CN107988123B - 一株具有调节氨苄青霉素诱导肠道菌群紊乱的植物乳杆菌 - Google Patents

一株具有调节氨苄青霉素诱导肠道菌群紊乱的植物乳杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有调节氨苄青霉素诱导肠道菌群紊乱的植物乳杆菌，属于食品技术领域。本发明是将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC12436扩大培养，辅以脱脂乳、海藻糖和蔗糖，冷冻干燥后制备成生物制剂，此制剂中植物乳杆菌CGMCC12436的活菌含量大于109CFU/g。本发明所提供的植物乳杆菌CGMCC12436生长代时较低，在体外模拟胃液、小肠液中存活率较高，并对人体HT‑29细胞的黏附性能良好，在药敏性测试中耐药性相对较低。所述的植物乳杆菌制成的生物制剂能够显著恢复小鼠体内氨苄青霉素导致的肠道菌群失调，改善肠道功能，具有良好的的市场应用前景。

Description

一株具有调节氨苄青霉素诱导肠道菌群紊乱的植物乳杆菌
技术领域
本发明涉及一株具有调节氨苄青霉素诱导肠道菌群紊乱的植物乳杆菌，属于食品技术领域。
背景技术
肠道菌群是人体肠道的重要组成部分，对肠道代谢和生理机能发挥主要作用。肠道菌群的平衡受宿主的生理、食物、药物和肠道菌之间相互作用的影响，各方面因素都可能引起肠道菌群紊乱，导致条件致病菌增多，有益菌比例降低，代谢机能降低，从而引起肠道疾病如抗生素相关性腹泻、肠易激综合征和炎症性肠炎等。抗生素的使用会导致肠道菌群减少、耐药菌相对增多、代谢紊乱等肠道症状，对肠道菌群平衡、功能稳定和机体健康有潜在危害。
肠道菌群失调指肠道中相对稳点的共生菌群中各菌种之间比例发生较大变化而超出正常范围的状态，从而导致病症。菌群失调时容易引发二次感染，即在原发感染的治疗中，产生另一种新致病菌群感染，而抗生素的使用则容易引起此类病状。对于抗生素使用导致的肠道菌群失衡，再次使用抗生素治疗会效果欠佳，副作用较大。一方面，抗生素会抑制整体肠道菌群的增长包括有益微生物，或者对革兰氏阴性菌或一类细菌有抑制作用，导致肠道失衡，另一方面，抗生素使用后对肠道器官本身具有器质性影响，长期或反复使用会引起较多副作用。而通过益生菌调整肠道菌群的潜在机制有：补充益生菌种类和数量、补充有益菌所需营养物质、抑制或减少肠道致病菌增殖、增强宿主免疫力以提高巨噬细胞对致病菌的吞噬作用等。而利用乳酸菌重塑肠道菌群具有较多优势，不仅可增加肠道有益菌比例，同时相对抑制致病菌增殖，对维持和恢复胃肠道正常代谢具有有益作用。
益生菌是指一类非致病的、经过消化系统对人体健康产生积极作用的微生物，它们通过改善人体内的微生态平衡进而促进人体健康。益生菌的主要功能包括：调节人体肠道菌群平衡(通过位阻或产酸作用抑制致病菌生长)，提供维生素等营养物质，产生淀粉酶、蛋白酶等有助于消化的酶类，促进肠道的正常蠕动，刺激机体的免疫系统并提高免疫力，抑制致癌物质。常见的益生菌菌种有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌等。乳杆菌属是人体肠道正常菌群的有益组成，可以提高机体免疫球蛋白含量、促进肠道菌群平衡、减少腹泻。活性乳杆菌在肠道内正常繁殖，可以治疗因大量使用抗生素而导致的伪膜性肠炎、慢性腹泻和便秘、降低胆固醇和预防癌症的发生。
乳酸菌的益生作用受其在宿主中的存活和增殖能力影响，为了达到较好的治疗效果，乳酸菌制剂需要达到一定数量级。通常，食品中活菌体的数量不应少于106CFU/mL，以确保足够数量的活菌到达肠道发挥作用。因此，为了获得所期望的保健或治疗效果，不仅提高乳酸菌制品中活菌的数量，而且应确保乳酸菌制品中的菌种活性较强，代谢功能稳定，通过胃和小肠后可大量存活，进入肠道后具有较强黏附性以发挥益生作用。
目前，国内针对抗生素包括氨苄青霉素导致的肠道菌群紊乱的报道较少，而对于调节肠道菌群功能，一些专利文献涉及了相关的食品、保健品及制备方法，如CN106509913A公开了包含膳食纤维、菊粉、聚葡萄糖、低聚麦芽糖等组合物调节肠道菌群平衡，并可提高人体免疫力，CN104824662A公开了一种具有调节肠道菌群功能的乳酸菌组合物，包括嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌和低聚果糖。但是，对于抗生素在治疗疾病后对肠道导致的副作用还未引起重视，针对抗生素导致的肠道菌群紊乱调节的相关专利申请相对缺乏。
