CN108244102B - 一种生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂、试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂、试剂盒及其使用方法。本发明所述生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂包括细胞内玻璃化冷冻试剂，所述细胞内玻璃化冷冻试剂包括跨膜载体和包裹在所述跨膜载体中的冷冻保护剂，所述冷冻保护剂选自糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻化保护剂或胺类冷冻保护剂，因此，本发明所述玻璃化冷冻试剂能够在避免细胞内形成冰晶同时，还极大地降低冷冻保护剂对细胞的毒性，提升细胞的存活率，保障细胞的正常发育。
Description
技术领域
本发明涉及生殖冷冻领域，具体而言，涉及一种生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂、试剂盒及其使用方法。
背景技术
生殖冷冻保存是指通过特殊的保护措施和降温程序，使生殖细胞和胚胎等在-196℃条件下停止代谢，而升温后又回复代谢能力的技术。随着体外受精-胚胎移植及其衍生技术的不断发展，涉及生殖细胞和胚胎的生殖冷冻保存技术已经成为人类辅助生殖领域或动物育种领域中必不可少的组成部分。
目前，常规的生殖冷冻技术包括慢速冷冻法和玻璃化冷冻法。
其中，慢速冷冻法是大多数哺乳动物生殖冷冻保存的主要方法。该方法选择较低浓度的渗透性防冻剂，采用缓慢降温和快速解冻的方法来保存冷冻生殖。常规慢速冷冻法可以分为以下6个步骤：(1)室温下生殖细胞或胚胎置于低分子量渗透性防冻液中5～10min，使生殖细胞/胚胎和冷冻液间达到平和；(2)在-5～-7℃植冰；(3)以0.2～2℃/min的速度缓慢降温；(4)降温到-30～-70℃，投入液氮中保存；(5)以250℃/min的速度快速解冻(例如25℃水中)；(6)在培养或移植前，室温下除去防冻剂[1]。
玻璃化冷冻是通过高浓度冷冻保护剂在冷冻过程中固化形成无结构的玻璃样物质从而减少细胞内外冰晶的形成以保护生殖的冷冻方法。所述无结构的玻璃样物质的质点不规则排列，能始终保持溶液的水分子和离子分布，使跨膜物质的浓度和渗透压差别不大，从而避免细胞内产生冰晶对细胞的机械性损伤，也消除细胞外冰晶形成引起的理化损伤[2]。与慢速低温冷冻法相比，玻璃化冷冻法无需降温仪精密控制降温速度，仅需1分钟即可完成，简化操作过程，大大缩短操作时间，同时玻璃化冷冻能大幅度提高生物样品的冷冻速率，使生物样品迅速穿过危险区温区，同时减少冰晶对细胞骨架、膜完整性等的损伤，对细胞的冷冻损伤更小。因此，玻璃化冷冻技术已经成为生殖冷冻技术新方向。
而尽管玻璃化冷冻技术存在诸多优势，已经成为发展趋势之所在，但现有的玻璃化冷冻技术仍然存在一定的瓶颈，限制其推广和应用，具体而言，主要表现在：
(1)玻璃化液需要加入高浓度的低温保护剂以避免冷冻过程中冰晶的形成。一般而言，渗透性低温保护剂浓度≥4M，非渗透性低温保护剂浓度≥0.5M。而高浓度的低温保护剂具有毒性，影响生殖细胞的质量以及胚胎的生长发育。例如，二甲基亚砜增加细胞外钙离子向细胞内流动，造成细胞的潜在损害，影响细胞的分化和DNA的甲基化。而乙二醇浓度过高，则会影响细胞线粒体的功能。就目前的玻璃化冷冻效果而言，胚胎的发育率、临床妊娠率和着床率难以达到令人满意的水平。
(2)发生玻璃化转变的生殖细胞或胚胎一直保存在液氮中，当需要恢复其活性时，必须复温到环境温度，但在复温过程中，玻璃化细胞及其周边冷冻保护液溶液容易却极其容易再次形成冰晶，对细胞造成严重的损伤。
为解决上述技术问题，现有技术尝试在生殖冷冻用玻璃化液中加入脯氨酸，以降低二甲基亚砜以及乙二醇等渗透型冷冻保护剂的使用，从而减少二甲基亚砜以及乙二醇等对细胞的毒害作用。但上述尝试不能完全避免二甲基亚砜以及乙二醇的使用。CN104839144A虽然在玻璃化冷冻液中加入脯氨酸，但其仍需要加入5～15v/v％的二甲基亚砜以及乙二醇，因此，仍然对细胞具有一定的毒害作用。
其次，现有技术还尝试在冷冻用玻璃化液中加入纳米颗粒，依靠纳米颗粒的高导热性，在复温过程中避免细胞内外再次结晶。但现有的纳米颗粒，例如二氧化钛纳米颗粒等对细胞具有较强的毒性，影响细胞的存活率和发育率。
因此，本领域亟待对现有的生殖冷冻用玻璃化液进行改进，以期极大地降低DMSO以及乙二醇的用量，甚至完全不使用DMSO和乙二醇，并减少纳米颗粒对细胞的毒性。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂，其中所述玻璃化冷冻试剂包括细胞内玻璃化冷冻试剂，该细胞内保护剂利用跨膜载体将糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻保护剂或胺类冷冻保护剂转运到细胞内，在避免细胞内形成冰晶同时，还能够极大地降低冷冻保护剂对细胞的毒性，提升细胞的存活率，保障细胞的正常发育；
