JPS6029471B2

JPS6029471B2 - 肝細胞の凍結方法

Info

Publication number: JPS6029471B2
Application number: JP54103565A
Authority: JP
Inventors: 二郎河原畑; 辰生鈴木; 政司吉田
Original assignee: Nikkiso Co Ltd
Current assignee: Nikkiso Co Ltd
Priority date: 1979-08-16
Filing date: 1979-08-16
Publication date: 1985-07-10
Also published as: JPS5629992A

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、肝細胞を生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を
高く保持したまま凍結する方法に関するものである。

一般に、生物学的試料は、生活機能や生物学的活性を有
しており、多方面において利用価値がある。

また、生物学的試料は、温度の高い条件下では、代謝あ
るいは変性のため、縫時的に変化し、その生活機能や生
物学的活性が低下ないいま消失してしまう。従って、生
物学的試料を長時間保存しておくことが困難であり、今
日まで生物学的試料の保存方法について多くの研究が行
われている。動物細胞の長期保存には、凍結保存が適す
ると考えられるが、一般に、動物細胞はそのまま凍結す
ると氷晶形成や電解質濃縮等の原因により、活性低下や
生活機能の消失を惹起し易い。

そこで、従来よりこのような凍害を防止すべ〈凍結保護
物質の使用や冷却速度等の凍結条件について多くの研究
がなされ、対象物質により最適凍結条件が異なっている
ことが解明されている。例えば、赤血球や精子等の凍結
保存については既に実用化されているものもあるが、肝
細胞に関しては未だ満足すべき結果は得られていない。
近年、肝細胞が生物学的あるいは医学的な分野等の試験
研究に利用されるようになったり、また肝不全患者の血
液を単離肝細胞と間接的に接触させて肝機能を補助させ
ることが企画されているが、一定で高品質の肝細胞をい
つどこででも得ることは困難な現状であり、有効な肝細
胞の凍結方法の開発が望まれている。

従釆、肝細砲の凍結に関する研究は少く、比較的高い生
存率を維持できた例は草野満夫等によるものだけである
（草野満夫、大西俊郎、江端英隆、関口定美、水戸過郎
「日本外科学会誌」第７９巻増刊号、１６４頁、１９７
群王発行）。

草野等は、凍害保護物質としてジメチルスルホキシドを
ラツト肝細胞懸濁液に対し１０％添加し、１℃／分の冷
却速度で凍結して−１９がｏに保存し、２４時間後に解
凍してこれにトリパンブルー（ｏｙｐａｎｂｌｕｅ）で
染色した結果、７５〜８０％の肝細胞が染色されず生存
していることが確認されたとの報告をしている。なお、
肝細胞は肝臓を構成する細胞であり、肝臓は数種類の細
胞で構成されているが、その大部分は肝実質細胞であり
「この肝実質細胞が凍結保存の対象となる。また、こ
れらの肝細胞は、肝臓をコラゲナーゼの如き蛋白分解酵
素で処理することにより容易に得られる。さらに、肝細
胞の生存率の検査は、一般にトリパンブルー（０．２〜
０．５％）染色により簡易的に行うことができ、光学顕
微鏡または電子顕微鏡による形態学的所見および生物学
代謝試験の所見等から、トリパンブルーで染色されない
ことが生存細胞の最低必要条件とみなされている。そこ
で、本発明者等は、肝細砲の生存率をさらに向上すべく
凍結方法の改良並びに研究を重ねた結果、凍害保護物質
としてグリセリンまたはジメチルスルホキシド１０％を
使用し、１００／分の冷却速度で凍結して−１９が○で
保存した肝細胞は「解凍直後のトリパンフルーによる非
染色率が８０％程度得られることを確認した。

しかるに、凍害保護物質は、分子量が小さくて細胞膜を
通過し易く、細胞内において凍害防止効果を発揮する物
質は細胞内性凍害保護物質と呼称され、例えば、グリセ
リン、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、ア
セトアミド等がこの範蟻に含まれる。

また、分子量が大きくて細胞膜が通過し難く、細胞外に
おいて凍害防止効果を発揮する物質は細胞外性凍害保護
物質と呼称され、例えば、デキストラン、アルブミン、
ポリビニルピロリドン等がこの範鴫に含まれる。従って
、発明者等は、前述した多種類の細胞内性凍害保護物質
の単品、および多種類の細胞外性凍害保護物質の単品を
用いて肝細胞の凍結処理を行った結果、比較的高い生存
率を維持して凍結できたのは、グリセリンまたはジメチ
ルスルホキシドを使用した場合のみであることが確認さ
れた。

しかしながら、これらの場合にも凍結肝細胞の生存率は
充分満足すべきものではなかった。そこで、発明者等は
さらに研究並びに工夫を重ねた結果、細胞内性凍害保護
物質と細胞外性凍害保護物質の共鰯効果を企図し、細胞
内性凍害保護物質と細胞外性凍害保護物質を複合で使用
し、０．１〜３℃／分の緩遠冷却を行ったところ、凍害
保護物質の単品を使用した場合よりも肝細胞の生存率を
さらに向上させることができることが判った。

