した（表３．９）。したがって、前述の結果（第３．４．３部）と同様に、すべてのデンプン基質発酵は発酵の開始時に、各デンプン基質のバイオロジカルレプリケートは発酵の完了時に非類似であった。

ＤＧＧＥクラスタツリー解析は、ドナー５および９からの糞便接種源を使用する以前の発酵で見られたものとは異なり、ドナー２の０時間および４８時間試料を分離する明確なクラスタを示さなかった。代わりに、すべての試料が、試料時点、デンプンタイプ、または元のバイオロジカルレプリケート間の関連なく、ランダムにクラスタ化したように見えた（図１９）。異なるデンプン基質発酵を互いに比較する相関係数値を解析して、同様の傾向が観察された。２つのデンプン基質間の比較は、４８時間後にゲル特異的カットオフ閾値を上回る相関係数を有さず、２つのデンプン基質発酵は互い類似していなかったことを示した（表３．９）。

ピアソン相関係数値を使用して生成されたＮＭＤＳ図から、樹形図で見られたものと同様の結果を得た。ＮＭＤＳ図は、低いストレス（クラスカルのストレス（１）＝０．１１３）を有するデータの信頼性のあるモデルであったが、データが図全体にランダムに散乱しているように見えたので、結論を導くことはできなかった（図２０）。

図２０ドナー２糞便（Ｖ２−１）クラスカルのストレス（１）＝０．１３３が播種されたケモスタット物質の接種後０および４８時間でサンプリングされたデンプン基質の小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関から生成された類似性マトリックスからのＮＭＤＳ図。

表３．８接種後０および４８時間で接種源対照に対してドナー２ケモスタット物質（Ｖ２−１）が接種された予備消化デンプン基質の小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較する平均相関係数（ＳＩ％）

ＰｈＡＳＴＢｌｕｅ−生／死細胞ＤＮＡ標識

小規模バッチ発酵中に存在する微生物コミュニティの解析は、死細胞に由来するＤＮＡの存在によって歪んでいる場合がある。このようなものとして、我々は、ＰｈＡＳＴＢＬＵＥシステムでの処理後のドナー９糞便接種源での発酵のコミュニティプロファイルを解析することにした。ＰｈＡＳＴＢＬＵＥは、エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）を組み込んだＤＮＡを増幅することができないことを利用する市販のキットである。微生物コミュニティ源からの試料は死または瀕死細胞を含有し得、そのＤＮＡは結果を歪ませ得る。ｇＤＮＡ抽出およびその後の増幅前の、試料のＥＭＡでの処理、およびその後の強い青色光での固定は、微生物コミュニティプロファイリング実験からの歪みを低減する。残念なことに、ｐＨＡＳＴＢＬＵＥシステムは、プロジェクトの終盤にさしかかって初めて利用可能となり、よってドナー９糞便接種源での発酵の第２のバイオロジカルレプリケートのみをこの技術で解析した。システムの制約は、ＥＭＡ処理／光固定ステップを、凍結または他の保存方法により損傷されてない、入手したばかりの試料で実施しなければならないことである。

０時間および４８時間の試料からのＤＧＧＥプロファイルを、６つのデンプン基質発酵の各々について、ＥＭＡ処理ありおよびなしで比較した。０時間のＣｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆ発酵および接種源対照のプロファイル比較からの相関係数は、平均で９７．４％類似であり、ＥＭＡで処理された同じ試料は、平均で９６．３％類似であったプロファイルを有した（表３．１０）。０時間のＥＭＡ処理および未処理試料は、２６．５％の平均類似性を有した（表３．１１）。発酵の４８時間後、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆを含有するＥＭＡ処理試料のプロファイルは９６．７％類似であり、ＥＭＡで処理された接種源対照と平均で２９．３％類似であった（表３．１０）。ＥＭＡ処理なしのＣｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆ発酵間のプロファイルは、接種後４８時間で９７．５％類似であり、４８時間後の接種源対照と平均で５２．３％類似であった（表３．１０）。ペアとした４８時間Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆ発酵試料（ＥＭＡ処理対未処理）からのＤＧＧＥプロファイルの比較は、平均で２３．５％類似であった（表３．１１）。これらの結果は、０時間および４８時間のレプリケートがゲル特異的カットオフ閾値を上回り、したがってＥＭＡ処理ありおよびなしで同一であったので、ＰｈＡＳＴＢＬＵＥシステムが死細胞からのＤＮＡを再現可能に不活性化したことを示す。さらに、０時間および４８時間時点の両方で、試料がＥＭＡで処理された後、コミュニティプロファイル間には実質的な相違があったことが観察され、これは、死細胞に由来するＤＮＡによるプロファイルへの顕著な寄与を示した。ＤＧＧＥクラスタツリー解析は、共に独立してすべての他の試料とは別々にクラスタ化した４８時間接種源対照（ＥＭＡ処理ありおよびなし）を例外として、試料時点およびＥＭＡ処理に基づく４つの異なるクラスタをもたらした（図２１）。

表３．１０ドナー９ケモスタット物質（Ｖ９−１）が接種された予備消化デンプン基質のレプリケート小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティの再現性を比較する平均相関係数（ＳＩ％）。試料は接種後０および４８時間で採取し、値はＥＭＡ処理あり（網掛け）またはなしのいずれかで表す。

表３：１１ＥＭＡ処理ありまたはなしの試料間の（ＳＩ％）値として表される接種後０および４８時間で採取された微生物コミュニティ間の類似性を比較する、ドナー９ケモスタット物質（Ｖ９−１）が接種された予備消化デンプン基質の小規模バッチ発酵からの平均相関係数（ＳＩ％）。

ＥＭＡ処理が死細胞からのＤＮＡを一貫して無効化したという、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆで見られたものと同等の傾向が、残った５つのデンプン基質で見られた。これは、未処理試料で観察されたように、０時間および４８時間の両方で高レベルの類似性を維持するレプリケート試料のＤＧＧＥプロファイルをもたらした（表３．１０）。ＥＭＡ処理ありおよびなしの０時間および４８時間でのＤＧＧＥプロファイルを比較する平均相関係数を（表３．１１）に示す。５つのデンプンのＤＧＧＥクラスタツリー解析は、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆで観察されたものと同様のクラスタ化パターンをもたらした（図３３）。

図３３Ａ〜ＥＥＭＡ処理前および後の微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図。ケモスタット物質ドナー９（Ｖ９−１）が接種されたデンプン基質のレプリケート小規模バッチ発酵から接種後０および４８時間でサンプリングした。ａ）Ｃｇ１０２を含有する発酵、ｂ）Ｃｇ１０２ｗｘを含有する発酵、ｃ）Ｃｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅを含有する発酵、ｄ）Ｃｇｘ３３３を含有する発酵、ｅ）Ｃｇｘ３３３Ｓｕ２を含有する発酵。

図１９接種後０および４８時間でサンプリングされたドナー２糞便（Ｖ２−１）が播種されたケモスタット物質が接種された６つのデンプン基質の小規模バッチ発酵からの微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図。黄色で網掛けされた試料は、０時間試料を表し、青色で網掛けされた試料は、発酵の４８時間後にデンプン基質を含有する試料を表す。

ＧＣ−ＭＳデータ解析

ＧＣ／ＭＳクロマトグラムの目視検査は、０時間および４８時間デンプン基質発酵試料間の相違を示した（図３４）。３人のドナーの各々からの糞便マイクロバイオータが接種された発酵のＧＣ／ＭＳデータを個別に使用してＰＣＡモデルを構築し、データにおける傾向を可視化し、外れ値を特定した。ＰＣＡモデルは、主に第１の主成分（ＰＣ）ｔ［１］に沿って、０時間試料を４８時間デンプン基質発酵試料から一貫して分離した（図２２ａ〜ｃ）。さらに、４８時間接種源対照試料は、すべての３つのＰＣＡモデルにおいて別々にクラスタ化した。単一の外れ値、Ｃｇｘ３３３（２ｉ−４８ｈ）を、ドナー５からの糞便接種源での発酵についてのデータセット内で特定し、これは４８時間試料に反して０時間試料と共にクラスタ化したので、その後のすべての解析から省略した。ＯＰＬＳ−ＤＡモデルを構築し、０および４８時間試料クラス間で異なる潜在的な変数を特定し、デンプン基質の発酵により影響を受けた変数のより良好な特定のために対照試料を除去した（図３２ｄ〜ｆ）。ＰＣＡは、点がデータセット内での分散によってのみ分離される教師なし技術であり、あるいはＯＰＬＳ−ＤＡは、Ｙマトリックス中の、クラス同一性、この場合ではサンプリング時間を利用し、これをＧＣ／ＭＳ解析から得られるデータと相関させる教師あり技術である。２つの定義されたクラス間を判別するデータは、強制的に第１のＰＣに入り、クラス分離に寄与していないデータは、連続直交成分に入る。３人のドナーのデータセットから構築されたＯＰＬＳ−ＤＡモデルは、０時間発酵試料のすべてを第１のＰＣに沿って４８時間試料から分離した。

図３４は、０時間および４８時間時点のドナー９からの糞便マイクロバイオータが接種されたケモスタット物質でのＣｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆの発酵からのトータルイオンクロマトグラムを示す。赤色のクロマトグラムは０時間時点を表し、緑色のクロマトグラムは４８時間時点を表す。

グループ分離の原因である変数の特定のためにＶＩＰ図を使用した。２つのクラスの分離に対して最も大きな影響を有するものとしてＶＩＰ統計（ＶＩＰ＞１）を使用して変数を特定し、特定された変数の０および４８時間時点間の統計的に有意な相違を、正規化ピーク面積に対するマン−ホイットニー−ウィルコクソン検定を使用して確認した。代謝物仮同定に沿った各変数についての結果および倍率変化を、ドナー９、５、および２からの糞便マイクロバイオータでの発酵について、それぞれ表３．１２、３．１３、および３．１４に示す。０および４８時間試料間で異なるものとして同定された代謝物の大部分は、発酵期間にわたって減少を示した。この研究の目的は、宿主による吸収に利用可能であり得る糞便マイクロバイオータにより産生された代謝物を同定することであったので、関連する減少がある代謝物は、特にこの研究の対象ではなく、それ以上議論されていない。

ブタン酸における統計的に有意な増加が、すべてのドナーからの糞便接種源での発酵の４８時間後に観察された。さらに４８時間後、ドナー９からの糞便接種源での発酵は、ペンタン酸およびプロパン酸の両方における有意な増加をもたらした（表３．１２、３．１３、および３．１４）。各ドナーの糞便接種源についての試料クラス（時点）の分離に対して顕著な影響を有するものとして同定された代謝物における相違は、個体のマイクロバイオータが宿主にとって代謝物の産生および利用可能性において重要な役割を果たすことを示す。