进一步的，本发明所述细胞类冷冻保护剂优选为葡萄糖、脯氨酸，在复温之后，葡萄糖可以直接被细胞消耗利用，而脯氨酸则可以通过被动扩散的方式从细胞内扩散到细胞外中；
进一步地，本发明所述玻璃化冷冻试剂还包括细胞外玻璃化冷冻试剂，所述细胞外玻璃化冷冻试剂同样选自糖类、糖醇类或胺类冷冻保护剂，可减少冷冻保护剂对细胞的毒性；
更进一步地，本发明所述细胞外玻璃化冷冻试剂中还包括表面包裹有由超低粘度海藻酸或其衍生物交联形成的凝胶层的石墨烯纳米颗粒，所述纳米颗粒包裹的凝胶层极薄，不但可以极大减少、甚至基本消除石墨烯纳米颗粒对细胞的毒性，同时还保有良好的导热性能，可以有效避免重结晶；
更进一步地，本发明所述石墨烯纳米颗粒为磁性石墨烯纳米颗粒，可通过电磁感应加热辅助冻存细胞的复温，同时，所述磁性石墨烯纳米颗粒可以容易地与冻存细胞分离并回收。
本发明的第二目的在于提供一种用于玻璃化冷冻的试剂盒，所述试剂盒包括前述玻璃化液和其他辅助试剂，便于储存、运输和使用。
本发明的第三目的在于提供前述细胞内玻璃化冷冻试剂在制备生殖冷冻用玻璃化液中的应用。
本发明的第四目的在于提供前述细胞内玻璃化冷冻试剂和细胞外玻璃化冷冻试剂在制备生殖冷冻用玻璃化液中的应用。
本发明的第五目的在于提供一种生殖冷冻保存方法，所述方法使用前述玻璃化液或试剂盒进行生殖冷冻保存，所述保存方法可减少低温保护剂对细胞的毒性以及避免复温过程出现重结晶。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂，所述玻璃化冷冻试剂包括细胞内玻璃化冷冻试剂，所细胞内玻璃化冷冻试剂包括跨膜载体和包裹在所述跨膜载体中的冷冻保护剂，所述冷冻保护剂选自糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻化保护剂或胺类冷冻保护剂。
本发明还涉及用于玻璃化冷冻的试剂盒，所述试剂盒包前述玻璃化冷冻试剂和其他辅助试剂。
本发明还涉及前述细胞内玻璃化冷冻试剂在制备生殖冷冻用玻璃化液中的应用。
本发明还涉及述细胞内玻璃化冷冻试剂和细胞外玻璃化冷冻试剂在制备生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂中的应用。
本发明还涉一种生殖冷冻保存方法，所述方法使用前述玻璃化冷冻试剂或者前述试剂盒进行生殖冷冻保存。
具体实施方式
本发明涉及用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂，所述玻璃化冷冻试剂包括细胞内玻璃化冷冻试剂，所述细胞内玻璃化冷冻试剂包括跨膜载体和包裹在所述跨膜载体中的冷冻保护剂，所述冷冻保护剂选自糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻化保护剂或胺类冷冻保护剂。
在玻璃化冷冻过程中，现有的玻璃化液主要依靠渗透型冷冻保护剂，例如，二甲基亚砜、乙二醇或脯氨酸，渗入到细胞内部，提高细胞内渗透压，避免因降温而形成细胞内冰晶。但二甲基亚砜和乙二醇对细胞具有较大的毒性。而通过离子通道转运入细胞内的脯氨酸数量有限，为避免细胞内冰晶形成，添加有脯氨酸的玻璃化液仍然需要一定浓度的二甲基亚砜或者乙二醇，对细胞仍然存在伤害。为解决上述技术问题，本发明在前述生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂中包括细胞内玻璃化冷冻试剂，所述细胞内玻璃化冷冻试剂采用跨膜载体将糖、糖醇或胺类冷冻保护剂包裹起来，通过所述跨膜载体的运输作用能够将大量的糖、糖醇或胺类冷冻保护剂运输到细胞内，从而在玻璃化冷冻过程中，替代二甲基亚砜或乙二醇的使用，在避免细胞内形成冰晶的同时，可以极大地减轻冷冻保护剂对细胞的伤害，提高细胞冻存的存活率以及保障其发育正常。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述玻璃化冷冻试剂还包括细胞外玻璃化冷冻试剂，所述细胞外玻璃化冷冻试剂选自糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻保护剂、胺类冷冻保护剂或多聚物类冷冻保护剂，所述细胞外玻璃化冷冻试剂与所述细胞内玻璃化冷冻试剂单独包装。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述细胞内玻璃化冷冻试剂中，冷冻保护剂的浓度为0.5～2M。