KR20210088408A - 락토바실러스 플란타럼 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미생물 기술분야에 관한 것으로서, 구체적으로는 락토바실러스 플란타럼 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 기탁 번호가 CGMCC No.18760인 락토바실러스 플란타럼을 보호하며, 상기 락토바실러스 플란타럼은 항생제에 의해 야기된 장내 균총 불균형이 회복하도록 촉진시키고, 병원균의 체외 증식을 억제하며 생존율이 높아, 식품 발효 생산에 응용될 경우, 식품의 영양 이용률이 향상되고, 맛이 개선될 수 있다.

Description

락토바실러스 플란타럼 및 그의 용도{Lactobacillus Plantarum and uses thereof}
본 발명은 미생물 기술분야에 관한 것으로서, 구체적으로는 락토바실러스 플란타럼 및 그의 용도에 관한 것이다.
프로바이오틱스는 숙주인 장의 미생물 균총의 균형 개선을 통해 작용을 발휘하는 활성 미생물이다. 2001년, 국제연합식량농업기구(FAO)와 세계보건기구(WHO)는 프로바이오틱스에 대해, 적당한 양의 섭취를 통해 사용자의 건강에 유효한 작용을 발휘할 수 있는 활성균이라고 정의하였다. 현재 보편적으로, 프로바이오틱스는 숙주에게 유익해야 하고; 독성작용과 발병 작용이 없어야 하며; 소화기관에서 생존할 수 있고, 위산과 담즙염에 내수성이 있어야 하며; 소화기관 표면에 정착할 수 있어야 하고; 유용한 효소류와 대사물을 생성할 수 있어야 하며; 가공 및 보관 과정에서 활성을 유지해야 하고; 양호한 감각기관 특성 등을 지녀야 한다는 등의 조건을 구비해야 한다고 알려져 있다. 1899년 프랑스의 Tissier 박사가 최초의 프로바이오틱스인 비피더스균을 발견한 이후, 인류의 프로바이오틱스에 대한 연구는 이미 백여년의 역사를 가지고 있다. 과학자들은 이미 점차적으로 프로바이오틱스를 각종 질병의 치료 보조로서 연구하는 추세이며, 프로바이오틱스는 인간의 장내에서 서식, 경쟁 또는 탐식 등 복잡한 관계를 통해, 숙주인 장내 미생물 균총의 균형을 개선하고 음식물의 유익한 대사를 촉진시켜, 면역력을 향상시키고 대사성 질환을 방지 및 치료하는 등의 작용을 발휘할 수 있다는 것이 점점 더 많은 연구에 의해 밝혀지고 있다.
유산균은 인체에 유익한 작용을 하는 주요한 프로바이오틱스로서, 유산균은 포도당을 이용하여 젖산을 생성함으로써, 숙주의 에너지에 대한 흡수와 이용을 감소시킬 수 있다. 젖산의 생성은 또한 장의 연동운동을 촉진시킬 수도 있어 영양 물질이 소장 내에 머무르는 시간을 감소시키고, 영양 물질의 이동 속도를 향상시킬 수 있다.
어떻게 전통식품 중에서 특수한 효과를 가진 유산균을 분리 선별해낼 것인가는 매우 중요한 의미가 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술문제는 항생제로 인한 장내 균총 불균형의 회복을 촉진시키고, 병원균의 체외 증식을 억제하며, 생존율이 높아 식품의 발효 생산에 응용 시 식품의 영양 이용률을 향상시키고 맛을 개선할 수 있는 락토바실러스 플란타럼 및 그의 용도를 제공하고자 하는데 있다.
상기 발명 목적을 구현하기 위하여, 본 발명은 이하의 기술방안을 제공한다:
본 발명은 기탁 번호가 CGMCC No.18760인 락토바실러스 플란타럼을 제공한다.
본 발명은 상기 락토바실러스 플란타럼을 포함하여 장내 균총의 불균형을 개선하기 위한 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 장내 균총의 불균형은 항생제에 의해 야기된 것이다.
바람직하게는, 상기 조성물은 식품 조성물, 건강보조제 조성물 또는 약학적 조성물이다.
본 발명은 상기 락토바실러스 플란타럼을 포함하는 활성균제를 제공한다.
바람직하게는, 보조제를 더 포함한다.
본 발명은 이하 단계를 포함하는 활성균제의 제조방법을 더 제공한다:
상기 락토바실러스 플란타럼을 액체 배지 내에서 확대 배양시켜, 균체를 수집하는 단계;
확대 배양 후 수집된 균체를 보호제에 투입하여 재현탁시키고, 진공 동결 건조시킨 다음, 분쇄를 거쳐 활성균제를 획득하는 단계.
본 발명은 상기 락토바실러스 플란타럼을 발효시켜 획득되는 발효 생성물을 더 제공한다.
바람직하게는, 상기 발효 생성물은 발효 유제품, 발효 귀리 제품, 발효 콩 제품 또는 발효 과채 제품이다.
종래 기술과 비교하여, 본 발명은 기탁 번호가 CGMCC No.18760인 락토바실러스 플란타럼을 제공하며, 상기 균주 및 이를 포함하는 조성물은 다음과 같은 효과를 지닌다:
(1) 본 발명의 락토바실러스 플란타럼은 항생제가 야기하는 장내 균총 불균형의 회복을 현저히 촉진시킬 수 있고, 장내 비피더스균과 락토바실러스균의 수량을 현저히 증가시키며, 장내구균의 수량을 현저히 감소시킬 수 있다. 분변 중 단쇄지방산과 젖산의 함량을 현저하게 증가시킬 수 있으며; 다양한 병원균의 체외 증식을 뚜렷하게 억제시킬 수 있다. 모의 인공 위장액에 내수성을 지니고, 인체의 장상피세포에 점착되며, 장내 세균총의 불균형으로 야기되는 변비, 설사 및 관련 장염증 등 질환을 예방, 완화 및 치료하는데 사용될 수 있다.