３人のドナーの糞便マイクロバイオータが６つのデンプン基質に対して固有の応答を有したかを評価するために、以前に解析されたデータセットのサブセットについてさらなる解析を完了した。４８時間試料のみに関するＧＣ−ＭＳデータを、デンプン基質に基づき６つのクラスに分離し、ＰＣＡおよびＯＰＬＳ−ＤＡモデルの両方を使用して解析した。ドナー９に由来する糞便接種源での発酵についてのＰＣＡモデルは、６つのデンプン基質を第１のＰＣに沿って分離する傾向を示した（図２３）が、この傾向は他の２人のドナーについてのＰＣＡモデルにおいては観察されず（データは示されていない）、それ以上の解析は実施されなかった。２つのデンプン基質を一度に比較するドナー９についての４８時間発酵試料の解析のためにＯＰＬＳ−ＤＡモデルを生成した。デンプン基質のすべての可能なペアの組み合わせ間の相違を比較する場合に有意なモデルをＯＰＬＳ−ＤＡにより誘導することはできなかった。生成されたすべてのモデルは、ＣＶ−ＡＮＯＶＡｐ値＞０．０５で低いＲ２Ｙ（累積）およびＱ２（累積）値をもたらし（データは示されていない）、したがってモデルはデータに過剰適合しており、また高いＣＶ−ＡＮＯＶＡｐ値によって有意ではなかった。これは、デンプン基質間で、各ドナーの糞便マイクロバイオータについての０時間および４８時間時点間で観察されたものよりも不明確な相違を示した。このようなものとして、特定の代謝物をデンプン基質間で有意に異なるものとして同定することはできなかった。

図２１ＥＭＡ処理前および後の微生物コミュニティを比較するＤＧＧＥプロファイルのピアソンおよびＵＰＧＭＡ相関に基づく樹形図。ケモスタット物質ドナー９（Ｖ９−１）が接種されたＣｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆのレプリケート小規模バッチ発酵からの接種後０および４８時間でサンプリングした。

図２２ドナー９（パネルａおよびｄ）、ドナー５（パネルｂおよびｅ）、ならびにドナー２（パネルｃおよびｆ）からのケモスタット物質でのデンプン基質発酵から得られたＧＣ／ＭＳデータのＰＣＡモデル（パネルａ〜ｃ）およびＯＰＬＳ−ＤＡモデル（ｄ〜ｆ）。変数を平均中心化およびパレート尺度化し、ＯＰＬＳ−ＤＡモデルについて、０および４８時間時点をＹ判別マトリックスとして使用した。モデル特性は、（ａ）Ｒ^２Ｘ（累積）０．９０２、Ｑ^２（累積）０．８２５、および９つの有意なＰＣ、（ｂ）Ｒ^２Ｘ（累積）０．９３３、Ｑ^２（累積）０．８２、および７つの有意なＰＣ、（ｃ）Ｒ２Ｘ（累積）０．８４、Ｑ^２（累積）０．７６２、および３つの有意なＰＣ、（ｄ）有意な成分１＋１、Ｒ^２Ｘ（累積）０．８０２、Ｒ^２Ｙ（累積）０．９９８、Ｑ^２（累積）０．９９５、ＣＶＡＮＯＶＡ０、（ｅ）有意な成分１＋１、Ｒ^２Ｘ（累積）０．８２６、Ｒ^２Ｙ（累積）０．９９７、Ｑ^２（累積）０．９９５、ＣＶＡＮＯＶＡ０、（ｆ）有意な成分１＋１、Ｒ^２Ｘ（累積）０．７、Ｒ^２Ｙ（累積）０．９９５、Ｑ^２（累積）０．９９２、ＣＶＡＮＯＶＡ０である。図凡例：緑色の丸は０時間発酵試料であり、青色の四角は４８時間発酵試料である。

表３．１２は、マイナスの倍率変化が０時間と４８時間との間での濃度の低下を表すことを示し、倍率変化値が報告されないことは、２つの時点のうちの１つで代謝物が検出されなかったことを示す。代謝物は推定によってのみ割り当てられ、同定はＮＩＳＴ質量スペクトルデータベースとの比較により実施された。値はｎ＝２４で±標準誤差であり、統計的に有意なレベルはマン−ホイットニー−ウィルコクソン検定により決定され、＊はｐ値＜０．０５を示す。

表３．１３は、マイナスの倍率変化が０時間と４８時間との間での濃度の低下を表すことを示し、倍率変化値が報告されないことは、２つの時点のうちの１つで代謝物が検出されなかったことを示す。代謝物は推定によってのみ割り当てられ、同定はＮＩＳＴ質量スペクトルデータベースとの比較により実施された。値はｎ＝２４で±標準誤差であり、統計的に有意なレベルはマン−ホイットニー−ウィルコクソン検定により決定され、＊はｐ値＜０．０５を示す。

表３．１４は、マイナスの倍率変化が０時間と４８時間との間での濃度の低下を表すことを示し、倍率変化値が報告されないことは、２つの時点のうちの１つで代謝物が検出されなかったことを示す。代謝物は推定によってのみ割り当てられ、同定はＮＩＳＴ質量スペクトルデータベースとの比較により実施された。値はｎ＝２４で±標準誤差であり、統計的に有意なレベルはマン−ホイットニー−ウィルコクソン検定により決定され、＊はｐ値＜０．０５を示す。

ケモスタット供給試験

この実験では、ヒト供給試験の複雑な性質のために、ケモスタットの使用が代替として探究され、ケモスタット研究は、ヒト遠位結腸をモデル化する効果的な手段であることを以前証明している。デンプン富化培地を、ケモスタット供給試験における使用のために調製し、基本培地レシピ（２Ｌ）（表２．２）を、１２０ｇの予備消化ハイメイズ２６０（＋ＲＳ）またはコーンスターチ（＋ＣＳ）で富化し、容器に１日当たり追加の〜３０ｇの予備消化デンプンを４日間提供した（詳細は第２．５部を参照されたい）。

この研究では２つの別々のケモスタットラン、１）ドナー９からの新鮮な糞便が播種され、４日間デンプン富化培地が供給された後、４日間基本培地に戻されたツイン容器（Ｖ９−Ｒ１およびＶ９−Ｒ２）と、２）ドナー５糞便が播種され、４日間デンプン富化培地が供給された後、４日間基本培地に戻されたツイン容器（Ｖ５−１およびＶ５−２）とを解析した。ドナー５からの糞便マイクロバイオータが接種されたケモスタットランからの１つの容器は、関連のない別の実験に使用されており、このためツイン容器の各々についての供給試験は異なる日数で開始された。追加の解析を行い、供給試験の開始間の７日間にＶ５−２に顕著な変化が起こらなかったことを確認した。図２４は、供給試験実験のタイムラインおよびワークフローを概説する。

２つの別々のケモスタットランからのツイン容器をＤＧＧＥにより解析し、予備消化されたコーンスターチ（＋ＣＳ）と比較して予備消化された難消化性デンプン（＋ＲＳ）を含有するデンプン富化培地が、模擬遠位腸内コミュニティのコミュニティダイナミクスおよび安定性に影響を及ぼしたかを決定した。

Ｖ９−Ｒ１およびＶ９−Ｒ２についての移動窓相関解析は、両方の容器について２２〜３８日目の間でゲル特異的カットオフ閾値を下回る再現可能な変化率（Δｔ）値をもたらした（図２５ａ）。Ｖ５−１は、３６〜４７日目の間でゲル特異的カットオフ閾値を下回ったままであった再現可能なΔｔ値を有し、Ｖ５−２は、３４〜４０日目の間でゲル特異的カットオフ閾値を下回ったままであったΔｔ値を有した（図３．１６ａ）。これは、すべての４つの容器が供給試験の開始前に定常状態に到達したことを示す。

Ｖ９−Ｒ１およびＶ９−Ｒ２のＤＧＧＥ相関係数は、ゲル特異的閾値の５％以内であった３６および３８日目を例外として、２２〜３８日目の間でそれらのゲル定義カットオフ閾値を上回ったままであり（図２５ａ）、容器が高度の類似性を共有したことを示し、供給試験の開始前に定常状態が達成されたという結果を支持した。３４、３６、および３８日目のＶ５−１およびＶ５−２を比較するＤＧＧＥ相関係数は、ゲル特異的カットオフ閾値を下回る、５０．６％〜５５．７％類似の範囲内であった（表３．１５）。ＲＳ＋およびＣＳ＋供給試験の開始が７日離れていることを補うために、Ｖ５−２の４０〜４５日目をＶ５−１の３８日目と比較し、ゲル特異的カットオフ閾値を下回る、５２．３％〜５５．６％類似の範囲内の相関係数をもたらした（表３．１５）。よって、Ｖ５−２について４０〜４５日目のツイン容器の間で容器類似性における実質的な変化は起こらなかった。移動窓相関解析が、この期間中にＶ５−２についてゲル特異的カットオフ閾値を下回ったΔｔ値をもたらし、ひいては容器が定常状態に到達したことを示したので、これは予測されていた。Ｖ５−１およびＶ５−２相関係数は、供給試験前の期間中にゲル特異的カットオフ閾値を下回ったままであり、容器が類似していなかったことを示した。これは、両方の容器が定常状態に到達したが、定常状態構築の経過中に微生物コミュニティ組成に相違が生じたことを示す。

供給試験の開始後、Ｖ９−Ｒ１（ＲＳ＋）およびＶ９−Ｒ２（ＣＳ＋）相関係数は、３８〜４１日目（供給試験の１〜４日目）にゲル特異的カットオフ閾値を下回って５２．０％まで低下し、難消化性デンプンがコーンスターチ対照と比較してコミュニティ組成に対する固有の影響を有していたことを示した。ウォッシュアウト中、相関係数は、４５日目（供給試験の８日目）までに７２．２％類似まで増加し、ひいては２つのコミュニティがより類似するようになり、治療前コミュニティ組成に戻るプロセス中にある可能性があることを示した（表３．１６、図２５ｂ）。これらの結果は、供給試験全体（３７〜４５日目）を通した移動窓相関解析において反映され、Ｖ９−Ｒ１（ＲＳ＋）およびＶ９−Ｒ２（ＣＳ＋）についてのΔｔ値は変動したが、一貫してゲル特異的カットオフ閾値を上回り、コミュニティが安定ではなく、代わりにデンプン補充培地に応じて急速に変化していたことを示した（図２５ａ）。供給試験の経過中、ドナー５について同様の結果が観察され、Ｖ５−１（ＲＳ＋）およびＶ５−２（ＣＳ＋）Δｔ値は、最初の４日間にゲル特異的カットオフ閾値を上回って上昇し、コミュニティが追加のデンプン基質に応答し、定常状態ではなくなっていたことを示した（図３．１６ａ）。Ｖ５−１（ＲＳ＋）Δｔ値は、定常状態への傾向を示すカットオフ閾値の５％以内まで低下した解析の最終日（４８日目）まで、ゲル特異的カットオフ閾値を上回ったままであった。Ｖ５−２（ＣＳ＋）Δｔ値は、５１〜５５日目にゲル特異的カットオフ閾値の５％以内であり（図３．１６ａ）、同様に定常状態へと戻る傾向を示した。Ｖ５−１およびＶ５−２相関係数は、供給試験の最初の３日間、２６．０％の類似性まで毎日低下した後、８日目に５４．３％の最終類似性で供給試験が終了するまで一貫して上昇した（表３．１６、図３．１６ｂ）。これらの劇的な変化は、デンプン富化培地（ＲＳ＋およびＣＳ＋）が、糞便マイクロバイオータのコミュニティ構造に対してかなりの異なる影響を有したことを示す。さらに改変培地の終了後、コミュニティは治療前の状態に戻り始めた。

図２３は、４８時間でドナー９からのケモスタット物質でのデンプン基質発酵から得られたＧＣ／ＭＳデータのＰＣＡモデル（パネルａ）およびＯＰＬＳ−ＤＡモデル（パネルｂ）を示す。変数は平均中心化およびパレート尺度化され、モデル特性はＲ２Ｘ（累積））０．６９１、Ｑ２（累積））０．６０４、および２つの有意なＰＣである。図凡例：丸Ｃｇ１０２、四角Ｃｇｘ３３３、三角Ｃｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅ、ひし形Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆ、五角形Ｃｇｘ３３３Ｓｕ２、星形Ｃｇ１０２ｗｘ。