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述细胞内玻璃化冷冻试剂中，冷冻保护剂的浓度为0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M、2.0M。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述细胞外玻璃化冷冻试剂中，冷冻保护剂的浓度为2.5～3.5M。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述细胞外玻璃化冷冻试剂中，冷冻保护剂的浓度为2.5M、2.6M、2.7M、2.8M、2.9M、3.0M、3.1M、3.2M、3.3M、3.4M或3.5M。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中的所述糖类冷冻保护剂选自单糖、二糖或三糖，所述单糖、二糖或三糖选自葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中的所述糖类冷冻保护剂为葡萄糖。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中的所述糖醇类冷冻保护剂选自甘露糖醇或山梨醇。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中的所述胺类冷冻化保护剂选自脯氨酸、羟脯氨酸或甜菜碱。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中的所述胺类冷冻保护剂为脯氨酸。
所述细胞外玻璃化冷冻试剂中的多聚物选自人血清蛋白、Ficoll、羟乙基淀粉、葡聚糖、聚乙烯二醇或聚乙烯吡咯烷酮。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述跨膜载体选自脂质体、类脂囊泡、聚合物胶束。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述跨膜载体选自脂质体。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述跨膜载体为脂质体。
本发明所述玻璃化冷冻试剂中的细胞内玻璃化冷冻试剂优选使用脂质体包裹葡萄糖、半乳糖、脯氨酸，其中，葡萄糖、半乳糖可以在细胞复温后直接作为能源供细胞消耗，而脯氨酸一方面可以通过离子通道转运到细胞外中，同时还可以作为原料参与蛋白质的合成。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述细胞外玻璃化冷冻试剂中还包括石墨烯纳米颗粒，其中所述石墨烯纳米颗粒的表面包被有经超低粘度海藻酸或其衍生物交联而形成的凝胶层，所述超低粘度海藻酸的cps为30～70。
为避免复温时细胞内外形成冰晶，本发明在所述玻璃化液中加入石墨烯纳米颗粒。与用于玻璃化冷冻中的其他纳米颗粒下相比，例如羟基磷灰石、二氧化硅、二氧化钛，石墨烯纳米颗粒具有更为优良的导热性能，但同时也对细胞具有更强的毒性。为解决石墨烯纳米颗粒的毒性较大的问题，本发明所述方法在石墨烯纳米颗粒的表面包被超低粘度海藻酸或其衍生物，通过氯化钙诱导其形成一层极薄的凝胶层，将石墨烯纳米颗粒包裹、封装起来，避免其与细胞直接接触，极大地降低了石墨烯纳米颗粒对细胞的毒性。同时，由于石墨烯纳米颗粒包被的是超低粘度海藻酸或其衍生物，形成的凝胶层薄，对石墨烯纳米颗粒的导热性影响小，仍然能够有效地抑制复温过程中的重结晶。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，海藻酸衍生物为海藻酸钠。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述石墨烯纳米颗粒为磁性石墨烯纳米颗粒，更优选地，所述磁性石墨烯纳米颗粒为四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒。所述磁性石墨烯纳米颗粒可通过电磁感应加热辅助冻存细胞的复温，同时，所述磁性石墨烯纳米颗粒可以容易地与冻存细胞分离并回收。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述石墨烯纳米颗粒在细胞外玻璃化冷冻试剂中的质量分数为0.1～5％。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的玻璃化冷冻试剂中，所述石墨烯纳米颗粒在细胞外玻璃化冷冻试剂中的质量分数为1％。
