CN111304117B - 一株具有抗氧化活性的植物乳杆菌gl-5及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有抗氧化活性的植物乳杆菌GL‑5及其应用。本发明从海拔4000m以上的青海果洛地区牧民家自制的发酵乳制品中筛选出了一株具有抗氧化活性的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GL‑5，于2019年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18988，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarumGL‑5的16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的植物乳杆菌GL‑5具有较好的抑菌活性，能够显著抑制肠道致病菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性；本发明提供的植物乳杆菌GL‑5具有较强的抗氧化活性，能够显著耐受过氧化氢酶；本发明提供的植物乳杆菌GL‑5具有较强的胃肠液耐受性和胆盐耐受性，在模拟胃液和肠液中培养后的存活率显著高于鼠李糖乳杆菌LGG。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有抗氧化活性的植物乳杆菌GL-5及其应用。
背景技术
氧化作用是机体的必要代谢过程，但过度的氧化作用会引起生物大分子的损伤，导致机体衰老等相关疾病的发生，其中自由基具有强烈的氧化作用，可以引发脂质过氧化反应造成细胞膜受损，进而使细胞死亡。当人体有过量自由基产生时，自由基会与人体细胞内的蛋白质、核酸等生物大分子结合，并破坏它们的结构和功能。自由基对人体的危害主要包括：降低抵抗力、减弱细胞更新率、造成氧化性疲劳、导致炎症和衰老等。
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥对肠道有益作用的活性有益微生物的总称。目前应用最为广泛的益生菌是乳杆菌和双歧杆菌等，可以调整肠道菌群平衡，提高蛋白质和维生素的代谢，产生抗菌素来抑制有害菌群生长，抗肿瘤，增强免疫力，降低血清胆固醇等。其中具有抗氧化活性的益生菌可以通过清除人体内过多的自由基来使人体维持正常状态，发挥抗衰老作用，因此，对于抗氧化活性较强的益生菌的筛选较为关键。
植物乳杆菌属于革兰氏阳性菌，可发酵碳水化合物并且产生大量乳酸，因其优越的发酵性能和多样的功能性，得到广泛的关注，其发酵食品在全球各地食用历史悠久，同时也是公认安全(GRAS)的食用菌种。目前，植物乳杆菌已被广泛地应用到营养保健、发酵食品、生物医药、饲料、畜牧养殖等行业中。植物乳杆菌也是人体胃肠道的益生菌群，代谢可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种天然抑菌物质，具有调节肠道微生物菌群的平衡，增强机体的免疫力，降低胆固醇水平，缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成等作用。其中鼠李糖乳杆菌LGG是益生菌中研究最多、功能性最多的一种益生菌。LGG菌可以定殖在人体内长达两周之久，能有效改善调整人体胃肠道菌群群落，对人体健康非常有益，并且LGG在耐胃酸和胆汁方面的性能非常突出，可以活体进入人体肠道。但是LGG菌的抗氧化活性较弱。
虽然目前已经筛选出了多种具有抗氧化活性的植物乳杆菌，但是，普遍存在抑菌效果差或胃肠不耐受性等缺点。其中，中国专利CN109182162A提供了一种高原植物乳杆菌，具有一定的抗氧化活性，能够有效清除机体内自由基，但是其在肠液中的存活率较低，胃肠耐受性较弱；中国专利CN104789511A提供了一株植物乳杆菌AB-2，具有广谱的抑菌性能，但是对胆盐的耐受性较弱。因此，对于机体耐受且具有抗氧化活性的植物乳杆菌开发和研究具有广泛的应用价值。
本发明从海拔4000m以上的青海果洛地区牧民家自制的发酵乳制品中筛选出了一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GL-5，具有良好的抑菌活性和胆盐耐受性，且具有较强的抗氧化活性，可用于制备调节肠道菌群和抗氧化的药品和保健品。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一株具有抗氧化活性的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GL-5，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GL-5于2019年11月 21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.18988。
优选地，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GL-5的16S rRNA序列如SEQID NO： 1所示。
