CN107365707B - 植物乳杆菌的冷冻保藏方法 - Google Patents

植物乳杆菌的冷冻保藏方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌的冷冻保藏方法，其特征在于：在预定冷冻保藏条件下，采用预定保护剂对植物乳杆菌进行冷冻保藏，并在使用植物乳杆菌时采用预定解冻条件进行解冻，其中，预定保护剂由质量体积百分比为10％～30％的海藻糖溶液、质量体积百分比为10％～30％的蔗糖溶液、质量体积百分比为10％～25％的脱脂乳溶液以及体积百分比为10％～30％的甘油溶液等体积混合制备而成，采用这样的冷冻保藏方法，可最大程度上降低植物乳杆菌的低温冷冻的损伤和死亡，提高植物乳杆菌存活率和活力，从而大大提高发酵效率、节约成本以及缩短发酵周期。

Description

植物乳杆菌的冷冻保藏方法
技术领域
本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的冷冻保藏方法，属于微生物技术领域。
背景技术
超低温冷冻保藏是实验室乳酸菌菌种保藏最直接、最简单、最常用的方法之一，把需要保存的菌种离心重悬新的培养基后加入合适的保护剂混匀后分装到冻藏管中，放入－80℃超低温冰箱保藏。超低温冷冻保藏法具有保存费用低、不容易发生变异、操作简单、保存时间长等优点，超低温冷冻保藏方法在菌种保藏中非常值得推广。
虽然低温冷冻保藏有很多优点，但也会对乳杆菌细胞造成一定的生理损伤，降低细胞存活率。针对乳酸杆菌冷冻干燥生理损伤机制及保护策略的研究，一直是乳酸杆菌冷冻干燥研究的重点，国内外开展了大量的研究工作，然而对乳杆菌的低温冷冻保藏方法的研究还很少，尤其是针对植物乳杆菌的保藏方法的研究更少。由此可见，研究植物乳杆菌的最佳冷冻保藏方法是非常有必要的。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种植物乳杆菌的冷冻保藏方法。
本发明提供了一种植物乳杆菌的冷冻保藏方法，具有这样的特征，包括：在预定冷冻保藏条件下，采用预定保护剂对植物乳杆菌进行冷冻保藏，并在需要使用时采用预定解冻条件进行解冻，其中，预定保护剂由等体积的海藻糖溶液、蔗糖溶液、脱脂乳溶液以及甘油溶液混合制备而成，海藻糖溶液的质量体积百分比为10％～30％，蔗糖溶液的质量体积百分比为10％～30％，脱脂乳溶液的体积百分比为10％～25％，甘油溶液的体积百分比为10％～30％。
在本发明提供的植物乳杆菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，海藻糖溶液的质量体积百分比为10％～20％。
在本发明提供的植物乳杆菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，海藻糖溶液的质量体积百分比为10％。
在本发明提供的植物乳杆菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，蔗糖溶液的质量体积百分比为10％～20％。
在本发明提供的植物乳杆菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，蔗糖溶液的质量体积百分比为10％。
在本发明提供的植物乳杆菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，甘油溶液的体积百分比为20％～30％。
在本发明提供的植物乳杆菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，甘油溶液的体积百分比为30％
在本发明提供的植物乳杆菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，脱脂乳溶液的体积百分比为20％。
在本发明提供的植物乳杆菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，预定冷冻保藏条件为以-1～-10℃/min的降温速率从4℃降温至-80℃，并在-80℃下冷冻保藏，预定解冻条件为解冻温度采用0～40℃。
在本发明提供的植物乳杆菌的冷冻保藏方法中，还可以具有这样的特征：其中，降温速率为-10℃/min，解冻温度为0℃。
发明的作用与效果
本发明所涉及的植物乳杆菌的冷冻保藏方法中，将质量体积百分比为10％～30％的海藻糖溶液、质量体积百分比为10％～30％的蔗糖溶液、体积百分比为10％～25％的脱脂乳溶液以及体积百分比为10％～30％的甘油溶液等体积混合制备成预定保护剂对植物乳杆菌进行冷冻保藏，并在使用植物乳杆菌时采用预定解冻条件进行解冻。采用这样的冷冻保藏方法，可最大程度上降低植物乳杆菌的低温冷冻的损伤和死亡，提高植物乳杆菌存活率和活力，从而大大提高发酵效率、节约成本以及缩短发酵周期。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例对本发明植物乳杆菌的冷冻保藏方法作具体阐述。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例对本发明的植物乳杆菌的冷冻保藏方法作具体阐述。
