CN115261262B - 一株植物乳杆菌hsf-lab-1303及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)HSF‑LAB‑1303及其用途。该植物乳杆菌HSF‑LAB‑1303用于螺旋藻发酵时，该发酵步骤包括菌种活化、种子培养、扩大培养与螺旋藻发酵等步骤。利用植物乳杆菌HSF‑LAB‑1303菌株制得的螺旋藻发酵产物的DPPH自由基清除率为98.7％以上、羟基自由基清除率为92.4％以上、超氧阴离子清除率为33.5％以上、总还原力82.5％以上与亚铁离子螯合率51.2％以上，因此，本发明为后续开发利用螺旋藻及螺旋藻的加工处理奠定了扎实基础。

Description

一株植物乳杆菌HSF-LAB-1303及其用途
【技术领域】
本发明属于天然食品发酵技术领域。更具体地，本发明涉及一种植物 乳杆菌(Lactobacillusplantarum)HSF-LAB-1303，还涉及所述植物乳杆菌 HSF-LAB-1303的用途。
【背景技术】
螺旋藻(Spirulinaplatensis)一种多细胞丝状蓝藻，其营养丰富，蛋白含 量高达60％，其中藻蓝素是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全， 人体必需氨基酸含量高，占氨基酸总量的37.42％；类胡萝卜素含量可达 4.43mg/g。此外，它还含有藻多糖、SOD酶、多种维生素、矿物质、多种 脂肪酸等物质。它非常适合人体每天补充对营养物质的需求。一些研究结 果表明，长期服用螺旋藻不仅能够提高免疫力，增强机体的抗氧化能力， 而且还不会产生任何副作用。螺旋藻能抗辐射损伤、抗肿瘤、抗菌，降低 血清胆固醇、提高铁的生物有效性和调理贫血症，其生物活性物质在提高 人体免疫力、提高运动能力、促进机体新陈代谢、抗衰老等多方面都有重 要作用。因此，螺旋藻是一种极具应用潜力的食品原料。
乳酸菌在消化方面起到重要作用，同样乳酸菌也具有一定的抗氧化能 力。因此，利用乳酸菌进行植物基发酵研究越来越多。一些研究结果表明， 发酵螺旋藻和未发酵螺旋藻均具有抗氧化和抗炎作用，且发酵后效果更好。 因此，利用乳酸菌进行螺旋藻发酵的研究是一个热点。目前，螺旋藻发酵 方式包括：1)螺旋藻多种乳酸菌混合发酵，未比较不同菌种之间的差异； 2)螺旋藻单菌乳酸菌发酵，未开展发酵后功效性成分和活性物质的研究；3)已知螺旋藻单菌乳酸菌发酵，并研究活性成分的变化，比较抗氧化活性 等，未得到能显著提高螺旋藻抗氧化活性的乳酸菌，具体参见文献：刘云 鹏，论文题目“螺旋藻乳酸菌发酵工艺优化及发酵产物抗衰老作用的研究”， 山东师范大学，2021年。
针对现有技术存在的技术缺陷，本发明人在总结现有技术基础之上， 通过大量实验研究与分析总结，终于完成了本发明。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) HSF-LAB-1303。
本发明的另一个目的是提供所述植物乳杆菌HSF-LAB-1303的用途。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)HSF-LAB-1303， 该菌株已于2022年05月09日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 其保藏号为CGMCCNo.24866。
本发明还涉及所述的植物乳杆菌HSF-LAB-1303在螺旋藻发酵中用途。
根据本发明的一种优选实施方式，该螺旋藻发酵的步骤如下：
A、菌种活化
保存植物乳杆菌HSF-LAB-1303菌株用灭菌生理盐水稀释，再涂布在 MRS培养基平板上，在恒温震荡摇床中在温度37℃下培养1.5天，生长出 表面光滑、凸起、边缘整齐、直径2.9～3.1mm的乳白色单菌落；
B、种子培养
使用接种环挑取步骤A得到的一个单菌落，接种于50ml灭菌的MRS 肉汤培养基中，在恒温震荡摇床中在温度36℃与转速120r/min的条件下培 养24h，然后使用紫外分光光度计测定在波长600nm处的OD值为3.52时 就得到种子培养液；
C、扩大培养
按照以毫升计种子培养液与以毫升计MRS肉汤培养基的比1：10，将 种子培养液接种到MRS肉汤培养基中，在恒温震荡摇床中在温度36℃与转 速120r/min的条件下培养24h，然后使用紫外分光光度计测定在波长600nm 处的OD值为3.52时就得到扩大种子培养液；
D、螺旋藻发酵
