CN114158549B - 一种免疫细胞的置核冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞冻存液、使用其的置核冻存方法及其应用。所述细胞冻存液为4～6％HSA、2～4％DMSO或甘油或乙二醇、0.2～0.6M海藻糖或乳糖或蔗糖。本发明的冻存液对细胞或人体伤害更小。本发明的置核冻存技术解决了T淋巴细胞快速冻存的技术难题，降温速率在15℃/min～90℃/min的区间内都可达到较好的冻存效果，降低了实际操作中出现生产事故的概率。

Description

一种免疫细胞的置核冻存方法
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种免疫细胞的置核冻存方法。
背景技术
细胞免疫疗法是目前被国际公认为最有希望攻克癌症的方法之一，调节性T细胞(T regulatory cells)，λδT细胞(gamma delta T cells)，树突细胞(dendritic cells)以及经过基因工程技术改造后的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell)等都是细胞免疫疗法中的重要成员，这其中嵌合抗原受体T细胞(CAR-T cells)在治疗血液淋巴细胞瘤疗效显著，其已在美国及一些欧洲国家被FDA批准作为治疗B系淋巴细胞白血病的有效手段。CAR-T细胞的生产和制备是人T淋巴细胞基础上进行的，因此对人T淋巴细胞进行长期的深低温储存对基础研究或者临床均有及其重要的意义。
细胞冻存是利用深低温环境来抑制活细胞内的生化反应从而实现细胞的长期储存的技术。细胞的扩增通常是有时间限制的，本发明涉及的人T淋巴细胞的扩增周期为14天，超过14天细胞的活力会显著降低，因此低温保存是其能够开展应用的基础。
在低温保存过程中会由于细胞内外的水结晶而对细胞造成严重的低温损伤，目前明确已知的两种低温损伤包括溶质损伤和胞内冰损伤，这两种损伤与降温的速率密切相关。在慢速降温过程中，细胞外的基质比如培养基等会先形成冰晶，使得细胞悬液中的未冻结组分的溶质浓度逐渐升高，细胞在降温过程中逐渐失水并经历严重的渗透压损伤，即渗透损伤。在快速降温过程中，冰晶同样在细胞外基质先形成，但是由于冰晶生长速率过快，细胞没有足够长的时间脱水，导致细胞内的水分在较低温度下形成冰晶，从而造成胞内冰损伤。最为理想的低温保存速率是在降温过程中在不产生渗透损伤之前使得细胞经历足够长时间的脱水，从而抑制胞内冰晶的形成。
在细胞悬液低温冻存过程中，溶液会由于过冷而导致溶液的冰晶延迟形成，过冷体系中的冰晶一旦形成，其生长速率会较快，引起细胞的不充分脱水，从而造成细胞内部冰晶的形成，造成胞内冰损伤。
现有技术中有文献报道了利用置核两步法慢速降温对人脐静脉内皮细胞进行低温保存，其研究了置核后的降温速率，保护剂的配方与浓度(DMSO+HES)，以及进入液氮前的温度。其得出的最优组合是5％DMSO+6％HES，置核温度是-3℃，置核后降温速率是1℃/min，进入液氮前的温度是-35℃。其最优组具体的冻存方法如下：将HUVECs细胞悬液和等体积的2×冻存液混合(5％DMSO+6％HES+EGM[endothelial growth medium])；冻存的体积是200μl，冻存的容器为6*50mm的玻璃培养管，将装有细胞悬液的细胞培养管置于-5℃的低温甲醇浴中平衡2min，用液氮预冷的镊子接触管壁进行置核，之后平衡3min，之后以1℃/min的速率降温至-35℃后直接投入液氮当中(Sultani A Billal.,Marquez-Curtis Leah A.,Elliott Janet A W.,McGann Locksley E.,(2016).Improved Cryopreservation ofHuman Umbilical Vein Endothelial Cells:A Systematic Approach.,Sci Rep,6,34393)。还有文献报道了利用海藻糖预脱水和置核实现了对小鼠成纤维细胞NIH 3T3、小鼠间充质干细胞C3H10T1/2 cells和人血红细胞的低温保存，保护剂仅为海藻糖+DMEM或者海藻糖+PBS。