図２４この研究において利用されたインビトロケモスタット供給の実験デザインのフローチャート

図２５ドナー９（Ｖ９−Ｒ１およびＶ９−Ｒ２）からの糞便が播種されたケモスタットコミュニティに対するデンプン富化培地の効果を評価するインビトロ供給試験のＤＧＧＥ解析。パネルａ）移動窓相関解析を使用して計算されたコミュニティダイナミクス。パネルｂ）同一の時点でのツイン容器のプロファイル類似性を比較する相関係数（パーセントとして表される）。

図２６ドナー５（Ｖ５−１およびＶ５−２）からの糞便が播種されたケモスタットコミュニティに対するデンプン富化培地の効果を評価するインビトロ供給試験のＤＧＧＥ解析。パネルａ）移動窓相関解析を使用して計算されたコミュニティダイナミクス。パネルｂ）同一の時点でのツイン容器のプロファイル類似性を比較する相関係数（パーセントとして表される）。

Ｍａｕｖｅアラインメント
アラインメントは、コンティグ数および種株間の類似性の良好な可視化を提供した。アラインメントの可視化に基づき、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス株およびラクトバチルス・カゼイ株は、非常に類似して見えた。アラインメント可視化はまた、ルミノコッカス・オベウム株が、調査された他の５つの種と比べて似ていないという、早期の指摘を示した。アラインメントの相違は、真の株の相違を反映し得るが、ゲノム再編成で現れる、コンティグの誤った配列順序の結果でもあり得る。アラインメント図を図２に示す。

ＳＥＥＤビューアを使用する機能比較
表２は、ＳＥＥＤビューア機能比較結果を示す。サブシステムアノテーションに基づく６つの異なる細菌種からの細菌株ペアの機能比較の要約であり、数字は、株Ｂではなく株Ａに存在すること、株Ａではなく株Ｂに存在すること、または両方の株に存在することが確認されたサブシステム役割の数、および各々の種比較について確認されたサブシステム役割の合計数を示す。

２つの異なる株を有する６つの細菌種についての株ベアの機能比較によって、比較的に、３つの種における非常に高い機能的冗長性、２つの種における高い機能的冗長性、および１つの種における低い機能的冗長性が明らかとなった。最高レベルの機能的冗長性は、サブシステムベースの比較方法を使用して、ラクトバチルス・カゼイのペアの比較において見られた。機能的サブシステムにおける唯一の相違は、株Ａではなく株Ｂに存在し、ラクトースおよびガラクトース摂取に関与することが確認された（表３）。最低レベルの冗長性は、ルミノコッカス・オベウム株ペアの比較において見られ、広範囲のサブシステムおよびカテゴリにわたって、機能的サブシステム役割における２４７の相違が確認された。ルミノコッカス・トルクエスおよびビフィドバクテリウム・アドレッセンティス株の両ペアの比較は、それぞれ株間の５つおよび６つのみの相違、ならびに比較的に非常に高レベルの冗長性を明らかにした（表３）。ビフィドバクテリウム・ロンガムの株ペアの比較は、わずかに低い冗長性を示し、株Ａと株Ｂとの間の機能的サブシステム役割において１９の相違があり、そのうちの１４はビフィドバクテリウム・ロンガム株ＢではなくＡに存在し、５つは株ＡではなくＢに存在した。ドレア・ロンギカテナ株ペアの比較は、株ＢではなくＡに存在する８つのサブシステム役割、および株ＡではなくＢに存在する１７のサブシステムを明らかにした。ビフィドバクテリウム・ロンガムおよびドレア・ロンギカテナ株ペアについての機能的サブシステムの比較における相違の完全なリストを、表８に示す。

表８は、ＳＥＥＤビューア機能比較の要約を示す。（Ａ）は、ビフィドバクテリウム・ロンガムを示す。（Ｂ）は、ドレア・ロンギカテナを示す。ビフィドバクテリウム・ロンガムおよびドレア・ロンギカテナについての株ＡとＢとの間のサブシステムベースの機能的相違の要約は、確認されたカテゴリ、サブカテゴリ、サブシステム、および役割を示す。「ファージ、プロファージ、転移因子、およびプラスミド」という行で示された部分は、ファージ因子に関連する相違を示す。

表３は、ＳＥＥＤビューア機能比較の要約を示す。ラクトバチルス・カゼイ、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、およびルミノコッカス・トルクエスについての株ＡとＢとの間のサブシステムベースの機能的相違の要約は、確認されたカテゴリ、サブカテゴリ、サブシステム、および役割を示す。灰色で強調された部分は、ファージ因子に関連する相違を示す。

留意すべき重要な要素は、比較において存在するファージ関連タンパク質およびファージに関連する役割の数の多さである（表３および表８において灰色テキストで強調されている）。ファージ関連タンパク質は、ビフィドバクテリウム・ロンガムおよびドレア・ロンギカテナの一方の株のみに存在し、役割は異なるが、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスおよびルミノコッカス・オベウムの両方の株に存在した。これらの要素は、これらの株ペア間の相違を説明するのに役立ち得る。一方の株にファージが感染し、もう一方が影響を受けないままであった場合、または株に異なるファージが感染した場合、これは、この解析において報告されている遺伝子および機能性における相違のいくつかを引き起こし得る。ファージは、重要な遺伝子水平伝播（ＨＧＴ）メディエータ、およびヒト腸内マイクロバイオームへの遺伝子導入のための重要なパスウェイであるため、これは株分岐の優れた説明である。

ＳＥＥＤビューアを使用する配列比較

その２つの株が元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系に含まれていた細菌種の株ペアについての配列比較によって、機能比較に類似した結果が明らかとなった。調査された６つの種のうちの５つが、それらのタンパク質配列において高い〜非常に高い冗長性を示した。ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ドレア・ロンギカテナ、ラクトバチルス・カゼイ、およびルミノコッカス・トルクエスについての株ペアの比較は、すべて９５％以上の平均タンパク質配列同一性パーセントを示した（図７参照）。ルミノコッカス・オベウム株比較は、対照的に、仮想タンパク質が比較に含まれていたかどうか、およびどの株が参照株として使用されたかに応じて、４５〜６２％のかなり低い平均タンパク質配列同一性パーセントを有した。タンパク質配列間の相違は、同じ種の株Ａが参照として使用される場合の６つの種の各々についての株Ｂのタンパク質配列同一性パーセントを示す図１において、はっきりと可視化することができる。最初の５つの種は明らかに、同定されたタンパク質配列の大部分について９０％以上の範囲に含まれ、ルミノコッカス・オベウム株は５０〜６０％の範囲の近くに現れる。

表７は、タンパク質配列同一性パーセントに基づく６つの異なる細菌種からの細菌株のペアのＳＥＥＤビューア配列比較の要約を示し、括弧内の数字は、仮想タンパク質を除いた比較を示す。表は、同定されたタンパク質の合計数、双方向および単方向ヒットの数、ヒットなし（０％）のタンパク質の合計数、完全配列一致（１００％）のタンパク質の合計数、タンパク質配列同一性が高い（９５％〜９９％）タンパク質の数、タンパク質配列同一性が低い（５０％以下、ヒットなしのものを含まない）タンパク質の数、ならびに平均タンパク質配列同一性パーセントを含む。（Ａ）は、参照株としての株Ａとの配列比較をまとめる。（Ｂ）は、参照株としての株Ｂとの配列比較をまとめる。

図１Ａおよび１Ｂは、株ペアについてのＳＥＥＤビューア配列比較図を示す。図は、参照配列としての株Ａと株Ｂとの間の比較を示す。Ａ）株Ａ対株Ｂのビフィドバクテリウム・アドレッセンティス配列比較。Ｂ）株Ａ対株Ｂのビフィドバクテリウム・ロンガム配列比較。Ｃ）株Ａ対株Ｂのドレア・ロンギカテナ配列比較。Ｄ）株Ａ対株Ｂのラクトバチルス・カゼイ配列比較。Ｅ）株Ａ対株Ｂのルミノコッカス・トルクエス配列比較。Ｆ）株Ａ対株Ｂのルミノコッカス・オベウム配列比較。

平均タンパク質同一性パーセント対ゲノムサイズおよびコンティグ数の比較のために当てはめられた線形モデルは、これらの因子の両方がＳＥＥＤ配列比較についての結果をある程度交絡し得ることを示した。ゲノムサイズ対平均タンパク質配列同一性パーセントの比較のための線形モデルは、０．００６のｐ値を有し、有意な線形関係を示した。コンティグ数と平均タンパク質配列同一性パーセントとの間の線形関係も、０．０１６のｐ値で有意であった。これらの関係を表す散布図を図３に示す。

図３は、Ｒを使用する比較のための散布図を示す。図は、下に示す疑似コードの変形を使用して、Ｒで作成した。

図３Ａは、第Ｉ部において解析された１２の細菌ゲノムについてのゲノムサイズ対平均タンパク質配列同一性パーセントの散布図を示し、線は両者間の線形相関を示す。線形モデルは、０．００６１４４のｐ値を有する。図３Ｂは、第Ｉ部において解析された１２の細菌ゲノムについてのコンティグ数対平均タンパク質配列同一性パーセントの散布図を示し、線は両者間の線形相関を示す。線形モデルは、０．０１６２９のｐ値を有する。図３Ｃは、３３の細菌ゲノムすべてについてのゲノムサイズ対コンティグ数の散布図を示す。外れ値は、ユーバクテリウム・レクターレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｅｃｔａｌｅ）１８ＦＡＡであり、配列決定でエラーがあったように見える。

ＫＥＧＧパスウェイ解析

ＫＥＧＧパスウェイ結果は、ＳＥＥＤビューアを使用する機能および配列比較の結果を確認した。ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスについてのＫＥＧＧオーソロジーの比較は、ｉＰａｔｈ２．０内部リストとのＩＤマッチングおよび競合解決後、株Ｂに存在し、株Ａには存在しなかった、パスウェイにおける３つのみの重要な相違を明らかにした。ビフィドバクテリウム・ロンガムＫＥＧＧ比較は、株ＡとＢとの間のＫＯＩＤにおける４０の相違をまず明らかにしたが、マッチングおよび競合解決後、株Ａに固有の５つのＩＤおよび株Ｂに固有の３つのＫＯＩＤ、ならびに株Ａにおいて複製物の数が多い４つのＫＯＩＤおよび株Ｂにおいて複製物の数が多い２つのＫＯＩＤが見出された。ラクトバチルス・カゼイＫＥＧＧパスウェイ比較は、１つのみの相違、株Ｂに固有であったＫＯＩＤを明らかにした。これは、この研究全体を通して見られるラクトバチルス・カゼイ株間の高レベルの冗長性と一貫している。ドレア・ロンギカテナ比較は、株Ａについて２つの固有のＫＯＩＤ、および株Ｂについて６つの固有のＫＯＩＤを明らかにした。ルミノコッカス・トルクエスＫＥＧＧ比較は、各株について２つのみの固有のＫＯＩＤを見出した。これらの５つの種についてのＫＥＧＧオーソロジー割り当てにおける相違、およびそれらがマッピングするパスウェイ要素の完全なリストを、表９に示す。ＫＥＧＧパスウェイ解析に基づくルミノコッカス・オベウム株の比較は、前節とほぼ同じ結果を示した。比較は、株Ａについて４３の固有のＩＤおよび株Ｂについて３２の固有のＩＤ、ならびに株Ａにおいて複製が多い５つのＩＤおよび株Ｂにおいて複製が多い３つのＩＤを見出した（図５）。これは、ＳＥＥＤビューア比較において見られる低レベルの冗長性と一貫し、ルミノコッカス・オベウムの両株の必要性を示している。これらの結果は、ＳＥＥＤビューア比較からの結果と組み合わされた場合、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ラクトバチルス・カゼイ、およびドレア・ロンギカテナの株Ａ、ならびにビフィドバクテリウム・ロンガムおよびルミノコッカス・トルクエスの株Ｂが、機能的に冗長なようであり、生態学的な不均衡を引き起こすことなく、生態系から除去され得ることを示す。