按照以克计螺旋藻与以毫升计蒸馏水的比1：5，把螺旋藻加到蒸馏水 中配制成螺旋藻发酵培养基，然后按照以克计螺旋藻与以毫升计扩大种子 培养液的比2:1，再加入扩大种子培养液，在恒温震荡摇床中在温度36℃与 转速120r/min的条件下培养5天，得到螺旋藻发酵液。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A中，保存植物乳杆菌 HSF-LAB-1303菌株与灭菌生理盐水的体积比1:100000。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A中，MRS培养基平板制 备方法如下：
把200ml MRS培养基装到500ml锥形瓶中，使用立式蒸汽压力灭菌锅 在温度121℃下灭菌15min，灭菌培养基与一次性培养皿放到超净工作台中 进行紫外灭菌25min，待MRS培养基温度降低到40℃时倒入培养皿中，冷 却至室温，得到MRS培养基平板。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，在250ml锥形瓶中 的MRS肉汤培养基在立式蒸汽压力灭菌锅中在温度121℃下灭菌15min， 得到灭菌的MRS肉汤培养基。
根据本发明的另一种优选实施方式，恒温震荡摇床是HZC-250、 HZQ-F160、HZQ-X100或THZ-22型恒温震荡摇床。
根据本发明的另一种优选实施方式，紫外分光光度计是UV2100、 UV2600A、UV2600、或UV2802型紫外分光光度计。
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，得到的螺旋藻发酵 液在菌种保藏真空冷冻干燥机中在温度-80℃下进行冻干处理，得到螺旋藻 发酵产物。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述螺旋藻发酵产物的DPPH自 由基清除率为97.7％以上、羟基自由基清除率为92.4％以上、超氧阴离子清 除率为33.5％以上、总还原力82.5％以上与亚铁离子螯合率51.2％以上。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)HSF-LAB-1303， 该菌株已于2022年05月09日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 其保藏号为CGMCC No.24866。
本发明的植物乳杆菌HSF-LAB-1303是从四川成都、陕西西安等六个 不同地区农家自然发酵泡菜缸中分离得到的。
它是按照下述方法筛选得到的：
A、泡菜母液中乳酸菌的分离纯化
泡菜母液采自四川成都、陕西西安等六个不同地区农家自然发酵泡菜 缸中，泡菜缸中的泡菜母液搅拌混合均匀，移取100ml泡菜母液，装在透 明塑料瓶中在冰箱中在温度4℃下保存，用于菌株分离纯化。
根据本发明，稀释涂布与平板划线所使用的培养基是乳酸菌特异培养 基MRS培养基，该MRS培养基组成列于表1中。
表1：MRS培养基组成，g·L-1
Figure BDA0003716668820000041
泡菜母液使用灭菌生理盐水稀释液按照泡菜母液与稀释液的体积比分 别为1：10、1：100与1：1000进行稀释，采用三区或四区方式划线。选 用的菌株在培养箱在培养温度35～37℃的条件下进行发酵培养2～3d。
本发明使用的培养皿、培养箱、显微镜与染色剂等试剂都是本技术领 域里通常使用的设备与试剂。
B、高抗氧化活性植物乳杆菌筛选
对采集的泡菜母液样品采用平板划线纯化方法在培养箱中在温度37℃ 的条件下分离得到63个状态不一的单菌落，根据培养终期菌落的颜色和状 态等观察，除去部分长势不佳，颜色较深的菌落，重点考察了27种性质优 良的菌株，这些菌株列于表2中。
表2：27株优良菌株来源及其菌落形态
Figure BDA0003716668820000051
Figure BDA0003716668820000061
对纯化的单菌落再次涂布培养，并进行革兰氏染色和过氧化氢耐受性 实验，鉴定革兰氏染色呈阳性、过氧化氢耐受性试验为阴性，即得到植物 乳杆菌。
A、革兰氏染色试验
该试验步骤如下：
试验试剂：结晶紫染液、番红染液、碘液、95％酒精、蒸馏水；
试验步骤如下：
将涂片固定，然后使用结晶紫染色进行初染1分钟，使用蒸馏水冲洗 去掉浮色；
然后，使用碘液覆盖涂面染色约1分钟(媒染)，使用蒸馏水洗去浮色， 再用吸水纸吸去水分；
接着，滴加3～8滴浓度为以体积计95％酒精溶液，并轻轻摇动进行脱 色20秒，再使用蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去水分；
再滴加两滴番红染色液染色1分钟，蒸馏水冲洗除去浮色，在酒精灯 上干燥，使用光学显微镜在100目oil镜下进行镜检。