该文献中使用的低温保存方法如下：将200μl的细胞悬液(含0.33M海藻糖)转移至600μl的塑料离心管中。盖好管子后，将其转移至10％的NaCl冰水混合物中(-4℃)平衡5min。细胞冻存的密度为5-10*106个/ml。平衡完成后，用液氮预冷的铜线接触管壁进行置核，然后将管子放回NaCl冰水混合物中平衡1min，之后直接将管子投入液氮中(HuangHaishui.,Zhao Gang.,Zhang Yuntian.,Xu Jiangsheng.,Toth Thomas L.,HeXiaoming.,(2017).Predehydration and Ice Seeding in the Presence of TrehaloseEnable Cell Cryopreservation.,ACS Biomater Sci Eng,3,1758-1768)。当前缺乏一种高存活率、高回收率的免疫细胞冻存方法。
发明内容
为解决现有技术中缺乏一种高存活率、高回收率的免疫细胞快速冻存方法的缺陷，提供了一种免疫细胞优选T淋巴细胞的置核冻存方法。
为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种免疫细胞的置核冻存方法，其包括以下步骤：
(1)将包含免疫细胞与细胞冻存液的冻存管置于-7℃～-18℃的冷却剂中冷却，使冻存管冷却至与冷却剂同温；
(2)将所述冻存管移至所述冷却剂的液面上方，用经液氮预冷1～5分钟的金属接触所述冻存管的管壁对侧，接触1～5秒进行置核；
(3)将所述冻存管置于所述冷却剂中，放置10～15分钟；
(4)将所述冻存管移至低温设备中，以15～90℃/min的速率降温至-150℃～-185℃，放置5～10分钟后，将所述冻存管转移至液氮中储存。
在本申请中，术语“置核”即：使用在液氮中预冷1分钟的金属接触所述冻存管的管壁的一处或多处，使所述冻存管中的细胞冻存液产生冰晶。
在优选的具体实施例中，所述(1)中，将所述冻存管置于-10℃～-18℃的冷却剂中冷却；和/或，所述冷却剂为异丙醇、无水乙醇或盐水。
在优选的具体实施例中，所述(2)中，将所述冻存管移至于所述冷却剂的液面上方0.5～2cm优选1cm处，和/或，所述金属为镊子或铜线；
在优选的具体实施例中，所述预冷的时间为1分钟，和/或，所述置核的时间为1秒。
在优选的具体实施例中，所述(4)中，以50℃/min的速率降温，和/或，所述低温设备为程序降温仪例如Thermo Fisher Scientific 7453。
在优选的具体实施例中，所述(1)中，所述免疫细胞为T淋巴细胞；和/或，所述免疫细胞的量为0.5～2×107个细胞/毫升；优选所述T淋巴细胞由PBMC通过CD3和CD28双信号刺激培养得到。
在优选的具体实施例中，所述(1)中，所述冻存管为1.2ml的冻存管、0.5ml的EP管或经打孔优化传热的2.5ml的冻存管。
在优选的具体实施例中，所述(1)中，所述细胞冻存液为4～6％HSA、2～7.5％优选2～4％DMSO或甘油或乙二醇、0.2～0.6M海藻糖或乳糖或蔗糖。较佳地，所述免疫细胞与所述细胞冻存液的比例为0.5～2×107个细胞/ml:0.5ml。
在优选的具体实施例中，所述置核冻存方法包括以下步骤：
(1)将所述冻存管置于-10～-18℃的异丙醇中冷却10分钟；所述冻存管中含由0.5ml细胞冻存液保存的0.5～2×107个T淋巴细胞；
(2)将所述冻存管移至异丙醇的液面上方1cm处，用经液氮预冷1分钟的镊子夹住冻存管管壁对侧，接触1秒进行置核；
(3)将所述冻存管移至所述冷却剂中，放置10分钟；
(4)将所述冻存管移至程序降温仪中，以50～90℃/min的速率降温，放置5分钟后，将所述冻存管转移至液氮中储存；
其中，所述细胞冻存液为4％HSA、2％DMSO或甘油或乙二醇，以及0.2～0.6M海藻糖。
为解决上述技术问题，本发明的第二方面提供了一种细胞冻存液，其中，所述细胞冻存液为4～6％HSA、2～7.5％DMSO或甘油或乙二醇，以及0.2～0.6M海藻糖或乳糖或蔗糖。