図５Ａ〜Ｂは、ルミノコッカス・オベウムを比較するためのＫＥＧＧパスウェイマップを示す。図５Ａは、代謝パスウェイマップを示す。図５Ｂは、制御パスウェイマップを示す。ＫＥＧＧパスウェイマップは、ルミノコッカス・オベウム株Ａ対株Ｂの比較のために、ｉＰａｔｈ２．０を使用して生成した。緑線は共有パスウェイを表し、赤線は株Ａに固有の、または株Ａにおいて反復が多いパスウェイを表し、青線は株Ｂに固有の、または株Ｂにおいて反復が多いパスウェイを表す。線の太さは、ＫＯＩＤの反復数により決定される。

表９は、第Ｉ部において比較された種のうちの５つについてのＫＥＧＧパスウェイにおける相違の要約を示す。表９は、ＫＯＩＤ、マップ名（二次代謝物の生合成を含む）、および一方の株に固有の特定のパスウェイ要素を含む。青の部分は、一方の株に固有のものではないが、示された株において複製物の数が多い、ＫＯＩＤおよび要素を示す。

第ＩＩ部：ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系内の冗長性

方法

ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系内の冗長性を、上に記載されているＫＥＧＧパスウェイ比較とほぼ同じ方法だが、より大規模で調査した。ＫＡＡＳ（ＫＥＧＧ自動アノテーションサーバー）を使用し、第Ｉ部には含まれていないドラフトゲノム（２１のさらなるゲノム）中の遺伝子の機能アノテーションを提供した。各ゲノムについてのＫＯ割り当て（ＫＯＩＤ）のリストをダウンロードし、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌの表において比較した。元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系内の３３の種すべてについて見られたＫＯＩＤのリスト、およびあるＫＯＩＤが生態学全体内で見られた回数のリストを、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌの表から作成した。次にこれらのリストを使用し、ＫＥＧＧオーソロジー割り当て（ＫＯＩＤ）の複製物の数と一致した太さで、ＫＥＧＧＩＤの最終リストを作成した。ＫＯＩＤのリストを次にプログラムｉＰａｔｈ２．０：インタラクティブ・パスウェイ・エクスプローラにインポートし、マッピング前にｉＰａｔｈ２．０により使用される内部リストと一致させ、これによっていくつかのＫＯＩＤが除去された。この３３の種すべてについての最終一致リストを第ＩＩＩ部において使用した。

この研究の第Ｉ部において冗長であると判明した８つの種株の除去後、更新されたリストを次に作成した（表４）。第２のリストは、２５のみの異なる細菌を含んでいた。このより小さい生態系についての一致ＫＯＩＤのリストを、単一の種に特異的な、２つの種により共有される、３つの種により共有される、４つの種により共有される、および５つ以上の種により共有されるＫＯＩＤのリストと共に作成した。各ＫＯＩＤについての複製物の数のリストも作成した。１、２、３、４、および５つ以上の種により共有されるＫＯＩＤのリストを、各々色分けし（それぞれ紫、青、緑、赤、および黒）、ｉＰａｔｈ２．０にインポートした。色の競合を、競合している最も数の多い種の色として解決し、すなわち、パスウェイが赤（４つの種）と青（２つの種）との間の競合を有した場合、赤として解決した。最終代謝パスウェイマップを考察し（図６）、各色の間で共有されるノードの数を数えた。マップ中のノードは各種化合物に対応し、エッジは酵素反応の系列またはタンパク質複合体を表す。１、２、３、および４つの種についてのマップも個別に作成し、それらのＫＯＩＤがマッピングしたパスウェイ要素（エッジ）の数を求めた（表１０）。

表１０は、１、２、３、または４つの種により共有されるｉＰａｔｈ２．０ＫＥＧＧ比較パスウェイの要素数を示す。１、２、３、および４つの種により共有されるパスウェイに注目する、第Ａ部についての冗長な株が除去（２９の種を含む）された後のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ種の比較についての結果の要約である。３つのマップの各々についての選択されたパスウェイ要素の数、ならびに代謝マップ（図８）についての固有ノードおよび共有ノードの数を含む。固有ノードは、ノードが示される数の種を含むパスウェイの一部のみであった場合に数え、４つより多い（＞４）種により共有されるノードは、１つ以上の色付き線および黒線があるノードを共有した場合に数え、１／２／３／４つの種により共有されるノードは、２つの異なる色付き線、すなわち、青（２つの種）および緑（３つの種）が、あるノードを共有した場合に数えた。

図６は、１、２、３、または４つの種により共有されるパスウェイのｉＰａｔｈ２．０ＫＥＧＧ比較のための代謝パスウェイマップを示す。第Ｉ部についての冗長な株が除去された後のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ種（２５の種を含む）の比較のための完全な代謝パスウェイマップであり、１、２、３、または４つの種により共有される代謝パスウェイを示す。紫線は単一の種により共有される固有パスウェイに対応し、青線は２つの種により共有される代謝パスウェイに対応し、緑線は３つの種により共有されるパスウェイに対応し、赤線は４つの種により共有されるパスウェイに対応し、黒線はシステム内のすべての他のパスウェイ（＞４種）である。線の太さは、可視化しやすさのために選択され、ＫＥＧＧオーソロジーＩＤのコピー数を反映しない。

単一の種に特異的なＫＯＩＤのリストは、含まれた２５の細菌のうちの２２のみが固有のＫＯＩＤを有したことを示し、３つの明らかに冗長な株としては、ドレア・ロンギカテナ４２ＦＡＡ、ユーバクテリウム・レクターレ２９ＦＡＡ、およびユーバクテリウム・ヴェントリオスム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ）４７ＦＡＡが挙げられた。これらの３つの種を除去し、これらの３つの種の除去を反映するように複製物の数を更新した。単一の種に特異的な一致ＫＯＩＤのリストを次に使用し、固有の色を、その他の種により共有されていないＫＯＩＤを有した各々の種に合わせる、色凡例を手動で作成した。次に色凡例を使用し、ＫＯＩＤおよび合わせる色のリストを作成し、共有ＫＯＩＤは黒とし、固有ＫＯＩＤを有する各々の種は異なる色とした。このリストをｉＰａｔｈ２．０にインポートして使用し、カスタムマップを作成した。これは色競合のリストを作成した。いずれの色競合も、これはパスウェイが単一の細菌に固有のものではないことを意味したため、黒として解決した。例外は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｋ００１２９）についての唯一の固有ＫＯＩＤとの競合であり、さらなる調査によって、この競合がＫＯＩＤがマッピングした６つのパスウェイのうちの１つのみに影響を及ぼしたことが判明し、この競合は黒としてではなく、代わりにビフィドバクテリウム・ロンガムに特異的な色に合わせて解決した。

競合解決後、共有パスウェイは黒線、および固有のＫＯＩＤを有する各々の種は異なる色付き線で、最終マップを作成した（図７）。代謝および二次代謝物の生合成マップを解析し、固有ノードの数および接続ノードの最多数を求めた。細菌における多数の生化学および代謝パスウェイは不明のままであるため、これらを調査し、したがってこれらの要素数は、考えられる基礎パスウェイについて、エッジを単独で調査するよりも良好な理解をもたらし得る（表１１）。

表１１は、ｉＰａｔｈ２．０ＫＥＧＧパスウェイ解析の要素数を示す。固有ＫＯＩＤを有する２２の種の名称、３つのマップの各々についてそれらのＫＯＩＤがマッピングする固有パスウェイ要素（固有パスウェイ）の数、ならびに代謝および二次代謝物の生合成マップについての固有ノードの数および接続ノードの最多数を含む、第ＩＩ部：ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系内の冗長性の結果の要約である。固有ノードは、ノードが固有パスウェイの一部のみであり、その他のパスウェイにより共有されていない場合に数えた。括弧内の数字は、同様に固有パスウェイの一部であった共有ノードの数である。接続ノードは、固有パスウェイ要素により接続された固有ノードの最多数として数えた。括弧内の数字は、同様に固有パスウェイの一部である共有ノードが含まれる場合の固有パスウェイ要素により接続されたノードの最多数である。

図７は、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ集団比較のためのＫＥＧＧパスウェイマップを示す。図７Ａは、単一の株に固有のすべてのパスウェイを示す、元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系からの２５の種（冗長な株を除去）の比較のための完全な代謝パスウェイマップを示す。図７Ｂは、単一の株に固有のすべてのパスウェイを示す、元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系からの２５の種（冗長な株を除去）すべての比較のための完全な制御パスウェイマップを示す。左の色凡例は、どの色がどの種に対応するかを示す。線の太さは、可視化しやすさのために選択され、ＫＥＧＧＩＤのコピー数を反映しない。

固有ＫＯＩＤおよび合わせる色コードでの、２２の種についての固有ＫＯＩＤのみを含有する最終リストを使用し、固有パスウェイのみを示すマップを作成した（図８）。これらのマップを解析し、キーストーン種およびパスウェイを決定するのに役立てた（表１２）。２２の種についてのすべてのＫＯＩＤの最終リストを、元の３３の種についてのＫＯＩＤのリストと比較し、いずれかのＫＯＩＤがプロセス中に失われたかを決定した。ＫＯＩＤのコピー数を反映する太さのリストでの最終の２２の種についてのＫＯＩＤのリストを、この研究の第ＩＩＩ部において再度使用した。データに対して、配列決定およびゲノムアセンブリにおいて明らかなエラーがないかを確認するシンプルな品質チェックも行った。３３のゲノムすべてについてのゲノムサイズおよびコンティグ数を、Ｒで作成された散布図（図３Ｃ）を使用して比較した。以前に記載したユーバクテリウム・レクターレ１８ＦＡＡにおけるエラーは明白であり、すべての他のゲノムは正常に見えた。

表１２は、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系の固有のＫＥＧＧパスウェイの要約を示す。第Ｉ部において見出された冗長な株の除去後の固有ＫＯＩＤを有する２２の細菌種についての代謝および制御パスウェイならびに二次代謝物の生合成の要約である。マッチングおよび競合解決後に固有ＫＯＩＤを有する種の名称と共に、それらの固有ＫＯＩＤ、およびそれらがマッピングするパスウェイを含む。色は、代謝および制御パスウェイマップ（図７）に使用される色凡例を反映する。赤（３）のＫＯＩＤは、第ＩＩ部におけるドレア・ロンギカテナ４２ＦＡＡ、ユーバクテリウム・レクターレ２９ＦＡＡ、およびユーバクテリウム・ヴェントリオスム４７ＦＡＡの除去後のみに見られる固有ＩＤである。青（１４）のＫＯＩＤは、Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．データセットにおいても見られた。括弧内の数字は、そのＫＯＩＤがマッピングする３つのマップの各々に含まれる要素の数を示す。

図８は、単一の株に固有の制御パスウェイを示す、元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系からの２２の種の比較のための制御パスウェイマップを示す。左の色凡例は、どの色がどの種に対応するかを示す。線の太さは、可視化しやすさのために選択され、ＫＯＩＤのコピー数を反映しない。

