JP5100998B2

JP5100998B2 - 抜歯体の凍結保存方法

Info

Publication number: JP5100998B2
Application number: JP2005311115A
Authority: JP
Inventors: 一夫丹根; 俊嗣河田; 信也河野; 寛子釜田; 真人加来; 哲男大和田
Original assignee: Hiroshima University NUC
Current assignee: Hiroshima University NUC
Priority date: 2005-10-26
Filing date: 2005-10-26
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2025-10-26
Also published as: JP2007119372A

Description

本発明は、抜歯体の凍結保存方法に係り、特に歯根膜を有する状態で生体から抜歯された歯牙（抜歯体）をガラス化凍結させて凍結保存を行う抜歯体の凍結保存方法に関する。

生体由来の細胞、組織等を凍結保存し、これを必要に応じて解凍して利用に供することは種々の分野で行われているが、利用の成功率を向上させるため凍結保存された細胞、組織等の生存率をさらに高めることが求められている。

このような要請に対し、特許文献１に、細胞の凍結保存方法として利用されている徐冷凍結法、急速凍結法及びガラス化凍結法のいずれであっても細胞を基材に接着させる前に凍結させるのが細胞の生存率を高くすることができることが開示されている。そして、徐冷凍結法とは-0.1から-10℃/minの冷却速度で冷却する方法、急速凍結法とは-10から-30℃/minの冷却速度で冷却する方法、ガラス化凍結法とは液体窒素に被凍結物を投入して急速に冷却する方法であることが開示されている。

特許文献２に、細胞、組織の冷凍保存に当たって、被冷凍物にマイクロウェーブと超音波を同時又は交互に照射することにより冷凍物内部の水分子に回転運動を生じさせて水分の氷結温度を低下させ、約-20℃以下の極低温まで水分を氷結させずに被冷凍物全体を均一に冷却した後、冷凍機及びファンを作動させて被冷凍物を瞬時に凍結させることにより、被冷凍物をガラス状に氷結させる方法が開示されている。また、この方法によれば、-10℃から-40℃程度、特に好ましくは-20℃から-30℃の温度で氷結させることができ、低温での氷結の開始により硝子体の氷が形成され、細胞、組織の損傷が防止されることが開示されている。

特許文献３に、冷凍庫の内部空間に収容されている被冷凍物に、交番電界、好ましくは周波数：50Hzから５MHzの可変周波数交番電界を、あるいはさらに磁場を作用させながら、あるいはさらに冷気にイオン風を重畳させて、水分の凍結を抑制しつつ所定の温度まで急速冷却したのち、該所定の温度で瞬時に冷凍する冷凍装置及び冷凍方法が開示されている。そしてこの冷凍方法において、交番電界を作用させて、水分の凍結を抑制しつつ−20から−40℃の間の温度まで急速冷却したのち、交番電界の作用を停止し、該所定の温度で瞬時に冷凍するのが好ましいことが開示されている。

また、特許文献４に、凍結すべき生物学的材料を冷却流体を収容したタンク内に浸漬し、実質的に一定とされた所定の速度および温度でもって生物学的材料の周囲を通して冷却流体を循環させることにより、生物学的材料の細胞構造内における氷結晶の形成を十分に避け得るくらいに急速に生物学的材料を凍結（ガラス化凍結）させる方法が開示されており、冷却流体の温度は、-20℃から-30℃とするのが好ましいことが開示されている。そしてその凍結方法は、従来のように液体窒素中に投入し急速冷却させてガラス化凍結させる方法より好ましいことが開示されている。

一方、抜歯体の移植は人工インプラント以上の機能・性能を有することから多くの臨床例があるが、さらに抜歯体の有効利用を図るため特許文献５に抜歯体をプログラム冷却により凍結保存し所要時に解凍して移植を行う方法が開示されている。

WO01/070021 A1 号公報特開2004-251498号公報特開2003-88347号公報特開2004-503473号公報特開2005-239690号公報

このように生体由来の細胞、組織等を凍結保存する方法は種々提案されているが、所定の温度で瞬時に凍結させ細胞、組織等の中に非常に微細な氷結晶が存在するか、または、氷結晶が存在しない状態で凍結させるガラス化凍結法は注目に値する。

しかしながら、特許文献２から４に示すように、開示された従来のガラス化凍結法にあってはその具体的な態様は種々であり、実際に最適な態様がどのようなものであるのかは明確でない。また、特許文献５に抜歯体のプログラム凍結法についての開示はあるが、石灰化されたエナメル質、生細胞を含む歯根膜等からなる複合材のような抜歯体のガラス化凍結について開示されているものはない。さらに、歯根膜の生存率を向上し、抜歯体の移植成功率を向上させることが求められている。

