CN109536414A - 一种抗氧化应激植物乳杆菌tg-95及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具备抗氧化应激功能的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）TG‑95，其保藏编号为CGMCC No.16772。本发明还涉及植物乳杆菌TG‑95在制备功能性食品中的用途。本发明涉及的植物乳杆菌TG‑95可抗胃肠液消化，对肠上皮细胞具备高粘附性；具有较高SOD酶活性和GSH‑Px酶活性，可高效清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子，抑制脂质过氧化，可用于制备抗氧化应激方面的功能食品。

Description

一种抗氧化应激植物乳杆菌TG-95及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种抗氧化应激植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）TG-95，还涉及植物乳杆菌TG-95的用途。
背景技术
1956年Denham Harman等基于自由基和放射化学首次提出针对机体成长、衰退、死亡现象的衰老理论学说；1990年Rajindar Sohal指出了自由基衰老理论学说存在的缺陷，首先提出了氧化应激的概念和基于氧化应激的衰老理论学说。
目前，氧化应激及其导致的氧化损伤现象，已成为备受关注的机体病变重要原因之一。机体抗氧化系统的内源性调节仅能在一定范围内清除导致氧化应激现象的自由基、活性氮、活性氧等，因此，补充外源性抗氧化剂缓解氧化应激状态的研究应用已成为重点攻关方向。
乳酸菌是一类革兰氏阳性、可发酵碳水化合物并且产生大量乳酸的细菌总称，其发酵食品在全球各地食用历史悠久，同时也是公认安全（GRAS）的食用菌种。
乳酸菌在抗氧化应激方面的研究发现为解决这一问题提供了新的途径。乳酸菌针对机体的抗氧化应激作用已知途径：通过自身的抗氧化酶系统；形成具有还原活性或调节氧化应激的大分子或小分子代谢物；通过代谢产物转导细胞信号的方式调节氧化还原平衡调节因子的表达水平；调节肠道菌群抑制氧化应激状态的形成。
因此，本发明在制备抗氧化应激、抗衰老功能性食品方面具有广泛的应用前景。
发明内容
要解决的技术问题：本发明的目的是提供一种具备抗氧化应激功能的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）TG-95。本发明的另一个目的是提供所述植物乳杆菌TG-95的用途。
技术方案：本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明第一方面涉及一种具有抗氧化应激功能的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）TG-95，该菌株已于2018年11月22日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.16772。
本发明所述的抗氧化应激植物乳杆菌 TG-95筛选过程如下。
（1）抗过氧化氢乳酸菌的分离和筛选：采用常规方法从西藏那曲牧区分离出119株乳酸菌，利用含0.3% ~ 0.9%过氧化氢梯度胁迫培养的方法对它们进行了高耐受过氧化氢菌株的筛选。结果表明：9株乳酸菌可耐受0.3%过氧化氢，分别标记为TG-09、TG-11、TG-12、TG-31、TG-44、TG-62、TG-68、TG-70、TG-112；2株乳酸菌可耐受0.6%过氧化氢，分别标记为TG-26、TG-83；1株乳酸菌可耐受0.9%过氧化氢，标记为TG-95。这些菌株均保藏于江苏恒康生物科技有限公司菌种保藏中心。
（2）清除DPPH∙自由基乳酸菌的初筛：将步骤（1）中的12株高耐受过氧化氢菌株采用乳酸菌常规培养基和常规方法活化三代，利用同体积无菌超纯水离心（4 ℃，4000 r/min，6min）洗涤两次后，重悬成菌悬液。利用常规方法进行清除DPPH∙自由基筛选。结果表明：12株菌株中TG-95、TG-112、TG-12、TG-26、TG-68对0.4mmol/L DPPH∙清除率最高，分别为94.26%±0.12%、91.26%±0.23%、82.26%±0.09%、72.36%±0.36%、69.65%±0.39%。