本发明还涉及用于玻璃化冷冻的试剂盒，所述试剂盒包括前述玻璃化冷冻试剂和其他辅助试剂。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的试剂盒中，所述其他辅助试剂包括平衡液或解冻液。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的试剂盒中，所述平衡液为含0.25～0.75M葡萄糖、0.1～0.3M甜菜碱和1～2mM HSA的缓冲液。
优选地，所述平衡液为含0.25M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS；或者，所述平衡液为含0.5M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS；或者，所述平衡液为含0.75M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的试剂盒中，所述解冻液包括渗透压依次降低的解冻液1～3或解冻液1～4。
优选地，在如上所述用于生殖冷冻的试剂盒中，所述解冻液包括解冻液1～3，其中，解冻液1～2为含葡萄糖、甜菜碱和HSA的DPBS，解冻液3为含甜菜碱和HSA的DPBS；
或者，所述解冻液包括解冻液1～4，其中解冻液1～3为含葡萄糖、甜菜碱和HSA的DPBS，解冻液4为含甜菜碱和HSA的DPBS。
本发明还涉及前述细胞内玻璃化冷冻试剂在制备生殖冷冻用玻璃化液中的应用。
本发明还涉及前述细胞内玻璃化冷冻试剂和细胞外玻璃化冷冻试剂在制备生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂中的应用。
本发明还涉及一种生殖冷冻保存方法，所述方法使用前述玻璃化冷冻试剂或者前述试剂盒进行生殖冷冻保存。本发明所述方法使用前述玻璃化液或试剂盒进行生殖冷冻保存，所述保存方法可减少低温保护剂对细胞的毒性以及避免复温过程出现重结晶。
优选地，在如上所述生殖冷冻保存方法中，所述方法包括以下步骤：将待冻存的细胞先置于平衡液中平衡3～5分钟，然后置于细胞内玻璃化冷冻试剂中处理5～10分钟，再置于细胞外玻璃化冷冻试剂中处理1～2分钟，之后放入液氮中保存。
优选地，在如上所述生殖冷冻保存方法中，所述细胞为生殖细胞或胚胎。
优选地，在如上所述生殖冷冻保存方法中，所述生殖细胞为卵母细胞，所述胚胎为卵裂期胚胎或囊胚。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所述玻璃化冷冻试剂、试剂盒、应用和使用方法涉及细胞内保护剂，所述细胞内保护剂利用跨膜载体将对细胞无害的糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻保护剂或胺类冷冻保护剂转运到细胞内，在避免细胞内形成冰晶同时，还能够极大地降低冷冻保护剂对细胞的毒性，提升细胞的存活率，保障细胞的正常发育。
(2)本发明优选使用脂质体包裹葡萄糖、半乳糖、脯氨酸，其中，葡萄糖、半乳糖可以在细胞复温后直接作为能源供细胞消耗，而脯氨酸一方面可以通过离子通道转运到细胞外中，同时还可以作为原料参与蛋白质的合成。
(3)优选地，本发明所述细胞外玻璃化冷冻试剂中还包括表面包裹有由超低粘度海藻酸或其衍生物交联形成的凝胶层的石墨烯纳米颗粒，所述纳米颗粒包裹的凝胶层极薄，不但可以极大减少、甚至基本消除石墨烯纳米颗粒对细胞的毒性，同时还保有良好的导热性能，可以有效避免出现重结晶。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1
一种玻璃化冷冻用试剂盒，所述试剂盒包括平衡液、玻璃化液和解冻液，其中，所述平衡液、玻璃化液和解冻液的具体配方如下所示：
平衡液：0.5M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2。
玻璃化液由独立包装的细胞内玻璃化液和细胞外玻璃化液组成，其中，细胞内玻璃化液：包裹葡萄糖的脂质体，其中，葡萄糖的浓度为1M；细胞外玻璃化液：2M葡萄糖、0.25M脯氨酸、0.3M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2。
解冻液1：1M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2；
解冻液2：0.5M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2；
解冻液3：0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2。
实施例2
一种玻璃化冷冻用试剂盒，所述试剂盒包括平衡液、玻璃化液和解冻液，其中，所述平衡液、玻璃化液和解冻液的具体配方如下所示：