益生菌对肠道健康的促进作用已有相关报道，如CN105920049A公开了一株鼠李糖乳杆菌grx19在调节肠道菌群以及防止病毒性腹泻的功能，并表明该菌株grx19对大鼠小肠隐窝上皮细胞具有显著粘附性。此外，CN102586155A报道了一种植物乳杆菌N13具有抑制肠侵袭性大肠杆菌生长的作用。但是，对于抗生素的使用引起的肠道疾病原因较为复杂，病症不够显著，其导致的长期亚健康状态并无较为有效的措施。
因此，为了缓解抗生素导致的菌群紊乱以及引起的一系列症状，针对抗生素导致的肠道紊乱的益生菌制品的制备是非常缺乏的，开发促进肠道健康更为有效的乳酸菌菌种，为利用膳食补充方法缓解抗生素导致的肠道紊乱开辟出新的解决途径。
发明内容
本发明的第一个目的是供一株具有调节氨苄青霉素诱导肠道菌群紊乱的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CGMCC12436，于2016年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC12436。
在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌CGMCC12436为革兰氏阳性菌细胞为短杆状，两端圆形。
在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌CGMCC12436的菌落特征为，形成的单菌落为圆形，乳白色，半透明，表面湿润光滑，边缘整齐。
应用所述的乳酸菌生物制剂制备方法如下：
(1)菌株培养：将植物乳杆菌CGMCC12436活化后，按所述培养基的质量计以2-4％的接种量接种培养基中，在35-38℃下培养16-24h获得活性较高的菌悬液；
(2)冷冻干燥：将植物乳杆菌CGMCC12436菌液，用pH 7.0-7.42磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用冷冻干燥保护剂重悬使活菌浓度达109-1012CFU/mL，混匀后预冻，之后进行冷冻干燥得到所述生物制剂
在本发明的一种实施方式中，所述冷冻干燥保护剂含有脱脂乳粉、海藻糖和蔗糖。
在本发明的一种实施方式中，所述冷冻干燥保护剂成分为：80-120g/L脱脂乳、25-75g/L海藻糖和75-125g/L蔗糖，余量为水。
在本发明的一种实施方式中，所述冷冻干燥保护的制备方法如下：分别称量脱脂乳粉、海藻糖和蔗糖溶于水，得到含有80-120g/L脱脂乳、25-75g/L海藻糖和75-125g/L蔗糖的保护剂，分别加热灭菌，其中脱脂乳灭菌条件为90-110℃8-10min，蔗糖和海藻糖灭菌条件为110-115℃15-20min，灭菌后立即冷却。
在本发明的一种实施方式中，所述生物制剂按重量份数计含有75-78％的菌粉，脱脂乳7-10％，海藻糖5％，蔗糖10％。
在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌CGMCC12436在发酵乳制品和功能食品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵乳的制备方法：优质原料乳，用150-200目筛网过滤后，加入以原料乳质量计8-12％的蔗糖；将乳化稳定剂溶解后按0.2-0.4％量加入到牛乳中，在压力为18-22MPa下进行均质；将均质后的原料乳进行巴氏杀菌，冷却至室温；按照牛乳体积计3-5％接种工作发酵剂，所述发酵剂由保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌CGMCC12436；接种后的牛乳在35-38℃下发酵6-8h，凝乳后置于4-6℃冷藏22-26h后熟，即制得发酵乳。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂中保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌CGMCC12436的体积比为1-2:1-2:1-3。
在本发明的一种实施方式中，所述乳酸饮料的制备方法：制备重量计10-12％的脱脂乳，90-110℃下灭菌8-10min后冷却备用；以重量计3-5％接种量在脱脂乳中接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌液体发酵剂以及植物乳杆菌CGMCC12436工作发酵剂；在35-38℃下发酵6-8h，当pH达到4.3-4.4时停止发酵，使用均质机在18-22MPa压力下进行4-6min均质，并冷却至4-6℃；添加白砂糖、复配稳定剂、柠檬酸和水等进行调配，搅拌溶解调整其总酸度为0.4-0.6％，pH 3.9-4.0；使用均质机在18-22MPa压力下进行二次均质4-6min，之后在95℃下杀菌10min，冷却后进行灌装、保存，即得到所述乳酸菌饮料。