（3）耐酸、耐胆盐乳酸菌的筛选：将步骤（2）中的5株高效清除DPPH∙自由基乳酸菌，采用乳酸菌常规培养基和常规方法活化三代，利用同体积无菌生理盐水离心（4 ℃，4000r/min，6min）洗涤两次后，重悬成菌悬液。吸取1 mL菌悬液于9 mL pH 1.5、2.0、2.5、6.8的MRS肉汤培养基中，37℃水浴摇床（150r/min）处理2 h，并于0、2 h采用GB 4789.35-2016进行活菌计数，进行耐酸性筛选；吸取1 mL菌悬液于9 mL含0、0.3%、0.6%、0.9%胆盐的MRS肉汤培养基（pH7.6）中，37℃水浴静置处理2 h，并于0、2 h采用GB 4789.35-2016进行活菌计数。结果表明：菌株TG-95经pH 2.0 酸处理2h存活率高达91.40% ± 0.9%，活菌数维持在1.95×108CFU/mL（附图1）；经0.9%的胆盐处理2h，存活率为80.15% ± 1.6%以上，活菌数维持在1.86×107CFU/mL（附图2）。
（4）菌株 TG-95的生理生化特性和基因序列分析：根据《Berger's Handbook ofSystemic Bacteriology》第九版进行菌株 TG-95单细胞形态观察、单菌落形态观察和生理生化特征分析；采用常规方法进行16S rDNA序列分析。结果表明：菌株 TG-95的单菌落形态见附图3、单细胞形态见附图4、生理生化特征见附图5、基于16S rDNA基因片段的系统发育树见附图6，可将菌株 TG-95分类为植物乳杆菌 TG-95。
（5）植物乳杆菌TG-95 益生特性评价。
A 模拟胃肠道环境对植物乳杆菌TG-95存活的影响。
采用乳酸菌常规培养基和常规方法将植物乳杆菌TG-95活化三代，利用同体积无菌生理盐水离心（4 ℃，4000 r/min，6min）洗涤两次后，重悬成菌悬液。以10%（体积计）的比例将其与胃液混合后37℃水浴摇床（150r/min）2h，处理前后的菌悬液采用GB 4789.35-2016进行活菌计数；另将胃液处理2h的菌悬液以10%（体积计）的比例与肠液混合37℃水浴摇床（150r/min）3h，处理前后采用GB 4789.35-2016进行活菌计数，将计数结果进行存活率计算，分析菌株对胃肠液的耐受性。结果表明：植物乳杆菌TG-95经胃液处理2h后，存活率高达97.74% ± 1.1%；经肠液继续处理3h后，存活率仍高达79.65% ± 2.1%，活菌数维持在5.64×107CFU/mL，具备较强的耐受能力（附图7）。
在本发明中，胃液配方为：0.2% NaCl、浓盐酸调pH至2.5后加入1%胃蛋白酶（2500U/mg），滤菌（0.22μm滤菌器，下同）；肠液配方为：胰液与胆液以2：1的比例混合。所述胰液配方为：0.68%KH2PO4、利用5mol/L的NaOH调pH至7.6后加入1%胰蛋白酶（2500U/mg），滤菌；所述胆液配方为：1.8%胆盐，利用5mol/L的NaOH调pH至7.6，滤菌。
B 植物乳杆菌TG-95对Caco-2细胞的粘附作用。
采用乳酸菌常规培养基和常规方法将植物乳杆菌TG-95活化三代，利用同体积无菌生理盐水离心（4 ℃，4000 r/min，6min）洗涤两次后，重悬成108 CFU / mL菌悬液；将Caco-2细胞以105细胞/孔的浓度从培养瓶传代接种至12孔板中，每24h更换一次孔中培养液，待细胞贴壁完全后，继续培养至极化状态；利用无菌PBS洗涤两次孔板中单层Caco-2细胞后，向每个孔中加入500μL浓度为108 CFU / mL（b）的植物乳杆菌TG-95，置于5% CO2培养箱中，37℃培养2h；用无菌PBS溶液洗涤每孔中的单层细胞3次；向每个孔中加入250μL0.25%胰蛋白酶-EDTA孵育10 min；再加入250 μL血清终止消化；收集每个孔内溶液采用GB4789.35-2016进行活菌计数（a）。根据粘附前植物乳杆菌 TG-95的活菌数b和粘附后活菌数a的比值进行粘附率的计算。结果表明：植物乳杆菌 TG-95 对Caco-2细胞的粘附率为42%±1.2%。
在本发明中Caco-2为人体结肠腺癌细胞系Caco-2细胞株，乳酸菌在胃肠道中的粘附是其发挥益生作用的重要前提条件，Caco-2细胞作为肠上皮细胞系典型表型之一，常用来体外评价益生菌的肠道粘附作用。
（6）植物乳杆菌 TG-95的抗氧化应激特性：采用乳酸菌常规培养基和常规方法将植物乳杆菌TG-95活化三代，利用同体积无菌超纯水离心（4 ℃，4000 r/min，6min）洗涤两次后，重悬成107CFU / mL菌悬液；利用超声波破碎仪（300w，2s/2s，20min）冰浴处理，经显微镜检查无完整细胞后离心（4℃，12000r/min，10min）取上清液，即为无菌提取物。将植物乳杆菌 TG-95 菌悬液和无细胞提取物进行清除羟自由基作用、清除超氧阴离子作用、抗脂质过氧化作用、 超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性评价。结果表明：植物乳杆菌 TG-95的菌悬液和无细胞提取物均有一定的抗氧化应激作用，说明其活、死细胞在产品应用中均可起到较好的抗氧化应激作用。具体表现为：植物乳杆菌 TG-95无细胞提取物对羟自由基清除率为86.27% ± 2.24%，其菌悬液对超氧阴离子清除率和抑制脂质过氧化率分别为57.56% ± 1.23%、85.39% ± 0.46%；此外，其SOD酶活性和GSH-Px酶活性分别高达562.36 ± 2.36（U/mg）、465.38 ±3.58（U/mg）（附图8）。