(2) 본 발명의 활성균제는 생산공정 파라미터가 단순하여 제어가 용이하고, 주기가 짧아 락토바실러스 플란타럼의 높은 생존율을 보장하며, 획득되는 제품은 장기 보관이 가능하고, 제품 품질이 안정적이다.
(3) 본 발명의 락토바실러스 플란타럼은 발효우유, 귀리우유와 당근쥬스 등의 발효물을 발효 생산할 수 있어, 식품의 영양이용률을 높이고, 맛을 개선함과 동시에, 인체에 필요한 활성 유익균을 보충할 수 있다.
도 1은 UPGMA 방법에 기반하여 구축된 락토바실러스 플란타럼의 RAPD 집락 분석도이다.
본 발명은 균주 및 그의 응용을 공개하며, 당업자는 본문의 내용에 따라, 공정 파라미터를 적당해 변경하여 구현할 수 있다. 특히 언급할 점은, 모든 유사한 교체와 변경은 당업자에게 있어서 자명한 것으로서, 모두 본 발명에 포함되는 것으로 간주된다. 본 발명의 방법 및 응용은 이미 바람직한 실시예를 통해 설명하였으나, 관련자라면 본 발명의 내용, 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 본문의 방법과 응용을 수정하거나 또는 적당히 변경 및 조합하여 본 발명의 기술을 구현 및 응용할 수 있음을 분명히 알 것이다.
생물 기탁 설명:
생물 재료: HOM3204, 분류 명명: 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 2019년 10월 28일 중국 미생물 균종 보존관리위원회 보통 미생물 센터, 보존 센터 주소: 북경시 조양구 북진서로 1원 3호 중국 과학원 미생물연구소; 기탁 번호: CGMCC No.18760.
상기 락토바실러스 플란타럼은 네이멍구 동부 산악지역의 가정에서 직접 만든 수제 백김치로부터 분리하였으며, 수집된 백김치 샘플은 2-4개월 이상, 바람직하게는 3개월 동안 절인 것이다. 1g의 백김치를 덜어, 9mL의 0.9% 생리식염수로 백김치즙을 제조하고, 10배로 희석시킨 다음, 희석액을 개량된 MRS 평판(pH 5.0-6.0, 지시약으로써 브로모크레졸 그린을 첨가한다)에 도포하고, 30-40℃에서 24~72h 동안 혐기 배양하였다. 주변이 황색으로 변한 단일 균락을 선별하여, 염색하고, 현미경으로 형태를 관찰하였다. 현미경을 통해 간균(bacillus)으로 검사된 단일 균락을 선별하여, 정제 배양하고, 16S rDNA 감정을 실시하였다. 상기 락토바실러스 플란타럼 균주 세포는 짧은 막대 형상이며, 균체의 폭은 0.5-1.0㎛이고, 길이는 2-4㎛이며, 양끝은 원형이고 아포(spore)를 형성하지 않는다. MRS 평판에 유백색 원형 균락이 형성되었으며, 표면은 촉촉하고 매끄러우며, 가장자리는 가지런하다.
분리된 락토바실러스 플란타럼 HOM3204에 대하여 무작위증폭다형 DNA 분석(RAPD)을 실시하였으며, 그 결과 HOM3204는 일부 상업용 락토바실러스 플란타럼 균주와 모두 상이하여, 유일성(uniqueness)을 지니는 것으로 나타났다.
분리된 락토바실러스 플란타럼 HOM3204에 대하여 확대 배양을 실시하고, 원심분리하여 균체를 수집한 다음, 적당한 동결건조 보호제를 투입하여 재현탁시키고, 다시 진공 동결건조시켜 동결건조 균분말을 제조하였으며, 이하 단계를 포함한다:
(1) 균종의 배양
-80℃로 냉동 보존된 락토바실러스 플란타럼 HOM3204를 0.5%-3%의 접종량으로 무균 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃에서 16~24시간 동안 배양하여, 이와 같이 2회 계대 배양으로 활성화 후의 종자 배양 액체를 획득한다. 종자 배양액을 0.5%-3%의 접종량으로 배합이 20-60g/L의 포도당, 20-60g/L의 효모 추출물, 5-20g/L의 아세트산나트륨 삼수화물, 0.1-0.3g/L의 황산마그네슘, 1-3g/L의 인산수소이칼륨, 2-6g/L의 트리아민 시트레이트, 0.5-2g/L의 트윈-80인 발효 배지에 접종하여, 37℃에서 항온 배양하고, 발효 과정에서 수산화나트륨 용액을 자동 유가(fed-batch)하여 일정하게 pH 5.0~6.5를 유지시키면서 산 생성이 정지될 때까지 발효시킨 다음, 수산화나트륨이 더 이상 유가되지 않을 때 발효를 종료하여, 락토바실러스 플란타럼 HOM3204 고밀도 배양액을 획득하며, 생균수는 100-200억 CFU/mL에 달할 수 있다.
(2) 냉동 동결건조 보호제의 제조
무균수와 보호제 원료를 혼합하여 50-200g/L의 탈지분유, 20-80g/L의 트레할로스, 1-5g/L의 비타민 C, 2-10g/L의 L-글루탐산나트륨을 함유한 보호제를 제조한다.
(3) 동결건조
배양이 종료된 락토바실러스 플란타럼 HOM3204 발효균액을 2~8℃에서 10min 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한 후, 균 오니(sludge)를 수집하여, 0.9%의 무균 생리식염수로 균 오니를 1~2회 세척한 다음, 세척 후의 균 오니를 상기 보호제와 혼합하고, 동결건조기 내에서 동결건조시킨 후, 동결 건조가 완료되면, 정밀 연마기로 박테리아를 분쇄 처리하여 상기 동결건조 균분말을 획득하며, 동결건조 균분말의 생균수는 1.0-2.0×1011CFU/g이다.