本发明的另一目的在于提供一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GL-5在制备抑制肠道致病菌药物中的应用。
优选地，所述肠道致病菌包括金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
本发明的另一目的在于提供一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GL-5在制备抗氧剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GL-5在制备抗氧化药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GL-5在制备耐缺氧保健品中的应用。
本发明的有益效果是：①本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarumGL-5具有较好的抑菌活性，能够显著抑制肠道致病菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性；②本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GL-5具有良好的胃肠耐受性和胆盐耐受性，在模拟胃液和肠液中培养后的存活率显著高于鼠李糖乳杆菌LGG；③本发明提供的植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum GL-5具有较强的抗氧化活性，能够显著耐受过氧化氢酶。
附图说明
图1为不同菌株对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果图；
图2为菌株GL-5的系统发育树；
图3为菌株GL-5在模拟胃液和肠液中的存活率，其中a为菌株GL-5在模拟胃液中的存活率，b为菌株GL-5在模拟肠液中的存活率；
图4为菌株GL-5的抗氧化活性结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。
在本发明的下述实施例中所用菌株来源如下：
实验菌株：菌株GL-5、DFD2-1、SN-1-1、QA-3-1均分离于来自海拔4000m以上的青海果洛地区牧民家自制的发酵乳制品；阳性对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG菌(菌种编号为BNCC136673)、指示菌大肠杆菌(BNCC336902)、金黄色葡萄球菌(BNCC186335)购自北纳创联生物技术有限公司。
其他实验材料和仪器如无特殊说明，均可通过商业途径购买。
实施例1植物乳杆菌的分离与活性检测
1.1分离
将来自海拔4000m以上的青海果洛地区牧民家自制的发酵乳制品取0.5g左右，用PBS 分别稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8的浓度梯度，各个浓度吸100μL到加有碳酸钙的改良型MRS固体培养基上涂布均匀，每一浓度两个重复。放置于37℃恒温培养箱内培养48h后观察菌落以及透明圈产生的情况，便于进一步分离纯化。
1.2纯化培养
从以上培养的浓度梯度中选择一合适的梯度，挑选边界清晰可见并均有透明圈的单菌落 15-25个，挑选出来的菌落采用划线法在新制的MRS固体培养基上传代培养24-48h，再次划线培养，此步骤共重复三次，以获得单克隆菌株。此菌株通过MRS液体培养基培养24h后，共获得了包括GL-5、DFD2-1、SN-1-1、QA-3-1在内的10株菌株，并将上述菌液于50％甘油中保存。
1.3菌株活性筛选
取50％甘油中保存的上述菌液按2％接种量接种到1.5ml的MRS液体培养基中并置于 37℃恒温培养箱中培养10h作为种子菌液用于接下来的实验。种子菌液按2％的接种量接种到2ml装有MRS液体培养基的EP管中并置于37℃恒温培养箱中培养18h进行二代培养后放4℃备用；
本研究的指示菌株分别是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，分别用LB培养基和营养肉汤培养基培养15h，用麦氏比浊法将每个指示菌的浓度调至1-3×108DFU/mL，放4℃冰箱备用。
将已培养18h的乳酸菌培养液500g离心10min，取上清备用。取100μL已活化指示菌，调整指示菌的浓度为1.5×108CFU/mL，在相应的培养基上进行涂板，涂布后培养皿置于超净工作台半敞开10min，在固体培养基摆好的牛津杯中加如上述保存的种子菌液上清液200μL，平稳放在37℃培养18h，观察测量每种菌液的抑菌圈直径，平行做三组实验。
抑菌实验表明，上述菌株中的GL-5、DFD2-1、SN-1-1和QA-3-1对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抑菌作用，结果如图1所示，其中菌株GL-5、DFD2-1、SN-1-1和QA-3-1对金黄色葡萄球菌的平均抑菌圈直径分别为2.2cm、1.5cm、1.5cm、1cm，对大肠杆菌的抑菌圈分别为1.95cm、1.75cm、0.6cm、1.55cm，菌株GL-5对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有显著的抑菌效果。