本发明第二方面涉及一种植物乳杆菌TG-95菌制剂，该制剂是通过将上述植物乳杆菌 TG-95（CGMCC No.16772）扩大培养实现的。
本发明所述的植物乳杆菌 TG-95扩大培养方法可以参照现有技术中植物乳杆菌的扩大培养方法，均能很好的扩大培养本发明的植物乳杆菌 TG-95。
本发明第三方面还涉及所述的植物乳杆菌TG-95、植物乳杆菌TG-95菌制剂在制备食品中的用途。
作为优选，所述食品为益生菌产品或乳制品或饮料，作为优选，所述食品包括植物乳杆菌粉剂、植物乳杆菌片剂、植物乳杆菌胶囊、植物乳杆菌微胶囊、植物乳杆菌滴剂、植物乳杆菌颗粒剂、植物乳杆菌饮料、植物乳杆菌乳制品、植物乳杆菌糖果、植物乳杆菌巧克力、植物乳杆菌果冻、植物乳杆菌冰棒。
本发明所述的含有植物乳杆菌TG-95的粉剂、片剂、胶囊、微胶囊、滴剂、颗粒剂、糖果、巧克力、果冻、冰棒是通过将植物乳杆菌TG-95或其菌制剂按照本领域常规的方法，以常规的比例与常规的辅料制成；所述的植物乳杆菌 TG-95饮料、乳制品，可将植物乳杆菌或其菌制剂直接添加再按照本领域常规的方法，以常规的比例与常规的原料制成。
本发明所述制成的食品，其特征在于：所述食品的有效成分为植物乳杆菌 TG-95或植物乳杆菌 TG-95菌制剂；所述食品功能性为抗氧化应激功能。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，并不构成对本发明的限制，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容进行实施，以下以本发明的优选实施例并配以附图详细说明如后。
有益效果：本发明提供了一种植物乳杆菌TG-95和植物乳杆菌TG-95菌制剂，可广泛用于益生菌产品、乳制品和发酵饮料。本发明生产的益生菌产品、乳制品和发酵饮料可高效清除自由基等，有效缓解机体的氧化应激现象。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1为植物乳杆菌 TG-95经酸处理2h活菌数评价。
图2为植物乳杆菌 TG-95耐胆盐评价。
图3为植物乳杆菌 TG-95单菌落形态（×2倍）。
图4为植物乳杆菌 TG-95革兰氏染色单细胞形态（×1000倍）。
图5为菌株 TG-95生理生化特征。
图6为植物乳杆菌 TG-95的系统发育树。
图7为植物乳杆菌 TG-95模拟胃肠液处理存活。
图8为植物乳杆菌 TG-95抗氧化应激特性。
所述附图1、2中大写字母不同表示差异显著（p < 0.05）。
具体实施方式
通过下述实施例将能够更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
百分含量如无特别说明均为质量百分含量。
实施例1：植物乳杆菌TG-95的分离、筛选和鉴定。
（1）抗过氧化氢乳酸菌的分离和筛选：采用常规方法从西藏那曲牧区分离出119株乳酸菌，利用含0.3% ~ 0.9%过氧化氢梯度胁迫培养的方法对它们进行了高耐受过氧化氢菌株的筛选。结果表明：9株乳酸菌可耐受0.3%过氧化氢，分别标记为TG-09、TG-11、TG-12、TG-31、TG-44、TG-62、TG-68、TG-70、TG-112；2株乳酸菌可耐受0.6%过氧化氢，分别标记为TG-26、TG-83；1株乳酸菌可耐受0.9%过氧化氢，标记为TG-95。这些菌株均保藏于江苏恒康生物科技有限公司菌种保藏中心。
（2）清除DPPH∙自由基乳酸菌的筛选：将步骤（1）中的12株高耐受过氧化氢菌株采用乳酸菌常规培养基和常规方法活化三代，利用同体积无菌超纯水离心（4 ℃，4000 r/min，6min）洗涤两次后，重悬成菌悬液。吸取2mL菌悬液与1mL 0.4mmol/L DPPH∙溶液混合，室温遮光反应30min，离心取上清液（4℃，12000r/min，10min），利用分光光度计测量OD517nm值。1mL超纯水替代样品作为阴性对照组，用1mL无水乙醇代替DPPH∙无水乙醇溶液为空白组，1.5mL超纯水与同体积无水乙醇混合溶液调0，清除率按如下公式计算。
式中：Ai为样品组、Aj为空白组、A0为对照组。
结果表明：12株菌株中TG-95、TG-112、TG-12、TG-26、TG-68对0.4mmol/L DPPH∙清除率最高，分别为94.26%±0.12%、91.26%±0.23%、82.26%±0.09%、72.36%±0.36%、69.65%±0.39%。