본 발명은 락토바실러스 플란타럼 HOM3204로 발효를 실시하여 획득되는 발효 생성물을 더 제공한다. 락토바실러스 플란타럼 HOM3204를 탈지분유, 귀리우유, 또는 당근쥬스에 접종하고, 30~37℃에서 발효하여 발효 생성물을 획득할 수 있다. 상기 발효 생성물에는 다량의 락토바실러스 플란타럼이 함유되며, 식품의 영양 이용률이 향상되고, 맛이 개선됨과 동시에, 인체에 필요한 활성 프로바이오틱스를 보충할 수 있다.
본 발명을 좀 더 이해할 수 있도록, 이하 실시예를 결합하여 본 발명이 제공하는 락토바실러스 플란타럼 및 그의 용도에 대해 상세히 설명하며, 본 발명의 보호범위는 이하 실시예로 한정되지 않는다.
실시예 1: 락토바실러스 플란타럼 HOM3204의 분리 및 동정
(1) 유산균 선별 배지 배합
MRS 고체 배지 배합: 펩톤 10.0g, 쇠고기 엑기스 분말 8.0g, 효모분말 4.0g, 포도당 20.0g, 소르비탄모노올레산 1mL, 인산수소이칼륨 2.0g, 트리아민 시트레이트 2.0g, 아세트산나트륨 삼수화물 5.0g, 황산마그네슘 칠수화물 0.2g, 황산망간 사수화물 0.05g, 한천(agar) 10.0g, 재증류수 1L, 영국 OXIOD사(CM1163); 완제품 배지를 기초로 브로모크레졸 그린 0.005g을 첨가하여 충분히 고르게 교반하였다. pH를 5.5로 조정하고, 121℃에서 20min 동안 멸균하여 준비해두었다.
(2) 락토바실러스 플란타럼 HOM3204 균주의 분리 선별
1g의 백김치를 취하여, 9mL의 0.9% 생리식염수로 백김치즙을 제조한 후, 0.5mL의 즙액을 흡취하여 10배 희석법으로 희석도가 10-3-10-5이 되도록 샘플을 희석하고, 희석액을 상기 MRS 평판에 도포하여 35℃에서 48-72h 동안 혐기배양하였다. 주변이 황색으로 변한 단일 균락을 선별하여, 획선 배양(streak culture)하고, 균락이 단일화될 때까지 3-4회 정제한 후, 그람 염색(Gram stain)과 현미경 검사를 동시에 진행하여 균락의 형태를 관찰하였다. 단일 균락을 MRS 액체 배지로 옮겨 순수배양(axenic culture)을 실시하고, 글리세린으로 보존하여, 각각의 균에 대해 번호를 매겼다.
(3) 락토바실러스 플란타럼 HOM3204 균주의 분자생물학적 특성 분석
무작위증폭다형DNA 마킹(RAPD) 방법을 이용하여 획득된 균주와 상업용 균주에 대해 지노타이핑(genotyping) 비교 연구를 실시하고, 획득된 균주의 특이성을 확인하였다.
프라이머 OPA-02(5'- TGCCGAGCTG -3'), OPA-18(5'- AGGTGACCGT -3'), OPL-07 (5'-AGGCGGGAAC-3'), OPL-16(5'-AGGTTGCAGG-3') 및 OPM-05(5'- GGGAACGTGT -3')를 선택하여 균주의 게놈 DNA에 대해 무작위 증폭을 실시하였다. 증폭 조건은 다음과 같다: 먼저 형판(templet)과 프라이머를 95℃에서 5min 동안 유지한 후, 56℃로 낮추어 반응 혼합물을 투입한 후, 이하 방식, 즉 94℃에서 1분 동안 변성하고, 30℃에서 1min 동안 어닐링하며, 72℃에서 2min 동안 연신하는 방식으로 45회 증폭시킨다.
10μL의 PCR 증폭 생성물을 취하여 2%의 아가로스겔 전기영동으로 검출하고, 이후 겔 이미지 장치로 이미지화를 실시하였다.
Bionumerics version 6.6 소프트웨어를 이용하여, UPGMA 방법에 따라 RAPD 그래프에 대해 집락 분석(cluster analysis)을 실시하였으며, 결과는 도 1과 같다. 분리하여 획득된 락토바실러스 플란타럼은 각각 HOM3201，HOM3202，HOM3203，HOM3204와 HOM3205이다. 상업용 락토바실러스 플란타럼 균주는 LP115, LP-ONLLY, P-8, CCFM8661과 STⅢ이다.
결과에 따르면, HOM3204는 선별된 상업용 균주의 막대그래프와 모두 뚜렷한 차이가 있었으며, 차이율이 30%보다 큰 것으로 나타났다. 계통수(phylogenetic tree)에서 유사도가 90% 이상인 균주는 일반적으로 동주성(homothallic) 균일 가능성이 있다고 여겨지며, 따라서, HOM3204는 상기 상업용 균주와 비교하여, 유전자형 특이성을 갖는다.
