CN111676156A

CN111676156A - 一株提高还原活性的贝莱斯芽孢杆菌mrs及其发酵物和应用

Info

Publication number: CN111676156A
Application number: CN202010487194.8A
Authority: CN
Inventors: 朴美子; 陈铁军; 张月; 陈芊茹
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2020-06-03
Publication date: 2020-09-18
Anticipated expiration: 2040-06-03
Also published as: CN111676156B

Abstract

本发明提供了一株提高还原能力的贝莱斯芽孢杆菌MRS及其发酵物和应用。所述菌株的分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.18065；该菌株核苷酸序列为SEQ ID NO.5，其菌体呈长杆状，菌落呈圆形，淡黄色，半透明，具有规则的形状，表面凸起、水润光滑、呈粘液状，菌落直径1.5 mm～2.5 mm。本发明还提供了利用该菌株制成的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物，其制备方法简单，并具有很好的提高清除自由基能力以及还原活性能力，可以用于制备具有抗氧化活性的制剂。

Description

一株提高还原活性的贝莱斯芽孢杆菌MRS及其发酵物和应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株提高还原活性的贝莱斯芽孢杆菌MRS及其发酵物和应用。

背景技术

普洱茶主要产自云南省，是由大叶种晒青毛茶经多种加工工序而成。普洱茶与绿茶相比需要经过长时间微生物的发酵，才能形成其浓厚醇香的口味。在普洱茶在由生茶到熟茶的过程中，有很多微生物参与发酵，因此从发酵过程中的普洱茶中已筛选出多种霉菌、酵母、细菌、放线菌等。

微生物的种类和数量在普洱茶的贮存过程中对塑造其品质和风味有重要影响，比如从陈化3年、5年、8年的云南普洱生茶中分离出的灰绿曲霉，人为接入到普洱生茶中发酵，使普洱茶产生茉莉花香；将从高级高牡丹白茶中分离出的黑曲霉接入普洱茶中进行发酵表现为陈香透花果香或浓郁的蘑菇香。

自由基在人体内无时无刻都在产生和清除，在正常状况下，自由基的产生和清除处于一种动态平衡，但该平衡若被打破，就会引起生物大分子被破坏、组织器官功能下降等问题，进而引发癌症、动脉粥样硬化、糖尿病和关节炎等疾病。在普洱茶中就存在着许多能够制止和破坏自由基链式反应的抗氧化活性物质，比如茶多酚、黄酮类化合物、没食子酸、多糖等都可以在一定程度下清除自由基。在普洱茶中存在多种细菌，它们具有不同的抗氧化活性，但至今，仍有很多普洱茶中富含的菌株未被分离出来，且抗氧化活性未知。因此，从普洱中分离出具有良好抗氧化活性的微生物，对改善普洱茶的风味、缩减普洱茶的发酵时间和研发抗氧化的新产品，具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一株提高还原活性的贝莱斯芽孢杆菌MRS及其发酵物和应用，本发明分离得到的贝莱斯芽孢杆菌MRS及其发酵物能够提高还原活性，具有良好的抗氧化活性。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株提高还原活性的贝莱斯芽孢杆菌MRS，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.18065。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌MRS的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌MRS呈革兰氏阳性。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌MRS的菌体为长杆状且比较细长，菌落呈圆形，淡黄色，半透明，具有规则的形状，表面凸起，水润光滑，呈粘液状，菌落直径1.5mm～2.5mm。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌MRS的最适生长温度为37℃。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌MRS的最适培养基为MRS培养基。

本发明还提供了由所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵制备得到的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的制备步骤如下：

(1)将贝莱斯芽孢杆菌MRS接种于MRS液体培养基中，25℃、180r/min摇床培养24h～48h后得到种子液；

(2)将步骤(1)的种子液以1-3％的体积比接种到MRS液体培养基中，摇床培养36h～48h后，5000r/min离心处理20-25min，得到菌液上清液；

(3)将步骤(2)的菌液上清液使用旋转蒸发仪在60℃，37r/min下蒸发至上清液剩余15mL～20mL时，再-20℃预冻24h～48h，再使用冷冻干燥机在-50℃冷冻直至冻成粉状，得到贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物冻干粉。