従って、本発明の一般的な目的は、肝細砲を凍結するに
際し、凍結保護物質として特定のものを選択し、かつ綾
速冷却により凍結することにより肝細胞の生存率を８０
％以上に向上させることができる肝細胞の凍結方法を提
供するにある。

前記目的を達成するため、本発明においては肝細胞懸濁
液に細胞内性凍害保護物質と細胞外性凍害保護物質とを
添加し、穣遠冷却して凍結することを特徴とする。

前記の肝細砲の凍結方法において、細胞内性凍害保護物
質には、グリセリンおよびジメチルスルホキシドの中か
ら選択される少なくとも１種を使用することが好適であ
り、この場合、グリセリンとしては２０Ｗ／Ｖ％以下、
ジメチルスルホキシドとしては１５Ｗ／Ｖ％以下、グリ
セリンとジメチルスルホキシドとの合計では２〜２０Ｗ
／Ｖ％の範囲で使用し、一方、細胞外性凍害保護物質に
は、デキストランおよびアルブミンの中から選択される
少なくとも１種を使用することが好適であり、この場合
、デキストランとしては２０Ｗ／Ｖ％以下、アルブミン
としては２０Ｗ／Ｖ％以下、デキストランとアルブミン
との合計では２０Ｗ／Ｖ％以下で使用すれば、解凍直後
のトリパンブルー非染色率が８０％以上の保存肝細胞を
得ることができる。

なお、前記デキストランは、糖の重合物であり、、重合
度により分子量の異なるものが存在するが、本発明では
デキストラン４０およびデキストラン７０を好適に使用
することができる。さらに、グリセリン、ジメチルスル
ホキシド、デキストランおよびアルブミンを適切に組合
せることにより、解凍直後のトリパンフルー非染色率の
向上を図ることができる。

例えば、グリセリン６Ｗ／Ｖ％とデキストラン９Ｗ／Ｖ
％を使用し、０．１〜１℃／分の冷却速度で凍結した結
果、トリパンフルー非染色率が９０〜９８％の保存肝細
胞を得ることができた。なお、凍害保護物質の組合せは
、保存肝細胞の利用目的を考慮して選択すればよい。肝
細胞の凍結に際し、例えば、一１９６００の液体窒素中
へ直薮浸潰して急速冷却する場合、グリセリン濃度は３
５〜４０％が適当であるが、冷却速度を遅くすることに
より、低濃度グリセリンの使用でＺ好適な凍結を達成す
ることができる。

また、グリセリンやジメチルスルホキシドを高濃度で使
用すると、非凍結時の操作中に肝細胞の生存率を低下さ
せる原因となり、しかも解凍後の凍害保護物質の除去操
作を考慮するとき煩雑になる等の欠点がＺあり、可能な
限り凍害保護物質の濃度は低いことが望ましい。この場
合、細胞内性凍害保護物質として５〜６Ｗ／Ｖ％、細胞
外性凍害保護物質として８〜１２Ｗ／Ｖ％を夫々使用す
るのが最も好適である。本発明において使用する肝細胞
懸濁液は、肝細胞を生理的塩類緩衝液または培養液に浮
遊懸濁されることにより調製することができる。

生理的塩類緩衝液または培養液は、肝細胞が好適に生存
するに必要な成分を含有するものであれば、特に限定さ
れるものではなく、要は肝細胞懸濁液中で肝細胞がトリ
パンフルー非染色率で９５〜１００％を維持できること
が望ましく、形態学的あるいは生物学的に好ましい状態
を保つことができるものが望ましい。さらに、前記懸濁
液中に補助的な凍害保護効果を有する第３成分を存在さ
せることは差し支えない。また、本発明において、凍害
保護物質の添加に際しては、予め塩類液や培養液に溶解
希釈したものを添加する事が好都合である。

細胞内性凍害保護物質は、一般に細胞内へ浸透して細胞
の内外の濃度が平衡に達するまで若干の時間を要する。
例えば、赤血球の凍結にグリセリンを使用する場合は、
２０〜３７０で１時間以上を要する。本発明において、
肝細砲の凍結にグリセリンを使用する場合は、１〜１０
℃で３０分以内でも充分である。また、ジメチルスルホ
キシドを使用する場合は、さらに速やかであり、細胞外
性凍害保護物質の場合は均質に熔解または懸濁している
限り平衡時間は必要ない。さらに、本発明において、冷
却速度は、肝細胞懸濁液の温度を直接モータリングする
ことにより制御することが望ましい。

少量の試料の場合は、冷却装置あるいは容器により条件
は異なるが、冷却装置の庫内温度を以つて制御すること
も可能である。冷却操作は、一３０ｑｏまで０．１〜３
００／分の速度で冷却し、一３０ｏｏ以降は徐々に冷却
速度を上げて急速冷却へ変換すれば好適である。最終凍
結温度は、用途により選択でき、より長時間の保存を目
的とする場合は、例えば、一１９６００等の超低温が望
ましい。次に、本発明に係る肝細砲の凍結方法につき実
施例を挙げて説明する。