平衡液：0.25M海藻糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2。
玻璃化液由独立包装的细胞内玻璃化液和细胞外玻璃化液组成，其中，细胞内玻璃化液：脂质体包裹的葡萄糖，葡萄糖的浓度为0.75M；细胞外玻璃化液：1M海藻糖、0.5M脯氨酸、0.3M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2。
解冻液1：0.5M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2；
解冻液2：0.2M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2；
解冻液2：0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2。
实施例3
一种玻璃化冷冻用试剂盒，所述试剂盒包括平衡液、玻璃化液和解冻液，其中，所述平衡液、玻璃化液和解冻液的具体配方如下所示：
平衡液：0.75M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2。
玻璃化液由独立包装的细胞内玻璃化液和细胞外玻璃化液组成，其中，细胞内玻璃化液：包裹葡萄糖的脂质体，其中，葡萄糖的浓度为2M；细胞外玻璃化液：3M葡萄糖、0.3M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2。
解冻液1：1.5M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2；
解冻液2：0.5M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2；
解冻液3：0.1M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2；
解冻液4：0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS缓冲液，pH＝7.2。
实施例4
如实施例1所述的试剂盒，区别仅在于，所述细胞内玻璃化液为包裹有葡萄糖和脯氨酸的脂质体，其中，所述葡萄糖的浓度为0.75M，所述脯氨酸的浓度为0.5M。
实验例5
如实施例2所述的试剂盒，区别仅在于，所述细胞内玻璃化液为包裹有葡萄糖和脯氨酸的脂质体，其中，所述葡萄糖的浓度为0.5M，所述脯氨酸的浓度为0.3M。
实验例6
如实施例3所述的试剂盒，区别仅在于，所述细胞内玻璃化液为包裹有葡萄糖和脯氨酸的脂质体，其中，所述葡萄糖的浓度为1.5M，所述脯氨酸的浓度为0.5M。
实验例7
参照实施例1所述方法制备玻璃化冷冻用试剂盒，区别仅在于，所述细胞外玻璃化液中还包括四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒(采用溶剂热法制备而成)，其在细胞外玻璃化液中的质量分数为1％、直径大小为100nm，所述纳米颗粒经cps＝50的超低粘度海藻酸钠包被，并由氯化钙引发交联。
实施例8
参照实施例7所述方法制备玻璃化冷冻用试剂盒，区别仅在于，所述四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒在细胞外玻璃化液中的质量分数为0.1％。
实施例9
参照实施例7所述方法制备玻璃化冷冻用试剂盒，区别仅在于，所述四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒在细胞外玻璃化液中的质量分数为5％。
对比例1
一种玻璃化冷冻用试剂盒，所述试剂盒包括平衡液、玻璃化液和解冻液，其中，所述平衡液、玻璃化液和解冻液的具体配方如下所示：
平衡液：7.5％EG、7.5％DMSO和3mM HSA的DPBS，pH＝7.26；
玻璃化液：15％乙二醇、15％DMSO和3mM HSA的DPBS；
解冻液1:1M蔗糖和3mM HSA的DPBS；
解冻液2：0.5M蔗糖和3mM HSA的DPBS；
解冻液3：0.25M蔗糖和3mM HSA的DPBS；
解冻液4：3mM HSA的DPBS。
对比例2
如对比例1所示的玻璃化冷冻用试剂盒，区别仅在于，所述玻璃化液为7.5％乙二醇、10％DMSO、3mM HSA和0.5M脯氨酸的DPBS。
对比例3
如实施例7所示的玻璃化冷冻用试剂盒，区别仅在于，所述四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒的表面不包被任何物质。
对比例4