本発明は、このような従来の問題点及び社会的要請に鑑み、ガラス化凍結方法を基礎とし、より歯根膜の生存率が高く抜歯体の移植成功率を高くすることができる抜歯体の凍結保存方法を提供することを目的とする。

本発明に係る抜歯体の凍結保存方法は、凍結保存液に浸漬した抜歯体をガラス化凍結する段階と、該ガラス化凍結された抜歯体を-130℃以下の温度で保存する段階と、からなる。

上記発明において、ガラス化凍結は−25から−35℃の温度域で行われるものであるのがよく、磁場を作用させつつ抜歯体のガラス化凍結を行うのがよい。また、上記発明においては、最大氷結晶生成温度帯において所定時間保持するようにするのがよい。

本発明に係る抜歯体の凍結保存方法により、歯根膜の生存率を向上し、抜歯体の移植成功率を向上させることができる。

以下本発明に係る抜歯体の凍結保存方法の実施態様について説明する。本発明に係る抜歯体の凍結保存方法は、凍結保存液に浸漬した抜歯体をガラス化凍結する段階と、該ガラス化凍結された抜歯体を-130℃以下の温度で保存する段階と、からなる。

本発明において、抜歯体とは、歯根膜を有する状態で生体から抜歯された歯牙を意味するが、エナメル質、象牙質、セメント質及び生きた歯根膜細胞を有する状態のものをいう。なお、抜歯体に歯髄はあってもなくてもよく、また、歯髄が存在する場合においても凍結保存時に何らの処理も要しない。

凍結保存液は、公知の凍結保存液を使用することができる。例えば、ジメチルスルフォキシド（Dimethylsulfoxide、DMSO）、トレハロース、エチレングリコール、プロピレングリコール等の凍結防止剤を純水や生理的食塩水（0.9%水溶液）等の細胞の生存に適した塩類溶液に溶解させた水溶液を使用することができる。なお、抜歯体の凍結保存のため抜歯体を冷却するに際しては、抜歯体を凍結保存液に浸漬し凍結保存液が歯根膜細胞中に十分に浸透するように所定時間保持した後冷却を開始する。

ガラス化凍結（vitrification）とは、細胞中に非常に微細な氷結晶が存在するか、または、氷結晶が存在しない状態で対象物を瞬時に凍結させることを意味する。本発明においてガラス化凍結は、−25から−35℃の温度域で行うのがよい。

図１は、ガラス化凍結において、ガラス化凍結温度が歯根膜細胞に与える影響を調べた試験結果を示すグラフである。図１において、横軸はガラス化凍結温度を示し、縦軸は歯根膜細胞中の細胞死の割合を示す。図１によると、ガラス化凍結温度が-20℃と-40℃との間に最も細胞死の割合が少ない温度域が存在し、その温度は約-30℃前後であることが分かる。また、ガラス化凍結温度が-20℃のときの細胞死の割合は10.3%で、-40℃のときの細胞死の割合は8.3%であるから、ガラス化凍結温度が-40℃のときの細胞死の割合は-20℃のときの細胞死の割合よりも約20%少ないことが分かる。なお、-10℃においてはガラス化凍結が生じなかった。

ガラス化凍結を上記温度範囲で安定して行わしめるには、抜歯体内の水分の凍結開始を阻止するために磁場、電磁場等を抜歯体に作用させるのがよい。この場合、抜歯体に作用させる磁場、電磁場等の強度は最適な大きさを選択する必要がある。例えば、図２に示すように磁場を作用させる場合は、作用させる磁場の強さはガラス化凍結の開始を阻止できる程度であってなるべく弱い方がよい。すなわち、図２に示すように、磁場を作用させないでガラス化凍結させた場合の細胞死の割合は65%であるのに対し、作用させる磁場の強さが0.01mTの場合は細胞死の割合が7%、0.076mTの場合は細胞死の割合が10%、0.16mTの場合は細胞死の割合が15%となっており、磁場を作用させることによりガラス化凍結開始を阻止できるばかりでなく、細胞死を非常に少なくできることが分かる。また、作用させる磁場の強さはできるだけ弱い方がよいことが分かる。なお、磁場の作用停止とともにガラス化凍結させるより、磁場は作用させたままでガラス化凍結させる方がよい。