试验结果判断：蓝紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌。
该试验共筛选出17株植物乳杆菌，筛选结果列于下表3中。
B、过氧化氢耐受性试验
该试验的试验步骤如下：
试验试剂：浓度为以重量计3％过氧化氢溶液。
试验方法：使用接种环挑取一环在固体培养基上的菌落，将它置于洁 净试管内，滴加2mL浓度为以重量计3％过氧化氢溶液，观察结果。
试验结果：在半分钟内发生气泡者确定为阳性，不发生气泡者确定为 阴性。试验结果列于下表3中。
表3：革兰氏染色和过氧化氢耐受性试验结果
Figure BDA0003716668820000071
Figure BDA0003716668820000081
表中：+代表阳性，-代表阴性
革兰氏染色为阳性，而过氧化氢耐受性为阴性的菌株确定为是植物乳 杆菌，否则不是植物乳杆菌，表3的结果表明，HSF-LAB-1101、 HSF-LAB-1103、HSF-LAB-1104、HSF-LAB-1201、HSF-LAB-1204、 HSF-LAB-1205、HSF-LAB-1301、HSF-LAB-1302、HSF-LAB-1303、 HSF-LAB-2102、HSF-LAB-2103、HSF-LAB-2105、HSF-LAB-2201、 HSF-LAB-2203、HSF-LAB-2104、HSF-LAB-2302、HSF-LAB-2304是植物 乳杆菌株。
C、高抗氧化活性植物乳杆菌筛选
前面得到的十七个植物乳杆菌分别使用MRS培养基在温度37℃的条 件下进行培养1.5d。
采用微生物总蛋白提取试剂盒(
Figure BDA0003716668820000082
Microbial Protein Kit)说明 书描述的方法，从生长的菌落中提取乳酸菌总蛋白，它含有待检测的酶。
使用购自碧云天生物的BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCAProteinAssay Kit)测定蛋白浓度，并使用蛋白裂解液将各乳酸菌蛋白提取液蛋白浓度都 调整为500μg/ml。
与抗氧化相关的酶包括SOD、CAT与GSH-Px。使用微生物ELISA试 剂盒(购自江莱生物公司)精准测定每种乳酸菌提取液的这些酶含量及 T-AOC。每种酶活平行测定三组，并对测定结果进行相关性分析，最终筛 选出抗氧化能力较高的乳酸菌菌株。
在本发明中，使用96孔板制样，使用美国Thermo Scientific公司的全 波长酶标仪Multiscan Go进行测定。
在本发明中，得到的ELISA测定结果以三次平均值作为测定值，采用 吸光度值标准曲线计算蛋白样品中各自指标的含量。这些结果制成柱状图， 其结果参见附图1与表4。在附图1与表4中，菌株名省去了其中的 HSF-LAB，只是使用菌株名中的数字代表该菌株。
表4：抗氧化能力分析结果
Figure BDA0003716668820000091
由附图1与表4列出的结果可以确定，抗氧化能力较强的8株植物乳 杆菌分别是HSF-LAB-1101、HSF-LAB-1204、HSF-LAB-1301、 HSF-LAB-1303、HSF-LAB-2102、HSF-LAB-2105、HSF-LAB-2204与 HSF-LAB-2304。
D、发酵螺旋藻并显著提高螺旋藻抗氧化性植物乳杆菌筛选
前面筛选得到的植物乳杆菌进行螺旋藻发酵实验。
在培养箱中，让所述的植物乳杆菌在常规的MRS肉汤培养基在温度 35～37℃的条件下进行种子培养22～26h，得到植物乳杆菌种子培养液。
根据本发明，种子液培养时间为22～26h时植物乳杆菌种长势最佳， 在波长600nm处测定的OD值是3～4，而种子液培养时间短于22h或长于 26h时的OD值均有所下降。因此，种子液培养时间22～26h是适当的，优 选地是23～24h；
螺旋藻培养基配制与灭菌：将50ml蒸馏水加到250ml锥形瓶中，接着 置于高压蒸汽灭菌锅中在温度121℃下灭菌15min，冷却至室温，在超净工 作台中，将10g螺旋藻加入到灭菌的蒸馏水中，得到螺旋藻培养基；
按照植物乳杆菌种子液接种量为以螺旋藻培养基体积计5％～10％把乳 酸菌种子培养液加到螺旋藻培养基中，在温度35～37℃、摇床转速120～ 160r/min与避光的条件下在摇床中培养5d；使用5ml灭菌蒸馏水作为对照 组进行同样培养。
下面将描述螺旋藻活性成分提取方法与抗氧化指标测定方法。
1.螺旋藻活性成分提取方法
