CN117378598B - 一种卵母细胞冻存液及其制备方法 - Google Patents
一种卵母细胞冻存液及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117378598B CN117378598B CN202311681430.XA CN202311681430A CN117378598B CN 117378598 B CN117378598 B CN 117378598B CN 202311681430 A CN202311681430 A CN 202311681430A CN 117378598 B CN117378598 B CN 117378598B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oocyte
- parts
- hydroxyapatite
- frozen stock
- modified nano
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 93
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 51
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 37
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims abstract description 31
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims abstract description 30
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims abstract description 26
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims abstract description 12
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 claims abstract description 12
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 claims abstract description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 76
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 28
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 24
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 21
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 10
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims description 9
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 claims description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 5
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 25
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 24
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 24
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 22
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 17
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 14
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 14
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 12
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 8
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 8
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 6
- 210000000625 blastula Anatomy 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical group OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 231100000045 chemical toxicity Toxicity 0.000 description 2
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 2
- 125000000914 phenoxymethylpenicillanyl group Chemical group CC1(S[C@H]2N([C@H]1C(=O)*)C([C@H]2NC(COC2=CC=CC=C2)=O)=O)C 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-DHVFOXMCSA-N L-galactose Chemical compound OC[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 229920006321 anionic cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- DBLXOVFQHHSKRC-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid;2-piperazin-1-ylethanol Chemical compound CCS(O)(=O)=O.OCCN1CCNCC1 DBLXOVFQHHSKRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- XRZSXZKAAVJHQX-UHFFFAOYSA-M sodium;ethanesulfonate;2-piperazin-1-ylethanol Chemical compound [Na+].CCS([O-])(=O)=O.OCCN1CCNCC1 XRZSXZKAAVJHQX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0215—Disinfecting agents, e.g. antimicrobials for preserving living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种卵母细胞冻存液及其制备方法，所述卵母细胞冻存液包括血清白蛋白、半乳糖、多元醇、PVA、改性纳米羟基磷灰石、HEPES缓冲液等成分。其中，改性纳米羟基磷灰石由羟基磷灰石接枝烷基酸和羧甲基纤维素改性，有效改善了纳米羟基磷灰石的生物活性和分散性；半乳糖与多元醇复配，与改性纳米羟基磷灰石产生了良好的协同作用。本发明有效优化了卵母细胞冻存液方案，相比现有技术，具有显著的提升效果和良好的应用前景，为卵母细胞冻存技术提供了借鉴和参考。
Description
技术领域
本发明属于辅助生殖技术领域，具体涉及一种卵母细胞冻存液及其制备方法。
背景技术
冷冻保存技术已成为生物医学领域不可或缺的保存方法之一。采用该技术可以将细胞、组织及器官等生物材料保存于超低温环境中，使细胞新陈代谢大大减慢甚至停止，一旦恢复正常生理温度又能继续发育。目前最常见的冷冻保存方法为玻璃化冻存，玻璃化冻存是将快速冷冻与冷冻保护剂相结合，用高浓度的冷冻保护剂将细胞内水分置换出来，经急速降温，使得细胞由液态转化为外形似玻璃状的非晶体化固体状态的方法。在玻璃化冻存过程中，适当的冷冻保护剂可以减少细胞特性的改变或丢失，起到保护细胞的作用。
卵母细胞冻存技术是一种用于保存卵母细胞的玻璃化冻存方法，被广泛应用于生育力保存及辅助生殖技术中。卵母细胞冻存液作为冷冻保护剂，是卵母细胞冻存技术中最关键的基础物质之一，目的是避免冻存体系中形成冰晶而导致卵母细胞失活。但目前冷冻保护剂中使用的高浓度渗透性冷冻保护剂（如DMSO等）容易引起化学毒性，一旦操作过慢可能引起强烈的渗透损伤，破环卵母细胞的骨架结构；玻璃化过程还会引起卵母细胞脂质含量变化，影响卵母细胞膜的完整性，进而影响后续的受精和发育过程。而且现有的冷冻保护剂不能有效的控制冰晶的生长，进而损害细胞。
现有技术，例如，一种冷冻保存液及其制备方法（CN111789108B），公开了一种含有PVA，乙二醇和蔗糖的冷冻保存液，以PVA为主要低温保护剂成分，但仍需要DMSO渗透性保护剂，且卵母细胞玻璃化过程中的质量变化未得到明显改善。
因此，亟需在现有技术的基础上，提供新的技术方案，开发细胞毒性更低、能更高效抑制冻存过程中脂质变化的卵母细胞冻存液。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种卵母细胞冻存液及其制备方法。