优选地，所述细胞冻存液为4％HSA、2％DMSO或甘油或乙二醇，以及0.2～0.6M海藻糖。
为解决上述技术问题，本发明的第三方面提供了所述的细胞冻存液在制备免疫细胞置核冻存的试剂中的应用。
本发明通过优化置核冻存技术解决了T淋巴细胞快速冻存这一技术难题。此外，本发明也解决了细胞冻存过程中由于结晶温度不可控造成的样本冻存过程不可控的难题。采用本发明进行细胞冻存更利于细胞冻存标准操作规范的建立。最后，本发明通过置核技术解决了冻存液的细胞毒性这一难题。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明通过优化置核冻存技术解决了免疫细胞尤其是T淋巴细胞快速冻存这一技术难题，在降温速率为15℃/min～90℃/min的区间内都可达到较好的冻存效果，降低了实际操作中出现生产事故的概率。此外，本发明也解决了细胞冻存过程中由于结晶温度不可控造成的样本冻存过程不可控的难题，采用本发明进行细胞冻存更利于细胞冻存标准操作规范的建立。最后，本发明通过置核技术解决了冻存液的细胞毒性这一难题，可使用极低浓度的DMSO或者采用毒性更低的其他保护剂组合配方进行冻存，本发明中使用的冻存液配方渗透压远低于市面上使用的其他冻存液，对细胞或人体伤害更小。
附图说明
图1为人T淋巴细胞置核冻存的具体步骤示意图。
图2为全部冻存过程中程序降温仪的运行程序。
图3示出了冻存过程中冻存管内样品的实际温度变化情况。
图4为细胞复苏后的细胞计数显微照片。
图5示出了采用不同冻存程序冻存的人T淋巴细胞复温后的存活率以及回收率。
图6示出了采用不同置核后降温速率冻存细胞的存活率。
图7示出了采用不同置核后降温速率冻存细胞的回收率。
图8示出了采用不同置核温度冻存细胞的存活率。
图9示出了采用不同置核温度冻存细胞的回收率。
图10示出了采用不同浓度冻存液冻存细胞的存活率。
图11示出了采用不同浓度冻存液冻存细胞的回收率。
图12示出了采用不同种类冻存液冻存细胞的存活率。
图13示出了采用不同种类冻存液冻存细胞的回收率。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行详细描述。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明提供的T淋巴细胞冻存液、以及冻存方法中所用的原料以及试剂均可由市场购得。人T淋巴细胞由人外周血单个核细胞(PBMC)进行体外诱导扩增，PBMC来源：使用Spectra Optia(TERUMO,Optia，日本)从健康志愿者的静脉血中分离出PBMC细胞。按照一定的细胞密度，用cryosureedx40(WAK,Cat.0482)冻存液进行冻存细胞，冻存体系为1mL/支，将有细胞和冻存液的冻存管放入程序降温盒，于-80℃冰箱中放置过夜后，细胞转入液氮罐(-196℃)中低温保存。T淋巴细胞由PBMC通过双信号刺激(CD3、CD28)培养得到。
人T淋巴细胞体外扩增培养方法如下：利用CD3、CD28抗体包被培养容器，CD3和CD28的包被浓度均为2μg/ml，包被时间为3h，刺激培养时间为72h，扩增培养时间为12-14天。扩增培养基为X-ViVo+5％FBS+1000IU/ml白介素2。利用扩增培养基将PBMC置于所述包被后的培养容器内进行扩增培养。扩增培养用于冻存的人T淋巴细胞最终存活率需达到90％左右。图1为人T淋巴细胞置核冻存的具体步骤。使用AO/PI荧光染料(NexcelomBioscience,Lawrence,USA)进行对细胞染色，用Cellometer Auto 2000细胞计数仪(Nexcelom Bioscience,Lawrence,USA)进行计数。
步骤简述如下：
1.1:1混合细胞悬液与AO/PI荧光染料；
2.吸取20μl细胞悬液+AO/PI荧光染料混合液到配套的计数板孔内；
3.将计数板放置到Cellometer Auto 2000细胞计数仪内，选择相应的程序(根据细胞类型的不同细胞计数会有对应的计数程序)进行计数。