（3）耐酸耐胆盐乳酸菌的筛选：将步骤（2）中的5株高效清除DPPH∙自由基乳酸菌，采用乳酸菌常规培养基和常规方法活化三代，利用同体积无菌生理盐水离心（4 ℃，4000r/min，6min）洗涤两次后，重悬成菌悬液。吸取1 mL菌悬液于9 mL pH 1.5、2.0、2.5、6.8的MRS肉汤培养基中，37℃水浴摇床（150r/min）处理2 h，并于0、2 h采用GB 4789.35-2016进行活菌计数，进行耐酸性筛选；吸取1 mL菌悬液于9 mL含0、0.3%、0.6%、0.9%胆盐的MRS肉汤培养基（pH7.6）中，37℃水浴摇床（150r/min）处理2 h，并于0、2 h采用GB 4789.35-2016进行活菌计数。
结果表明：菌株TG-95经pH 2.0 酸处理2h存活率高达91.40% ± 0.9%，活菌数维持在1.95×108CFU/mL（附图1）；经0.9%的胆盐处理2h，存活率为80.15% ± 1.6%以上，活菌数维持在1.86×107CFU/mL（附图2）。
（4）植物乳杆菌 TG-95的生理生化特性和基因序列分析：根据《Berger'sHandbook of Systemic Bacteriology》第九版进行菌株 TG-95单细胞形态、单菌落形态观察和生理生化特征分析。
所述基因序列分析：植物乳杆菌 TG-95的DNA提取参考天根生化科技(北京)有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书中步骤进行总DNA的提取；以F5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'、R5'－CCGTCAATTCCTTTGAGTTT3'为引物进行16S rDNA片段扩增，取5μL扩增后的产物，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，若1500 bp处有清晰的扩增条带，无非特异性产物，表明PCR扩增成功；委托生工生物工程（上海）股份有限公司对PCR扩增产物测序；测序结果利用DNAStar软件中的SeqMan双向拼接后，在GeneBank中利用BLAST进行同源性序列检索，选择Mega7.0中的邻接法（Neighbor-Joining）将同源性较高的菌株序列连同试验菌株序列进行1000次自展（Bootstrap）检验后，绘制系统发育树。
结果表明：菌株 TG-95的单菌落形态见附图3、单细胞形态见附图4、生理生化特征见附图5、基于16S rDNA基因片段的系统发育树见附图6，可将菌株 TG-95分类为植物乳杆菌 TG-95。
（5）植物乳杆菌TG-95益生特性。
A 模拟胃肠道环境对植物乳杆菌TG-95存活的影响：采用乳酸菌常规培养基和常规方法将植物乳杆菌TG-95活化三代，利用同体积无菌生理盐水离心（4 ℃，4000 r/min，6min）洗涤两次后，重悬成菌悬液。以10%（体积计）的比例将其与胃液混合后37℃水浴摇床（150r/min）2h，处理前后的菌悬液采用GB 4789.35-2016进行活菌计数；另将胃液处理2h的菌悬液以10%（体积计）的比例与肠液混合37℃水浴摇床（150r/min）3h，处理前后采用GB4789.35-2016进行活菌计数，将计数结果进行存活率计算，分析菌株对胃肠液的耐受性。
结果表明：植物乳杆菌TG-95经胃液处理2h后，存活率高达97.74% ± 1.1%；经肠液继续处理3h后，存活率仍高达79.65% ± 2.1%，活菌数维持在5.64×107CFU/mL,具备较强的耐受能力（附图7）。
在本发明中，胃液配方为：0.2% NaCl、浓盐酸调pH至2.5后加入1%胃蛋白酶（2500U/mg），滤菌（0.22μm滤菌器，下同）；肠液配方为：胰液与胆液以2：1的比例混合。所述胰液配方为：0.68%KH2PO4、利用5mol/L的NaOH调pH至7.6后加入1%胰蛋白酶（2500U/mg），滤菌；所述胆液配方为：1.8%胆盐，利用5mol/L的NaOH调pH至7.6，滤菌。
B 植物乳杆菌TG-95对Caco-2细胞的粘附作用：采用乳酸菌常规培养基和常规方法将植物乳杆菌TG-95活化三代，利用同体积无菌生理盐水离心（4 ℃，4000 r/min，6min）洗涤两次后，重悬成108 CFU / mL菌悬液；将Caco-2细胞以105细胞/孔的浓度从培养瓶传代接种至12孔板中，每24h更换一次孔中培养液，待细胞贴壁完全后，继续培养至极化状态；利用无菌PBS洗涤两次孔板中单层Caco-2细胞后，向每个孔中加入500μL浓度为108 CFU / mL（b）的植物乳杆菌TG-95，置于5% CO2培养箱中，37℃培养2h；用无菌PBS溶液洗涤每孔中的单层细胞3次；向每个孔中加入250μL 0.25%胰蛋白酶-EDTA孵育10 min；再加入250 μL血清终止消化；收集每个孔内溶液采用GB 4789.35-2016进行活菌计数（a）。根据粘附前植物乳杆菌 TG-95的活菌数b和粘附后活菌数a的比值进行粘附率的计算。