実施例１〜５ハンクス（比ｎｋｓ）液に懸濁させて調製したトリパン
フルー非染色率９８％の単離家兎肝細胞浮遊懸濁液に、
グリセリンおよびデキストラン７０を夫々表１に示す配
合例に従って添加し、時々振り混ぜながら４℃で３０分
間放置した。

この時の肝細胞濃度は１×１０７個／肌であった。得ら
れた懸濁液各１０の【づつをポリエチレンの袋に分注し
、密閉した後、一３０ｏｏまで０．５〜３℃／分の冷却
速度で冷却し、一３０ｑｏ以降は徐々に冷却速度を速め
て−１５０００以下まで冷却して凍結した。凍結した試
料は−１９がｏに保持し、約２０時間経過後に解凍を行
った。解凍は３７００の水浴中へ浸贋振燈して急速に行
い、直ちにトリパンフルー染色により非染色率を計測し
た。計測結果は表１に示す通りであり、グリセリンとデ
キストランとを併用した場合〔実施例３〜５〕のトリパ
ンブルー非染色率が優れていることが確認された。表１実施例６〜８トリパンフルー非染色率９５％の単離ラツト肝細胞を使
用し、グリセリンおよびデキストラン４０を夫々表ロー
こ示す配合例に従って添加し、前記実施例１〜５と同様
の操作を行った。

試料は各２叫づつとした。冷却速度は、一３０ｏｏまで
０．１〜１℃／分で行い、一３００○以降は実施例１〜
５と同様にした。解凍直後のトリパンフルー染色による
非染色率を計測した結果は、表ロに示す通りであり、夫
々優れた肝細胞の生存率が確認された。表Ｕ実施例９〜１６トリパンブルー非染色率１００％の単離家兎肝細胞を使
用し、グリセリン、デキストラン４０、デキストラン７
０を夫々表ｍに示す配合例に従って添加し、前記実施例
１〜５と同様の操作を行った。

試料は各２の【づつとした。冷却速度は、一３０ｑｏま
で０．５ｑｏ／分で行い、一３０ｏｏ以降は実施例１〜
５と同機にした。解凍直後のトリパンブル−染色による
非染色率を計測した結果は、表ｍに示す通りであり、夫
々優れた肝細胞の生存率が確認された。表ｍ実施例
１７〜２３トリパンフルー非染色率９８％の単離家兎肝細胞を使用
し、グリセリン、ジメチルスルホキシド、デキストラン
７０、牛血清アルブミンを夫々表Ｗに示す配合例に従っ
て添加し、前記実施例１〜５と同様の操作を行った。

試料は、細胞濃度２×１０７個／舷とし、各２の‘づつ
とした。冷却速度は、一３０００まで０．１〜１℃／分
で行い、一３０００以降は実施例１〜５と同様にした。
解凍直後のトリパンフルー染色による非染色率を計測し
た結果は、表Ｗに示す通りであり、夫々優れた肝細胞の
生存率が確認された。表【Ｖ上述した実施例から明らかなように、肝細胞懸濁液にグ
リセリン、ジメチルスルホキシドからなる細胞内性凍害
保護物質とデキストラン、アルブミンからなる細胞外性
凍害保護物質とを夫々添加し、緩速冷却して凍結するこ
とにより、解凍直後のトリパンフルー非染色率に基づい
て肝細胞の生存率を著しく向上させることができる。

殊に、本発明の実施例においては、グリセリンとデキス
トランとを絹合せた場合の肝細胞の生存率が極めて高い
という有意差が認められた。本発明方法によれば、凍結
保存肝細胞の生存率を著しく向上することができること
から、生物学的あるいは医学的な分野等における肝細胞
の試験研究への利用を一層促進し、これら試験研究の飛
躍的発展に寄与する効果は極めて大きい。

Claims

【特許請求の範囲】

１グリセリンおよびジメチルスルホキシドよりなる群
から選択される少なくとも１種の細胞内性凍害保護物質
と、デキストランおよびアルブミンよりなる群から選択
される少なくとも１種の細胞外性凍害保護物質とを肝細
胞懸濁液に添加して、最終の肝細胞懸濁液に対する前記
細胞内性凍害保護物質の濃度をグリセリンとしては２０
Ｗ／Ｖ％以下、ジメチルスルホキシドとしては１５Ｗ／
Ｖ％以下としかつ合計して２〜２０Ｗ／Ｖ％の範囲で使
用すると共に、最終の肝細胞懸濁液に対する細胞外性凍
害保護物質の濃度を２０Ｗ／Ｖ％以下で使用し、次いで
０．１〜３℃／分の冷却速度で緩速冷却して凍結するこ
とを特徴とする肝細胞の凍結方法。