本发明的一个目的在于，提供一种卵母细胞冻存液，所述卵母细胞冻存液包括质量份数如下的成分：
血清白蛋白 0.1-5份
半乳糖 9-20份
聚乙二醇 1-8份
多元醇 10-30份
PVA 1-6份
改性纳米羟基磷灰石 0.01-0.1份
HEPES缓冲液 20-50份
水 20-50份；
其中，
所述改性纳米羟基磷灰石是由纳米羟基磷灰石接枝烷基酸和羧甲基纤维素所得产物。
在冷冻过程中，卵母细胞可能会受到氧化应激损伤，导致其活性和复活率降低。保持卵母细胞线粒体活性可以促进细胞内代谢和能量产生，有助于减少这种损伤。纳米羟基磷灰石可减少卵母细胞线粒体内活性氧的产生，促进细胞增殖和分化，从而保护卵母细胞免受氧化应激的伤害，减少损伤和凋亡。
PVA，能够有效的抑制玻璃化过程中冰晶的产生，提高冷冻液的玻璃化能力。
PVA溶液作为非渗透性冷冻保护剂，主要通过维持低温细胞渗透压、减少细胞内冰晶形成、抑制蛋白质变性和促进细胞复苏等多方面的作用来保护细胞的完整性。有研究表明，普通的玻璃化冷冻液冷冻后的卵母细胞复温后的成活率在80%左右，添加PVA的冷冻液冷冻卵母细胞复温后的成活率达到了95%以上。
多元醇作为渗透性冷冻保护剂，主要通过降低细胞内冰点，防止冰晶形成和破坏细胞结构。冰晶的形成会破坏细胞的结构和功能，而多元醇的保护作用在于抑制冰晶的形成，从而保护细胞的完整性。
半乳糖与多元醇复配，产生协同作用，通过防止细胞内蛋白质的聚合，诱导脂质的稳定性，从而提高卵母细胞玻璃化后的囊胚率。
聚乙二醇，优选PEG8000，无毒，有研究证明其能够提高卵母细胞玻璃化后的正常率，能够防止某些卵磷脂的降解，可以有效的保持细胞膜的完整性。
乙二醇作为渗透性保护剂，特定的渗透性保护剂提供的有效保护基于它们的膜渗透性和其他特性，以及卵母细胞的成熟阶段。研究表明，乙二醇的通透性是PG和DMSO的一半，但是其毒性低，作为渗透性保护剂的首选，在玻璃化过程中，穿透质膜与水分子形成氢键，降低冰晶的形成，而恰好PEG8000能够促进细胞膜的通透性，两者相互弥补，同时PEG8000不单单是提高膜的通透性，当细胞膜在玻璃化过程中受损时，能够防止水流入细胞导致细胞涨破。
半乳糖，属于单糖，与二糖相比有较小的偏摩尔体积，置换水的能力弱于二糖，能够降低细胞内外渗透性保护剂的浓度，可以提供最佳的低温保存条件；此外糖与细胞双分子层相互作用，防止细胞内蛋白质的聚合，诱导脂质的稳定性；其与乙二醇的生物相容性较好。
相同浓度的单糖和双糖的渗透压相似，但是双糖溶液的粘度大，半乳糖溶液能够更好的与其他渗透性保护剂混合，此外，有研究表明，卵母细胞对单糖溶液的耐受性高于双糖溶液，能够更好的保护细胞免损伤。
进一步地，血清白蛋白可选人血清白蛋白或者替代物，如十二烷基磺酸钠SDS或者羟丙基纤维素HPC中的任意一种。
进一步地，所述PVA的水解度大于80%。
进一步地，所述多元醇选自丙二醇、乙二醇或丁二醇。
进一步地，所述聚乙二醇分子量为4000-8000。
进一步地，所述半乳糖选自D-半乳糖或L-半乳糖。
进一步地，所述HEPES缓冲液的浓度为50-70 wt%。
进一步地，所述缓冲液选自HEPES缓冲液、M199缓冲液的任意一种。
本发明的另一个目的在于，提供上述卵母细胞冻存液的制备方法，包括如下步骤：
（1）改性纳米羟基磷灰石的制备：在装有冷凝装置的反应器中，将纳米羟基磷灰石、烷基酸、羧甲基纤维素加入乙醇的水溶液中，加热回流，然后除去溶剂，水洗固相，烘干得到所述改性纳米羟基磷灰石；
（2）卵母细胞冻存液的制备：将所述改性纳米羟基磷灰石、半乳糖、聚乙二醇、多元醇、PVA和水共混，搅拌后加入血清白蛋白和HEPES缓冲液，得到卵母细胞冻存液。
进一步地，所述纳米羟基磷灰石、烷基酸和羧甲基纤维素的质量比为1:5:5-1:10:10。
进一步地，所述乙醇的水溶液中，乙醇的浓度为50-70 wt%。
进一步地，所述加热的温度为80-100℃。
本发明具有以下有益效果：
1. 本发明的卵母细胞冻存液采用PVA、多元醇、半乳糖等成分复配，产生了良好的协同效应。通过有效降低玻璃化试剂的化学毒性，控制卵母细胞玻璃化过程中脂质的变化，提高卵母细胞玻璃化后的囊胚率、成活率和发育能力，改善卵母细胞解冻后的质量。
2. 本发明中的改性纳米羟基磷灰石由纳米羟基磷灰石与烷基酸接枝羧甲基纤维素制备，不仅具有防止重结晶、增加卵母细胞线粒体活性、降低活性氧的生物学作用，且表面接枝的长链烷基结构，提高纳米羟基磷灰石分散性的同时，也可作为细胞的能量代谢物，有免疫增强和抗菌作用，与羧甲基纤维素的抗粘连、保水作用相结合，综合提高了材料的生物相容性和分散性，改善了纳米羟基磷灰石在卵母细胞冻存液中的应用效果。
3. 本发明有效优化了卵母细胞冻存液方案，相比现有技术，解冻后的细胞存活率有较大提升，具有良好的应用前景，为卵母细胞冻存技术提供了借鉴和参考。
附图说明
图1是本发明实施例1中的卵母细胞放大图。
图2是本发明实施例1中的囊胚放大图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
本实施例中，除非另外指明，所有配制和测试均发生在25℃的环境。实施例中将使用下列成分，并且具有所标明的功能。