表４．ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ細菌種の要約。表は、元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅプロトタイプに含まれる３３の種すべてを、ＲＡＳＴサーバー上に挙げられている名称で含む。種は、第ＩおよびＩＩ部における解析に基づき、３つのカテゴリに分ける。第Ｉ部において見出された冗長な株の除去後に固有ＫＥＧＧパスウェイを有することが判明した２２の種は、最初の２つの列に入り、研究の第Ｉ部において冗長であると判明した８つの種および第ＩＩ部において冗長であると判明した３つの種は、最後の列に入る。太字で挙げられている９つの種は、Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．のデータにも存在する固有ＫＯＩＤを有する種であり、括弧内の数字は、ＫＯＩＤの数を示す。

結果

１、２、３、または４つの種または株により共有される、固有およびほぼ固有のパスウェイおよびノードの比較は、いくつかの興味深いパターンを示した。（パスウェイは生態系にとって全体的に、固有ではないが、稀なものであるため）容易に除去することができない生態系内の冗長性について説明するために、２、３、および４つの種により共有されるパスウェイの比較を行った。第Ｉ部における冗長な種の除去後に残った細菌コミュニティ内の２５の種のＫＥＧＧオーソロジー割り当て比較は、固有ＫＯＩＤを有さず、生態系内のさらなる冗長性であるような３つの種（ドレア・ロンギカテナ４２ＦＡＡ、ユーバクテリウム・レクターレ２９ＦＡＡ、およびユーバクテリウム・ヴェントリオスム４７ＦＡＡ）を明らかにした。これらの３つの種についてのほぼ固有のパスウェイを調査した際も、ほぼ固有のパスウェイは少数のみであった。それぞれ２、３、および４つの種により共有されるＫＯＩＤを比較した場合、ユーバクテリウム・レクターレ２９ＦＡＡは、３、１、および３つの共有ＫＯＩＤを有し、ドレア・ロンギカテナ４２ＦＡＡは、３、５、および３つの共有ＫＯＩＤを有し、ユーバクテリウム・ヴェントリオスム４７ＦＡＡは、３、７、および６つの共有ＫＯＩＤを有した。これは、これらの３つの種が生態系内であまり重要ではなく、生態学的な均衡を崩すことなく除去され得る可能性があることを示す。

ほぼ固有のＫＯＩＤの比較はまた、生態系内のキーストーン種である可能性がある４つの種の重要性を明らかにした。ラオウルテラ属種（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａｓｐ．）６ＢＦ７、バクテロイデス・オヴァタス５ＭＭ、エシェリキア・コリ３ＦＭ４ｉ、およびパラバクテロイデス・ディスタソニス５ＦＭはすべて、高レベルのほぼ固有のパスウェイを有し、その大部分はこれらの４つの種の間で共有されていた。ラオウルテラ属種６ＢＦ７およびエシェリキア・コリ３ＦＭ４ｉは特に、２つの種により共有されるＫＯＩＤを見ると、非常に多数のＫＯＩＤを共有した。４つの種により共有されるＫＯＩＤを調べると、バクテロイデス・オヴァタス５ＭＭおよびパラバクテロイデス・ディスタソニス５ＦＭは、多数のＫＯＩＤをラオウルテラ属種６ＢＦ７およびエシェリキア・コリ３ＦＭ４ｉと共有した。これは、これらの４つの種が生態系において相互作用し、重要な役割を果たし得ることを示す。２、３、または４つの種の比較について３つ以下の共有ＫＯＩＤを有し、低レベルのほぼ固有のパスウェイを有するいくつかの種が同様に確認された（表５）。フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ４０ＦＡＡ、ラクノスピラ・ペクチノシザ３４ＦＡＡ、およびユーバクテリウム・レクターレ２９ＦＡＡは、３つの比較すべてにおいて低レベルの共有ＫＯＩＤを有した。コリンセラ・アエロファシエンス、およびドレア・ロンギカテナ４２ＦＡＡも、３つの比較のうちの２つにおいて少ないＫＯＩＤを有した。これは、これらの５つの種が、必要な低レベルの冗長性においていかなる主要な役割も果たし得ないことを示す。

表５は、２、３、または４つの種により共有されるＫＥＧＧオーソロジー割り当ての比較の要約である。表５は、２、３、または４つの種の間で共有される３つ以下のＫＯＩＤを有し、低レベルのほぼ固有のパスウェイを有することが判明した種をまとめる。太字テキストで強調されている種は、２つ以上の比較についてこのカテゴリに該当する。括弧内の数字は、（競合解決前に）共有されるＫＯＩＤの数を示す。

最終パスウェイ解析は、最初の３３の細菌のうち２２のみが、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ系内のその他の細菌によりカバーされない固有のパスウェイを有するという結果をもたらした。更新されたモデルに含まれる最終の２２の種のリストを表４に示す。これらの２２の重要な種についての固有のパスウェイを示すＫＥＧＧパスウェイマップを表７および８に示し、これらのＫＯＩＤがマッピングするパスウェイを列挙するチャートを表１２に示す。その株に固有のパスウェイが交差する各株についてのノード数の考慮は、存在すると考えられる未知の固有パスウェイについてのより良好な説明を可能にし、接続ノードの数が多いほどパスウェイが重要である可能性が高いので、接続ノードの最多数に注目することにより、我々はパスウェイの関連性についていくらかの理解を得る。このデータの調査は、バクテロイデス・オヴァタス５ＭＭおよびラクノスピラ・ペクチノシザ３４ＦＡＡの両方が、ほとんどの他の種より多くの固有ノード（それぞれ１２および８）を有するが、接続ノードの最多数は両者についてわずか２であることを示した。これは未知のパスウェイが関与しているかもしれないことを示す。最も関連性のある種は、ラオウルテラ属種６ＢＦ７であると考えられ、４６の固有ノードを有し、接続パスウェイの最多数は１５である。これは、次に多くの接続ノードを有する種、すべて接続している３つの固有ノードを有するロゼブリア・インテスティナリス３１ＦＡＡよりも５倍多い（表１１）。

元の３３の種についてのＫＯＩＤのリストと比較した２２の重要な種についてのＫＯＩＤの最終リストの比較は、第Ｉ部において冗長であると判明した８つの種株の除去から引き起こされる２つのＫＯＩＤ（Ｋ０７７６８およびＫ１１６９５）の喪失を明らかにした。第１のＫＯＩＤは、ユーバクテリウム・レクターレ１８ＦＡＡの除去の結果として失われた可能性がある。これは、比較的に小さいゲノムサイズについて過度に多数のコンティグを有し、ゲノムアセンブリにエラーが発生していたように見えた唯一の細菌種または株であった（図３Ｃ）。この株の真の重要性を決定するには、さらなる研究が必要である。失われたと考えられるＫＯＩＤ（Ｋ０７７６８）は、シグナル伝達のための二成分系内の３つの制御パスウェイにマッピングするが、それらのパスウェイのうちの２つは、２２の種の生態系についてのＫＯＩＤの最終リストにまだ存在する、別のＫＯＩＤ（Ｋ０７７７６）によってもマッピングされる。これは、単一の小さなパスウェイのみが失われ、生態学的な均衡に影響を及ぼさない可能性があることを示す。冗長性除去のプロセスにおいて失われた第２のＫＯＩＤ（Ｋ１１６９５）は、ペプチドグリカン生合成のための単一の代謝パスウェイにマッピングし、このパスウェイにマッピングする唯一のＫＯＩＤである。このＫＯＩＤは、ビフィドバクテリウム・ロンガム４ＦＭの除去の結果として失われた。このパスウェイの喪失が、生態系の持続可能性に悪影響を及ぼすかは不明であり、この細菌株が必要であり得るかを決定するにはさらなる研究が必要である。

２２の種についての固有パスウェイを詳しく見ると、種の数のさらなる最適化が可能であり得ることがわかる。固有パスウェイを示すマップは、ユーバクテリウム・デスモランス４８ＦＡＡ、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ４０ＦＡＡ、ルミノコッカス属種（株Ａ）、およびルミノコッカス属種１１ＦＭという４つの細菌株が、非常に少ない固有パスウェイを有することを明らかにし、その各々は、単一のマップ要素のみ、および１つまたは２つのパスウェイのみにマッピングする（表１２）。この証拠は、２、３、および４つの種により共有されるパスウェイの比較（表５）から得られた情報と組み合わされ、ユーバクテリウム・デスモランス４８ＦＡＡおよびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ４０ＦＡＡが、生態系における不均衡をもたらすことなく、除去され得る可能性があることを示す。ラクノスピラ・ペクチノシザ３４ＦＡＡおよびコリンセラ・アエロファシエンスも、ほぼ固有のパスウェイが非常に少なく（表５）、少数の固有ＫＯＩＤおよびパスウェイ要素を有するのみである（表１２、それぞれ、３つのＫＯＩＤ、６つの要素、および２つのＫＯＩＤ、２つの要素）。これらの４つの種の必要性を決定し、新たなプロトタイプのＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系におけるそれらの除去または包含を正当化するためには、さらなる研究が必要となるだろう。

第ＩＩＩ部：ＫＥＧＧパスウェイカバレッジの比較
方法
第ＩＩ部において作成されたＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系内のＫＯＩＤ複製物の数により決定される太さでの３３の種すべてについてのＫＯＩＤのリストを、ｉＰａｔｈ２．０にロードして使用し、青に色付けした線、および各ＫＯＩＤについての複製物の数により決定される太さでカスタムマップを作成した。太さの競合は、競合する太さからランダムに選択するｉＰａｔｈ２．０により使用される自動的な方法を使用して解決した。同じプロセスを、固有ＫＯＩＤを有する２２の種からなる最適化された生態系についてのＫＯＩＤおよび更新された太さのリストについて完了し、このマップの線の色は黒とした。比較のための「健康な」ヒト腸内マイクロバイオームは、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．による研究から引用され、太さを伴うＫＯＩＤの完全なリストは、ｉＰａｔｈウェブサイト上に提供される。Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．研究の目標は、ヒト腸内マイクロバイオームの一般的かつ可変なゲノム特性を同定することであった。その研究は、乳児を含む、様々な年齢の１３人の健康な日本人の個体からの糞便試料の大規模な比較代謝解析からなる。この研究からのデータは、ｉＰａｔｈ２．０の開発においてその能力の実演として以前使用されたことがあり、この比較には時間制限下での使いやすさのために選択された。Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．データについてのｉＰａｔｈ２．０マップを、カスタムマップ機能および提供されているリストを使用して作成した。このリストの線の色は赤とする。次に３つのデータセットすべてについてのカスタムマップを、ポータブル・ドキュメント・フォーマット（ＰＤＦ）でダウンロードした。

３つのＰＤＦ画像をＧＩＭＰ２．８．１０（ＧＮＵ画像操作プログラム）に別々のレイヤーとしてロードし、Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．データおよびＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅパスウェイの両方のセットを可視化することができるように、αチャンネルに着色することにより透明度を操作した。これは、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系の各々が、天然ヒト腸内マイクロバイオームの例、および互いにどれほど良く一致したかを視覚的に比較し、ＫＥＧＧパスウェイのカバレッジを決定するために行った（図９）。ＫＥＧＧＩＤの３つのリスト（各マップに１つ）、および第ＩＩ部において見出された固有ＫＥＧＧＩＤのリストも、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌスプレッドシート表を使用して比較した。このプロセスを最適化するために、Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．ＫＯＩＤを、ｉＰａｔｈ内部リストと一致させ、第ＩＩ部において他のリストを一致させたのと同じ方法でｉＰａｔｈ２．０パスウェイにマッピングしなかったいかなるＫＯＩＤも除去した。