また、本発明においては、均質なガラス化凍結を行わしめるために抜歯体の冷却に際し、いわゆる最大氷結晶生成温度帯で所定時間保持し、その後冷凍装置の温度を低下させ抜歯体をさらに冷却するのがよい。図３は、-5℃で保持した保持時間と細胞死の関係を調べた試験結果を示すグラフである。図３において、横軸は保持時間、縦軸は細胞死の割合を示す。図３によると、保持時間が5minの場合の細胞死の割合が8.0%、15minの場合の細胞死の割合が11.5%であるのに対し、保持時間が25minの場合の細胞死の割合は2.2%、35minの場合の細胞死の割合は2.0%と非常に減少している。すなわち、最大氷結晶生成温度帯では25min程度保持するのがよい。また、冷却において最大氷結晶生成温度帯での保持は、できるだけ低温であるのがよい。なお、最大氷結晶生成温度帯とは、対象物を0℃以下に冷却するときその温度冷却曲線の勾配が、周囲の温度低下にもかかわらず対象物の温度低下が小さいためにほぼ平になる0から-5又は-7℃の温度域をいい、この温度域での被冷却物中の水分の凍結を防止することが重要であるとされる。

本発明においては、さらに、均質なガラス化凍結を行わしめるために抜歯体は徐冷するのがよい。例えば、冷却速度を-0.1から2℃/minとすることができる。これにより、凍結保存液及び抜歯体全体の温度をほぼ均一な状態で冷却することができる。

また、抜歯体の均質なガラス化凍結を行わしめるために、抜歯体の温度管理を正確に制御することができる冷凍装置を用いるのがよい。例えば、被冷却物を流動する液体冷媒中で冷却することができる冷凍装置が有用である。このような冷凍装置により、液体冷媒の温度と抜歯体の温度をほぼ同等にすることができ、抜歯体の温度管理が液体冷媒の温度管理によって可能になる。これにより、抜歯体の冷却温度・速度を正確に制御し、均質なガラス化凍結をさせることができるようになる。なお、液体冷媒としてジエチルグリコール50%vol/vol水溶液を使用することができる。このジエチルグリコール水溶液は、-40℃においても粘度の上昇や凝固等の現象は観察されないので液体冷媒として好適である。

なお、上記図１から３の試験は、以下の条件で行った。抜歯体は人から抜歯した歯牙をそのまま用いた。凍結保存液は、ジメチルスルフォキシド（最終濃度10%vol/vol）と市販の細胞凍結保存液（日本ジェネティクス株式会社製バンバンカー）との混合液を用いた。この凍結保存液を入れた容器（ガラス又はポリプロピレン製の10から30ml）に抜歯体を1本浸漬させて凍結保存に供した。冷却温度は冷凍装置の液体冷媒（容量5l）の温度により管理した。冷却速度は、-1.0℃/minとした。磁場は0から0.16mTの範囲で作用させた。細胞死の判定は、凍結保存された抜歯体を大気中で解凍させた後トリパンブルー染色法により行った。また、図１及び３の場合においては、0.076mTの磁場を作用させて試験を行った。各試験は、一条件当たり5本の試験片について試験を行いグラフ化した。図１から３において、棒グラフは平均値を示し、線分は試験結果のバラツキ範囲を示す。なお、本試験において、液体冷媒の温度と抜歯体の温度はほぼ等しいことを確認している。

以上抜歯体のガラス化凍結について説明した。このようにガラス化凍結させた抜歯体は、-130℃以下の温度まで冷却し保存に供する。保存温度が-130℃未満であると細胞、組織中の脂肪の酸化が進行するおそれがあるので保存温度は、-130℃以下の温度で保存するのがよい。なお、保存温度は、長期保存に対しては低い方が好ましい。

ガラス化凍結温度と細胞死の関係を示すグラフである。作用させる磁場の強さと細胞死の関係を示すグラフである。最大氷結晶生成温度帯での保持時間と細胞死の関係を示すグラフである。

Claims

冷却速度が-0.1から2℃/minの冷却速度で徐冷するとともに、抜歯体内の水分の凍結開始を阻止するために0.01〜0.16mTの強さの磁場又は電磁場を抜歯体に作用させて、凍結保存液に浸漬した抜歯体を-25から-35℃の温度域でガラス化凍結する段階と、該ガラス化凍結された抜歯体を-130℃以下の温度で保存する段階と、からなる抜歯体の凍結保存方法。
凍結保存液を歯根膜細胞中に十分に浸透させた後、冷却を開始することを特徴とする請求項１に記載の抜歯体の凍結保存方法。
最大氷結晶生成温度帯において20から35分間保持することを特徴とする請求項１又は２に記載の抜歯体の凍結保存方法。