<实施例>
本实施例提供了一种植物乳杆菌的冷冻保藏方法，该冷冻保藏方法为在预定冷冻保藏条件下，采用预定保护剂对植物乳杆菌进行冷冻保藏，并在使用植物乳杆菌时采用预定解冻条件进行解冻。
在本实施例中，对预定保护剂的配方、冷冻保藏时的降温速率、解冻时的解冻温度以及冷冻保藏时间进行了探索研究。
一、对预定保护剂的配方进行研究
(1)配制保护剂
配制海藻糖溶液:用电子天平分别称量5g、10g、15g海藻糖置于100ml烧杯中，再分别加入30ml去离子水，用玻璃棒搅拌溶解，然后定容于50ml容量瓶中，分别配制得到质量体积百分比为10％、20％、30％的海藻糖溶液，然后在115℃温度下灭菌20min。
配制蔗糖溶液:用电子天平称分别称量5g、10g、15g蔗糖置于100ml烧杯中，再分别加入30ml去离子水，用玻璃棒搅拌溶解，然后定容于50ml容量瓶中，分别配制得到质量体积百分比为10％、20％、30％的蔗糖溶液，然后在115℃温度下灭菌20min。
配制脱脂乳溶液:用电子天平称分别称量5g、10g、12.5g脱脂乳置于100ml烧杯中，再分别加入30ml去离子水，用玻璃棒搅拌溶解，然后定容于50ml容量瓶中，分别配制得到质量体积百分比为10％、20％、25％的脱脂乳溶液，然后在115℃温度下灭菌20min。
配制甘油溶液:用移液枪吸取5ml、10ml、15ml甘油置于100ml烧杯中，再分别加入30ml去离子水，用玻璃棒搅拌溶解，然后定容于50ml容量瓶中，分别配制得到体积百分比为10％、20％、30％的甘油溶液，然后在115℃温度下灭菌20min。
配制复合保护剂：取等体积的上述海藻糖溶液、蔗糖溶液、脱脂乳溶液以及甘油溶液，混合得到复合保护剂，然后将复合保护剂在115℃温度下灭菌20min。
(1)单保护剂的实验考查
按照表1的实验设计，采用单保护剂对植物乳杆菌的样品菌液进行冷冻保藏。
表1单保护剂对植物乳杆菌的存活率的影响
Figure BDA0001359634480000051
Figure BDA0001359634480000061
在表1中，1和2是样品稀释10－6涂布菌落计数的平行组。
由表1中可知，采用四种中任意一种单保护剂冷冻保藏植物乳杆菌的存活率均比PBS空白对照组的存活率要高很多。采用不同的单保护剂，植物乳杆菌的存活率不同。其中，在最适单保护剂(即质量体积百分比为30％的蔗糖溶液)作用下，植物乳杆菌的存活率为74.39％。
(2)复合保护剂的正交实验考查
按照表2进行正交实验，采用复合保护剂对植物乳杆菌的样品菌液进行冷冻保藏。
表2复合保护剂对植物乳杆菌的存活率的影响
Figure BDA0001359634480000062
Figure BDA0001359634480000071
在表2中，A为海藻糖溶液，B为蔗糖溶液，C为甘油溶液，D为脱脂乳溶液。因素A下面的1，2，3分别表示质量体积分数为10％、20％、30％的海藻糖溶液；因素B下面的1，2，3分别代表质量体积分数为10％、20％、30％的蔗糖溶液；因素C下面的1，2，3分别代表质量体积分数为10％、20％、30％的甘油溶液；因素D下面的1，2，3则分别代表体积分数为10％、20％、25％的脱脂乳溶液。例如在正交实验表中，试验号3采用的复合保护剂是由质量体积百分比为10％的海藻糖溶液、质量体积百分比为30％的蔗糖溶液、体积百分比为30％的甘油溶液、质量体积百分比为25％的脱脂乳溶液等体积混合制备而成。
由表1和2中可知，采用复合保护剂冷冻保藏植物乳杆菌的平均存活率比单独采用单保护剂冷冻保藏植物乳杆菌的平均存活率要高。用于配制复合保护剂的这四种组分对存活率的影响是不同的，在复合保护剂中对植物乳杆菌的存活率因素主次顺序依次为海藻糖溶液、蔗糖溶液、甘油溶液、脱脂乳溶液。
由表2可知，当海藻糖溶液质量体积百分比为10％且质量体积百分比为10％的蔗糖溶液(即试验号1)时，植物乳杆菌的存活率较高，数值为91.55％。从表2计算得出：最优组合为A1B1C3D2，即最优复合保护剂是由质量体积百分比为10％的海藻糖溶液、质量体积百分比为10％的蔗糖溶液、体积百分比为30％的甘油溶液、质量体积百分比为20％的脱脂乳溶液等体积混合制备而成。
(3)最优复合保护剂的配方验证
对最优组合A1B1C3D2进行验证，经实验证明植物乳杆菌的存活率高达92％。
二、对冷冻、解冻条件进行研究
(1)冷冻保藏及解冻操作
植物乳杆菌的样品菌液和保护剂按1:1添加，加好保护剂后使用程序冷冻仪(Kryo360-1.7型号)控制降温速率，具体操作步骤如下：
a.安装低温低压瓶。
b.安装泵和液氮罐。
c.设置MVR控制器，编辑相应降温程序：以不同的降温速率从4℃降温至-80℃。
d.加载样品，样品加载完毕后，等待5min，使冷冻室温度稳定至4℃，然后再在MVR控制器上按回车键，启动运行。