将螺旋藻发酵液冻干，取1g加到10ml无水乙醇中，使用由洁康超声 波设备有限公司销售的PS-30A型超声波清洗机在超声频率20kHz、超声功 率40W与温度55℃的条件下进行超声提取30min，以同样方式提取两次， 两次之间间隔10min。得到的提取液是发酵产物。
2.抗氧化指标测定
根据螺旋藻抗氧化指标测定方法(文献：何杉杉等人，题目“雪莲菌 中乳酸菌的益生特性”、《食品科学》，2022年，43(02)，pp210-216)，使用 美国尤尼科公司的紫外分光光度计(UV2600A)依次进行DPPH自由基清 除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、总还原力、亚铁离 子螯合能力测定。每个样品进行三次生物学重复，采用吸光度值绘制标准 曲线的方法计算蛋白样品中各指标抗氧活活性。
具体测定方法如下：
I、DPPH自由基清除率测定
将0.5ml所述提取液与1ml 0.2mmol/LDPPH无水乙醇溶液混匀，在温 度37℃与避光的条件下反应30min，使用离心机以转速6000r/min进行离心 分离10min，得到的上清液(样品溶液)测定了在波长517nm处的吸光度 A1，空白组是与上清液等体积的无水乙醇溶液，对照组是用等体积无水乙 醇代替提取液获得的样品，在相同的条件下测定了空白组的吸光度与对照 组的吸光度，测定时用无水乙醇调零。
按照下式(1)计算DPPH自由基清除率：
Figure BDA0003716668820000101
式中：
A0为空白组吸光度；
A1为样品组吸光度；
A2为对照组吸光度。
II、羟基自由基清除率测定
取5mmol/L硫酸亚铁溶液、5mmol/L水杨酸乙醇溶液、3mmol/L过氧 化氢溶液各1ml加到10ml具塞试管中，加入2ml样品溶液，用蒸馏水稀释 至刻度，接着在温度37℃的水浴中进行反应15min，再使用离心机在转速 6000r/min的条件下离心10min，移取上清液，测定在波长510nm处的吸光 度A1，蒸馏水为空白组样品。
按照下式(2)计算羟基自由基清除率：
Figure BDA0003716668820000111
式中：
A0为空白组吸光度，
A1为样品组吸光度。
III、超氧阴离子自由基清除率测定
取4.5ml浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.2，含有2mmol/L EDTA)，在水浴中在温度25℃下处理20min，然后加入2.3ml样品溶液和 2.2ml浓度为25mmol/L的邻苯三酚溶液，混合均匀，在水浴中在温度25℃ 下反应4min，再加入1ml浓度为10mol/L的HCl溶液终止反应，再使用离 心机在转速6000r/min的条件下离心分离10min，移取上清液，测定在波长 320nm处的吸光度A1，蒸馏水为空白组样品。
按照下式(3)计算超氧阴离子自由基清除率：
Figure BDA0003716668820000112
式中：
A0为空白组吸光度；
A1为样品组吸光度。
IV、总还原力测定
采用铁氰化钾法测定。移取0.5ml样品，加入0.5ml浓度为0.2mol/L 的PBS与0.5ml浓度为1g/100ml的铁氰化钾溶液，混合均匀；在水浴中在 温度50℃下反应20min，接着骤冷至室温，接着加入0.5ml浓度为10g/100ml 的三氯化铁溶液，使用离心机在转速4000r/min下离心分离5min，移取1ml 上清液，加入1ml超纯水与1ml浓度为0.1g/100ml三氯化铁的溶液，混匀， 静置10min，在波长700nm处测定吸光度A1，用PBS缓冲液代替样品作 为空白样品。
按照下式(4)计算总还原力：
Figure BDA0003716668820000121
式中：
A0为空白组吸光度；
A1为样品组吸光度。
V、亚铁离子螯合能力测定
往1ml提取液样品中加入0.05ml浓度为2.0mmol/L的氯化亚铁溶液、 2ml浓度为5.0mmol/L的菲啰嗪溶液与2.74ml超纯水，在震荡混合器中震 荡混合30s，放置室温下10min，测定该溶液在波长562nm处的吸光度A1。 使用纯水为空白组样品，用超纯水代替氯化亚铁制备的样品为对照组样品。
按照下式(5)计算亚铁离子螯合能力：
Figure BDA0003716668820000122
式中：
A0为空白组吸光度；
A1为样品组吸光度；
A2为对照组吸光度。
测定结果是在三组平行之间去除异常值后求平均值，这些测定结果列 于表4中，结果分析参见附图2
表4：对照组及6株植物乳杆菌发酵组、发酵空 白组与原藻粉抗氧化指标测定结果
Figure BDA0003716668820000123