结果表明：植物乳杆菌 TG-95 对Caco-2细胞的粘附率为42%±1.2%。
在本发明中Caco-2为人体结肠腺癌细胞系Caco-2细胞株，乳酸菌在胃肠道中的粘附是其发挥益生作用的重要前提条件，Caco-2细胞作为肠上皮细胞系典型表型之一，常用来体外评价益生菌的肠道粘附作用。
（6）植物乳杆菌 TG-95的抗氧化应激特性：采用乳酸菌常规培养基和常规方法将植物乳杆菌TG-95活化三代，利用同体积无菌超纯水离心（4 ℃，4000 r/min，6min）洗涤两次后，重悬成107CFU / mL菌悬液；利用超声波破碎仪（300w，2s/2s，20min）冰浴处理，经显微镜检查无完整细胞后离心（4℃，12000r/min，10min）取上清液，即为无菌提取物。将植物乳杆菌 TG-95 菌悬液和无细胞提取物进行清除羟自由基作用、清除超氧阴离子作用、抗脂质过氧化作用、 超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性评价。
所述清除羟自由基实验方法：吸取2mL 细胞悬浮液（2mL无细胞提取物）、1mL5mmol/L 硫酸亚铁（FeSO4）溶液 、1mL 5mmol/L 水杨酸乙醇液 、1mL 3mmol/L 过氧化氢溶液混合后用蒸馏水补至10mL；利用水浴锅37℃水浴15min后由离心机离心取上清（12000r/min，10min），以蒸馏水调0，波长510nm处由分光光度计测OD值。用超纯水替代样品为阴性对照组，清除率按以下公式计算。
式中：Ax为样品组，A0为空白组。
所述清除超氧阴离子实验方法：取4.5 mL 0.05 mol / L的Tris-HCl缓冲液（pH=8.2），置于25 ℃中水浴20 min，分别加入2.3mL胞菌悬液（无细胞提取液），和2.2 mL 25mmol/L邻苯三酚溶液。混匀后于25℃水浴4 min后，加1 mL 10 mol / LHCL终止反应，12000r/min离心4 min取上清液，在波长320 nm处测量吸光度。用超纯水替代样品为阴性对照组，清除率按以下公式计算。
式中：Ax为样品组，A0为空白组。
所述抗脂质过氧化实验方法：将1 mL亚油酸乳化液和0.5mL PBS缓冲液（pH=7.2）、0.2 mL 0.01% FeS04、0.2 mL 0.01%抗坏血酸以及0.5mL菌悬液（无细胞提取液），混合均匀，使用PBS作为空白对照。50℃培养12h后，取2 mL混合液，加入0.2mL4%三氯乙酸、2 mL0.8%TBA以及0.2mL0.4%丁轻甲苯。上述反应液在100℃下培养3 0 min，冷却后加入2 mL三氯甲烷，12000 r/min离心4 min取上清液，在波长532 nm测定吸光度值。抑制脂质过氧化率按以下公式计算。
式中：A空为空白组吸光度，A样为样品组吸光度。
所述超氧化物歧化酶（SOD）活性测定参照北京百奥莱博科技有限公司以商品名总超氧化物歧化酶测定试剂盒销售的试剂盒中说明书进行。
所述谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性评价方法参照上海晶抗生物工程公司以商品名GSH-Px ELISA kit销售的试剂盒中说明书进行。
结果表明：植物乳杆菌 TG-95的菌悬液和无细胞提取物均有一定的抗氧化应激作用，说明其活、死细胞在产品应用中均可起到较好的抗氧化应激作用。具体表现为：植物乳杆菌 TG-95无细胞提取物对羟自由基清除率为86.27% ± 2.24%，其菌悬液对超氧阴离子清除率和抑制脂质过氧化率分别为57.56% ± 1.23%、85.39% ± 0.46%；此外，其SOD酶活性和GSH-Px酶活性分别高达562.36 ± 2.36（U/mL）、465.38 ±3.58（U/mL）（附图8）。
实施例2：植物乳杆菌TG-95菌制剂的制备方法。
（1）菌种活化：挑取一环甘油保存的植物乳杆菌 TG-95划线于MRS琼脂培养基，在37℃下培养48h；挑取单菌落接种于MRS肉汤培养基37℃下培养22h，得到第一代培养物；采用GB 4789.35-2016进行活菌数检测，第一代培养物含有1～3×109CFU/mL植物乳杆菌 TG-95活细胞。
（2）扩大培养：按照MRS肉汤培养基体积计2%接种量，将步骤（1）得到的第一代培养物接种于MRS肉汤培养基中，在37℃下培养22h，得到第二代培养物；采用GB 4789.35-2016进行活菌数检测，第二代培养物含有1～3×109CFU/mL植物乳杆菌 TG-95活细胞。
将第二代培养物以体积计2%接种量接种于大麦培养基中，在37℃下高密度发酵20h，得到第三代培养物；采用GB 4789.35-2016进行活菌数检测，第三代培养物含有7~9×109CFU/mL植物乳杆菌 TG-95活细胞。