e.每个程序降温结束，带手套立即取出样品，放到-80℃低温冰箱冷冻冻藏。
解冻操作为：取出低温冷冻的样品分别放在不同温度的水浴中解冻。
(2)降温速率及解冻温度的正交实验考查
按照表3对植物乳杆菌冷冻保藏时的降温速率以及解冻时的解冻温度进行研究。
表3降温速率和解冻温度对植物乳杆菌存活率与菌落数的影响
Figure BDA0001359634480000091
在表3中，与-1℃/min对应的两行数据为平行组，如118(77.63％)和123(80.92％)表示降温速率为-1℃/min，解冻温度为0℃的植物乳杆菌的两组菌落数分别为118和123，两组存活率分别为77.63％和80.92％。
由表3可知，当降温速率为-10℃/min且解冻温度为0℃时，植物乳杆菌的存活率最高，其平均值为86.19％。
(3)冷冻保藏的时间及单保护剂的正交实验考查
按照表4对植物乳杆菌冷冻时间和单保护剂对存活率的影响进行研究。
表4冻藏时间和单保护剂对植物乳杆菌稀释涂布菌落数的影响
Figure BDA0001359634480000101
由表4可知，随着时间冷冻保藏时间的推移，植物乳杆菌的存活率整体呈下降趋势。
实施例的作用与效果
本发明所涉及的植物乳杆菌的冷冻保藏方法中，将质量体积百分比为10％～30％的海藻糖溶液、质量体积百分比为10％～30％的蔗糖溶液、体积百分比为10％～25％的脱脂乳溶液以及体积百分比为10％～30％的甘油溶液等体积混合制备成预定保护剂对植物乳杆菌进行冷冻保藏，并在使用植物乳杆菌时采用预定解冻条件进行解冻。采用这样的冷冻保藏方法，可最大程度上降低植物乳杆菌的低温冷冻的损伤和死亡，提高植物乳杆菌存活率和活力，从而大大提高发酵效率、节约成本以及缩短发酵周期。
由上述实施例可知，采用由质量体积百分比为10％的海藻糖溶液、质量体积百分比为10％的蔗糖溶液、体积百分比为30％的甘油溶液、质量体积百分比为20％的脱脂乳溶液等体积混合制备而成的最优复合保护剂对植物乳杆菌进行冷冻保藏，植物乳杆菌的存活率平高达92％。
采用-10℃/min的降温速率进行降温并在0℃的解冻温度下进行解冻，可使得植物乳杆菌保持更高的存活率，其存活率平均值为86.19％。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种植物乳杆菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
在预定冷冻保藏条件下，采用预定保护剂对植物乳杆菌进行冷冻保藏，并在需要使用时采用预定解冻条件进行解冻，所述预定冷冻保藏条件为降温速率采用-1℃/min～-10℃/min从4℃降温至-80℃，并在-80℃下冷冻保藏，且所述预定解冻条件为解冻温度采用0℃，或者所述预定冷冻保藏条件为降温速率采用-40℃/min从4℃降温至-80℃，并在-80℃下冷冻保藏，且所述预定解冻条件为解冻温度采用0℃-20℃，
其中，所述预定保护剂由等体积的海藻糖溶液、蔗糖溶液、脱脂乳溶液以及甘油溶液混合制备而成，
所述海藻糖溶液的质量体积百分比为10％～30％，
所述蔗糖溶液的质量体积百分比为10％～30％，
所述脱脂乳溶液的体积百分比为10％～30％，
所述甘油溶液的体积百分比为10％～30％。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述海藻糖溶液的质量体积百分比为10％～20％。
3.根据权利要求2所述的植物乳杆菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述海藻糖溶液的质量体积百分比为10％。
4.根据权利要求3所述的植物乳杆菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述蔗糖溶液的质量体积百分比为10％～20％。
5.根据权利要求4所述的植物乳杆菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述蔗糖溶液的质量体积百分比为10％。
6.根据权利要求5所述的植物乳杆菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述甘油溶液的体积百分比为20％～30％。
7.根据权利要求6所述的植物乳杆菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述甘油溶液的体积百分比为30％。
8.根据权利要求7所述的植物乳杆菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述脱脂乳溶液的体积百分比为20％。
9.根据权利要求1所述的植物乳杆菌的冷冻保藏方法，其特征在于：
其中，所述降温速率为-10℃/min，所述解冻温度为0℃。
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