实施例2菌株GL-5的鉴定与保藏
2.1菌株GL-5的16S rRNA的序列分析
提取菌株GL-5的DNA，使用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增：
上游引物为，27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
下游引物为；1492R GGTTACCTTGTTACGACTT
PCR扩增体系；
50μL反应总体系包含：2×Mix Taq，25μL；Primers(10μM)：上游引物(Forward)，2.0μL，下游引物(Reverse)，2.0μL；DNA模板(100ng/μL)，2.0μL；ddH2O，19μL。
PCR反应条件：
预变性：94℃，4min；94℃变性，1min；55℃复性，1min；72℃延伸，1.5min，共30 个循环；72℃延伸10min。
反应在Bio-Rad iCycler Thermal Cycler(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)仪器上进行。扩增产物送交上海生工生物科技有限公司进行测序。测序结果提交到GenBank数据库。
菌株GL-5的16S rRNA基因序列提交到GenBank数据库，利用BLAST搜索同源性较高的序列，用CLUSTAL X 1.81和MEGA 6.0软件进行序列的比对分析并建立系统发育树(图 2所示)。可知该菌株隶属于乳杆菌属(Lactobacillus)，初步确定该菌为植物乳杆菌GL-5。
2.2菌株初步鉴定与保藏
单克隆菌株GL-5通过革兰氏染色及过氧化氢产气实验初步证明是植物乳杆菌GL-5，该菌株命名为Lactobacillus plantarum GL-5，于2019年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18988，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例3菌株GL-5对模拟胃液和肠液的耐受性
胃液配置：配制pH值为7.4的PBS缓冲液，加入适量的稀盐酸调pH值为3.0，定容至100ml，再称取1.0g胃蛋白酶加入其中，0.22μm滤膜过滤，备用。
肠液配置：配制pH值为8.0的PBS缓冲液，定容至100ml，称取0.3g猪胆盐，1.0g胰蛋白酶，融入其中，0.22μm滤膜过滤，备用。
菌液配置：取50％甘油中保存的菌株GL-5，按2％接种量接种到1.5ml的MRS液体培养基中并置于37℃恒温培养箱中培养10h作为种子菌液用于接下来的实验。种子菌液按2％的接种量接种到5ml MRS液体培养基中并置于37℃恒温培养箱中培养18h进行二代培养。18h后6000r/min离心10min，弃去上清，沉淀的菌体用同弃去的上清等体积的生理盐水洗涤两次后制成菌悬液，备用。
涂板试验：取1ml的上述菌液接种到9ml的上述已备的胃液中，摇匀置于37℃，90r/min 的恒温摇床进行培养。按10倍稀释法进行稀释，并选择合适的稀释度进行涂板，每个稀释度重复两个，在0h、3h各取0.1ml的进行涂板，37℃恒温培养48h后计菌落数；取1ml上述培养3h的胃液加到9ml的已备好的肠液中，摇匀置于37℃，90r/min的恒温摇床进行培养，在0h、3h、6h、9h时进行涂板，37℃恒温培养48h后计数。
实验结果：结果表明，与阳性LGG菌相比，菌株GL-5具有一定耐酸耐胆盐的作用，其中，菌株GL-5在pH 3.0的胃液中培养三小时之后，其存活率(菌的存活率＝接种后某时活菌数/初始的活菌数×100％)在120％以上，存活率相比于阳性对照组LGG高出60倍以上，说明其具有较高的耐酸性和抗胃蛋白酶的能力，可以在胃液中生长(图3a)；在肠液中培养3h、6h、9h后GL-5的存活率分别为104.47％、92.70％、85.24％表现比较稳定，尤其9h时GL-5 在肠液中的存活率(85.24％)，与阳性对照组LGG菌株的存活率相当(图3b)。说明本发明提供的菌株GL-5具有较强的胃液和肠液耐受性。
实施例4菌株GL-5的抗氧化活性
菌株活化：取50％甘油中保存的菌株GL-5，按2％接种量接种到1.5ml的MRS液体培养基中并置于37℃恒温培养箱中培养10h作为种子菌液用于接下来的实验。种子菌液按2％的接种量接种到2ml装有MRS液体培养基的EP管中并置于37℃恒温培养箱中培养18h进行二代培养后放4℃备用。
菌株培养：配制分别含有5.5mmol/L和6.5mmol/L过氧化氢酶的MRS培养基，取已活化的菌株按2％的接种量分别接种到7mL的含有5.5mmol/L和6.5mmol/L的H2O2的MRS液体培养基中，37℃，培养12h。
过氧化氢酶耐受性检测：培养12h后，取出试管并混匀，取出3mL的菌悬液加到石英比色皿中，用分光度器在OD600下测各菌悬液的浓度，做记录。