図９は、健康なマイクロバイオームに対するＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅデータの比較を示す。Ａ）Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．研究からのデータに対して最適化前および後の完全なＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅコミュニティを比較する代謝パスウェイマップ。Ｂ）Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．研究からのデータに対して最適化前および後の完全なＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅコミュニティを比較する制御パスウェイマップ。赤線はＫｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．データを表し、青線はすべての３３のゲノムが含まれる元のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅデータを示し、黒線は２１のみのゲノムが含まれる最適化されたＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅデータを表す。

結果

完全な３３の種のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系についてのＫＯＩＤの一致リストを、Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．ＫＯＩＤの一致リストと比較し、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅデータセットにはＫｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．データセットに含まれない６３５のＫＯＩＤが見られ、Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．データにはＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅに含まれない８６のＫＯＩＤが見られることが明らかとなった。最適化プロセス中に除去された２つのＫＯＩＤは、Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．データセットには含まれていなかった。Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．データまたはＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅのいずれかに固有のＫＯＩＤのうち、６３のＫＯＩＤは、他のデータセットからの固有パスウェイと共有されたパスウェイを有した。Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．データについての２７の固有ＫＯＩＤは、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅについての固有ＫＯＩＤと重複する少なくとも１つのパスウェイを有し、３６の固有のＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅＫＯＩＤは、Ｋｕｒｏｋａｗａデータからの固有ＫＯＩＤにより共有される少なくとも１つのパスウェイを有した。健康な腸内マイクロバイオームを維持するためには存在すべきである、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系から失われた正確なパスウェイをより詳しく調べるには、さらなる解析が必要である。

最適化された生態系の２２の種のうちの単一の種に固有のＫＯＩＤのリストも、一致Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．データセットと比較した。同定された１１７の固有ＫＯＩＤのうち、１４のみがＫｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．データにも含まれ、これらは表１２において青で強調されている。単一の種に固有のものであり、Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．データと一致した１４のＫＯＩＤは、９つのみの種において見られ、これらの種が生態系において最も重要であり得ることを示した（表４参照）。

３３または２２いずれかの種を含む２つのＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅバージョンの視覚的な比較は、データの明らかな喪失なく、ＫＯＩＤの複製物の数における小さな相違のみを示した。ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅデータおよびＫｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．データの視覚的な比較は、Ｋｕｒｏｋａｗａｅｔａｌ．データと比較した場合の、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅデータ中の少数の代謝パスウェイの複製物の数におけるいくつかの明らかなずれを示した。これらの大部分は、生命に必要であり、したがってすべての細菌種に存在し、より多様な種についてより多数の複製物を有するだろう代謝領域において発生したので、これははるかに多数の細菌の存在による可能性が高い。制御パスウェイマップ内にも、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系におけるカバレッジが不足または欠乏していると考えられる領域がいくつかある。これらとしては、アミノアシル−ｔＲＮＡ生合成パスウェイ、ＡＢＣトランスポーターパスウェイ、二成分系、および細菌分泌系の領域が特に挙げられる。これらの足りない要素の重要性を理解し、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ系がパスウェイを制御することができる種を組み込むためのさらなる変更を要するかを確認するためには、さらなる研究が必要となるだろう。

考察
この研究の目標は、デンプン生合成パスウェイにおける突然変異を通して産生された新規メイズデンプンの潜在的な健康上の利点についての新たな情報を解明することであった。デンプン解析は、ＲＳ含有量およびヒト糞便マイクロバイオータによるインビトロ発酵に対する効果の評価を含み、デンプン基質の潜在的なプレバイオティクス特性を決定した。糞便接種源から播種されたケモスタット培養微生物コミュニティは、小規模バッチ発酵のための有用で再現可能な接種源であることが示された。インビトロ発酵は、デンプン基質に応じて糞便マイクロバイオータに対する固有の変化をもたらし、これらの変化は、糞便ドナー間で異なることが示された。異なるドナーからの物質が播種された容器からの発酵プロファイルにおいて代謝物の分別産生が観察されたが、同じドナーからの物質を使用して、代謝物プロファイルは、異なるデンプン基質に応じて感知できるほどには変化しなかった。

消化

この研究において使用された６つのメイズ系統は、アミロース：アミロペクチン比の変更をもたらしたデンプン生合成パスウェイにおける突然変異によるそれらのデンプン基質における相違のために選択され、これはひいてはＲＳの量に影響を及ぼすことが証明されている。Ｍｅｇａｚｙｍｅ難消化性デンプンアッセイキットを利用するＲＳ決定は、Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆ、Ｃｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅ、およびＣｇｘ３３３Ｓｕ２がインビトロ消化前および後の両方で最大量の難消化性デンプンを含有し、Ｃｇ１０２ｗｘが最小量を含有したことを明らかにした。最初の３つのメイズ系統のデンプン生合成パスウェイにおける突然変異は、ＲＳ含有量を増加させるデンプン構造に対する変更をもたらし、逆はＣｇ１０２ｗｘについて真であるので、これは予測されていた。ほとんどの場合、デンプン基質のＲＳ、ＳＳ、およびＴＳ含有量はインビトロ消化後に減少するが、調理によってデンプンがゼラチン化し、より消化されやすくなるので、これは予測される。ＲＳは、沸騰および焼成のようなほとんどの調理適用中、ゼラチン化されない。しかしながら、オートクレーブは従来の調理よりもはるかに高い温度および圧力に到達し、オートクレーブが発酵におけるその後の使用のためにデンプン基質の滅菌を提供する間、プロセスはＲＳ画分の部分ゼラチン化をもたらし得た。興味深いことに、Ｃｇｘ３３３Ｓｕ２のＲＳ含有量は、消化手順後に増加した。メイズ系統Ｃｇ１０２およびＣｇｘ３３３の遺伝的背景における実質的な相違は、部分的に、Ｃｇｘ３３３Ｓｕ２についてＲＳの増加をもたらす消化手順に対する異なる応答の原因であり得る。

発酵実験における無菌デンプン基質は、腸内マイクロバイオータによるデンプン発酵が、メイズ穀粒に関連した環境微生物により影響されないという初期の目標であった。よって、無菌デンプン基質を生成するステップをとったが、すべての試料はいくらかのレベルの汚染を有することが見出された。しかしながら、この汚染は、小規模バッチ発酵には影響を及ぼさないことが見出された。０時間および４８時間のデンプン基質対照は、ＤＧＧＥプロファイルにおいて変化を示さなかった（図３．１）。デンプン基質が調製され、好気的に消化され、このようなものとして、汚染物質は、腸内微生物発酵に使用された嫌気性環境において生存することができなかった偏性好気性生物であり得る。これは、以前の研究が、予備消化プロトコル中の無菌性の維持にあまり注意していなかった理由を説明し得る。デンプン基質の無菌性を確保することが、腸内マイクロバイオータによる発酵の評価にとって重要であるとは思われないので、このタイプの研究にはデンプンのオートクレーブではなく沸騰が適しているはずであり、デンプンの日常的な調理プロセスにもっと良く似ているという利点を有し、より生理的に適切な基質を提供する。さらに、ＲＳはＳＣＦＡの産生について用量依存的応答を示すので、コーンミールとは対照的に純粋なデンプンの単離が最適であり得る。

小規模バッチ発酵再現性

ケモスタットを使用し、ヒト糞便試料に由来する複雑なコミュニティを再現可能に発達させ、維持することができる。我々は、小規模バッチ発酵モデルにおいて６つのデンプン基質の発酵プロファイルを研究するための安定な接種源として、３人の異なるドナーの糞便が接種された３つの別々のランを使用した。我々の知る限りでは、これはバッチ発酵のための接種源として安定なケモスタットモデルが使用された最初の例である。ケモスタットが長期間にわたって一貫したコミュニティを提供し、必要に応じてサンプリングすることができるので、この方法はドナーからの繰り返し糞便回収に対して利点を提供する。対照的に、繰り返し糞便ドネーションは、腸内の遷移種の存在によって糞便マイクロバイオータにおける一過性の変化を引き起こす。最後に、インビボからインビトロへの移行は、糞便コミュニティを培養する際に行われ、バッチ発酵において観察される変化は、この移行により誤解され得る。コミュニティにおけるばらつきは治療の効果に直接起因し得るので、安定なケモスタット培養物の使用は、この移行がすでに行われている場合、レプリケート発酵間の比較をより簡単にする。

これらの実験において使用されたインビトロケモスタットモデルは、以前から検証されている。これは接種源物質と同一の糞便コミュニティをもたらさないが、コミュニティはそれでもなお、主としてインビボで見出されたものを代表する安定かつ多様なコミュニティであり、実験に使用することができる。この研究では、ケモスタットランおよび小規模バッチ発酵の微生物コミュニティ構造およびダイナミクスが、ＤＧＧＥ、分子フィンガープリント技術を使用して解析された。また、バッチ発酵内での代謝変化がＳＰＭＥＧＣ−ＭＳの使用によって解析された。

これは、新鮮な糞便試料とは対照的に、バッチ発酵のための接種源としてケモスタット培養物を使用する最初の研究であったため、我々の最初の目的は発酵の再現性を検証することであった。発酵は、テクニカルレプリケート間でほぼ同一のコミュニティ組成をもたらした。バイオロジカルレプリケート間の再現性は、使用されるケモスタット容器の安定性に依存していた。ドナー９からの糞便が播種されたケモスタットランは、サンプリング前に定常状態を達成し、サンプリング期間全体を通して低い変化率値を維持した（図１２ｃ）。このようなものとして、レプリケート発酵は接種直後に高いＳＩ％を有し、試験された６つのデンプン基質すべてについて同一のコミュニティプロファイルを示した。ドナー５からの糞便が播種されたケモスタットに由来する接種源でのバッチ発酵について、同様の結果が得られた。さらに、ドナー５および９の両方からの糞便接種源での発酵は、４８時間後に同一のコミュニティダイナミクスを維持するレプリケートで再現可能に進行した。この研究は、しかしながら、再現可能な結果を得るには、ケモスタットが、バッチ発酵における接種源としての使用のために、サンプリング前に定常状態に到達することが絶対条件であることを示した。ドナー２に由来する糞便マイクロバイオータが播種されたケモスタット容器のサンプリングは、ドナー５および９についてのそれとは対照的に、依然として容器内で急速な変化率があった期間中に開始された（図１２ａ）。同一のコミュニティを示す高いＳＩ％値は、バイオロジカルレプリケート間ではなく、テクニカルレプリケート内で０時間および４８時間の両方で観察され、接種源間の非類似性を示した。よって、各種基質がマイクロバイオータに対して有する効果を研究するためには、定常状態のケモスタットを使用し、高度の再現性で小規模バッチ発酵に接種することができると結論付けることができる。この方法は、インビボからインビトロへの移行中に起こる顕著なコミュニティ変化によって従来のバッチ発酵方法の使用では見逃し得る、小さな変化を検出することができる場合もある。

デンプン基質への応答

ＤＧＧＥプロファイル類似性のクラスタツリー解析およびＮＭＤＳは、ドナー９の糞便マイクロバイオータによる発酵後、デンプン基質の３つのグループへのクラスタ化をもたらし、ドナー５からの糞便マイクロバイオータでの発酵について、２つのグループのみが明らかであった。サンプリング前にケモスタット容器において定常状態が達成されなかったので、ドナー２からの糞便マイクロバイオータでの発酵に関して結論を出すことはできず、よってこれらの結果はこれ以上議論されない。