通过对表4列出数据对比分析知道，发酵空白组与原藻粉组之间无明 显差别，在发酵组中，除个测定结果差异较大外，HSF-LAB-1303菌株的各 项测定结果均高于其它菌株的测定结果。因此，最终筛选出能够显著提高 螺旋藻抗氧化能力的菌株是HSF-LAB-1303菌株
E、HSF-LAB-1303菌株鉴定
I、HSF-LAB-1303菌株DNA提取与PCR
首先，HSF-LAB-1303菌株在由北京奥博星生物科技有限公司销售的 MRS肉汤培养基中在温度30℃与转速120r/min的条件下进行活化，得到的 活化菌液进行DNA提取。使用由北京博凌科为生物技术有限公司销售的细 菌DNA提取试剂盒，按照其使用说明书描述的方法提取HSF-LAB-1303菌 株的DNA。
然后PCR扩增，扩增使用的引物是细菌16s r RNA通用引物，正向引 物(27F：5'-AGA GTT TGA TGG CTC AG-3')，反向引物(1492R：5'-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT-3')。PCR扩增使用由北京博凌科为生物技术有 限公司销售的高保真PCR扩增试剂盒，按照该说明书描述的方法设置扩增 体系及程序。
II、测序结果比对及系统发育树构建
将PCR产物送到生工生物工程(上海)有限公司进行16s rDNA测序， 并将测序结果提交到NCBI的Genbank中进行Blast序列比对，结果显示 HSF-LAB-1303菌株的16S r DNA序列与多个植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)序列的相似度达99％以上，其与MG754514.1Lactobacillus plantarum strain SourdoughA15的相似度最高。从GenBank数据库中选同 源性相近的植物乳杆菌与菌株HSF-LAB-1303基于MEGA软件进行多重序 列分析，构建系统进化树，结果见图3；图中HSF-LAB-1303菌株与 Lactobacillusplantarum，同源性支持率高达100％，因此确定HSF-LAB-1303 菌株为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
本发明还涉及所述的植物乳杆菌在螺旋藻发酵中的用途。
该螺旋藻发酵的发酵步骤如下：
A、菌种活化
将保存的植物乳杆菌HSF-LAB-1303菌株用灭菌生理盐水稀释，再涂 布在MRS培养基平板上，在恒温震荡摇床中在温度37℃下培养1.5天，生 长出表面光滑、凸起、边缘整齐、直径2.9～3.1mm的乳白色单菌落；
本发明使用的植物乳杆菌HSF-LAB-1303菌株是一株如前面描述确定 的菌株，它是本发明人通过大量实验从泡菜中筛选得到的、能发酵螺旋藻 并提高螺旋藻发酵产物抗氧化活性的菌株。
根据本发明，对植物乳杆菌菌株进行稀释涂布，以生理盐水稀释保证 菌株的生理活性。植物乳杆菌HSF-LAB-1303菌株与灭菌生理盐水的比 1:100000进行稀释，目的是得到植物乳杆菌单菌落，便于后续实验进行。
MRS培养基平板制备方法如下：：
把200ml由北京奥博星生物科技有限公司销售的MRS培养基装到 500ml锥形瓶中，使用立式蒸汽压力灭菌锅中在温度121℃下灭菌15min， 灭菌的MRS培养基与一次性培养皿放到超净工作台中进行紫外灭菌 25min，待MRS培养基温度降低到40℃时倒入培养皿中，冷却至室温，得 到所述的MRS培养基平板。
本发明使用的灭菌设备、震荡摇床及超净工作台都是本技术领域里通 常使用的设备，例如由上海申安医疗器械厂以商品名立式蒸汽压力灭菌锅 销售的灭菌设备、苏州培英实验设备有限责任公司以商品名恒温震荡摇床 销售的震荡摇床、由北京金洋万达科技有限公司以商品名SW-CJ-1FD医用 型超净工作台销售的超净工作台。
B、种子培养
使用接种环挑取步骤A得到的一个单菌落，接种于50ml灭菌的MRS 肉汤培养基中，在恒温震荡摇床中在温度36℃与转速120r/min的条件下培 养24h，然后使用紫外分光光度计测定在波长600nm处的OD值为3.52时 就得到种子培养液，该MRS肉汤培养基是北京奥博星生物科技有限公司销 售的产品。
在本发明中，在250ml锥形瓶中的MRS肉汤培养基在立式蒸汽压力灭 菌锅中在温度121℃下灭菌15min，得到灭菌的MRS肉汤培养基。
由于植物乳杆菌的最适宜生长温度为30～37℃，还由于植物乳杆菌为 厌氧微生物，因此在这个步骤中采用在温度36℃与低转速120r/min下进行 培养。
在种子培养20h后每隔2h进行一次OD值测定，结果表明在24h时 OD值达到最大值，在24h后OD值开始降低，故选择种子培养时间为24h。