如实施例7所示的玻璃化冷冻用试剂盒，区别仅在于，所述四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒的表面包被的是cps＝500的高粘度海藻酸钠。
对比例5
如实施例7所示的玻璃化冷冻用试剂盒，其区别仅在于，用羟基磷灰石纳米颗粒替换所述四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒，且所述羟基磷灰石纳米颗粒表面不包被任何物质。
对比例6
如实施例8所示的玻璃化冷冻用试剂盒，其区别仅在于，用羟基磷灰石纳米颗粒替换所述四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒，且所述羟基磷灰石纳米颗粒表面不包被任何物质。
对比例7
如实施例9所示的玻璃化冷冻用试剂盒，其区别仅在于，用羟基磷灰石纳米颗粒替换所述四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒，且所述羟基磷灰石纳米颗粒表面不包被任何物质。
实验例1
检测实施例1～6和对比例1～2所述玻璃化冷冻用试剂盒对卵母细胞的玻璃化冷冻保存效果，其中，具体检测方法和检测效果如下所示。
一、玻璃化冷冻与解冻
使用实施例1～6所述试剂盒进行冷冻和解冻：获取小鼠GV期卵母细胞，先将其置于平衡液中平衡4～5分钟，然后置于细胞内玻璃化液中15～20分钟，再置于细胞外玻璃化液中1～2分钟，最后放入液氮中保存5小时以上，最后依次置于解冻液1～3或解冻液1～4中各5分钟。
使用对比例1～2所述试剂盒进行冷冻和解冻：获取小鼠卵母细胞，先将其置于平衡液中平衡4～5分钟，然后置于玻璃化液中1～2分钟，最后放入液氮中保存5小时以上，最后依次置于解冻液1～4中各5分钟。
二、解冻后细胞存活率和发育率判断
观察解冻的细胞，将卵丘覆盖良好、细胞形态完整的细胞判定为存活的细胞，反之则判定为死亡细胞，存活细胞数与细胞总数之比为存活率。具体检测结果参见表1。
将经过洗涤后的卵丘卵母细胞复合体放入经过平衡的成熟液(TCM199+10％FBS+激素)中，成熟培养42h。之后，使用透明质酸酶消化成熟培养的卵母细胞，以去除卵丘细胞，用TCM199洗3-5遍备用。卵母用FDA染色3min，经洗涤后在显微镜下观察其是否着色。有荧光反应的为发育后的卵，没有荧光反应的为死卵。发育后卵与细胞总数之比为发育率。具体检测结果参见表1。
根据表1所示实验数据可知，对小鼠GV期卵母细胞进行玻璃化冻存时，本发明实施例1～6所述试剂盒尽管在细胞存活率上略低于对比例1～2，但其发育率从对比例1～2所示的18～31％提升到49～58％，得到极大提升。以上实验结果表明，使用细胞内玻璃化液替换常见的渗透型低温保护剂，二甲基亚砜和乙二醇，可以在玻璃化冷冻过程中达到较好的冷冻效果，同时极大地降低了冷冻保护剂对细胞的毒性。
表1不同的玻璃化冷冻试剂盒对小鼠GV期卵母细胞的冷冻效果
| 方案 | 存活率 | 发育率 |
| 实施例1 | 85％(85/100) | 55％(55/100) |
| 实施例2 | 80％(80/100) | 49％(49/100) |
| 实施例3 | 84％(84/100) | 52％(52/100) |
| 实施例4 | 83％(84/100) | 58％(58/100) |
| 实施例5 | 84％(84/100) | 52％(52/100) |
| 实施例6 | 85％(85/100) | 54％(54/100) |
| 对比例1 | 100％(100/100) | 18％(18/100) |
| 对比例2 | 98％(98/100) | 31％(31/100) |
实验例2
检测实施例7以及对比例3～5所述纳米颗粒对小鼠GV期卵母细胞的毒性，具体检测方法和检测结果如下所示。
将实施例7和对比例3～5所述纳米颗粒分别以0.1％、1％和5％的浓度添加到细胞培养基中，培养小鼠GV期卵母细胞42h，检测细胞的存活率。具体结果参见表2。根据表2所示实验结果可知，四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒对细胞具有较强的毒性(参见对比例3的实验结果)，这可能是由于四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒与细胞接触后导致细胞膜上的蛋白质发生变性，细胞膜失去流动性。而在四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒的表面包被超低粘度海藻酸钠，经过交联在纳米颗粒表面形成凝胶层，将纳米粒子包裹起来，避免其直接与细胞接触，极大地降低了四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒对细胞产生毒害作用，获得比羟基磷灰石纳米颗粒更低的细胞毒性(参见实施例7、对比例4-5所示结果)。