在本发明的一种实施方式中，所述酸豆乳的制备方法：。使用软水按照水与大豆体积比2-4:4在温度75-85℃下浸泡大豆1-2h，去除大豆皮和浸泡水，按照大豆与水1:6-10加沸水磨浆，使浆料在80-85℃下保持15min，用150目筛网过滤得到豆乳；在得到的豆乳中加入重量计5-10％的蔗糖，使用均质机在15-25MPa压力下进行均质，均质后在90-100℃下杀菌8-12min，冷却至25-37℃后，按照以豆乳重量计0.05-0.1％的接种量接种干粉发酵剂保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌以及上述植物乳杆菌CGMCC12436发酵剂，在温度37-42℃下发酵6-8h，然后在4℃冷却保藏，即得到酸豆乳。
本发明所述生物制剂的有益功能：
(1)比较不同植物乳杆菌体外生物特性，筛选所得的植物乳杆菌CGMCC12436具有良好益生特性，该菌株的代时较低，对体内增殖具有潜在优势，该菌对胃、小肠液耐受性良好并且对人体结肠癌细胞HT-29的黏附性能较好，因此这些良好生物特性对体内发挥益生功能具有潜在作用；
(2)本发明的生物制剂的制备方法简便，菌体存活率高，保存期长。其中的植物乳杆菌CGMCC12436能够调节肠道菌群失调，改善肠道功能，非常具有应用前景。
生物材料保藏
一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CGMCC12436，于2016年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC12436。
附图说明
图1是不同植物乳杆菌的生长代时比较；
图2是植物乳杆菌CGMCC12436对人体HT-29细胞的黏附情况图；
图3是不同植物乳杆菌对人体HT-29细胞的黏附数量比较；
图4是植物乳杆菌耐药性测试示意图；
图5是植物乳杆菌CGMCC12436调节小鼠肠道菌群失调的门水平菌群相对丰度变化图
具体实施方式
实施例1：不同植物乳杆菌的生长代时测定
代时指细胞每分裂一次所需的时间，而在对数期时比生长速率最大，所以本发明中测定不同植物乳杆菌在37℃有氧培养下，对数生长期的细菌代时。
将菌种按2％接种量接种于MRS培养基中，37℃培养，每隔0.5h取样测定菌液在600nm处的吸光度(OD600)。根据细菌生长规律，在对数生长期内：At＝A0*2(t-0)/G，其中A0代表进入对数生长期时细菌的初始数量；At表示t时刻细菌的数量；G代表细菌的代时。可推得公式：log2At＝log2A0+(1/G)*t。由此可见，在对数生长期内，log2At与时间t呈线性，且斜率为1/G。因此，可计算细菌的代时G是以log2At为纵坐标、t为横坐标所得直线的斜率的倒数。测定后计算结果见附图1。
通过图1可知，来自江南大学生物技术中心菌种保藏库(CCFM)的不同植物乳杆菌在37℃、液体MRS培养基中生长代时有差异。代时越低，表明其生长速率越快，更有利于在体内增殖。其中，CCFM595和CCFM605代时较高，CCFM595的代时为165.10±4.46min，CCFM10和CGMCC12436代时较低，CGMCC12436的代时为139.64±4.68min。说明植物乳杆菌CGMCC12436生长速度相比其他测试植物乳杆菌较快。
实施例2：植物乳杆菌在体外模拟胃肠液中的存活率测定
配制模拟胃肠液，模拟胃液为6.2g/LNaCl，2.2g/LKCl，0.22g/L CaCl2，1.2g/LNaHCO3，0.3％胃蛋白酶，用6M HCl调至pH 2.0；合成小肠液为6.4g/LNaHCO3，0.239g/LKCl，1.28g/LNaCl和0.1％胰液素，用6M HCl调节至pH 7.4。充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌并分装5mL于每只试管中，4℃冷藏备用。将培养18h的乳酸菌菌种离心，用0.9％生理盐水重悬代谢1h后接入模拟胃液混匀，置于37℃，转速75r/min的振荡水浴锅，模拟人体胃肠蠕动消化，2h后取出。离心后加入模拟肠液，置于振荡水浴锅振荡2h后取出。将两次的菌液分别梯度稀释至10-9，将稀释度为10-7、10-8、10-9的液体吸取100μL注入MRS琼脂平板，置于37℃恒温培养箱培养24h，分别计算在体外模拟胃液、模拟肠液中植物乳杆菌存活率。计算公式如下：