本发明使用的UV2100、UV2600A、UV2600或UV2802型紫外分光光 度计是本技术领域里通常使用的设备，例如由美国尤尼科公司以商品名 UV2600A型紫外分光光度计销售的紫外分光光度计。
本发明使用的恒温震荡摇床是HZC-250、HZQ-F160、HZQ-X100或 THZ-22型恒温震荡摇床，它们都是目前市场上销售的产品，例如由苏州培 英实验设备有限责任公司以商品名HZC-250双层恒温振荡培养箱销售的 HZC-250、HZQ-F160、HZQ-X100型恒温震荡摇床、以商品名THZ-22台 式恒温振荡器销售的THZ-22型恒温震荡摇床。
本发明使用的紫外分光光度计与恒温震荡摇床已经在这里作了说明， 故在下面不再赘述。
C、扩大培养
按照以毫升计种子培养液与以毫升计MRS肉汤培养基的比1：10，将 种子培养液接种到MRS肉汤培养基中，在恒温震荡摇床中在温度36℃与转 速120r/min的条件下培养24h，然后使用紫外分光光度计测定在波长600nm 处的OD值为3.52时就得到扩大种子培养液。
根据本发明，按照以毫升计种子培养液与以毫升计MRS肉汤培养基的 比1：10，将5ml种子液接种到50ml MRS肉汤培养基，进行扩大培养，使 种子液的长势达到最佳。
D、螺旋藻发酵
按照以克计螺旋藻与以毫升计蒸馏水的比1：5，把螺旋藻加到蒸馏水 中配制成螺旋藻发酵培养基，然后按照以克计螺旋藻与以毫升计扩大种子 培养液的比2:1，再加入扩大种子培养液，在恒温震荡摇床中在温度36℃与 转速120r/min的条件下培养5天，得到螺旋藻发酵液。
根据本发明，以克计螺旋藻与以毫升计蒸馏水的比为1：5时，能够使 得螺旋藻被蒸馏水充分浸湿，便于植物乳杆菌利用。将最终得到的螺旋藻 发酵液在菌种保藏真空冷冻干燥机中在温度-80℃下进行冻干处理，得到螺 旋藻发酵产物。
本发明使用的真空冷冻干燥设备是目前市场上销售的产品，例如由上 海舜制仪器制造有限公司以商品名菌种保藏真空冻干机销售的FD-1C-80型 真空冷冻干燥。
根据本申请说明书描述的方法检测，所述螺旋藻发酵产物的DPPH自 由基清除率为98.7％以上、羟基自由基清除率为92.4％以上、超氧阴离子清 除率为33.5％以上、总还原力82.5％以上与亚铁离子螯合率51.2％以上。
[有益效果]
本发明的有益效果是：
本发明首先从泡菜中获得植物乳杆菌，通过对植物乳杆菌菌体抗氧化 相关酶活性测定，筛选出抗氧化类酶表达量较高的菌株，利用植物乳杆菌 发酵螺旋藻，测定螺旋藻发酵液的抗氧化指标，得到一株能显著提高螺旋 藻抗氧化活性的植物乳杆菌菌株。利用植物乳杆菌HSF-LAB-1303菌株制 得的螺旋藻发酵产物的DPPH自由基清除率为98.7％以上、羟基自由基清除 率为92.4％以上、超氧阴离子清除率为33.5％以上、总还原力82.5％以上与 亚铁离子螯合率51.2％以上，因此，本发明为后续开发利用螺旋藻及螺旋藻 的加工处理奠定了扎实基础。
【附图说明】
图1是17种植物乳杆菌抗氧化活性检测结果图；
图2是螺旋藻抗氧化指标测定结果图；
每一组柱状图从左至右分别是：DPPH自由基清除率(％)、羟基自由 基清除率(％)、超氧阴离子清除率(％)、总还原力(％)和亚铁离子螯合 率(％)。；
图3是CDC-3菌株基于16S rDNA基因部分序列构建的系统发育树；
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：使用植物乳杆菌HSF-LAB-1303菌株发酵螺旋藻
该实施例的实施步骤如下：
A、菌种活化
制备MRS培养基平板：把200ml由北京奥博星生物科技有限公司销 售的MRS培养基装到500ml锥形瓶中，使用上海申安医疗器械厂生产的 LDZX-50KBS立式蒸汽压力灭菌锅在温度121℃下灭菌15min，灭菌的MRS 培养基与由江苏南通白耀实验器材有限公司销售的90mm一次性培养皿放 到由上海新苗医疗设备公司销售的SWCJ-A超净工作台中进行紫外灭菌 25min，待MRS培养基温度降低到40℃时倒入培养皿中，冷却至室温，制 成MRS培养基平板；
按照保存植物乳杆菌HSF-LAB-1303菌株与灭菌生理盐水的体积比 1:100000，将100μL保存植物乳杆菌HSF-LAB-1303菌株用灭菌生理盐水 稀释，再取20μL稀释液涂布在MRS培养基平板上，在由苏州培英实验设 备有限责任公司销售的恒温震荡摇床中在温度37℃下培养1.5天，生长出 表面光滑、凸起、边缘整齐、直径2.9～3.1mm的乳白色单菌落；
B、种子培养
制备灭菌的MRS肉汤培养基：在250ml锥形瓶中由北京奥博星生物科 技有限公司销售的MRS肉汤培养基在由上海申安医疗器械厂生产的立式蒸 汽压力灭菌锅中在温度121℃下灭菌15min，得到灭菌的MRS肉汤培养基；