卵母细胞：取自珠海百试通生物科技有限公司C57BL/6雌性小鼠；
人血清白蛋白：在细胞培养中起到维持渗透压、缓冲和营养作用，采购自深圳卫光生物制品股份有限公司；
半乳糖：与多元醇渗透性冷冻保护剂有协同作用，采购自Sigma，牌号为G5388；
乙二醇：一种多元醇，渗透性冷冻保护剂，采购自Sigma，牌号为102466；
聚乙二醇：采用PEG8000，一种高分子聚合物，能够促进细胞膜的通透性，采购自Sigma，牌号为89510；
PVA：聚乙烯醇，非渗透性冷冻保护剂，采购自Sigma，牌号为P8136，水解度88%；
HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸，一种两性离子缓冲剂，用于培养细胞时维持恒定的pH值，采购自Sigma，牌号为H4034；HEPES缓冲液浓度为50 wt%；
HEPES-Na：4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠盐，采购自Sigma；
改性纳米羟基磷灰石：用于增加卵母细胞系线粒体活性，降低活性氧的产生，自制。纳米羟基磷灰石原料采购自Sigma，牌号为919101；
月桂酸：一种饱和脂肪酸，是改性纳米羟基磷灰石的原料，采购自Sigma，牌号为W261416；
羧甲基纤维素：一种阴离子型纤维素醚，是改性纳米羟基磷灰石的原料，采购自Sigma，牌号为C5678。
实施例1
一种卵母细胞冻存液A，包括如下质量份数的成分：
人血清白蛋白 5份
半乳糖 9份
聚乙二醇 2份
乙二醇 15份
PVA 1份
改性纳米羟基磷灰石 0.05份
HEPES缓冲液 44.95份
纯化水 23份；
另外，公开一种冷冻平衡液A，包括如下质量份数的成分：
人血清白蛋白 10份
乙二醇 7.5份
PVA 1.5份
HEPES缓冲液 46份
纯化水 35份。
上述卵母细胞冻存液的制备方法包括如下步骤：
（1）改性纳米羟基磷灰石的制备：
将纳米羟基磷灰石、月桂酸和羧甲基纤维素（1:5:5，m/m/m）浸入足量的乙醇水溶液（65 wt%）中，室温下搅拌15 min，然后转移至水浴加热器中加热至85℃，搅拌回流反应3h，冷却至室温，转移至过滤离心机，除去水和乙醇，将剩余固相物质用纯化水进行清洗，放入恒温干燥箱在60℃下烘干5 h，得到改性纳米羟基磷灰石；
（2）卵母细胞冻存液的制备：
按上述质量份数，将纯化水、PVA、聚乙二醇、乙二醇、半乳糖和所述改性纳米羟基磷灰石混合，80℃搅拌1 h，降到室温后加入人血清白蛋白和HEPES缓冲液，用HEPES-Na调节pH为7.2，得到卵母细胞冻存液A；
上述冷冻平衡液的制备方法包括如下步骤：
按上述质量份数，将纯化水、PVA、乙二醇混合，80℃搅拌1 h，降到室温后加入人血清白蛋白和HEPES缓冲液，用HEPES-Na调节pH为7.2，得到冷冻平衡液A。
实施例2
一种卵母细胞冻存液B，包括如下质量份数的成分：
人血清白蛋白 5份
半乳糖 10份
聚乙二醇 5份
乙二醇 15份
PVA 1份
改性纳米羟基磷灰石 0.04份
HEPES缓冲液 39.96份
纯化水 24份；
另外，公开一种冷冻平衡液B，包括如下质量份数的成分：
人血清白蛋白 15份
乙二醇 15份
HEPES缓冲液 70份。
上述卵母细胞冻存液的制备方法包括如下步骤：
（1）改性纳米羟基磷灰石的制备方法同实施例1；
（2）卵母细胞冻存液的制备：
按上述质量份数，将纯化水、PVA、聚乙二醇、乙二醇、半乳糖和所述改性纳米羟基磷灰石混合，80℃搅拌1 h，降到室温后加入人血清白蛋白和HEPES缓冲液，用HEPES-Na调节pH为7.2，得到卵母细胞冻存液B；
上述冷冻平衡液的制备方法包括如下步骤：
按上述质量份数，将乙二醇、人血清白蛋白加入HEPES缓冲液，用HEPES-Na调节pH为7.2，得到冷冻平衡液B。
实施例3
一种卵母细胞冻存液C，包括如下质量份数的成分：
人血清白蛋白 1份
半乳糖 10份
聚乙二醇 5份
乙二醇 15份
PVA 1份
改性纳米羟基磷灰石 0.06份
HEPES缓冲液 38份
纯化水 29.94份；
一种冷冻平衡液A，包括如下质量份数的成分：
人血清白蛋白 10份
乙二醇 7.5份
PVA 1.5份
HEPES缓冲液 46份
纯化水 35份。
上述卵母细胞冻存液的制备方法包括如下步骤：
（1）改性纳米羟基磷灰石的制备方法同实施例1；
（2）卵母细胞冻存液的制备：
按上述质量份数，将纯化水、PVA、聚乙二醇、乙二醇、半乳糖和所述改性纳米羟基磷灰石混合，80℃搅拌1 h，降到室温后加入人血清白蛋白和HEPES缓冲液，用HEPES-Na调节pH为7.2，得到卵母细胞冻存液C；
冷冻平衡液A的制备方法同实施例1。
实施例4
一种卵母细胞冻存液D，包括如下质量份数的成分：
人血清白蛋白 1份
半乳糖 15份
聚乙二醇 5份
乙二醇 20份
PVA 2份
改性纳米羟基磷灰石 0.08份
HEPES缓冲液 36.92份
纯化水 20份；
一种冷冻平衡液B，包括如下质量份数的成分：