所述大麦培养基配方为：0.48%柠檬酸钠溶于5~5.5Bo的大麦基质，pH6.8，115℃灭菌20min。
（3）离心分离：将步骤（2）得到的第三代培养物6000r/min下离心4min，弃去上清，得到的沉淀物用等量无菌生理盐水离心洗涤（6000r/min，4min）3次，洗涤得到的沉淀物为植物乳杆菌 TG-95菌泥。
（4）添加保护剂：把步骤（3）得到的植物乳杆菌 TG-95菌泥中添加保护剂，其中以克计菌泥与以毫升计保护剂的比为1：10，旋涡混匀。
所述保护剂配方为：10%脱脂乳、3%麦芽糊精。
（5）冷冻干燥：将步骤（4）得到的含有保护剂的菌泥装入冻存盘，在液氮中预冻3min，再将其迅速放入真空冷冻干燥机中，在温度-53℃与68×10-3 Mb的条件下干燥18h，铝箔袋真空包装，得到植物乳杆菌 TG-95菌制剂。根据国家标准GB 4789.35-2016进行活菌数检测，该菌制剂中含有1~3×1010CFU/g的植物乳杆菌 TG-95活细胞。
实施例3：植物乳杆菌TG-95及其菌制剂在益生产品中的应用。
（1）植物乳杆菌 TG-95粉剂。
所述植物乳杆菌TG-95粉剂配方为：植物乳杆菌 TG-95菌制剂70%、低聚木糖9%、低聚异麦芽糖7%、木糖醇3%、抗性糊精5%、香蕉粉7%。
所述植物乳杆菌TG-95粉剂制备方法为：将低聚木糖、低聚异麦芽糖、木糖醇、抗性糊精、香蕉粉分别粉碎后过80目筛，按配方比例干混机中混合均匀（200r/min，30min），得到预混物1；在预混物1中加入配方比例植物乳杆菌 TG-95菌制剂，干混机中混合均匀（200r/min，60min）；样品分装；经质检合格后入库。
根据国家标准GB 4789.35-2016进行活菌数检测，该植物乳杆菌 TG-95粉剂中含有3~5×109CFU/g的植物乳杆菌 TG-95活细胞。
（2）植物乳杆菌 TG-95片剂。
所述植物乳杆菌TG-95片剂配方为：植物乳杆菌 TG-95菌制剂59%、低聚果糖5%、低聚异麦芽糖20%份以及低聚木糖5%、低聚半乳糖10%、硬脂酸镁1%。
所述植物乳杆菌TG-95片剂制备方法为：将上述原材料筛分至80目以下，然后按照配方比例进行称量；将称量物干混机中混合均匀（200r/min，60min）；将混合好后的各原料置于压片机（5KN）上进行压片制剂；将压片成型的植物乳杆菌 TG-95片剂装瓶封口，经质检合格后入库。
根据国家标准GB 4789.35-2016进行活菌数检测，该植物乳杆菌 TG-95片剂中含有1~3×109CFU/g的植物乳杆菌 TG-95活细胞。
（3）植物乳杆菌 TG-95颗粒剂。
所述植物乳杆菌TG-95颗粒剂配方为：植物乳杆菌 TG-95、海藻酸钠2%、海藻糖3%、抗性糊精5%、低聚半乳糖3%。
所述植物乳杆菌TG-95颗粒剂制备方法为：根据配方比例将植物乳杆菌TG-95 菌泥与海藻糖、抗性糊精、低聚半乳糖配制为乳化液；将海藻糖45℃溶胀1h后配制为胶体液；将乳化液和胶体液混合均匀后，缓慢加入0.5mol/L氯化钙溶液中硬化，并进行高速剪切搅拌，得到菌体混合物；将菌体混合物在液氮中预冻3min，利用真空冷冻干燥机在温度-53℃与68×10-3 Mb的条件下干燥18h，使用粉碎整粒机将其进行粉碎整粒得到30~60目颗粒剂；产品分装后经质检合格后入库。
根据国家标准GB 4789.35-2016进行活菌数检测，该植物乳杆菌 TG-95颗粒剂中含有1~3×109CFU/g的植物乳杆菌 TG-95活细胞。
（4）植物乳杆菌 TG-95微胶囊。
所述植物乳杆菌TG-95微胶囊配方为：植物乳杆菌 TG-95、海藻糖1%、海藻酸钠2%、低聚木糖3%、壳聚糖1%。
所述植物乳杆菌TG-95微胶囊制备方法为：根据配方比例将植物乳杆菌TG-95 菌泥与海藻糖、低聚木糖混为乳化液；将海藻酸钠45℃溶胀1h后配制为胶体液；将乳化液和胶体液混合均匀后，缓慢加入0.5mol/L氯化钙溶液中硬化，并进行高速剪切搅拌，得到微囊颗粒；将微囊颗粒加入1%壳聚糖溶液中进行二次包埋；离心收集多层包埋的微胶囊；将菌体混合物在液氮中预冻3min，利用真空冷冻干燥机在温度-53℃与68×10-3 Mb的条件下干燥18h；产品分装后经质检合格后入库。
根据国家标准GB 4789.35-2016进行活菌数检测，该植物乳杆菌 TG-95微胶囊中含有1~3×1010CFU/g的植物乳杆菌 TG-95活细胞。
（5）植物乳杆菌 TG-95滴剂。
所述植物乳杆菌TG-95滴剂配方为：植物乳杆菌 TG-95、葵花籽油70%、辛癸酸甘油酯20%。
所述植物乳杆菌TG-95滴剂制备方法为：按配方比例将植物乳杆菌 TG-95菌泥与辛癸酸甘油酯搅拌分散（600r/min，30min）；按配方比例缓慢加入葵花籽油，边加边搅拌（400r/min，30min）直至辛癸酸酯、葵花籽油和菌体全面均匀分散混合；灌装后，经质检合格后入库。