进一步的，所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物具有良好清除DPPH·自由基的能力。

进一步的，所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物具有较强的OH-自由基清除能力。

进一步的，所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物具有提高还原活性的能力，且具有剂量依赖性。

本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物在用于制备具有抗氧化活性制剂中的应用。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的适用质量浓度为20-100mg/mL。

进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的最适质量浓度为100mg/mL。

本发明与现有技术相比，具有的优点和有益效果：

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MRS是从云南勐海普洱茶中筛选并经过分离和纯化得到的，其性状稳定、培养简单。该菌株的发酵物制备方法简单，并具有很好的提高清除DPPH·自由基和OH-自由基的能力以及还原活性能力，也就是抗氧化能力，且抗氧化活性随着该菌株发酵物的浓度的增长而增长，呈剂量依赖性。所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物可以用于制备具有抗氧化活性的制剂，增加抗氧化的新产品种类和制剂的抗氧化能力，从而有利于预防疾病、改良茶叶的风味和缩减茶叶的发酵时间等，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌MRS在平板上的菌落照片。

图2为贝莱斯芽孢杆菌MRS的16S rDNA同源性系统发育树。

图3为贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物清除DPPH·自由基能力的结果图。

图4为贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物还原能力结果图。

图5为贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物清除OH-自由基能力结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细阐述，但是引用实施例仅用于说明本发明，本发明所保护范围不限于此。本发明所用试剂均采购自生物公司。

实施例1：贝莱斯芽孢杆菌MRS的筛选和纯化

1、细菌的初筛

将2005年产的云南勐海的普洱茶饼破碎后，称量2g茶叶，倒入装有18mL无菌水的锥形瓶中充分混合。吸取茶原液1mL加入装有9mL无菌水的试管中，然后稀释成10^-2、10^-3和10^-4的梯度，移取10^-2、10^-3和10^-4的液体各0.1mL于事先准备好的LB固体培养基平板，最后涂布(每个浓度涂2个板)，在37℃培养箱中培养24h，对比菌落在平板上的生长情况。

2、细菌的复筛

在无菌环境下，从LB培养基平板中挑选生长形态不同的单菌落进行四区画线，重复多次划线后，细菌进行革兰氏染色，在100倍油镜下检查细菌的形态，直到细菌纯化后，将纯化细菌接入斜面，在培养箱培养24h～48h，看到细菌在斜面的生长良好后，密封并标记好菌的名称MRS后，放入-4℃冷藏保存。

实施例2：贝莱斯芽孢杆菌MRS的鉴定

1、形态学和生理生化鉴定

观测并记下纯化后培养基平板上单个MRS菌落的形状和特性，然后进行革兰氏染色，在100倍油镜下观测，记下看到的细菌形态，并参照《伯杰氏细菌手册》和《细菌系统鉴定手册》对菌株MRS进行初步鉴定。

结果显示，菌株MRS是一株革兰氏阳性菌，它在100倍油镜下观察的菌落形态和特征如图1所示，该菌菌体为长杆状且比较细长；菌落颜色为淡黄色，圆形，半透明，具有规则的形状，表面凸起，水润光滑，呈粘液状，直径2mm。该菌落进行柠檬酸盐利用试验、M.R.试验、V.P.试验、产酸试验、葡萄糖、果糖、蔗糖利用实验和接触酶试验，结果均为阳性，因此初步判断MRS为芽孢杆菌属。

2、菌种16S rDNA序列分析

选用CTAB结合法提取细菌的基因组DNA，先加入溶菌酶溶解细菌的细胞壁，使用Proteinase K和去污剂使细菌裂解可得到基因组DNA。以16S rDNA通用引物进行PCR扩增。所用引物序列为：