(4) 락토바실러스 플란타럼 HOM3204 균주의 동정과 보관
균주를 MRS 고체 평판에서 획선 배양하고, 35℃에서 24-48h 동안 혐기배양한 후, HOM3204에 대해 세균의 총 DNA를 추출하여 16S rDNA 증폭을 실시하고, 범용 프라이머 27F, 1492R을 이용하여 PCR 증폭과 아가로스겔 전기영동을 실시한 후, 겔을 절단하여 회수하고, 서열을 분석하였으며, 분리하여 획득된 균주에 대해 16S rDNA 서열분석을 실시하였다. BLAST 툴을 이용하여 NCBI 데이터베이스에서 비교한 결과, 락토바실러스 플란타럼인 것으로 동정되어, 락토바실러스 플란타럼 HOM3204로 명명하였으며, 2019년 10월 28일 중국 미생물 균종 보존관리위원회 보통 미생물 센터에 보존하였고, 기탁 번호는 CGMCC No.18760이다.
실시예2: 위장 통과 능력 시험
(1) 균주의 활성화
피시험 균주를 1%의 접종량으로 MRS 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 24h 동안 배양한 후, 2회 활성화하여 준비해두었다.
(2) 인공 위액의 제조
묽은 염산 16.4mL를 약 800mL의 물과 10g의 펩신에 투입하고, 고르게 흔들어준 후, pH를 3.0으로 조절하고, 일정 용량인 1000mL까지 물을 투입한 후, 0.2㎛의 미세공 여과막으로 여과하여 준비해두었다.
(3) 인공 장액(intestinal juice)의 제조
인산이수소칼륨 6.8g을 취하여, 500mL의 물에 투입하여 용해시키고, pH를 6.8로 조절한 후, 별도로 트립신 10g, 돼지 담즙염 3g을 투입하여 용해시킨 다음, 두 용액을 혼합하고, 일정 용량인 1000mL까지 물을 투입한 후, 0.22㎛의 무균 여과막으로 무균 환경에서 여과하여 준비해두었다.
(4) 균주의 모의 위장관 중에서의 생존 능력 평가
피시험 균주가 활성화된 후의 균액 1mL를 취하여, 균체를 9mL의 인공 위액(pH 3.0)에 투입하고, 고르게 혼합한 후 생균수를 계산하고, 37℃의 인큐베이터에 넣어 3h 후 생균수를 계산하였다. 인공 위액에서 3h 배양한 후, 균체를 전부 등부피의 인공 장액(pH 6.8)으로 옮겨, 고르게 혼합한 후 37℃에서 배양하였다. 각각 3h, 24h에 MRS 배지에서 평판 생균 계수를 실시하였으며, 그 생존율은 이하 공식으로 계산한다:
위액에서 3시간 생존율(%)=[log CFU N1/log CFU N0]×100%
장액에서 3시간 생존율(%)=[log CFU N2/log CFU N0]×100%
장액에서 24시간 생존율(%)=[log CFU N3/log CFU N0]×100%.
N0= 미처리 전 락토바실러스 플란타럼의 생균수, N1= 위액으로 3시간 처리 후의 락토바실러스 플란타럼의 생균수, N2= 장액으로 3시간 처리 후의 락토바실러스 플란타럼의 생균수, N3= 장액으로 24시간 처리 후의 락토바실러스 플란타럼의 생균수이다.
표 1을 통해, 락토바실러스 플란타럼 HOM3204는 3시간의 모의 위액 처리를 거친 후, 생존율이 95% 이상에 달할 수 있고, 균액을 계속 24시간 동안 모의 장액으로 처리한 후에도, 그 생존율이 여전히 95% 이상에 달할 수 있는 것을 볼 수 있으며, 이는 락토바실러스 플란타럼 HOM3204이 장에서 비교적 높은 생존율을 지닌다는 것을 설명한다.
균주 명칭 위액에서 3시간 생존율 장액에서 3시간 생존율 장액에서 24시간 생존율
HOM3204 99.63±0.48% 98.50±0.07% 99.38±0.52%
STⅢ 98.31±1.86% 97.30±0.06% 96.96±0.21%
LP115 97.88±0.41% 97.79±0.22% 97.24±0.37%
실시예 3: 장상피세포 점착 능력 시험
(1) 세포의 소생(thawing)과 배양
Caco-2 세포 동결보존 튜브를 신속하게 37℃의 수욕조에 담아, 융해시킨 후 원심분리하여 상청액을 제거한 후, 신선한 배양액으로 세포를 재현탁하고, 이를 배양플라스크에 고르게 분산시켜, 5%의 CO2와 95%의 공기인 기체 조건하에 37℃에서 배양하고, 소생 시 48h마다 배양액을 1회 교체하였다. 세포의 생장이 양호해지면(80% 융합), 트립신-EDTA 용액을 사용하여 Caco-2 세포에 대해 온도가 37℃인 조건하에 해리(dissociation)시키고, 세포가 해리된 후 세포 농도를 1×105개/mL가 되도록 조정하여, 24웰 플레이트에 접종하여 융합도가 80%에 달할 때까지 세포를 생장시켰다.
(2) 점착 실험
원심분리로 상응하는 배지에서 생장한 균체를 수집하고; DPBS로 균체를 3회 세척한 후 불완전 배지에서 균체를 재현탁하고, 균체의 농도를 107cfu/mL로 조절하였다. 상기 균 현탁액 1mL를 단일층으로 성장한 Caco-2 세포가 함유된 24웰 플레이트에 투입하고, 5%의 CO2 인큐베이터에서 37℃로 2h 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 후 무균 DPBS로 3회 세척하고, 트립신-EDTA 용액으로 Caco-2 세포에 대해 37℃ 온도 조건하에 해리시킨 후, 세포수와 점착 전후의 생균수를 통계내었으며, 결과는 표 2를 참조한다. 결과를 통해, 락토바실러스 플란타럼 HOM3204의 인간 결장암세포 Caco-2에 대한 점착 지수는 4.14이고, 대조 균주와 비교하여 비교적 양호한 장상피세포 점착 능력을 가지는 것으로 나타났다.