Cellometer Auto 2000细胞计数仪可根据细胞种类编辑特定的计数程序，计数程序的参考依据为细胞的尺寸信息。具体的计数程序如下：
1.AO荧光染料激发波长为470nm，发射波长为535nm；
2.PI荧光染料激发波长为540nm，发射波长为605nm；
3.细胞直径为4-20μm。
实施例1
人T淋巴细胞置核冻存的具体流程，-5℃和-10℃置核后经过50℃/min程序降温的实验结果。
1.人T淋巴细胞冻存液的配制
13.692g海藻糖(国药集团化学试剂有限公司)用56ml生理盐水溶解，混匀；之后缓慢加入40ml人白蛋白注射液(GRIFOLS，10g(20％:50ml))、4ml乙二醇(国药集团化学试剂有限公司)，混匀，置于4℃冰箱中保存备用。由此，本实施例的2×细胞冻存液的配方即：8％HSA、4％乙二醇，以及0.4M海藻糖。
2.人T淋巴细胞收集与保护剂加载
将扩增培养后的人T淋巴细胞悬液转移至50ml离心管中并取50μl进行计数，配平后置于离心机中，离心力为500g，离心时间为5min。用1640培养基重悬细胞并根据计数结果决定加入1640培养基的量，调节细胞密度至1×107个/ml左右。调整细胞密度后再次离心，离心力为500g，离心时间为5min。用移液枪吸取一半体积的上清，然后逐滴加入4℃的2×人T淋巴细胞冻存液，边滴加冻存液加边旋转离心管。采用规格为1ml的冻存管作为冻存容器，每管的冻存体积为0.5ml。加载好冻存液后轻轻吹打混匀后，分装到冻存管中，置于4℃冰箱中平衡10min。所述平衡即：使冻存管中细胞冻存液的温度与环境温度接近或相同，并维持该温度。每批样品设置三支冻存管作为实验组，另外三支作为对照组，实验组采用置核操作，空白组不进行置核。
3.人T淋巴细胞的置核冻存
取50ml异丙醇于烧杯中，使用程序降温仪将异丙醇控温到置核温度。发明人发现，其他冷却剂比如无水乙醇、盐水浴等也可用于本发明，只要其能提供一个稳定的低温水浴环境即可。本实施例中的置核温度为-5℃和-10℃。将实验组冻存管置于预冷的异丙醇中，对照组直接置于程序降温仪隔板上，关闭舱门平衡10min，使样本降温至置核温度。打开舱门，从异丙醇中取出实验组冻存管并置于异丙醇液面上方。用液氮预冷1min的镊子夹住冻存管管壁5s进行置核。发明人通过实验发现，镊子的预冷时间不能小于1min，由于液氮温度极低，而且镊子为金属，1min足够镊子进行预冷，此外，延长镊子的预冷时间也不会影响置核效果。置核时间长短和容器的特性相关，管壁越薄，导热性越好，置核(金属或镊子夹持冻存管管壁对侧)时间越短。将置核完成的冻存管放回异丙醇中继续平衡10min，然后打开程序降温仪舱门将冻存管取出置于舱内的隔板上，关闭舱门。设定程序降温仪，以90℃/min的速率将舱内环境温度降温至-150℃，并平衡5min。图2为全部冻存过程中程序降温仪的运行程序。图3为冻存管内样品的实际降温速率，经Applent AT4204多路温度测试仪测量，其降温速率约为50℃/min。降温完毕后打开舱门，取出冻存管，将其转移至气相液氮罐中，24h后复苏进行活性检测。
4.人T淋巴细胞的复苏与活性检测
将冻存管从气相液氮罐中取出，迅速用镊子夹住并放入已预热至37℃水浴锅中，轻轻摇晃使细胞悬液融化，当液体中仅存在一小块冰晶时停止复温，并转移至生物安全柜中。使用手动移液枪吸取所有的细胞悬液，缓慢加入含有4.5ml 1640培养基的15ml离心管中，细胞悬液与1640稀释液的体积比为1:9，置于4℃下平衡15min，使细胞内部的保护剂渗透出细胞。洗脱完成后，将离心管配平并置于离心机中，离心力为500g，离心时间为5min。离心后用0.5ml的人T淋巴细胞培养基重悬，混匀后吸取50μl体积用于计数和活性检测。本发明使用的细胞计数方法为AOPI染色计数法，使用细胞计数仪为Nexcelom Auto2000。
5.实验结果