使用接种环挑取步骤A得到的一个单菌落，接种于50ml灭菌的MRS 肉汤培养基中，分成三组，每组三个平行，在由苏州培英实验设备有限责 任公司销售的HZC-250型恒温震荡摇床中分别在温度35℃、36℃、37℃与 转速120r/min的条件下培养24h，然后使用由美国尤尼科公司销售的 UV2100型紫外分光光度计测定在波长600nm处的OD值，三组测定结果平均值分别是2.93、3.65、3.21。依据OD值结果，后续选择以36℃培养种 子液。
C、扩大培养
按照以毫升计种子培养液与以毫升计MRS肉汤培养基的比1：10，将 步骤B得到的种子培养液接种到MRS肉汤培养基中，在HZC-250型恒温 震荡摇床中在温度36℃与转速120r/min的条件下培养24h，然后使用UV2100型紫外分光光度计测定在波长600nm处的OD值为3.52时就得到 扩大种子培养液；
D、螺旋藻发酵
按照以克计螺旋藻与以毫升计蒸馏水的比1：5，把螺旋藻加到蒸馏水 中配制成螺旋藻发酵培养基，共配制六瓶。用立式蒸汽压力灭菌锅在温度 121℃下灭菌15min。
将六瓶灭菌螺旋藻发酵培养基分成两组，每组三瓶。第一组实验组， 加入5ml步骤C得到的扩大培养种子液；第二组对照组，加入5ml蒸馏水， 以代替扩大培养种子液。两组均在恒温震荡摇床中在温度36℃与转速120 r/min的条件下培养5d。
每天都使用由上海拓西电子科技有限公司销售的pH-25型pH计测定两 组发酵液的pH值，此外，对于实验组，每天取1ml发酵液用无菌生理盐水 稀释1×106倍，涂布平板进行活菌计数，pH测定结果及活菌计数结果列于 表5中。
表5：发酵过程中pH测定及活菌计数结果(活菌计数单位：×107)
Figure BDA0003716668820000181
表5列出的结果表明，未接入植物乳杆菌对照组的pH并未发生变化， 且活菌计数为0；而实验组的pH及活菌数均显示植物乳杆菌在发酵过程中 逐渐增多。
根据本申请说明书描述的方法检测这些螺旋藻发酵产物的抗氧化指标 结果列于表6中。
表6：实施例1制备螺旋藻发酵产物的抗氧化指标测定结果
Figure BDA0003716668820000182
Figure BDA0003716668820000191
表6清楚表明，相比于对照组，经过植物乳杆菌发酵得到的螺旋藻发 酵产物的抗氧化指标均有显著的提升。
实施例2：使用植物乳杆菌HSF-LAB-1303菌株发酵螺旋藻
该实施例的实施步骤如下：
A、菌种活化
按照实施例1描述的方法制备MRS培养基平板；
按照保存植物乳杆菌HSF-LAB-1303菌株与灭菌生理盐水的体积比 1:100000，将100μL保存植物乳杆菌HSF-LAB-1303菌株用灭菌生理盐水 稀释，再取20μL稀释液涂布在MRS培养基平板上，在由苏州培英实验设 备有限责任公司销售的HZC-250恒温震荡摇床中在温度36℃下培养2.0天， 生长出表面光滑、凸起、边缘整齐、直径2.9～3.1mm的乳白色单菌落；
B、种子培养
按照实施例1描述的方法制备灭菌的MRS肉汤培养基；
使用接种环挑取步骤A得到的一个单菌落，接种于50ml灭菌的MRS 肉汤培养基中，分成三组，每组三个平行，在由苏州培英实验设备有限责 任公司销售的HZC-250型恒温震荡摇床中在温度36℃与转速120r/min的条 件下1～3组分别培养22h、24h、26h，然后使用由美国尤尼科公司销售的 UV2600A型紫外分光光度计测定在波长600nm处的OD值，三组测定结果 平均值分别是3.23、3.76、3.21。依据OD值结果，后续选择以24h培养种 子液。
C、扩大培养
按照以毫升计种子培养液与以毫升计MRS肉汤培养基的比1：10，将 步骤B得到的种子培养液接种到MRS肉汤培养基中，在HZC-250型恒温 震荡摇床中在温度36℃与转速120r/min的条件下培养24h，然后使用 UV2600A型紫外分光光度计测定在波长600nm处的OD值为3.83时就得到 扩大种子培养液；
D、螺旋藻发酵
按实施例1的方式配制螺旋藻发酵培养基，共配制九瓶，并灭菌。
将九瓶灭菌螺旋藻培养基分成三组，每组三瓶，每瓶加入5ml步骤C 得到的扩大种子培养液，在HZC-250型恒温震荡摇床中在温度36℃的条件 下培养5d，其中1～3组的摇床转速分别是120r/min、140r/min、160r/min。
每天都使用由上海拓西电子科技有限公司销售的pH-25型pH计测定每 组发酵液的pH值，此外，对于实验组，每天取1ml发酵液用无菌生理盐水 稀释1×106倍，涂布平板进行活菌计数，pH测定结果及活菌计数结果列于 表7中。