Ｃｇｘ３３３およびＣｇｘ３３３Ｓｕ２の発酵の結果としての試料は、共にかつドナー５および９の両方からの糞便マイクロバイオータでのすべての他のデンプン基質発酵とは別々にクラスタ化し、Ｃｇｘ３３３およびＣｇｘ３３３Ｓｕ２が他のデンプンとは異なって発酵されたことを示した。Ｃｇｘ３３３Ｓｕ２は野生型（Ｃｇｘ３３３）と比較して増加した量のＲＳを含有したが、両方ともドナー５および９に由来する微生物コミュニティに対して同様の効果を与えた。これは、Ｃｇｘ３３３Ｓｕ２における突然変異（還元アミロペクチン合成を引き起こす）が、本質的には糞便コミュニティに対してより大きなプレバイオティクス効果を与えなかったことを示した。Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆおよびＣｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅ系統に由来するデンプンは、分枝が低減し、アミロースの構造に類似し、よってＲＳ含有量を増加させる、より長いアミロペクチン鎖を含有する。これらのデンプン基質は、野生型Ｃｇ１０２とは異なるコミュニティダイナミクスに対する顕著な効果を有し、固有のコミュニティプロファイルをもたらした。すべての発酵から観察された効果と集合的に、結果は、異なる突然変異が、異なる群の結腸細菌を刺激するデンプン基質の発酵特性を変更するという仮説を支持する。同様の研究は、改変構造を有するデンプン基質に応じた糞便マイクロバイオータに対する変化を評価しているが、我々の研究は、コミュニティレベルの変化を解析することによる、より全体論的なアプローチをとった。対照的に、ほとんどの他の研究は、十分に特徴分析されたプロバイオティクス細菌種のサブセットのみを調査し、よって糞便コミュニティ全体が評価される場合にのみ見られる他の顕著な変化を見逃している。

例えば、高アミロースメイズデンプン（ＨＡＭＳ）の異なる処理を通して産生される２つのＲＳ多形体は、２４時間の発酵後に糞便コミュニティにおける固有の生態学的シフトを誘発することが示された。一方の多形体はバクテロイデス属種およびアトポビウム属種の増加をもたらし、他方の多形体はビフィドバクテリウム属種の増殖を刺激した。ラットモデルを使用し、２つの典型的な低アミロースメイズデンプン（ＬＡＭＳ）、ＨＡＭＳまたはブチリル化ＨＡＭＳ（ＨＡＭＳＢ）が補充された食事に応じた糞便マイクロバイオータに対する変化が観察された。これらの著者は、両方の高ＲＳ食が独立してマイクロバイオータに対する固有の変化をもたらし、２つのＬＡＭＳの間には相違が見られなかったことを報告した。ＨＡＭＳ食は、ルミノコッカス・ブロミイ様細菌の増加を誘発し、ＨＡＭＳＢ食は、ラクトバチルス・ガッセリおよびパラバクテロイデス・ディスタソニスの集団を増加させた。

また、ドナー９から得られた糞便マイクロバイオータを使用する発酵について、およびドナー５ではより低度の、デンプン基質間の腸内マイクロバイオータに対する固有の変化が観察された。これは、個体のマイクロバイオータの初期組成が所定の基質の効果に対して顕著な影響を有することを示し、個体の腸内マイクロバイオータの新規メイズデンプンに対する応答は異なるだろうという仮説を支持する。ＲＳ富化クラッカーを消費する１０人の対象間の個別の応答で、同様の結果が報告された。ＲＳの消費により顕著に影響されることが確認された分類群のうち、１０人の対象すべてにおいて同様の応答を示したものはなかった。これらの多様な応答は、基質利用における株レベルの相違、または所定の個体の腸内における特定の種の比存在度もしくは非存在のような、いくつかの因子によるものであり得る。また、宿主生理的因子は、個体の腸内マイクロバイオータの形成において顕著な役割を果たす。例えば、変動する腸内通過時間、消化速度、およびｐＨは、すべて結腸環境およびその中のマイクロバイオータに影響を及ぼす。腸内マイクロバイオータにおけるこれらの個体間相違のより良好な理解は、個別化された健康のためのプレバイオティクスの適合にとって極めて重要となるだろう。

代謝物産生

食物繊維の発酵は、ひいては宿主の全般的な健康に対して顕著な影響を有する、ＳＣＦＡの産生を増加させることが一貫して報告されている。炭水化物の発酵によってヒト結腸内で産生される総ＳＣＦＡの９０〜９５％は、酢酸、プロピオン酸、および酪酸であり、このようなものとして、ＲＳおよび他の食物繊維の研究は、これらの代謝物における変化を研究するのに標的アプローチを日常的に使用する。我々は、この研究において、健康なおよび疾患（腸内毒素症）を有する腸内の両方で個体間の糞便ＶＯＣにおける相違を確認するのに以前使用された非標的メタボロミクスアプローチを利用した。この非標的アプローチを使用し、新規バイオマーカーおよび、デンプン基質の発酵からもたらされる、ＳＣＦＡを識別することを期待して、所定の試料中で多数の代謝物を捕捉した。

我々は、すべてのドナーに由来する糞便マイクロバイオータにより発酵されたすべてのデンプン基質について、ブタン酸（酪酸）の産生における一貫した増加を観察した。興味深いことに、試料のいずれにおいても酢酸は検出されず、他の研究は他のＳＣＦＡと比較して最高量を報告しているので、これは意外であった。しかしながら、酪酸の産生は酢酸に依存し、酪酸産生の〜８０％がブチリルＣｏＡ：アセチルＣｏＡトランスフェラーゼパスウェイを通した酢酸の細胞外変換に起因することが示されている。ＳＣＦＡ産生における変化について４８時間時点のみが解析されたので、これらの試料中の酢酸のほとんどがマイクロバイオータにより酪酸に変換された可能性がある。よって、酢酸の産生および枯渇の動態を解明するには、より早期の時点を調べる必要があり得る。

プロパン酸およびペンタン酸の両方の産生は、ドナー９からの糞便マイクロバイオータでの発酵においてのみ検出された。糞便マイクロバイオータの個体間のばらつきは異なる機能的能力をもたらすことが提唱されており、これはこの研究において使用された３人の糞便ドナーが異なる代謝物の集団の産生をもたらした理由についてのもっともらしい説明となり得る。同様の結果が以前報告されており、ある研究は、肥満マウスが増加した食物エネルギー摂取容量を有し、これがそれらの糞便マイクロバイオータの組成に関連していることを示した。肥満は、宿主により吸収され、エネルギー源として使用される、ＳＣＦＡを産生する発酵容量の増加から生じ得る。これは産生された代謝物に関して３人の糞便ドナー間で観察された異なる結果のいくつかを説明し得る。

この研究では、複数の代謝物の検出を可能にする技術を使用したにもかかわらず、固有のまだ報告されていない発酵代謝物は検出されなかった。しかしながら、観察された結果は、個体間で固有の発酵プロファイルが生成されたという仮説を支持した。さらに、ＰＣＡにより決定されたように、デンプン基質間には産生された代謝物における相違が存在するようであったが、統計的に有意なＯＰＬＳ−ＤＡモデルで確認することはできなかった。このため、異なるデンプン基質に応じたマイクロバイオータ試料の発酵プロファイルを決定する将来の研究は、（あまり包括的ではないが）より簡単な標的メタボロミクス技術を使用する解析から恩恵を受けるかもしれない。標的アプローチはまた、より定量化可能な結果をもたらし、異なるデンプン基質の発酵により産生される代謝物間の顕著な相違のより良好な解明を可能にし得、この研究におけるＧＣ−ＭＳを使用する非標的解析は、いずれのこうした相違も検出しなかった。

ＰｈＡＳＴＢｌｕｅ

安定な単段階ケモスタット培養物から誘導された糞便コミュニティの小規模バッチ発酵に由来するＤＮＡのＤＧＧＥ解析は、４８時間の発酵後のコミュニティダイナミクスに対するかなりの変化を明らかにした。バッチ発酵は閉鎖系であるので、観察される変化は、死細胞に由来するＤＮＡの増幅により歪んでいる場合がある。この問題を解決する１つの方法は、生細胞からのＤＮＡの差動増幅の使用によるものである。ＰＣＲ増幅前に環境試料を処理するエチジウムモノアジド（ＥＭＡ）の使用は、試料中の細胞外ＤＮＡおよび、瀕死であり、よってＥＭＡ取り込みに対して透過性である細胞からのＤＮＡの増幅を防止し、一方で生細胞中のＤＮＡは化学物質から保護される。ＰｈＡＳＴＢｌｕｅキットは研究の終わり際に使用可能となり、このようなものとして、分子解析前に糞便コミュニティを処理する手段としてのこの技術の再現性を決定するのに、手短にのみ評価された。この研究では、ＰＣＲ増幅前のＥＭＡ処理は、未処理試料と比較して、依然としてレプリケート間の類似性度を維持しながら、いくつかのバンドにおける一貫したシグナル低減およびＤＧＧＥゲル上の他の強度における増加を示した（図２１）。したがって、この方法が、死細胞に由来するＤＮＡを標識するための信頼性および再現性のある方法であることを示している。これは、水リザーバーからの成熟バイオフィルムを解析する別の研究により観察される結果に類似する。この報告書の著者は、しかしながら、この手順を、バイアスを導入することなく、広範囲の微生物種に適用することができることを確認するには、より多くの研究が完了されなければならないので、これらの結果を解析する際にはいくらか注意を払わなければならないことに言及している。ＥＭＡ処理は、しかしながら、生存細胞集団のみを標的とする簡単な予備処理を提供することにより、微生物コミュニティにおける変化を解析する際の分子技術の感度を向上させる、微生物生態における非常に貴重な方法であることを証明し得る。容器内で起こるコミュニティレベルの変化をより正確に明らかにし得るので、将来の研究は、短期バッチ発酵および長期ケモスタット研究の両方の解析に、この技術の使用を組み込むべきである。

ケモスタット供給試験

遠位結腸を模倣するツイン容器単段階ケモスタットは、各種ストレッサーに応じた腸内マイクロバイオータにおける摂動を再現可能に研究する効果的な手段であることが示されている。プレバイオティクス基質の発酵特性は、様々な連続培養モデルを使用して研究されている。これらの実験の多くは、しかしながら、観察された変化がコミュニティのインビトロモデルへの適合によるものではないことを確認するための対照容器を欠き（容器ベースラインがその独自の対照として使用された）、または実験前に適切な定常状態のコミュニティを構築するのに失敗した。この研究では、我々は、複雑なヒト供給試験の代替としての糞便微生物コミュニティが播種されたツイン容器単段階ケモスタットの使用を確認することを目的とした。我々の知る限りでは、これはインビボ供給試験を模倣するインビトロモデルの培地を補充するのに予備消化基質が使用された最初の例である。

ツイン容器単段階ケモスタットは、改変培地（ＲＳ＋およびＣＳ＋）の開始後、両方のドナー（５および９）からの糞便コミュニティについてコミュニティ変化を示した。ツイン容器のＳＩ％は、模擬供給試験の経過にわたって低下し、２つのデンプン基質が糞便コミュニティに対して異なる効果を有したことを示した。基本培地供給に戻る際、ツイン容器のＳＩ％は増加し始め、容器が供給試験の開始時のような基本状態へと戻っていたことを潜在的に示した。