图4为细胞复苏后的计数显微照片，显示采用-10℃置核、50℃/min的降温速率冻存后细胞状态最好；其他组活细胞数明显下降，死亡细胞数目明显增加。图5为采用不同冻存程序冻存的人T淋巴细胞复温后的存活率以及回收率。图5中仅对比存活率和回收率内部不同降温程序的显著性差异，存活率和回收率之间不进行显著性分析，不同的英文字母表示存在显著性差异，P<0.05。由图5可见，采用-10℃置核，50℃/min的降温速率冻存的细胞复苏后存活率和回收率要显著高于其他两组，其存活率为91.3％，回收率为78.0％；采用-5℃置核，50℃/min的降温速率冻存的细胞复苏后存活率和回收率分别为52.8％和37.4％；不置核，直接采用50℃/min的降温速率冻存的细胞复苏后存活率和回收率最低，分别28.2％和21.9％。
实施例2
本实施例中细胞的存活率以及回收率为细胞刚复苏时的结果，存活率直接从Cellometer Auto 2000细胞计数仪(NexcelomBioscience,Lawrence,USA)上得到，回收率计算的公式如下：
细胞回收率＝冻存前的活细胞浓度/冻存后的活细胞浓度。
置核后降温速率最佳范围确定
1.人T淋巴细胞冻存液的配制
10.269g海藻糖(国药集团化学试剂有限公司)用20ml生理盐水溶解，混匀，定容至终体积30ml，配制成1M的海藻糖母液；按照4％DMSO，0.4M海藻糖，8％HSA的比例配比成2×的冻存液，置于4℃冰箱中保存备用。
2.人T淋巴细胞收集与保护剂加载
将扩增培养后的人T淋巴细胞悬液转移至50ml离心管中并取50μl进行计数，配平后置于离心机中，离心力为500g，离心时间为5min。用1640培养基重悬细胞并根据计数结果决定加入1640培养基的量，调节细胞密度至1×107个/ml左右。调整细胞密度后再次离心，离心力为500g，离心时间为5min。用移液枪吸取一半体积的上清，然后逐滴加入4℃的2×人T淋巴细胞冻存液，边滴加冻存液加边旋转离心管。采用规格为1ml的冻存管作为冻存容器，每管的冻存体积为0.5ml。加载好冻存液后轻轻吹打混匀后，分装到冻存管中，置于4℃冰箱中平衡10min。每批样品设置三支冻存管作为实验组，另外三支作为对照组，实验组采用置核操作，空白组不进行置核。
3.人T淋巴细胞的置核冻存
取50ml异丙醇于烧杯中，使用程序降温仪将异丙醇控温到置核温度。本实施例中的置核温度为-10℃。将实验组冻存管置于预冷的异丙醇中，对照组直接置于程序降温仪隔板上，关闭舱门平衡10min，使样本降温至置核温度。打开舱门，从异丙醇中取出冻存管并置于异丙醇液面上方。用液氮预冷的镊子夹住实验组冻存管管壁5s进行置核。将置核完成的冻存管放回异丙醇中继续平衡10min，然后打开程序降温仪舱门将冻存管取出置于舱内的隔板上，关闭舱门。设定程序降温仪使样品分批按照15℃/min、50℃/min、90℃/min的降温速率进行降温，降温完毕后打开舱门，取出冻存管，将其转移至液氮中，5min后复苏进行活性检测。最后一组在置核平衡完成后直接取出置于液氮中以获得500℃/min的降温速率。
4.人T淋巴细胞的复苏与活性检测
将冻存管从液氮中取出，迅速放入已预热至37℃水浴锅中，轻轻摇晃使细胞悬液融化，当液体中仅存在一小块冰晶时停止复温。复温完成后混匀细胞并吸取50μl体积用于计数和活性检测。本发明使用的细胞计数方法为AOPI染色计数法，使用细胞计数仪为Nexcelom auto2000。
5.实验结果
图6和图7分别为采用不同置核后降温速率冻存的细胞相对存活率与回收率。实验发现在降温速率为15℃/min～90℃/min的区间内，冻存细胞均具有较好的存活率(相对存活率94％以上)以及回收率(90％以上)。因此，针对人T淋巴细胞的置核冻存，置核后降温速率可在15℃/min-90℃/min优选50℃/min-90℃/min的区间内进行选择。
实施例3
置核温度的最佳范围确定
1.人T淋巴细胞冻存液的配制
10.269g海藻糖(国药集团化学试剂有限公司)用20ml生理盐水溶解，混匀，定容至终体积30ml，配制成1M的海藻糖母液；按照4％DMSO，0.4M海藻糖，8％HSA的比例配比成2×的冻存液，置于4℃冰箱中保存备用。
2.人T淋巴细胞收集与保护剂加载
将扩增培养后的人T淋巴细胞悬液转移至50ml离心管中并取50μl进行计数，配平后置于离心机中，离心力为500g，离心时间为5min。用1640培养基重悬细胞并根据计数结果决定加入1640培养基的量，调节细胞密度至1×107个/ml左右。调整细胞密度后再次离心，离心力为500g，离心时间为5min。用移液枪吸取一半体积的上清，然后逐滴加入4℃的2×人T淋巴细胞冻存液，边滴加冻存液加边旋转离心管。采用规格为1ml的冻存管作为冻存容器，每管的冻存体积为0.5ml。加载好冻存液后轻轻吹打混匀后，分装到冻存管中，置于4℃冰箱中平衡10min。每批样品设置三支冻存管作为实验组，另外三支作为对照组，实验组采用置核操作，空白组不进行置核。
3.人T淋巴细胞的置核冻存
取50ml异丙醇于烧杯中，使用程序降温仪将异丙醇控温到置核温度。本实施例中的置核温度为-5℃、-7℃、-10℃、-14℃、-16℃和-18℃。将冻存管置于预冷的异丙醇中，关闭舱门平衡10min，使样本降温至置核温度。打开舱门，从异丙醇中取出冻存管并置于异丙醇液面上方。用液氮预冷1min的镊子夹住冻存管管壁5s进行置核。将置核完成的冻存管放回异丙醇中继续平衡10min，然后打开程序降温仪舱门将冻存管取出置于舱内的隔板上，关闭舱门。设定程序降温仪以90℃/min的速率将舱内环境温度降温至-185℃，并平衡5min。图2为全部冻存过程中程序降温仪的运行程序。图3为冻存管内样品的实际降温速率，经Applent AT4204多路温度测试仪测量，其降温速率约为90℃/min。降温完毕后打开舱门，取出冻存管，将其转移至液氮中，5min后复苏进行活性检测。
4.人T淋巴细胞的复苏与活性检测
将冻存管从液氮中取出，迅速放入已预热至37℃水浴锅中，轻轻摇晃使细胞悬液融化，当液体中仅存在一小块冰晶时停止复温。复温完成后混匀细胞并吸取50μl体积用于计数和活性检测。本发明使用的细胞计数方法为AOPI染色计数法，使用细胞计数仪为Nexcelom Auto2000。
5.实验结果
图8和图9分别为采用不同的置核温度冻存的细胞相对存活率与回收率。实验发现在-10℃到-18℃的温度区间内进行置核均可获得较好的冻存细胞存活率(相对存活率94％以上)以及回收率(平均90％左右)。在高于-10℃下进行置核，比如本实验中的-7℃和-5℃，会使得细胞的相对存活率和回收率显著下降(P<0.05)。因此，针对人T淋巴细胞的置核冻存，置核温度可在-10℃到-18℃的温度区间内进行选择。
实施例4
置核冻存液浓度优化
本实施例中海藻糖的最高浓度为0.6M。
1.人T淋巴细胞冻存液的配制
10.269g海藻糖(国药集团化学试剂有限公司)用20ml生理盐水溶解，混匀，定容至终体积30ml，配制成1M的海藻糖母液。实验设计DMSO的浓度为2％(V/V)和7.5％(V/V)，海藻糖的浓度为0.2M和0.6M，通过交互实验设计得到以下配方组合：
表1冻存液配方
2.人T淋巴细胞收集与保护剂加载
将扩增培养后的人T淋巴细胞悬液转移至50ml离心管中并取50μl进行计数，配平后置于离心机中，离心力为500g，离心时间为5min。用1640培养基重悬细胞并根据计数结果决定加入1640培养基的量，调节细胞密度至1×107个/ml左右。调整细胞密度后再次离心，离心力为500g，离心时间为5min。用移液枪吸取全部上清，然后逐滴加入4℃的1×表1的冻存液，边滴加冻存液加边旋转离心管。采用规格为1ml的冻存管作为冻存容器，每管的冻存体积为0.5ml。加载好冻存液后轻轻吹打混匀后，分装到冻存管中，置于4℃冰箱中平衡10min。每批样品设置三支冻存管作为实验组，另外三支作为对照组，实验组采用置核操作，空白组不进行置核。
3.人T淋巴细胞的置核冻存
取50ml异丙醇于烧杯中，使用程序降温仪将异丙醇控温到置核温度。本实施例中的置核温度为-16℃。将冻存管置于预冷的异丙醇中，关闭舱门平衡10min，使样本降温至置核温度。打开舱门，从异丙醇中取出冻存管并置于异丙醇液面上方。用液氮预冷1min的镊子夹住冻存管管壁5s进行置核。将置核完成的冻存管放回异丙醇中继续平衡10min，然后打开程序降温仪舱门将冻存管取出置于舱内的隔板上，关闭舱门。设定程序降温仪以90℃/min的速率将舱内环境温度降温至-185℃，并平衡5min。图2为全部冻存过程中程序降温仪的运行程序。图3为冻存管内样品的实际降温速率，经applent AT4204多路温度测试仪测量，其降温速率约为90℃/min。降温完毕后打开舱门，取出冻存管，将其转移至液氮中，5min后复苏进行活性检测。
4.人T淋巴细胞的复苏与活性检测
将冻存管从液氮中取出，迅速放入已预热至37℃水浴锅中，轻轻摇晃使细胞悬液融化，当液体中仅存在一小块冰晶时停止复温。复温完成后混匀细胞并吸取50μl体积用于计数和活性检测。本发明使用的细胞计数方法为AOPI染色计数法，使用细胞计数仪为Nexcelom Auto 2000。
5.实验结果
下表2、图10和图11分别为采用不同的DMSO和海藻糖浓度的冻存液冻存的细胞相对存活率与回收率。实验发现DMSO浓度区间为2％-7.5％，且海藻糖的浓度区间为0.2M-0.6M时，冻存细胞相对存活率均在95％以上，无统计学差异(P>0.05)。在海藻糖浓度为0.2M时，DMSO的浓度从2％提高到7.5％，采用置核冻存细胞的回收率有显著下降。发明人推测其原因是DMSO本身是对细胞有毒性的，但是其低温保护效果显著，所以需要在细胞毒性和低温保护效果之间找到平衡，而海藻糖是无毒的胞外低温保护剂，并且具有稳定并保护细胞膜的作用，在高海藻糖和高DMSO联合使用的情况下，海藻糖可抵消DMSO对细胞造成的损伤。
标有不同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间差异不显著(P>0.05)。
表2不同配方获得的细胞相对存活率和回收率
实施例5
1.人T淋巴细胞冻存液的配制
在HSA浓度均为4％的前提下，实验设计以等体积浓度的甘油和乙二醇来替代DMSO作为渗透性低温保护剂，以等物质的量浓度的蔗糖和乳糖来替代海藻糖作为非渗透性保护剂。
具体的配方组合见表3：
表3同类型低温保护剂替代配方
2.人T淋巴细胞收集与保护剂加载
将扩增培养后的人T淋巴细胞悬液转移至50ml离心管中并取50μl进行计数，配平后置于离心机中，离心力为500g，离心时间为5min。用1640培养基重悬细胞并根据计数结果决定加入1640培养基的量，调节细胞密度至1×107个/ml左右。调整细胞密度后再次离心，离心力为500g，离心时间为5min。用移液枪吸取全部上清，然后逐滴加入4℃的1×表1冻存液，边滴加冻存液加边旋转离心管。采用规格为1.2ml的冻存管作为冻存容器，每管的冻存体积为0.5ml。加载好冻存液后轻轻吹打混匀后，分装到冻存管中，置于4℃冰箱中平衡10min。每批样品设置三支冻存管作为实验组，另外三支作为对照组，实验组采用置核操作，空白组不进行置核。
3.人T淋巴细胞的置核冻存
取50ml异丙醇于烧杯中，使用程序降温仪将异丙醇控温到置核温度。本实施例中的置核温度为-16℃。将冻存管置于预冷的异丙醇中，关闭舱门平衡10min，使样本降温至置核温度。打开舱门，从异丙醇中取出冻存管并置于异丙醇液面上方。用液氮预冷1min的镊子夹住冻存管管壁5s进行置核。将置核完成的冻存管放回异丙醇中继续平衡10min，然后打开程序降温仪舱门将冻存管取出置于舱内的隔板上，关闭舱门。设定程序降温仪以90℃/min的速率将舱内环境温度降温至-185℃，并平衡5min。图2为全部冻存过程中程序降温仪的运行程序。图3为冻存管内样品的实际降温速率，经Applent AT4204多路温度测试仪测量，其降温速率约为90℃/min。降温完毕后打开舱门，取出冻存管，将其转移至液氮中，5min后复苏进行活性检测。
4.人T淋巴细胞的复苏与活性检测
将冻存管从液氮中取出，迅速放入已预热至37℃水浴锅中，轻轻摇晃使细胞悬液融化，当液体中仅存在一小块冰晶时停止复温。复温完成后混匀细胞并吸取50μl体积用于计数和活性检测。本发明使用的细胞计数方法为AOPI染色计数法，使用细胞计数仪为Nexcelom Auto 2000。
5.实验结果
表4、图12和图13分别为采用不同配方的冻存液冻存的细胞相对存活率与回收率。实验发现在置核的条件下2％乙二醇和2％甘油能够等效替代2％DMSO，0.2M蔗糖和0.2M乳糖能够等效替代0.2M海藻糖，在冻存细胞的相对存活率和回收率上均没有统计学差异。因此，针对人T淋巴细胞的置核冻存，可选择乙二醇、甘油或者DMSO作为渗透性保护剂，可选择蔗糖，乳糖或者海藻糖作为低温保护剂。