27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ.ID.NO.1)；

1540R：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’(SEQ.ID.NO.2)；

7F：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’(SEQ.ID.NO.3)；

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ.ID.NO.4)。

PCR反应体系为：10×buffer 5μL，dNTP 20μL，引物27F 1μL，引物1492R 1μL，Taq酶5μL，DNA模板1μL，加水至50μL。

PCR程序设定为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸20s，共30个循环；72℃延伸8min；4℃保温。

电泳测试条带后，以pEASY-T1为载体进行TA连接，目的片段与载体的比例为8∶1。在42℃条件下移入至E.coli 110菌株后，在具有氨苄青霉素的LB平板中涂布，观察平板的蓝白斑，并选出想要的菌落进行PCR鉴定的阳性克隆。依据试剂盒提取DNA后交由生工生物工程有限公司进行测序，测序结果见序列表SEQ ID NO.5的核苷酸序列。

3、系统进化树的构建与分析

将测序结果先在NCBI上通过BLAST比对处理后找出相似的序列，再采用Clustal软件对比，选用MEGA建立细菌的系统发育树。

菌株MRS的16S rDNA同源性系统发育树如图2所示，发现MRS菌株与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis具有较近的亲缘关系，因此判断菌株MRS为贝莱斯芽孢杆菌。

本发明将筛选到的贝莱斯芽孢杆菌MRS进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年07月03日；贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis的保藏编号为CGMCC No.18065。

贝莱斯芽孢杆菌MRS的最适生长温度为37℃，好氧，最适培养基为MRS培养基。

实施例3：贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的制备

将保藏于斜面的贝莱斯芽孢杆菌MRS在无菌环境下接种于组分相同的100mL MRS液体培养基中，25℃、180r/min摇床培养24h～48h后作为种子液。种子液培养完成后，用移液管以2％的接种量将种子液吸取到两瓶200mL的MRS液体培养基中，在25℃、180r/min摇床下培养48h。培养完成后，菌液在离心机中以5000r/min离心处理20min，上清液使用旋转蒸发仪在60℃，37r/min下处理，直到液体剩余15-20mL后，装在密闭容器中，预冻。预冻温度为-20℃，预冻24h～48h后，再把冷冻干燥机设定在-50℃，冷冻干燥2～3d，直到全部冻成粉状，得到贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的冻干粉。

将得到的冻干粉用蒸馏水制作成质量浓度为0～100mg/mL的溶液，用于后续的实验。

实施例4：贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物清除DPPH·自由基能力的测定

不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物清除DPPH·自由基能力的测定方法如表1所示，每个浓度重复三次平行实验。

表1 DPPH·自由基清除率测定方法

清除率/％＝[(A₀-A₁-A₂)/A₀]×100％

式中：

A₀-对照管的吸光值；A₁-样品管的吸光值；A₂-样参管的吸光值。

结果如图3所示，可以看出不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物均具有清除DPPH·自由基的能力，且根据其浓度的增加表现为增高的趋势。贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的清除率从20mg/mL到100mg/mL由23.24％增加到48.62％；在0～20mg/mL和80～100mg/mL质量浓度范围内，清除率增加迅速；40mg/mL到80mg/mL清除率增加较为平缓，无显著性差异(p＞0.05)；当发酵物为100mg/mL时，清除率最高为48.62％，说明此时贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的清除能力表现最好。测定的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的IC₅₀为64.61 mg/mL。实验结果表明，贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物具有良好清除DPPH·自由基的能力，可以提高产品清除DPPH·自由基的活性。

实施例5：贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物还原能力的测定

不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的还原能力的测定方法如表2所示，每个浓度重复三次平行实验。

表2还原能力的测定方法

贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的还原能力与吸光值的大小呈正比，测定结果如图4所示，可以看出贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的还原能力随着质量浓度的增加后再趋于平缓。其中，贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的吸光值在0～20mg/mL的质量浓度范围内，增加迅速；从20mg/mL到100mg/mL由1.499增加到1.635，增长较为平缓，并且在40mg/mL时，发酵物吸光值达到最高为1.635，说明此时贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的还原能力表现最好。因此结果表明，贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物具有很好的还原能力，可以提高还原活性。