实验结果：结果表明，与阳性LGG菌相比，菌株GL-5具有较强的抗氧化活性。其中，菌株GL-5在5.5mmol/L和6.5mmol/L的的H2O2的MRS液体培养基中，37℃，培养12h后的吸光值高于其他菌株，说明菌株GL-5有较强的过氧化氢耐受性和抗氧化能力(如图4所示)。
综上，本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GL-5，具有强抑菌活性、胆盐耐受性和抗氧化活性，可用于制备保健品或药品，具有抗衰老、抗氧化、抑制肠道致病菌以及调节肠道菌群等作用。
以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 一株具有抗氧化活性的植物乳杆菌GL-5及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 942
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌GL-5(Lactobacillus plantarum)
<400> 1
tgccccttag gcaggctggt tctagaaggt taccccaccg actttgggtg ttacaactct 60
catggggtga cgggcggggt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc 120
cgcgattact agcgattccg acttcatgta ggcgagttgc agcctacaat ccgaactgag 180
aagggcttta agagattagc ttactctcgc gagttcgcaa ctcgttgtac catccattgt 240
agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct 300
ccggtttgtc accggcagtc tcaccagagt gcccaactta atgctggcaa ctgataataa 360
gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat 420
gcaccacctg tatccatgtc cccgaaggga acgtctaatc tcttagattt gcatagtatg 480
tcaagacctg gtaaggttct tcgcgtagct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt 540
gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca gccttgcggc cgtactcccc aggcggaatg 600
cttaatgcgt tagctgcagc actgaagggc gtaaaccctc caacacttag cattcatcgt 660
ttacggtatg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgcta cccatacttt cgagcctcag 720
cgtcagttac agaccagaca gccgccttcg ccactggtgt tcttccatat atctacgcat 780
ttcaccgcta cacatggagt ccactgtcct cttctgcact caagtttcca gtttccgatg 840
ccttcttcgg tgagccgaag gtttcaatcg gattaaaaaa ccgcctggct cgtttacgcc 900
aataatccgg acacgctgcc actacgttta cgcggtggtg gc 942
Claims (6)
1.一株具有抗氧化活性的植物乳杆菌( Lactobacillus plantarum)GL-5，所述植物乳杆菌( Lactobacillus plantarum)GL-5于2019年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18988。
2.如权利要求1所述的植物乳杆菌 GL-5在制备抑制肠道致病菌药物中的应用，所述肠道致病菌为金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus ) 和大肠杆菌( Escherichia coli ) 。
3.如权利要求2所述的植物乳杆菌 GL-5在制备调节肠道菌群保健品中的应用。
4.如权利要求1所述的植物乳杆菌 GL-5在制备抗氧剂中的应用。
5.如权利要求1所述的植物乳杆菌 GL-5在制备抗氧化药物中的应用。
6.如权利要求1所述的植物乳杆菌 GL-5在制备耐缺氧保健品中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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