점착지수=점착 후 세균수/각 페트리 접시의 세포수
점착률= 점착 후 세균수/점착 전 세균수
락토바실러스 플란타럼의 Caco-2 세포에 대한 점착 능력
균주 명칭 점착률(%) 점착지수(CFU/세포)
HOM3204 3.45±1.18% 4.14±1.41
LP115 0.97±0.21% 0.56±0.12
STⅢ 1.86±0.43% 1.53±0.36
실시예 4: 일반 병원균 억제능력 시험
(1) 지시균 활성화
지시균(대장균(Escherichia coli) ATCC8739; 금황색 포도상구균 ATCC6538; 쥐장티푸스균(Salmonella typhimurium) ATCC14028; 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) ATCC9027; 리스테리아균(Listeria monocytogenes) ATCC19111)을 1%의 접종량으로 TSB 배지에 접종하고, 37℃에서 18h 동안 배양하여 준비해두었다.
(2) 락토바실러스 플란타럼 활성화
각각 락토바실러스 플란타럼 HOM3204, STⅢ와 Lp115를 1%의 접종량으로 기멸균된 MRS 배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 정지 배양(stationary culture) 하고, 2회 활성화 후 균주 발효액을 획득하였다. 이후 10min 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 균억제 시험을 실시하였다.
(3) 평판 제조
기멸균된 TSA 배지를 가열하여 완전히 녹인 후, 배양접시에 담고, 한천층에 균일한 두께가 형성되어 응고되도록 수평한 테이블 면에 놓아두었다. 지시균을 TSA 배지에 투입하고, 고르게 진탕 후, 미리 제조된 TSA 블랭크 한천 평판 내에 담고 정지 상태로 응고시켰다.
(4) 균 억제 실험
무균 집게로 옥스포드 컵을 평판 위에 가볍게 올려놓고, 중간에 일정 거리를 유지하면서, 그 안에 각각 0.2mL의 측정할 유산균 발효액 상청액을 투입한 후, 4℃의 냉장고에서 24시간 동안 확산시키고, 37℃의 인큐베이터에서 18시간 동안 배양하여 억제대(inhibition zone)의 출현을 관찰하였다. 억제대가 형성된 후 곧은자로 측정하였다. MRS 액체 배지를 음성 대조로 하고, 락토바실러스 플란타럼 Lp115와 STⅢ를 대조 균주로 하여, 매 회 3개의 평행 비교로 삼았다.
락토바실러스 플란타럼 HOM3204의 병원균에 대한 억제 효과
균주 명칭 억제대
대장간균 티푸스균 금황색 포도상구균 녹농균 리스테리아균
HOM3204 +++ +++ + + ++
STⅢ ++ ++ + + ++
LP115 ++ ++ + + ++
배지 대조 - - - - -
주: "-" 억제활성 없음; "+" 11~16mm; "++" 17-22mm; "+++" ≥23mm.표 3을 통해, 락토바실러스 플란타럼 HOM3204가 5종의 병원균에 대해 모두 억제 작용이 있고, 대장간균, 티푸스균 및 리스테리아균에 대한 효과가 비교적 양호한 것을 알 수 있다.
실시예 4: 항산화 지표 검출 시험
(1) 락토바실러스 플란타럼 활성화
각각 락토바실러스 플란타럼 HOM3204, STⅢ와 Lp115를 1%의 접종량으로 기멸균된 MRS 배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 정지 배양하여, 2회 활성화 후 균주 발효액을 획득하였다. 이후 원심분리하고 균주 농도를 1010 CFU/mL로 조정하여 평행 비교를 실시하였다.
(2) 항산화 지표의 검출
지표는 총 항산화 능력 측정(T-AOC), 하이드록시 자유래디컬 제거 측정(·OH), DPPH 래디컬 제거 측정을 포함한다. 앞의 2개의 지표는 난징 지엔청(建成)사로부터 구매한 시약 키트를 이용하여, 조작 설명서에 따라 측정하였다. DPPH 래디컬 제거 시험은 비색법을 이용하였으며, 그 원리는 자유래디컬 제거제(free radical scavenger)가 하나의 전자를 제공하여 DPPH 자유래디컬의 비공유 전자쌍과 쌍을 이룸으로써, 자신의 보라색을 황색으로 변화시키고, 517mm 파장 부위에서의 흡광도를 감소시키는 것으로서, 그 변화 정도는 자유래디컬의 제거 정도와 선형 관계를 이룬다. 즉 자유래디컬 제거제의 제거 능력이 강할수록, 흡광도가 감소한다. 결과는 표 4와 같다.
락토바실러스 플란타럼 HOM3204의 체외 항산화 능력 검출
균주 명칭 T-AOC（U/mL） ·OH제거율(%) DPPH제거율(%)
HOM3204 23.56±2.44 76.84±0.36% 94.18±0.45%
STⅢ 4.13±0.61 76.57±0.36% 93.00±0.65%
LP115 15.48±1.13 77.16±0.60% 91.03±0.53%
표 4를 통해, 락토바실러스 플란타럼 HOM3204의 총 항산화능력, 하이드록시 자유래디컬 제거, DPPH 래디컬 제거 측면에서의 표현이 특출함을 알 수 있다.
실시예 5: 항생제 감수성 시험
약물 감수성 시험은 미국 임상검사표준위원회(NCCLS)가 추천하는 K-B 한천법에 따라 실시하였으며, 약물 감수성 여과지 원반(paper disc)은 써모피셔 사이언티픽사로부터 구입하였고, 설명서에 따라 엄격하게 조작 및 판단하였다. 간단히 요약하여 설명하면 다음과 같다:
(1) 락토바실러스 플란타럼 HOM3204을 MRS 한천 평판에 접종하고, 37℃에서 18~24시간 동안 배양한 후, 순수 균락을 선별하여, 무균 생리식염수에 넣고, 0.5 맥팔랜드 탁도 표준(McFarland Standard)인 균 현탁액을 제조하였다.