根据国家标准GB 4789.35-2016进行活菌数检测，该植物乳杆菌 TG-95滴剂中含有1~3×109CFU/mL的植物乳杆菌 TG-95活细胞。
（6）植物乳杆菌 TG-95胶囊。
将植物乳杆菌 TG-95粉剂或者植物乳杆菌 TG-95颗粒剂或植物乳杆菌 TG-95滴剂 ，经胶囊机制作成为胶囊产品。该胶囊可进一步保障产品运输储运的稳定性和提高抗消化能力，同时，也可提高服用的便捷性。
实施例4：植物乳杆菌TG-95在冰淇淋中的应用。
在生鲜乳加入蔗糖12%、奶油6%、黄原胶0 .4%、单甘脂0 .3%搅拌均匀；90℃杀菌15min，然后迅速冷却至37℃；以5%比例接入植物乳杆菌 TG-95或其菌制剂，于37℃条件下发酵8h，冷却至5℃；所得发酵乳液置于均质机中20-30Mpa下进行均质后，迅速冷却至10℃；将均质乳液冷却至3℃进行6h老化；所得老化乳液在280r/min条件下搅拌23min，然后在-3℃的条件下进行凝冻；将凝冻后的冰淇淋装入指定的容器中成型；将成型后的酸奶冰淇淋迅速送入-32℃的冷库中放置6h，以加速硬化；经质检合格后，移入-18℃以下的冷库中冷藏。
根据国家标准GB 4789.35-2016进行活菌数检测，该植物乳杆菌 TG-95冰淇淋中含有1~3×107CFU/mL的植物乳杆菌 TG-95活细胞。
实施例5：植物乳杆菌TG-95在大麦发酵饮料中的应用。
（1）将5~6 Bo大麦汁加入已空消的发酵罐，进行100℃，90min的除菌处理；（2）将0.48%柠檬酸钠、7.36%异麦芽酮糖醇、山梨酸钾0.005%配制好后，经121℃、20min杀菌；加入（1）中发酵罐；（3）将0 .2％海藻酸钠加入50倍的40~50℃温水，混合均匀后，溶胀30min，先加入60％的水待水温升到40℃左右，依次添加海藻酸钠混合液、0 .05％羧甲基纤维素钠和0 .05％的瓜尔豆胶，混合均匀后，利用无菌水定容，115℃、20min杀菌后激冷；（4）将（2）中料液和（3）中胶液混合均匀；（5）待发酵罐内温度降至40℃以下，以2‰比例接入植物乳杆菌TG-95或其菌制剂；（6）发酵温度为37±0.5℃，当pH达到4.0±0.1时，终止发酵；（7）混入0.22μm过滤除菌的三氯蔗糖和食用香精；（8）质检合格后，灌装入库。
根据国家标准GB 4789.35-2016进行活菌数检测，该植物乳杆菌 TG-95大麦饮料中含有2~5×108CFU/mL的植物乳杆菌 TG-95活细胞。
实施例6：植物乳杆菌 TG-95在巧克力中的应用。
称取70% ~ 75%可可块经高温融化后，加入35% ~ 38%白砂糖粉，混合均匀后，制得巧克力匀浆；将上述巧克力匀浆，置于45 ~ 60 ℃的温度环境下，精炼75h；精炼完成的巧克力匀浆，待冷却至45℃，将实施例3中的植物乳杆菌 TG-95滴剂以5%比例添加入巧克力匀浆中，混匀；第一阶段冷却：40℃至29℃；第二阶段冷却：29℃至27℃；第三阶段回温：从27℃回升至30℃；灌入模具，置于8 ~10℃环境下冷却30min；脱模，质检合格后，包装入库。
根据国家标准GB 4789.35-2016进行活菌数检测，该植物乳杆菌 TG-95巧克力中含有2~5×107CFU/mL的植物乳杆菌 TG-95活细胞。
序列表
<110> 江苏恒康生物科技有限公司
<120> 一种抗氧化应激植物乳杆菌TG-95及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1303
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌 TG-95(Lactobacillus plantarumTG-95)
<400> 2
aaacagatgc taataccgca taacaacttg gaccgcatgg tccgagcttg aaagatggct 60
tcggctatca cttttggatg gtcccgcggc gtattagcta gatggtgggg taacggctca 120
ccatggcaat gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg ccacattggg actgagacac 180
ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg aaagtctgat 240
ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta aaactctgtt gttaaagaag 300
aacatatctg agagtaactg ttcaggtatt gacggtattt aaccagaaag ccacggctaa 360