表4不同配方获得的细胞相对存活率和回收率
配方编号 相对存活率 回收率
1 95.4±0.6％ 100.4±3.3％
8 95.8±0.4％ 95.4±0.1％
9 96.6±0.1％ 93.8±3.0％
10 97.6±0.5％ 94.4±3.2％
11 96.7±0.2％ 94.4±4.7％
总结：
1.在不置核的条件下，发明人发现在不同种类的渗透性保护剂(DMSO、乙二醇和甘油)之间以及不同非渗透性保护剂(海藻糖，蔗糖，乳糖)存在冻存效果的差异，这是由于不同保护剂之间存在由于分子结构的差异，导致其水合性能、冰晶抑制能力、细胞膜通透性以及对于细胞膜的保护等存在差异，导致最终其保护效果有所不同。
2.存活率和回收率之间并不一定具有线性的联系，存活率为机器直接读数所得，回收率为机器中读出的活细胞浓度经计算所得。存活率反映的是在所有的细胞中，存活细胞的占比；而回收率反应的是冻存后存留的活细胞总数量比上冻存前活细胞总数量。
3.图12和图13反映出了置核这一技术的部分内在机理，即低温浓缩效应，通过置核使得冻存液中的保护剂的浓度在冰晶生长过程中逐渐升高，而使得在非置核情况下中的保护剂特性之间的差异信号被掩盖，从而出现图12和13中所有组合在置核条件下都无显著差异的情况。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种免疫细胞的置核冻存方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)将包含T淋巴细胞与细胞冻存液的冻存管置于-16℃的冷却剂中冷却，使冻存管冷却至与冷却剂同温；所述冷却剂为异丙醇；
(2)将所述冻存管移至所述冷却剂的液面上方，用经液氮预冷1～5分钟的金属接触所述冻存管的管壁对侧，接触1秒进行置核；
(3)将所述冻存管置于所述冷却剂中，放置10分钟；
(4)将所述冻存管移至低温设备中，以90℃/min的速率降温至-185℃，放置5分钟后，将所述冻存管转移至液氮中储存；
所述细胞冻存液为4％HSA、2％DMSO，以及0.2M海藻糖。
2.如权利要求1所述的置核冻存方法，其特征在于，
所述(2)中，将所述冻存管移至于所述冷却剂的液面上方0.5～2cm处，和/或，所述金属为镊子或铜线。
3.如权利要求2所述的置核冻存方法，其特征在于，将所述冻存管移至于所述冷却剂的液面上方1cm处；
所述预冷的时间为1分钟。
4.如权利要求1所述的置核冻存方法，其特征在于，
所述(4)中，所述低温设备为程序降温仪。
5.如权利要求4所述的置核冻存方法，其特征在于，所述程序降温仪为Thermo FisherScientific 7453。
6.如权利要求1所述的置核冻存方法，其特征在于，
所述(1)中，所述T淋巴细胞的量为0.5～2×107个细胞/毫升。
7.如权利要求1所述的置核冻存方法，其特征在于，所述T淋巴细胞由PBMC通过CD3和CD28双信号刺激培养得到。
8.如权利要求1所述的置核冻存方法，其特征在于，
所述(1)中，所述冻存管为1.2ml的冻存管、0.5ml的EP管或经打孔优化传热的2.5ml的冻存管。
9.如权利要求1所述的置核冻存方法，其特征在于，
所述(1)中，所述T淋巴细胞与所述细胞冻存液的比例为0.5～2×107个细胞/ml:0.5ml。
10.如权利要求1所述的置核冻存方法，其特征在于，
(1)将所述冻存管置于-16℃的异丙醇中冷却10分钟；所述冻存管中含由0.5ml细胞冻存液保存的0.5～2×107个T淋巴细胞；
(2)将所述冻存管移至异丙醇的液面上方1cm处，用经液氮预冷1分钟的镊子夹住冻存管管壁对侧，接触1秒进行置核；
(3)将所述冻存管移至所述冷却剂中，放置10分钟；
(4)将所述冻存管移至程序降温仪中，以90℃/min的速率降温，放置5分钟后，将所述冻存管转移至液氮中储存；
其中，所述细胞冻存液为4％HSA、2％DMSO，以及0.2M海藻糖。
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