(2) 무균 면봉을 균 현탁액에 담고, 시험관 벽에 돌려가면서 가압하여, 잔여 배양액을 압출해내고, 평판 배지 표면에서 적어도 3개 방향을 따라 평판 표면을 도포하였다. 접종 후 15분 이내에 약물 감수성 여과지 원반을 평판에 설치하였다.
(3) 평판을 37℃에서 24~48시간 동안 배양하고, 곧은자로 균 억제대를 측정 및 기록하였으며, CLSI 판정 표준에 따라 판독한 결과는 표 5와 같다.
락토바실러스 플란타럼 HOM3204의 18종 항생제 감수성에 대한 측정 결과
항생제 명칭 약자 CLSI 표준 결과 판정
R I S
페니실린G P10 ≤14 15 ≥15 S
반코마이신 VA-3 ≤14 15-16 ≥17 R
린코마이신 MY-2 ≤14 15-20 ≥20 R
니트로푸란토인 F300 ≤14 15-16 ≥17 S
폴리믹신B PB30 ≤8 9-11 >12 R
에리트로마이신 E15 ≤13 14-22 ≥23 S
바시트라신 B10 ≤8 9-12 ≥13 I
클로람페니콜 C30 ≤12 13-17 ≥18 S
테트라사이클린 TE30 ≤14 15-18 ≥19 S
스트렙토마이신 S10 ≤11 12-14 ≥15 R
리팸핀 RD5 ≤16 17-19 ≥20 I
젠타마이신 CN10 ≤12 13-14 ≥15 R
카나마이신 K30 ≤13 14-17 ≥18 R
암피실린 AMP1 ≤11 12-13 ≥14 S
세폭시틴 KF30 ≤14 15-17 ≥18 S
네오마이신 N30 ≤12 13-16 ≥17 R
노보비오신 NV30 ≤17 18-21 ≥22 I
설프이속사졸 SF300 ≤12 13-16 ≥17 I
S(suseptible)는 감수성을 나타내고; I(intermediate)는 중간을 나타내며; R(resistance)은 약물 내성을 나타낸다.
실시예 6: 락토바실러스 플란타럼 HOM3204 활성균분말의 제조 공정
(1) 균종의 배양
-80℃로 냉동 보존된 락토바실러스 플란타럼 HOM3204를 1%의 접종량으로 무균 MRS 액체배지에 접종하고, 37℃에서 16~24시간 동안 배양하여, 이와 같이 2회 계대 배양으로 활성화 후의 종자 배양 액체를 획득하였다. 종자 배양액을 3%의 접종량으로 발효 배지(표 6 참조)에 접종하고, 37℃에서 항온 배양하였으며, 발효 과정에서 수산화나트륨 용액을 자동 유가(fed-batch)하여 일정하게 pH 5.8을 유지시키면서 산 생성이 정지될 때까지 발효시킨 다음, 수산화나트륨이 더 이상 유가되지 않을 때 발효를 종료하여, 락토바실러스 플란타럼 HOM3204 고밀도 배양액을 획득하였으며, 생균수는 200억 CFU/mL 이상에 달할 수 있다.
발효 배지 M307의 배합
배지 성분 함량（g/L)
포도당 40
효모 추출물 40
아세트산나트륨 삼수화물 10
황산마그네슘 0.2
인산수소이칼륨 2
트리아민 시트레이트 4
트윈-80 1
(2) 냉동 동결건조 보호제의 제조무균수와 보호제 원료를 혼합하여 100g/L의 탈지분유, 50g/L의 트레할로스, 3g/L의 비타민 C, 5g/L의 L-글루탐산나트륨을 함유한 보호제를 제조하였다.
(3) 동결건조
배양이 종료된 락토바실러스 플란타럼 HOM3204 발효균액을 2~8℃에서 원심분리하고, 상청액을 제거한 후, 균 오니(sludge)를 수집하여, 0.9%의 무균 생리식염수로 균 오니를 1~2회 세척한 다음, 세척 후의 균 오니를 상기 보호제와 혼합하여 혼합 후 균액의 균농도가 1010 CFU/mL 이상이 되도록 하고, 동결건조기 내에서 동결건조시킨 후, 동결건조가 완료되면, 정밀 연마기로 박테리아를 분쇄 처리하여 상기 동결건조 균분말을 획득하였으며, 동결건조 균분말의 생균수는 2.0×1011CFU/g이다.
실시예 7: 락토바실러스 플란타럼 HOM3204의 항생제로 유발된 마우스 장내균총의 불균형에 대한 회복 작용
6~8주령의 건강한 수컷 BALB/c 마우스를 사육하여, 무작위로 각 그룹당 12마리씩 블랭크 대조군, 항생제 모델군, 락토바실러스 플란타럼 HOM3204군의 3그룹으로 나누고, 전 과정에서 물과 음식을 자유롭게 섭취시켰다. 실험 기간은 35일이며, 블랭크 대조군은 실험 기간 동안 매일 0.3mL의 무균 생리식염수 용액을 위내 투여하였고; 항생제 모델그룹은 전 7일 동안 각 마우스에게 매일 2회, 매 회 0.3mL의 0.56g/mL 암피실린 용액을 위내 투여한 후, 28일 동안 매일 0.3mL의 무균 생리식염수 용액을 위내 투여하였다. 락토바실러스 플란타럼 HOM3204군은 전 7일 동안 각 마우스에게 매일 2회, 매 회 0.3mL의 0.56/mL 암피실린 용액을 위내 투여한 후, 28일 동안 매일 락토바실러스 플란타럼 HOM3204 활성균 분말(HOM3204 활성균 분말을 5mL의 무균 생리식염수 용액에 용해시키고, 생균수를 109 CFU/mL로 조정하였다)을 위내 투여하였다. 무균 조건하에 각 그룹의 마우스의 35일 동안의 분변을 채취하여, 각각 LBS, BL, EMB, 아자이드화나트륨-크리스탈 바이올렛-에스쿨린 한천 배지로 유산간균, 비피더스균, 대장균과 장내구균에 대해 평판 계수(plate count)를 실시하였으며, 결과는 표 7을 참조한다. 기체 크로마토그래피법으로 분변 중 젖산과 아세트산의 함량을 검출한 결과는 표 8을 참조한다. 난징 지엔청사의 시약 키트를 사용하여 마우스의 안구혈 혈청에 대해 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD)와 글루타티온 과산화효소(GSH-PX)를 실시한 결과는 표 9를 참조한다.
표 7과 표 8의 결과를 통해, 항생제 모델군과 비교하여, 락토바실러스 플란타럼으로 28일 동안 사육한 경우, 마우스의 장내 유산간균(P<0.01)과 비피더스균(P<0.05)의 수량이 현저히 증가하고, 마우스 장내구균(P<0.05)의 수량은 현저히 감소하였으며, 분변 중 젖산(P<0.01)과 아세트산(P<0.05)의 함량이 현저히 증가하였음을 알 수 있다. 따라서, 락토바실러스 플란타럼 HOM3204는 항생제로 인한 마우스의 장내 균총의 불균형에 대해 뚜렷한 회복 작용이 있다.
표 9를 통해, 항생제 모델군과 비교하여, 락토바실러스 플란타럼으로 28일 동안 사육한 경우, 혈액 중 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제의 함량(P<0.01)이 매우 현저하게 증가할 수 있어, 글루타티온 과산화효소의 상승에도 도움이 되는 것을 알 수 있으며, 따라서, 락토바실러스 플란타럼 HOM3204는 항생제로 인한 균총의 균형이 파괴된 마우스의 혈액 중 항산화효소의 활력을 향상시킬 수 있다.
마우스 장내 균총의 변화(log CFU/g)
그룹별 유산균 비피더스균 대장균 장내구균
블랭크 대조군 9.73±0.38A 9.74±0.39A 5.70±0.19 6.60±0.40a
항생제 모델군 8.30±0.31B 8.15±0.24Bb 5.78±0.20 7.47±0.37b
락토바실러스 플란타럼 HOM3204군 9.55±0.25A 9.08±0.55a 5.73±0.18 6.51±0.33a
주: 동일한 열의 상이한 대문자 윗첨자는 차이가 매우 현저함을 나타내고(P<0.01); 동일한 열의 상이한 소문자 윗첨자는 차이가 현저함을 나타낸다(P<0.05).
마우스의 분변 중 젖산과 아세트산 함량의 변화(μmol/g)
그룹별 젖산함량 아세트산함량
블랭크 대조군 64.4±15.0Aa 85.0±13.7
항생제 모델군 11.1±2.0B 62.9±14.5a
락토바실러스 플란타럼 HOM3204군 46.3±21.2Ab 89.8±18.8b
주: 동일한 열의 상이한 대문자 윗첨자는 차이가 매우 현저함을 나타내고(P<0.01); 동일한 열의 상이한 소문자 윗첨자는 차이가 현저함을 나타낸다(P<0.05).
마우스의 안구혈 혈청 중 항산화 지표의 변화(U/mL)
그룹별 SOD GSH-PX
블랭크 대조군 391.73±12.49A 264.62±13.55a
항생제 모델군 391.73±12.40A 204.61±17.24b
락토바실러스 플란타럼 HOM3204군 410.80±16.54B 261.53±11.94a
주: 동일한 열의 상이한 대문자 윗첨자는 차이가 매우 현저함을 나타내고(P<0.01); 동일한 열의 상이한 소문자 윗첨자는 차이가 현저함을 나타낸다(P<0.05).
실시예 8: 발효우유 시험
(1) 12g의 탈지분유, 4g의 포도당과 3g의 효모 추출물을 취하여, 재증류수로 100mL까지 보충하고, 교반을 통해 충분히 용해시킨 다음, 고압균질기로 균질화(60℃, 22MPa)한 후, 95℃에서 5min 동안 살균하고, 37℃로 냉각시켜 준비해둔다.
(2) 락토바실러스 플란타럼 HOM3204를 고체 MRS 배지에서 획선하고, 37℃에서 48h 동안 배양하며, 이러한 방법에 따라 2회 계대한 후, MRS 평판 상의 단일 균락을 선별하여 MRS 액체 배지에서 37℃로 15h 동안 배양하여 고활력 균액을 획득한 후, 4℃로 냉장 보관하여 준비해둔다.
(3) 무균 조건하에, 락토바실러스 플란타럼 HOM3204를 0.9% 생리 식염수로 2회 용리한 후, 1×106CFU/mL의 접종량으로 원료에 접종시키고, 교반하여 고르게 혼합한 후, 35℃의 환경에서, 적정 산도(titrable acidity)가 70°T에 이르도록 정지 발효시켜 발효유를 획득한다.
(4) 발효유를 빙욕 후 교반하는 방식을 통해 16℃까지 냉각시켜 냉각 발효유를 획득한다. 포장 용기에 포장한 후, 4℃의 환경으로 옮겨 냉장 후 12h 동안 숙성시키면 락토바실러스 플란타럼 HOM3204가 풍부하게 함유된 발효유를 획득할 수 있다.
(5) 식품안전 국가표준 GB4789.35 중의 유산균 검사 방법에 따라 락토바실러스 플란타럼을 계수한다. 상기 발효유 샘플에 대해 샘플링을 실시하고, 기울기 희석을 거친 후 평판 계수법으로 계수한다. 상기 발효유 중 활성 락토바실러스 플란타럼의 함량은 2.0×108CFU/mL 이상이고, pH는 4.52에 달할 수 있다.
실시예 9: 발효 귀리우유 시험
(1) 40g의 쌀귀리(naked oat)(장쟈커우(張家口))를 취하여 재증류수로 1000mL까지 보충하고 하룻밤 동안 담가두었다가, 초고속 블렌더에서 100min 동안 삶고, 10min 동안 갈아준 후, 고압균질기로 균질화(60℃，22MPa)하고, 거즈로 여과하여 찌꺼기를 제거한 후 귀리 페이스트를 획득하며, 95℃에서 5min 동안 살균하고 37℃로 냉각하여 준비해둔다.
(2) 락토바실러스 플란타럼 HOM3204를 고체 MRS 배지에서 획선하고, 37℃에서 48h 동안 배양하며, 이러한 방법에 따라 2회 계대한 후, MRS 평판 상의 단일 균락을 선별하여 MRS 액체 배지에서 37℃로 24h 동안 배양하여 고활력 균액을 획득한 후, 4℃로 냉장 보관하여 준비해둔다.
(3) 락토바실러스 플란타럼 HOM3204를 0.9% 생리 식염수로 2회 용리한 후, 1×106CFU/mL의 접종량으로 귀리 페이스트에 접종시키고, 고르게 혼합한 후, 35℃의 항온에서 20h 동안 정지 발효시키고, 포장용기에 포장하여, 발효 귀리우유를 획득한다.
(4) 상기 발효 샘플에 대해 샘플링을 실시하고, 기울기 희석을 거친 후 평판 계수법으로 계수한다. 상기 발효유 중 활성 락토바실러스 플란타럼의 함량은 1.16×108CFU/mL 이상이고, pH는 4.43에 달할 수 있다.
실시예 10: 발효 당근쥬스 시험
(1) 신선한 당근 40g을 취하여, 맑은 물로 세척하고, 당근을 얇게 썬다. 당근 슬라이스를 끓는 물에 10min 동안 삶아, 효소를 비활성화시켜 갈변을 방지한다.
(2) 식힌 후의 당근 조각을 초고속 블렌더에 담고, 적량의 물을 첨가하여 10min 동안 갈아준 후, 즙액을 8겹의 거즈로 여과하여 여과액을 획득한다. 2% 포도당을 첨가하고, 재증류수로 100mL까지 보충한 후, 고르게 교반하고, 95℃에서 8min 동안 살균한 후, 냉각시켜 당근쥬스를 획득하며, 준비해둔다.
(3) 락토바실러스 플란타럼 HOM3204를 고체 MRS 배지에서 획선하고, 37℃에서 48h 동안 배양하며, 이러한 방법에 따라 2회 계대한 후, MRS 평판 상의 단일 균락을 선별하여 MRS 액체 배지에서 37℃로 24h 동안 배양하여 고활력 균액을 획득한 후, 4℃로 냉장 보관하여 준비해둔다.
(4) 락토바실러스 플란타럼 HOM3204를 0.9% 생리 식염수로 2회 용리한 후, 1×106CFU/mL의 접종량으로 당근쥬스에 접종시키고, 고르게 혼합한 후, 35℃의 항온에서 24h 동안 정지 발효시킨다. 포장용기에 포장하여, 발효 당근쥬스 음료를 획득한다. 최종 제품은 색상이 오렌지레드이고, 맛이 시고 달콤하며, 향이 진하다.
(5) 상기 발효 샘플에 대해 샘플링을 실시하고, 기울기 희석을 거친 후 평판 계수법으로 계수한다. 상기 발효유 중 활성 락토바실러스 플란타럼의 함량은 3.20×108CFU/mL 이상이고, pH는 4.52에 달할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼, 이를 포함하는 조성물 및 그 발효 생성물은 장내 균총 불균형을 개선하기 위한 식품, 건강보조제 또는 약학적 제제 등에 유용하게 이용될 수 있다.
이상의 설명은 단지 본 발명의 바람직한 실시방식일 뿐이며, 언급해둘 점으로, 본 기술분야의 보통 기술자에게 있어서, 본 발명의 원리를 벗어나지 않는 전제하에, 약간의 개선과 수식을 더 가할 수 있으며, 이러한 개선과 수식 역시 본 발명의 보호범위로 간주되어야 한다.
중국보통미생물보존센터 CGMCC18760 20191028

Claims (9)

  1. 락토바실러스 플란타럼에 있어서,
    기탁 번호가 CGMCC No.18760인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼.
  2. 제1항에 따른 상기 락토바실러스 플란타럼을 포함하는 것을 특징으로 하는, 장내 균총 불균형을 개선하기 위한 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 장내 균총 불균형은 항생제에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물, 건강보조제 조성물 또는 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 따른 상기 락토바실러스 플란타럼을 포함하는 것을 특징으로 하는 활성균제.
  6. 제5항에 있어서,
    보조제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 활성균제.
  7. 활성균제의 제조방법에 있어서,
    제1항에 따른 상기 락토바실러스 플란타럼을 액체 배지 내에서 확대배양시켜 균체를 수집하는 단계;
    확대배양 후 수집된 균체를 보호제에 투입하여 재현탁시키고, 진공 동결건조시킨 다음 분쇄하여 활성균제를 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성균제의 제조방법.
  8. 제1항에 따른 락토바실러스 플란타럼으로 발효를 실시하여 획득되는 것을 특징으로 하는 발효 생성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 발효 생성물은 발효 유제품, 발효 귀리 제품, 발효 콩 제품 또는 발효 과채 제품인 것을 특징으로 하는 발효 생성물.
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