人血清白蛋白 15份
乙二醇 15份
HEPES缓冲液 70份。
上述卵母细胞冻存液的制备方法包括如下步骤：
（1）改性纳米羟基磷灰石的制备方法同实施例1；
（2）卵母细胞冻存液的制备：
按上述质量份数，将纯化水、PVA、聚乙二醇、乙二醇、半乳糖和所述改性纳米羟基磷灰石混合，80℃搅拌1 h，降到室温后加入人血清白蛋白和HEPES缓冲液，用HEPES-Na调节pH为7.2，得到卵母细胞冻存液D；
冷冻平衡液B的制备方法同实施例2。
实施例5
一种卵母细胞冻存液E，包括如下质量份数的成分：
人血清白蛋白 2份
半乳糖 12份
聚乙二醇 5份
乙二醇 20份
PVA 1.5份
改性纳米羟基磷灰石 0.08份
HEPES缓冲液 29.42份
纯化水 30份；
一种冷冻平衡液A，包括如下质量份数的成分：
人血清白蛋白 10份
乙二醇 7.5份
PVA 1.5份
HEPES缓冲液 46份
纯化水 35份。
上述卵母细胞冻存液的制备方法包括如下步骤：
（1）改性纳米羟基磷灰石的制备方法同实施例1；
（2）卵母细胞冻存液的制备：
按上述质量份数，将纯化水、PVA、聚乙二醇、乙二醇、半乳糖和所述改性纳米羟基磷灰石混合，80℃搅拌1 h，降到室温后加入人血清白蛋白和HEPES缓冲液，用HEPES-Na调节pH为7.2，得到卵母细胞冻存液E；
冷冻平衡液A的制备方法同实施例1。
对比例1
一种卵母细胞冻存液F，本对比例与实施例1的区别在于，本对比例中的卵母细胞冻存液F中不含月桂酸和羧甲基纤维素接枝改性的纳米羟基磷灰石，而是用等质量份数的未改性纳米羟基磷灰石代替，其他成分、质量份数和制备方法均与实施例1相同。
一种冷冻平衡液A，各成分及制备方法同实施例1。
对比例2
一种卵母细胞冻存液G，本对比例与实施例2的区别在于，本对比例中的卵母细胞冻存液G中未加乙二醇，而是用等质量份数的纯化水代替，其他成分、质量份数和制备方法均与实施例2相同。
一种冷冻平衡液B，各成分及制备方法同实施例2。
对比例3
一种卵母细胞冻存液H，本对比例与实施例3的区别在于，本对比例中的卵母细胞冻存液H中未加半乳糖，而是用等质量份数的纯化水代替，其他成分、质量份数和制备方法均与实施例3相同。
一种冷冻平衡液A，各成分及制备方法同实施例1。
测试例
对实施例1-5和对比例1-3进行卵母细胞的生物活性测试。
测试方法如下所述：
S1、冷冻：将卵母细胞分别加入实施例1-5、对比例1-3的冷冻平衡液中平衡2.5min，然后将上述卵母细胞转移到对应卵母细胞冻存液A-H中保持20 s，然后将卵母细胞转移到冷冻载杆上，并迅速放入液氮中冷冻保存；
S2、解冻：将上述卵母细胞置于37℃的复苏液中平衡1 min，然后转移到稀释液中等待3 min，最后再转移到清洗液中5 min。解冻后，将卵母细胞转移到适当的培养基中进行孵育至完全恢复，计算卵母细胞的存活率，然后进行卵胞浆内单精子注射、培养，并计算卵母细胞的受精率、囊胚率。
其中，所述复苏液，由1份人血清白蛋白，20份半乳糖，79份HEPES缓冲液组成；所述稀释液，由5份人血清白蛋白，10份半乳糖，75份HEPES缓冲液组成；所述清洗液，由5份人血清白蛋白，95份HEPES缓冲液组成。
所得结果如表1和图1、2所示。
表 1 测试结果
图1是本发明实施例1中的卵母细胞放大图。
图2是本发明实施例1中的囊胚放大图。
从表1可以得出，实施例1-5的卵母细胞冻存液，均具有优良的生物活性和稳定性。在实际应用测试时，实施例1的卵母细胞活性明显优于未加改性纳米羟基磷灰石的对比例1，实施例2、3的卵母细胞活性也明显优于对比例2、3。证明本发明的技术方案中，改性纳米羟基磷灰石、多元醇、半乳糖之间能够产生协同效应，在保证冻存液稳定性的同时，可以有效改善卵母细胞解冻后的质量，提高卵母细胞玻璃化后发育能力。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (8)
1.一种卵母细胞冻存液，其特征在于，所述卵母细胞冻存液包括质量份数如下的成分：
血清白蛋白 0.1-5份
半乳糖 9-20份
聚乙二醇 1-8份
多元醇 10-30份
PVA 1-6份
改性纳米羟基磷灰石 0.01-0.1份
HEPES缓冲液 20-50份
水 20-50份；
其中，
所述改性纳米羟基磷灰石是由纳米羟基磷灰石接枝月桂酸和羧甲基纤维素所得产物；
所述多元醇为乙二醇；
所述改性纳米羟基磷灰石的制备包括如下步骤：
在装有冷凝装置的反应器中，将纳米羟基磷灰石、月桂酸、羧甲基纤维素加入乙醇的水溶液中，加热回流，然后除去溶剂，水洗固相，烘干得到改性纳米羟基磷灰石。
2.根据权利要求1所述卵母细胞冻存液，其特征在于，所述PVA的水解度大于80%。
3.根据权利要求1所述卵母细胞冻存液，其特征在于，所述聚乙二醇分子量为4000-8000。
4.根据权利要求1所述卵母细胞冻存液，其特征在于，所述HEPES缓冲液的浓度为50-70wt%。
5.根据权利要求1所述卵母细胞冻存液，其特征在于，所述纳米羟基磷灰石、月桂酸和羧甲基纤维素的质量比为1:5:5-1:10:10。