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg 420
taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctc aaccgaagaa 480
gtgcatcgga aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg 540
gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct ggtctgtaac 600
tgacgctgag gctcgaaagt atgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccatac 660
cgtaaacgat gaatgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca 720
ttaagcattc cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 780
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac cttaccaggt 840
cttgacatac tatgcaaatc taagagatta gacgttccct tcggggacat ggatacaggt 900
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 960
aacccttatt atcagttgcc agcattaagt tgggcactct ggtgagactg ccggtgacaa 1020
accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1080
gtgctacaat ggatggtaca acgagttgcg aactcgcgag agtaagctaa tctcttaaag 1140
ccattctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagtcggaa tcgctagtaa 1200
tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1260
ccatgagagt ttgtaacacc caaagtcggt ggggtaacct tta 1303

Claims (6)

1.一种具有抗氧化应激功能的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）TG-95、植物乳杆菌 TG-95菌制剂及其用途，该菌株已于2018年11月22日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.16772。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌 TG-95其特征在于：作为一种优选方式，植物乳杆菌TG-95经胃、肠液连续处理5h后，存活率高达79.65% ± 2.1%，活菌数维持在5.64×107CFU/mL；其对Caco-2肠上皮细胞的粘附率为42% ± 1.2%；其可耐受0.9%过氧化氢胁迫；对DPPH∙清除率为94.26% ± 0.12%、对羟自由基清除率为86.27% ± 2.24%、对超氧阴离子清除率为57.56% ± 1.23%、抑制脂质过氧化率为85.39% ± 0.46%；此外，其SOD酶活性和GSH-Px酶活性分别高达562.36 ± 2.36（U/mL）、465.38 ±3.58（U/mL）。
3.根据权利要求1所述的具有抗氧化应激功能的植物乳杆菌 TG-95的菌制剂，其特征在于：该菌制剂是通过将植物乳杆菌 TG-95扩大培养实现的。
4.根据权利要求1所述的植物乳杆菌 TG-95或权利要求3所述的植物乳杆菌 TG-95菌制剂在制备食品中的用途。
5.根据权利要求4所述的食品，其特征在于：所述食品为益生菌产品或乳制品或饮料，作为优选，所述食品包括植物乳杆菌粉剂、植物乳杆菌片剂、植物乳杆菌胶囊、植物乳杆菌微胶囊、植物乳杆菌滴剂、植物乳杆菌颗粒剂、植物乳杆菌饮料、植物乳杆菌乳制品、植物乳杆菌糖果、植物乳杆菌巧克力、植物乳杆菌果冻、植物乳杆菌冰棒。
6.根据权利要求5所述的食品，其特征在于：所述食品的有效成分为权利要求1所述的植物乳杆菌 TG-95或权利要求3所述的植物乳杆菌 TG-95菌制剂；所述食品功能性为抗氧化应激功能。
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