实施例6：贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物清除OH-自由基能力的测定

不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的清除OH-自由基能力的测定方法如表3所示，每种浓度重复三次平行实验。

表3 OH-自由基能力的测定方法

清除率/％＝(A₀-A₁-A₂)/(A₃-A₂)×100％

式中：A₀-样品管的吸光值；A₁-样品参比管的吸光值；A₂-损伤管的吸光值；A₃-未损伤管的吸光值。

结果如图5所示，可以看出不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物具有一定的清除OH-自由基的能力，并随着质量浓度的升高而增加。贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物从20mg/mL到100mg/mL OH-自由基清除率由22.73％增加到66.78％，增加较为平缓，具有显著性差异(p＜0.05)；并且在100mg/mL时，OH-自由基清除率达到最高为66.78％，说明此时贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的OH-自由基清除能力表现最好。因此结果表明，贝莱斯芽孢杆菌MRS的发酵物具有较强的OH-自由基清除能力，可以提高产品清除OH-自由基的活性。

综上，贝莱斯芽孢杆菌MRS及其发酵物具有提高清除自由基的能力及还原活性的能力，也可以说明贝莱斯芽孢杆菌MRS及其发酵物具有很好的抗氧化活性，且抗氧化活性随着发酵物的浓度的增长而增长，呈剂量依赖性。所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物可以制备成具有抗氧化活性的制剂，增加抗氧化的新产品种类，所制备的制剂可以直接添加用于茶叶的生产，改善茶叶的风味，提高茶叶的抗氧化能力；而在使用时，贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的适用质量浓度为20-100mg/mL，最适浓度为100mg/mL。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一株提高还原活性的贝莱斯芽孢杆菌MRS及其发酵物和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtttgatcm tggctcag 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggaggtgat ccagccgca 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagagtttga tcctggct 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 5

<211> 1487

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 5

gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcggac agatgggagc 60

ttgctccctg atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac 120

tgggataact ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcag 180

acataaaagg tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg 240

tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca 300

ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat 360

ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct 420

ctgttgttag ggaagaacaa gtgccgttca aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc 480

agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt 540

ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc 600

cggctcaacc ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg 660

aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga 720

ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata 780

ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag 840

tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca 900

aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960

aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg 1020

gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080

gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg 1140

tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat 1200

gacctgggct acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta 1260

agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag 1320

ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta 1380

cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taacctttat 1440

ggagccagcc gccgaaggtg ggacagatga ttggggtgaa gtcgtaa 1487

Claims

1.一株提高还原活性的贝莱斯芽孢杆菌MRS，其特征在于，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.18065。

2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌MRS的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌MRS呈革兰氏阳性，菌体呈长杆状且比较细长，菌落呈圆形，淡黄色，半透明，具有规则的形状，表面凸起，水润光滑，呈粘液状，菌落直径1.5 mm～2.5 mm。

4.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌MRS的最适生长温度为37℃。

5.由权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵制备得到的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物。

6.根据权利要求5所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的制备步骤如下：

（1）将贝莱斯芽孢杆菌MRS接种于MRS液体培养基中，摇床培养24 h～48 h后得到种子液；

（2）将步骤（1）的种子液以1-3%的体积比接种到MRS液体培养基中，摇床培养36 h～48h后，5000 r/min离心处理20-25 min，得到菌液上清液；

（3）将步骤（2）的菌液上清液使用旋转蒸发仪在60℃，37 r/min下蒸发至上清液剩余15mL～20 mL时，再-20℃预冻24 h～48 h，再使用冷冻干燥机在-50℃冷冻直至冻成粉状，得到贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的冻干粉。

7.根据权利要求6所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物，其特征在于，所述摇床培养的温度为25℃，转速为180 r/min。

8.根据权利要求5所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物，其特征在于，所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物具有提高还原活性的能力，且具有剂量依赖性。

9.权利要求5所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物在用于制备具有抗氧化活性制剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的贝莱斯芽孢杆菌MRS发酵物的适用质量浓度为20-100 mg/mL。