表2不同纳米颗粒对小鼠GV期卵母细胞的毒性
实验例3
检测实施例7～9和对比例3～7所述玻璃化冷冻用试剂盒对卵母细胞的玻璃化冷冻保存效果，其中，具体检测方法如实验例1所示，具体检测结果如表3所示。
根据表3所示实验结果可知，由于四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒对细胞有毒害作用，其虽然具有良好的导热性，可避免复温时重结晶，能够提高小鼠GV期卵母细胞的存活率，但由于其具有较强的细胞毒作用，会极大地影响卵母细胞的发育率。使用高粘度海藻酸钠包被前述纳米颗粒虽然可以极大降低其对细胞的毒性，但纳米颗粒外层形成的凝胶层过厚，影响其导热性，反而导致细胞重结晶现象加重，影响细胞的存活率和发育率。而使用超低粘度海藻酸钠包被四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒可以在纳米颗粒表面形成一层极薄的凝胶层，既避免纳米颗粒对细胞产生毒害作用，又避免影响其导热性，从而提高小鼠GV期卵母细胞的存活率和发育率。
表3不同的玻璃化冷冻试剂盒对小鼠GV期卵母细胞的冷冻效果
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (27)
1.生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂，其特征在于，所述玻璃化冷冻试剂包括细胞内玻璃化冷冻试剂和细胞外玻璃化冷冻试剂，其中：
所述细胞内玻璃化冷冻试剂包括跨膜载体和包裹在所述跨膜载体中的冷冻保护剂，所述冷冻保护剂的浓度为0.5~2M，选自糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻化保护剂或胺类冷冻保护剂；
所述玻璃化冷冻试剂还包括细胞外玻璃化冷冻试剂，所述细胞外玻璃化冷冻试剂包括冷冻保护剂，所述冷冻保护剂的浓度为2.5~3.5M，选自糖类冷冻保护剂、糖醇类冷冻保护剂、胺类冷冻保护剂或多聚物类冷冻保护剂，所述细胞外玻璃化冷冻试剂与所述细胞内玻璃化冷冻试剂单独包装；
所述细胞外玻璃化冷冻试剂中还包括石墨烯纳米颗粒，其中所述石墨烯纳米颗粒的表面包被有经超低粘度海藻酸或其衍生物交联而形成的凝胶层，所述超低粘度海藻酸的cps为30~70，所述超低粘度海藻酸的衍生物为超低粘度海藻酸钠。
2.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，在所述细胞内玻璃化冷冻试剂中，所述冷冻保护剂的浓度为0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M、2.0M。
3.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，在所述细胞外玻璃化冷冻试剂中，所述冷冻保护剂的浓度为2.5M、2.6M、2.7M、2.8M、2.9M、3.0M、3.1M、3.2M、3.3M、3.4M或3.5M。
4.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，在所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中：所述糖类冷冻保护剂选自单糖、二糖或三糖，所述单糖、二糖或三糖选自葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖。
5.根据权利要求4所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，在所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中，所述糖类冷冻保护剂为葡萄糖。
6.根据权利要求4所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，在所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中，所述糖醇类冷冻保护剂选自甘露糖醇或山梨醇。
7.根据权利要求4所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，在所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中，所述胺类冷冻化保护剂选自脯氨酸、羟脯氨酸或甜菜碱。
8.根据权利要求7所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，在所述细胞内玻璃化冷冻试剂或所述细胞外玻璃化冷冻试剂中，所述胺类冷冻化保护剂为脯氨酸。