表7：发酵过程中pH测定及活菌计数结果(活菌计数单位：×107)
Figure BDA0003716668820000201
表7列出的结果表明，各组的pH及活菌数均显示植物乳杆菌在发酵过 程中逐渐增多，但相对而言控制转速在140r/min时，植物乳杆菌菌数最多。
根据本申请说明书描述的方法检测这些螺旋藻发酵产物的抗氧化指标 结果列于表8中。
表8：实施例2制备螺旋藻发酵产物的抗氧化指标测定结果
Figure BDA0003716668820000202
表8列出的结果清楚表明，在转速120r/min与140r/min下发酵培养5d， 得到的DPPH自由基清除率为97.7％以上、羟基自由基清除率为92.4％以上、 超氧阴离子清除率为33.5％以上、总还原力82.5％以上与亚铁离子螯合率51.2％以上。

Claims (9)

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HSF-LAB-1303，该菌株已于2022年05月09日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.24866。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌HSF-LAB-1303在螺旋藻发酵中用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于螺旋藻发酵的步骤如下：
A、菌种活化
保存植物乳杆菌HSF-LAB-1303菌株用灭菌生理盐水稀释，再涂布在MRS培养基平板上，在恒温震荡摇床中在温度37℃下培养1.5天，生长出表面光滑、凸起、边缘整齐、直径2.9～3.1mm的乳白色单菌落；
B、种子培养
使用接种环挑取步骤A得到的一个单菌落，接种于50ml灭菌的MRS肉汤培养基中，在恒温震荡摇床中在温度36℃与转速120r/min的条件下培养24h，然后使用紫外分光光度计测定在波长600nm处的OD值为3.52时就得到种子培养液；
C、扩大培养
按照以毫升计种子培养液与以毫升计MRS肉汤培养基的比1：10，将种子培养液接种到MRS肉汤培养基中，在恒温震荡摇床中在温度36℃与转速120r/min的条件下培养24h，然后使用紫外分光光度计测定在波长600nm处的OD值为3.52时就得到扩大种子培养液；
D、螺旋藻发酵
按照以克计螺旋藻与以毫升计蒸馏水的比1：5，把螺旋藻加到蒸馏水中配制成螺旋藻发酵培养基，然后按照以克计螺旋藻与以毫升计扩大种子培养液的比2:1，再加入扩大种子培养液，在恒温震荡摇床中在温度36℃与转速120r/min的条件下培养5天，得到螺旋藻发酵液，得到的螺旋藻发酵液在菌种保藏真空冷冻干燥机中在温度-80℃下进行冻干处理，得到螺旋藻发酵产物。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤A中，保存植物乳杆菌HSF-LAB-1303菌株与灭菌生理盐水的体积比1:100000。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤A中，MRS培养基平板制备方法如下：
把200mlMRS培养基装到500ml锥形瓶中，使用立式蒸汽压力灭菌锅在温度121℃下灭菌15min，灭菌培养基与一次性培养皿放到超净工作台中进行紫外灭菌25min，待MRS培养基温度降低到40℃时倒入培养皿中，冷却至室温，得到MRS培养基平板。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤B中，在250ml锥形瓶中的MRS肉汤培养基在立式蒸汽压力灭菌锅中在温度121℃下灭菌15min，得到灭菌的MRS肉汤培养基。
7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于恒温震荡摇床是HZC-250、HZQ-F160、HZQ-X100或THZ-22型恒温震荡摇床。
8.根据权利要求3所述的用途，其特征在于紫外分光光度计是UV2100、UV2600A、UV2600或UV2802型紫外分光光度计。
9.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述螺旋藻发酵产物的DPPH自由基清除率为97.7％以上、羟基自由基清除率为92.4％以上、超氧阴离子清除率为33.5％以上、总还原力82.5％以上与亚铁离子螯合率51.2％以上。
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