Ｖ５−２がランの経過全体を通してＶ５−１よりもはるかに高い割合でのベースの添加を必要としたことが観察されたので、ドナー５糞便が接種されたツイン容器間で見られた低い類似性は、定常状態の構築中のコミュニティにおける相違によるものであり得る。しかしながら、コミュニティダイナミクスで観察された傾向は、定常状態のコミュニティにおける相違にかかわらず、ドナー９からの糞便マイクロバイオータが接種されたツイン容器で見られたものに類似する。

ツイン容器単段階ケモスタットの使用は、試験される基質への曝露前に糞便コミュニティを安定なインビトロ状態へ移行させることを可能にするので、より従来的なバッチ培養発酵に対して異なる利点を有することが見出された。さらに、ツイン容器単段階ケモスタットは、短い実験窓のみを有するバッチ培養物とは対照的に、変動する基質量および治療時間の効果を研究することを可能にする。このようなものとして、ツイン容器単段階ケモスタットを対照実験に効果的に使用し、宿主から独立した腸内微生物生態系に、プレバイオティクスを供給する、または他の摂動を導入する効果を調査することができる。

結論および追加の実施形態

ＲＳは、糞便マイクロバイオータの調節を通してヒトの健康を向上させる顕著な潜在能力を有する、証明されたプレバイオティクスである。広範囲のデンプンが豊富な食物に由来するＲＳの多数の形態は、個体の糞便マイクロバイオータ内、および異なる個体のマイクロバイオータ間の両方で、様々なプレバイオティクス効果を有することが示されている。完了された研究はここで、プレバイオティクス潜在能力が増加した変性デンプン基質のスクリーニングおよび同定のための基礎を提供する。ＤＧＧＥは、デンプン基質間のコミュニティプロファイル変化を明確に判別した。検出することができた代謝物のスペクトルを拡幅する試みにおいてＳＰＭＥＧＣ−ＭＳが使用されたが、ＳＣＦＡ（特に酪酸）の増加のみが一貫して観察された。これは、デンプン基質間の相違を決定する将来の試みが代謝物における変化を、特にＳＣＦＡに注目して測定すべきであり、非標的方法とは反対の定量的標的代謝アプローチを使用して達成するのが良いかもしれないことを示す。

追加の実施形態

これらの系統が最大量のＲＳを含有し、糞便マイクロバイオータに対する最大の効果を有すると考えられたので、変性デンプン、特にＣｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆおよびＣｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅの、プレバイオティクス潜在能力のさらなる評価を調査する。Ｃｇ１０２ａｅ１−ｒｅｆおよびＣｇ１０２ａｅ１−Ｅｌｍｏｒｅの、これらを必要とする患者への投与は、腸内マイクロバイオームにおける少なくとも１つの細菌株の増殖を促進することができる。

また、１６ＳｒＲＮＡコミュニティプロファイリングの使用は、デンプン基質に応じて起こっているコミュニティ組成変化を解明するのに使用することができる。これは、宿主および発生期の微生物コミュニティの両方に対する有益な効果に関連する生化学プロセスで、分類群の富化に関してより大きなプレバイオティクス潜在能力を有する基質をさらに同定するのに役立つだろう。さらに、広範囲の食ライフスタイルをカバーする、何人かの個体からの糞便コミュニティの個体間応答は、所定のデンプン基質を最適に利用する傾向があるコミュニティ構造をより良好に特徴付けることができる。

探究すべき別の考えられる道は、これらのプレバイオティクスが、ＩＢＤまたは潰瘍性大腸炎を患っているような、腸内毒素症を有する個体にどのように影響を及ぼすかであり得る。「腸内毒素症」とは、微生物生態に関する十分に理解されていない状況を表す、きちんと定義されていない用語であるので、この研究において開発された方法は、所定の生態系が基質を効果的に利用することができないことに関する腸内毒素症の基礎となるメカニズムのより良好な理解に寄与し得る。

この研究において記載されているモデルはインビボ環境を模倣するが、それらは宿主応答を容易にモデル化することができない。ヒトまたは動物モデルにおける将来の研究は、潜在的なプレバイオティクス基質のプレバイオティクス性質を確認するために行われるだろう。しかしながら、糞便バッチ発酵およびケモスタットモデルを使用し、候補デンプンおよび他の基質をそれらのプレバイオティクス潜在能力について費用効果的にスクリーニングすることができる。デンプン生合成の理解の向上と共にヒトの糞便マイクロバイオータおよびそれらの機能的能力を定義する因子ならびに消化性に影響を及ぼす因子についての継続的な研究は、本研究を推進し続け、個別化された健康および栄養の新時代をもたらすだろう。

細菌コミュニティ

このレポートにおいて概説されている研究デザインにはいくつかの制約がある。起こり得るエラーの主な要因の１つは、高レベルのデータセットの手動操作であり、これはヒューマンエラーの発生を助長している。競合を解決し、データを選別するのに選択された方法は理想的ではなく、将来的には、さらに自動化されたプログラミングベースのアプローチが、これらの考えられるエラー要因の多くを排除し、結果の妥当性を向上させるだろう。

この研究のデザインにおける第２の大きな問題は、細菌の代謝および生化学パスウェイについての一般的な知識の欠如である。重要な未知の細菌パスウェイの可能性の問題は、重要な種を正しく同定できないこと、および冗長性の誤同定を助長する。解析におけるノードおよびパスウェイの両方の調査によってこのエラー要因の修正を試みたが、これがすべての未知の可能性を説明するわけではない。同様に、プログラムｉＰａｔｈ２．０の使用も、プログラムが考えられるすべてのパスウェイを含むわけでも、すべての既知のＫＥＧＧオーソロジー割り当てを説明するわけでもないので、特定の未知の要素を導入することになる。このプロジェクトにおけるＫＥＧＧオーソロジー割り当ての比較は、簡潔さと理解しやすさの両方のために、ｉＰａｔｈ２．０プログラム内で使用されるもののみに注目した。しかしながら、これは、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系の３３のゲノムにおいて同定された４２１０のＫＯＩＤのうち、比較に含まれたのは１５３６のみであり、この解析では２６７４のＫＯＩＤを調査せずに残すことを意味した。

したがって、細菌の代謝および生化学パスウェイに関する我々の理解が向上すれば、これらのパスウェイに関するこの情報は、本発明の実施形態に組み込まれるだろう。

このレポートの第ＩＩ部において概説されている解析は、３３の元の細菌株のうちの２２のみが固有のパスウェイにマッピングすることを明らかにした。これは、これらの種のいくつかまたはすべてが生態系内の「キーストーン」種であり得ること、および他の種が冗長である可能性があり得ることを示す。この解析は、生態系内の特定のレベルの冗長性が必要であり得、調査されていない特定の細菌相互作用が生態学的に必要であり得、または未知の細菌パスウェイがコミュニティの生態学的均衡において役割を果たし得るという事実は説明しない。これらの種のうちの９つのみが「健康な」微生物コミュニティの例においても見られる固有ＫＯＩＤを有していたことにも言及しておかなければならない。ヒト腸内の生態系内の均衡に必要な「キーストーン」種およびパスウェイを絶対的に定義するには、さらなる研究が必要である。

ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系内の冗長性を探す最終比較は、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅプロジェクトの人工のコミュニティと比較して天然の「健康な」ヒト腸内細菌集団を調査するようにデザインした。「健康な」細菌集団はまだ明確に定義されていないので、これは困難であった。「健康な」ヒト腸内マイクロバイオームを表すために選択されたこの研究データは、時間制限のため選択され、そのデータは、容易に入手可能であり、既にこの研究において使用されるパスウェイ解析プログラムのための正しいフォーマットであった。しかしながら、データのソースは、全員日本人の祖先を持つ１３人のみの個体についてのデータを含有し、発達段階初期の腸内マイクロバイオームの動的な性質のためエラー要因となり得る、乳児のデータも含んでいたので、理想的ではなかった。すべての糞便試料が日本人の個体からのものであるという事実も、ヒト対象にわたる多様性の欠如および日本人特有の食事の両方のため、データにおけるエラー要因となり得る。以前の研究は、日本人が、日本人の食事における高レベルの海藻およびこの食物源を分解する腸内細菌の要件のため、海洋細菌に由来する遺伝子をより豊富に有することを示している。導入されたこれらの海洋細菌遺伝子は、データセットにおいて見られるパスウェイに影響を及ぼし得る。もし時間が許したならば、より良好なデータソースはＨｕｍａｎＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔまたは欧州主導のＭｅｔａＨｉｔであり、より典型的な北米人の腸内マイクロバイオームのデータソースを提供したであろう。

例：細菌コミュニティの形成
ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系を最適化するプロセスにおける次のステップは、明らかに冗長な種および株の除去によって生態学的な均衡が保たれているかを確認するための、培養おける、提案された細菌コミュニティの実際の形成を含む。この研究において用いられるメタゲノムアプローチは、同定された遺伝子が発現されているか、およびどのレベルにあるかを識別することができないので、メタトランスクリプトームアプローチによってコミュニティの実際の機能活性も調査されるべきである。メタトランスクリプトームは、相補的ＤＮＡに変換され、ハイスループットプラットフォームで配列決定された、コミュニティから単離されたメッセンジャーＲＮＡを使用する。このアプローチは、微生物生態系における遺伝子発現の特徴付けを可能にし、全体としてのコミュニティの相互作用のより良い理解をもたらすだろう。したがって、こうした細菌コミュニティの形成後、細菌コミュニティは、腸内毒素症（これらに限定されないが、例えば、ＩＢＤ、ＩＢＳ、ＵＣ、癌関連腸内毒素症、等）を患う患者に投与され、患者は胃腸病理の向上を示すだろう。

結論
この研究の第Ｉ部において概説されている証拠は、調査された６つの種のうちの５つにおける冗長性を明確に示す。第ＩＩ部において概説されている証拠は、あまり明確ではないが、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅ生態系内でいくつかのさらに冗長な種が見られ得るといういくつかの徴候がある。第ＩＩＩ部における最終解析は、ＲｅＰＯＯＰｕｌａｔｅコミュニティが健康なヒト腸内マイクロバイオームの代謝および制御パスウェイを非常に忠実に模倣することを示す。この比較は、元の３３ではなく２２の種からなる生態系が、機能性または生態学的な均衡を損なうことなく、より経済的な人工細菌コミュニティをもたらす可能性があることも示す。この理論を試験するには、細菌培養でのさらなる研究が必要である。

Claims

標的細菌系からの少なくとも１つの細菌種を富化する方法であって、
前記標的細菌の生態系を、単段階ケモスタット中の培地において、（ｉ）約５〜約２９０時間のシステム滞留時間、（ｉｉ）約３７℃の温度、（ｉｉｉ）約６．８〜７のｐＨ、および（ｉｖ）少なくとも１つの細菌種を富化するのに十分な時間のケモスタットに対する嫌気条件の維持の条件下で培養することを含み、
前記培地が、調製されたデンプン基質を含み、
前記標的細菌系が、抗生物質で少なくとも６か月間治療されていない患者から得られた糞便由来試料である、方法。
前記調製されたデンプン基質が、メイズ基質、コーン基質、コムギ基質、オオムギ基質、マメ基質、オートムギ基質、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
前記調製されたデンプン基質が、メイズ基質である、請求項１に記載の方法。
前記少なくとも１つの細菌種が、バクテロイデス属種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｓｐｐ．）、アトポビウム属種（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍｓｐｐ．）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｂｒｏｍｉｉ）、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）、およびパラバクテロイデス・ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）を含む、請求項１に記載の方法。
前記患者が抗生物質で少なくとも１年間治療されていない、請求項１に記載の方法。
前記システム滞留時間が、約２０〜７０時間である、請求項１に記載の方法。