9.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，所述细胞外玻璃化冷冻试剂中的多聚物选自人血清蛋白、Ficoll、羟乙基淀粉、葡聚糖、聚乙烯二醇或聚乙烯吡咯烷酮。
10.根据权利要求9所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，所述多聚物为人血清蛋白。
11.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，所述跨膜载体选自脂质体、类脂囊泡、聚合物胶束。
12.根据权利要求10所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，所述跨膜载体为脂质体。
13.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，所述超低粘度海藻酸或超低粘度海藻酸钠的cps为50。
14.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，所述石墨烯纳米颗粒在细胞外玻璃化冷冻试剂中的质量分数为0.1~5%。
15.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，所述石墨烯纳米颗粒在细胞外玻璃化冷冻试剂中的质量分数为1%。
16.根据权利要求1所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，所述石墨烯纳米颗粒为磁性石墨烯纳米颗粒。
17.根据权利要求16所述的玻璃化冷冻试剂，其特征在于，所述磁性石墨烯纳米颗粒为四氧化三铁-石墨烯纳米颗粒。
18.用于玻璃化冷冻的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1~17任一项所述玻璃化冷冻试剂和其他辅助试剂。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，所述其他辅助试剂包括平衡液或解冻液。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，所述平衡液为含0.25~0.75M葡萄糖、0.1~0.3M甜菜碱和1~2mM HSA的缓冲液。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述平衡液为含0.25M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS；或者，所述平衡液为含0.5M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS；或者，所述平衡液为含0.75M葡萄糖、0.2M甜菜碱和1.5mM HSA的DPBS。
22.根据权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，所述解冻液包括渗透压依次降低的解冻液1、解冻液2和解冻液3，其中，解冻液1和解冻液2为含葡萄糖、甜菜碱和HSA的DPBS，解冻液3为含甜菜碱和HSA的DPBS；
或，所述解冻液包括渗透压依次降低的解冻液1、解冻液2、解冻液3和解冻液4，其中解冻液1、解冻液2和解冻液3为含葡萄糖、甜菜碱和HSA的DPBS，解冻液4为含甜菜碱和HSA的DPBS。
23.权利要求18~22任一项所述细胞内玻璃化冷冻试剂和细胞外玻璃化冷冻试剂在制备生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂中的应用。
24.一种生殖冷冻保存方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1~17任一项所述玻璃化冷冻试剂或者权利要求18~22任一项所述试剂盒进行生殖冷冻保存。
25.根据权利要求24所述的方法，所述方法包括以下步骤：将待冻存的细胞先置于平衡液中平衡3~5分钟，然后置于细胞内玻璃化冷冻试剂中处理5~10分钟，再置于细胞外玻璃化冷冻试剂中处理1~2分钟，之后放入液氮中保存。
26.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述细胞为生殖细胞或胚胎。
27.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述生殖细胞为卵母细胞，所述胚胎为卵裂期胚胎或囊胚。
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