6.根据权利要求1所述卵母细胞冻存液，其特征在于，所述乙醇的水溶液中，乙醇的浓度为50-70 wt%。
7.根据权利要求1所述卵母细胞冻存液，其特征在于，所述加热的温度为80-100℃。
8.权利要求1-7任一项所述卵母细胞冻存液的制备方法，其特征在于，所述卵母细胞冻存液的制备方法包括如下步骤：
卵母细胞冻存液的制备：将改性纳米羟基磷灰石、半乳糖、聚乙二醇、多元醇、PVA和水共混，搅拌后加入血清白蛋白和HEPES缓冲液，得到卵母细胞冻存液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311681430.XA CN117378598B (zh) | 2023-12-08 | 2023-12-08 | 一种卵母细胞冻存液及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311681430.XA CN117378598B (zh) | 2023-12-08 | 2023-12-08 | 一种卵母细胞冻存液及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117378598A CN117378598A (zh) | 2024-01-12 |
| CN117378598B true CN117378598B (zh) | 2024-03-19 |
Family
ID=89466934
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311681430.XA Active CN117378598B (zh) | 2023-12-08 | 2023-12-08 | 一种卵母细胞冻存液及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117378598B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101508429A (zh) * | 2009-03-13 | 2009-08-19 | 四川大学 | 羟基磷灰石纳米复合粒子及其制备方法与应用 |
| CN107232185A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-10-10 | 青岛德瑞骏发生物科技股份有限公司 | 一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液、冷冻保存方法和应用 |
| CN108244102A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-07-06 | 北京大学第三医院 | 一种生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂、试剂盒及其使用方法 |
| CN108271770A (zh) * | 2017-01-06 | 2018-07-13 | 中国科学院化学研究所 | 微米颗粒在低温冻存中的应用 |
| CN111789101A (zh) * | 2019-04-09 | 2020-10-20 | 北京大学第三医院 | 一种基于pva的冻存液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用 |
| CN112869174A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-06-01 | 海南热带海洋学院 | 一种牡蛎钙乳液及其制备方法 |
| CN115282339A (zh) * | 2022-07-28 | 2022-11-04 | 四川大学 | 一种交联透明质酸/羟基磷灰石可注射材料、制备方法及应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20080098599A (ko) * | 2006-01-04 | 2008-11-11 | 두-쿱 테크놀로지스 리미티드 | 약제학적 제제의 생체내 흡수를 향상시키는 조성물 및 방법 |
-
2023
- 2023-12-08 CN CN202311681430.XA patent/CN117378598B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101508429A (zh) * | 2009-03-13 | 2009-08-19 | 四川大学 | 羟基磷灰石纳米复合粒子及其制备方法与应用 |
| CN108271770A (zh) * | 2017-01-06 | 2018-07-13 | 中国科学院化学研究所 | 微米颗粒在低温冻存中的应用 |
| CN107232185A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-10-10 | 青岛德瑞骏发生物科技股份有限公司 | 一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液、冷冻保存方法和应用 |