胃液存活率(％)＝2h活菌数/0h活菌数×100％
肠液存活率(％)＝4h活菌数/2h活菌数×100％
表1植物乳杆菌CGMCC12436在模拟胃肠液中存活率
Figure GDA0001616605750000051
通过表1可知，不同植物乳杆菌在体外模拟胃液和小肠液中的存活率存在差异。在pH 2.0的体外模拟胃液中培养2h，菌株存活率的范围为50-92％，其中CCFM595最高，为91.88±4.82％，而CGMCC12436的存活率也相对较高，为86.270±0.561％，表明此菌株具有良好的耐酸特性。对于植物乳杆菌在体外模拟小肠液中的测定，不同菌株的存活率范围为20-95％，其中CGMCC12436存活率最高，为93.25±4.39％。5株植物乳杆菌在体外模拟胃液培养2h的存活率比模拟小肠液中较高，CGMCC12436在体外模拟胃液和小肠液中存活率相比其他乳杆菌较高。
实施例3：不同植物乳杆菌对人体结肠癌细胞HT-29黏附性能的测定
培养HT-29细胞于RPMI 1640(10％胎牛血清，1％抗生素)培养基中，每两天更换培养基直到细胞达到80-90％。用0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，并调整细胞浓度为1×105个/mL，并接种于六孔培养板中，在培养板中预先放入18×18mm无菌盖玻片，并置于37℃、95％空气/5％CO2培养箱中培养，直到生长成为致密单层细胞。用PBS缓冲液(pH 7.2)清洗细胞两次后，每孔加入1mL无抗生素的RPMI培养基和1mL培养好并重悬于PBS中的菌悬液(调整细菌总数为108)，混匀后置于5％二氧化碳培养箱中孵育，每株菌有三个平行。培养2h后，取出培养板，用pH 7.2的PBS缓冲液清洗细胞直至除去未黏附的乳酸菌，加入无水甲醇固定30min后对细胞玻片进行革兰氏染色。
在高倍显微镜下随机选取20个视野进行观察，计数100个HT-29细胞上黏附的乳酸菌个数，结果见图2和图3。
植物乳杆菌CGMCC12436对细胞HT-29黏附情况见图3，可见HT-29细胞周围均匀地黏附的植物乳杆菌CGMCC12436。
不同植物乳杆菌对细胞的黏附情况如图2所示，它们之间黏附能力具有差异，乳酸菌表面结构和表面成分是影响其黏附性能的重要因素。五株乳酸菌的黏附数不同，5株植物乳杆菌的黏附数都大于10个/细胞，但植物乳杆菌CGMCC12436的黏附菌数相最高，为30.0个/细胞，明显优于其他乳酸菌。
实施例4：植物乳杆菌CGMCC12436对抗生素的耐药性测试
药敏试验根据美国临床标准委员会(NCCLS)推荐的K-B琼脂法进行，药敏纸片选择中国生物制品鉴定所的药敏纸片，其抗生素含量为30μg/片，试验所选择药物必须包括下列抗生素：氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、头孢噻肟、头孢曲松、四环素、克林霉素、青霉素G、庆大霉素、氯霉素、环丙沙星、万古霉素和多粘菌素B。药敏结果判定标准按照NCCLS手册2010版。
(1)将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16-18h，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3mL生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管(0.5麦氏单位)相同。
(2)用无菌棉蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。
(3)待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。每个平板贴6张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。在菌接种后15min内贴完纸片。
(4)将平板反转，置于培养箱中孵育18-24h后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录，根据NCCLS标准进行判读：抑菌圈直径≤12mm为抗生素耐药，抑菌圈直径≥18mm为抗生素素敏感(表2)。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，这些都不作为抑菌环的边缘。
表2植物乳杆菌CGMCC12436对常见12种抗生素的耐药性测试
Figure GDA0001616605750000071
注：药敏测试结果根据NCCLS 2010年发布的《抗微生物药物敏感性试验的执行标准(第20版)》
进行判读。S：敏感，R：耐药。
由表2可知，植物乳杆菌CGMCC12436对庆大霉素、环丙沙星、万古霉素和多粘菌素B具有耐药性，对其他抗生素敏感。
实施例5：含植物乳杆菌CGMCC12436生物制剂制备方法
乳酸菌生物制剂制备方法如下：
(1)菌株的培养：配制MRS培养基，将植物乳杆菌CGMCC12436活化后扩大培养两代，菌种按所述培养基的质量计以3％的接种量接种到经115℃下灭菌20min后冷却的培养基中，然后在37℃下培养18h获得活性较高的菌悬液。
(2)冷冻干燥保护剂的制备：分别称量脱脂乳粉、海藻糖和蔗糖溶于水，得到含有100g/L脱脂乳、50g/L海藻糖和100g/L蔗糖的保护剂，分别加热灭菌，其中脱脂乳灭菌条件为100℃10min，蔗糖和海藻糖灭菌条件为115℃20min，灭菌后立即冷却。
(3)将培养好的植物乳杆菌CGMCC12436，用pH 7.2磷酸盐缓冲液清洗3次，用步骤(2)所述的冷冻干燥保护剂重悬使活菌浓度达1011CFU/mL，混匀后预冻，之后进行冷冻干燥得到生物制剂。
实施例6：植物乳杆菌CGMCC12436对氨苄青霉素导致的肠道紊乱小鼠的恢复作用
使用4周龄的健康雄性C57BL/6小鼠，随机分为4组：空白对照组、肠道失调组、植物乳杆菌恢复组、自然恢复组，每组8只小鼠，全程自由饮水、进食。实验为期42天，空白对照组在实验期间每天灌胃0.2mL无菌生理盐水溶液；肠道失调组前14天每天灌胃0.2mL的500mg/kg氨苄青霉素溶液，建立肠道菌群失调症状。植物乳杆菌恢复组前14天每天灌胃0.2mL的500mg/kg氨苄青霉素溶液，之后28天灌胃植物乳杆菌CGMCC12436生物制剂溶液(冷冻干燥制备的膳食补充剂溶解于1mL无菌生理盐水溶液中，调整活菌数为109)。自然恢复组组前14天每天灌胃0.2mL 500mg/kg氨苄青霉素溶液，之后28天每天灌胃0.2mL无菌生理盐水溶液。无菌条件下取各组小鼠14天和42天的粪便，提取总DNA并进行16S rDNA测序，得到菌群的相对丰度变化。结果如附图5所示：
通过图5可知，菌群失调组相比对照组，其门水平粪便菌群具有显著差异，变形菌门相对丰度显著增多而拟杆菌门减少。通过自然恢复效果较差，自然恢复组相比对照组仍有较高丰度的变形菌门和拟杆菌门降低。而植物乳杆菌恢复组中，变形菌门的相对丰度显著降低到对照组水平，并且厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度都恢复到对照组水平。说明本发明的植物乳杆菌CGMCC12436生物制剂具有调节抗生素导致的肠道菌群紊乱功能，可恢复肠道菌群平衡，改善肠道功能。
实施例7：利用植物乳杆菌CGMCC12436制备发酵乳
制备10％脱脂乳溶液，在100℃下灭菌10min后冷却备用，将植物乳杆菌CGMCC12436菌种按照以脱脂乳体积计8-10％接种于脱脂乳中，在37℃下静置培养至凝乳良好，得到植物乳杆菌CGMCC12436的工作发酵剂。选择符合标准的优质原料乳，用200目筛网过滤后，加入以原料乳质量计8-12％的蔗糖，搅拌至溶解。将乳化稳定剂溶解后按0.2-0.4％量加入到牛乳中，在压力为18-22MPa下进行均质。将均质后的原料乳加热到90℃，10min进行巴氏杀菌，冷却至室温。按照牛乳体积计3-5％接种保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和上述制备的植物乳杆菌CGMCC12436工作发酵剂(体积比为1:1:1)。接种后的牛乳在37℃下发酵6-8h，凝乳后置于4℃冷藏22-26h后熟，即制得发酵乳。
实施例8：利用植物乳杆菌CGMCC12436制备乳酸菌饮料
制备重量计10-12％的脱脂乳，100℃下灭菌10min后冷却备用。以重量计3-5％接种量在脱脂乳中接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌液体发酵剂以及植物乳杆菌CGMCC12436工作发酵剂(体积比为1:1:1)，在37℃下发酵6-8h，当pH达到4.3-4.4时停止发酵，使用均质机在18-22MPa压力下进行4-6min均质，并冷却至4℃。添加白砂糖、复配稳定剂、柠檬酸和水等进行调配，搅拌溶解调整其总酸度为0.4-0.6％，pH 3.9-4.0。使用均质机在18-22MPa压力下进行二次均质4-6min，之后在95℃下杀菌10min，冷却后进行灌装、保存，即得到所述乳酸菌饮料。
实施例9：利用植物乳杆菌CGMCC12436制备酸豆乳
使用树脂层交换器过滤水得到不含或含少量可溶性钙、镁化合物的软水。使用软水按照水与大豆体积比2:4在温度75-85℃下浸泡大豆1-2h，去除大豆皮和浸泡水，按照大豆与水1:6-10加沸水磨浆，使浆料在80-85℃下保持15min，用150目筛网过滤得到豆乳。在得到的豆乳中加入重量计5-10％的蔗糖，使用均质机在15-25MPa压力下进行均质，均质后在95℃下杀菌10min，冷却至37℃左右后，按照以豆乳重量计0.05-0.1％的接种量接种干粉发酵剂保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌以及上述植物乳杆菌CGMCC12436发酵剂(体积比1:1:1)，在温度37-42℃下发酵6-8h，然后在4℃冷却保藏，即得到含有植物乳杆菌CGMCC12436的酸豆乳。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一株植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）于2016年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No:12436。
2.应用权利要求1所述植物乳杆菌制备的乳酸菌生物制剂。
3.根据权利要求2所述的乳酸菌生物制剂，其特征在于，所述乳酸菌生物制剂按重量份数计含有75-78%的权利要求1所述植物乳杆菌，7-10%脱脂乳粉，3-6%海藻糖，8-12%蔗糖。
4.一种乳酸菌生物制剂制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）菌株培养：将权利要求1所述植物乳杆菌活化，按所述培养基的质量计以2-4%的接种量接种培养基中，在35-38°C下培养16-24 h获得活性较高的菌悬液；
（2）冷冻干燥：将步骤（1）获得的菌悬液，用pH 7.0-7.42磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用冷冻干燥保护剂重悬使活菌浓度达109-1012 CFU/mL，混匀后预冻，之后进行冷冻干燥得到所述生物制剂。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述冷冻干燥保护剂成分为：80-120 g/L脱脂乳粉、25-75 g/L海藻糖和75-125 g/L蔗糖，余量为水。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述冷冻干燥保护剂的制备方法如下：分别称量脱脂乳粉、海藻糖和蔗糖溶于水，得到含有80-120 g/L脱脂乳、25-75 g/L海藻糖和75-125 g/L蔗糖的保护剂，分别加热灭菌，其中脱脂乳灭菌条件为90-110°C 8-10 min，蔗糖和海藻糖灭菌条件为110-115°C 15-20 min，灭菌后立即冷却。
7.权利要求1所述植物乳杆菌在发酵乳制品中的应用。
8.一种酸豆乳的制备方法，其特征在于，所述方法具体步骤为：按照水与大豆体积比2-4:4在温度75-85°C下浸泡大豆1-2 h，去除大豆皮和浸泡水，按照大豆与水体积比1:6-10加沸水磨浆，使浆料在80-85°C下保持15 min，用150目筛网过滤得到豆乳；在得到的豆乳中加入重量计5-10%的蔗糖，使用均质机在15-25 MPa压力下进行均质，均质后在90-100°C下杀菌8-12 min，冷却至25-37°C后，按照以豆乳重量计0.05-0.1%的接种量接种工作发酵剂，所述工作发酵剂由保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和权利要求1所述植物乳杆菌组成，所述发酵剂中保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、权利要求1所述植物乳杆菌的体积比为1-2:1-2:1-3；在温度37-42°C下发酵6-8 h，然后在4°C冷却保藏，即得到酸豆乳。
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