| CN108244102A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-07-06 | 北京大学第三医院 | 一种生殖冷冻用玻璃化冷冻试剂、试剂盒及其使用方法 |
| CN111789101A (zh) * | 2019-04-09 | 2020-10-20 | 北京大学第三医院 | 一种基于pva的冻存液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用 |
| CN112869174A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-06-01 | 海南热带海洋学院 | 一种牡蛎钙乳液及其制备方法 |
| CN115282339A (zh) * | 2022-07-28 | 2022-11-04 | 四川大学 | 一种交联透明质酸/羟基磷灰石可注射材料、制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 纳米羟基磷灰石悬浮液稳定性能的研究;张园;袁媛;刘昌胜;;中国生物医学工程学报;20080220(01);110-113+118 * |
| 纳米羟基磷灰石的制备及改性;庞桂花;程志强;李俊锋;;中国组织工程研究;20130416(16);2989-2993 * |
| 纳米颗粒对猪GV期卵母细胞低温保存效果的影响;李维杰;周新丽;刘宝林;戴建军;吕福扣;张德福;徐利;;中国生物医学工程学报;20131020(05);601-605 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117378598A (zh) | 2024-01-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108207930B (zh) | 一种鸡尾酒式冷冻保护剂及其应用 | |
| CN111789105B (zh) | 一种氨基酸类冷冻保存液在干细胞冻存中的应用 | |
| CN111793107B (zh) | 一种无dmso的冷冻保存液及其制备方法 | |
| CN111789106B (zh) | 一种冷冻保存液在器官和组织冻存中的应用 | |
| CN109619088A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞的保存液 | |
| JPH07255469A (ja) | 動物細胞の凍結保存液 | |
| CN113925049B (zh) | 一种保持细胞活性的细胞保存液及其制备方法和应用 | |
| CN111793108A (zh) | 一种含肽类化合物的冷冻保存液在器官和组织冷冻保存中的应用 | |
| CN117378598B (zh) | 一种卵母细胞冻存液及其制备方法 | |
| JP2023153389A (ja) | 凍結保存液 | |
| JPWO2020166711A1 (ja) | 凍結保存液 | |
| CN110115265A (zh) | 一种胚胎玻璃化冷冻液 | |
| CN111789101B (zh) | 一种基于pva的冻存液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用 | |
| CN115053891A (zh) | 一种细胞冻存液及实施方法 | |
| CN114190367A (zh) | 冻存液及其制备方法与在免疫细胞的应用 | |
| CN106172369B (zh) | 一种优化的抗氧化脱细胞保护液 | |
| JP6981425B2 (ja) | 粘性の高い無菌の３次元培養用培地組成物の製造方法 | |
| JPH03188001A (ja) | 臓器保存用溶液 | |
| CN117481109B (zh) | 一种细胞储存介质及储存方法 | |
| CN111789098A (zh) | 一种氨基酸类冻存液在卵母细胞或胚胎冷冻保存中的应用 | |
| EP3939429A1 (en) | Thawing fluid, preparation method therefor and use thereof | |
| CN111789102B (zh) | 一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用 | |
| CN111789103B (zh) | 一种冷冻保存用解冻液及解冻方法 | |
| CN115678859A (zh) | 一种病毒类疫苗半成品冻存保护剂、制备方法及其应用 | |
| CN117882706A (zh) | 一种无血清神经干细胞冻存液及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |