JP6981425B2 - 粘性の高い無菌の3次元培養用培地組成物の製造方法 - Google Patents
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Description
[1]以下の工程を含む、無菌の液状の培地組成物の製造方法:
(I)下記(i)の特定化合物及び増粘性多糖類を含有する第1の液体を濾過滅菌に付し、無菌の第1の液体を得ること;
(II)下記(ii)の連結物質及び前記増粘性多糖類を含有する第2の液体を濾過滅菌に付し、無菌の第2の液体を得ること;及び
(III)工程(I)で得られた無菌の第1の液体と、工程(II)で得られた無菌の第2の液体とを混合し、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体及び前記増粘性多糖類を均一に分散した状態で含有する無菌の液状の培地組成物を形成すること:
(i)2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物、
(ii)2価金属カチオンである連結物質。
[2]前記(ii)の連結物質を含有する液体と、前記増粘性多糖類を含有する液体とを混合し、前記第2の液体を得ることを更に含む、[1]に記載の製造方法。
[3]前記液状の培地組成物中の増粘性多糖類濃度が、0.422%(w/v)以下のメチルセルロース濃度に相当する粘度を該液状の培地組成物に与える濃度である、[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4]前記液状の培地組成物中の増粘性多糖類濃度が、0.2%(w/v)以上のメチルセルロース濃度に相当する粘度を該液状の培地組成物に与える濃度である、[3]に記載の製造方法。
[5]前記第1の液体及び前記第2の液体中の増粘性多糖類濃度が、0.422%(w/v)以下のメチルセルロース濃度に相当する粘度を該液体に与える濃度である、[3]又は[4]に記載の製造方法。
[6]前記第1の液体、前記第2の液体、及び前記液状の培地組成物中の増粘性多糖類濃度が、実質的に同一である、[1]〜[5]の何れかに記載の製造方法。
[7]前記増粘性多糖類がメチルセルロースである、[1]〜[6]の何れかに記載の製造方法。
[8]前記(i)の特定化合物が脱アシル化ジェランガムであり、第1の液体が該脱アシル化ジェランガム及び前記増粘性多糖類を含有する水溶液であり、
前記(ii)の連結物質が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、第2の液体が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方、及び前記増粘性多糖類を含有する液体培地であるか、または、該液体培地の濃縮液である、
[1]〜[7]の何れかに記載の製造方法。
[9]濾過滅菌に使用する濾過膜の孔径が0.2〜0.22μmである、[1]〜[8]の何れかに記載の製造方法。
[10]高圧蒸気滅菌工程を含まない、[1]〜[9]の何れかに記載の製造方法。
(i)2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物、
(ii)2価金属カチオンである連結物質。
第1の液体は、特定化合物として、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物を含有する。
アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。本発明に用いられる高分子化合物には、前記アニオン性の官能基の群より選択される1種又は2種以上が含まれていてもよい。
ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。
脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「KELCOGEL(シーピー・ケルコ社の登録商標)CG−LA」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル(シーピー・ケルコ社の登録商標)」等を使用することができる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル(シーピー・ケルコ社の登録商標)HT」等を使用することができる。
CY1×V1+CY2×V2=CY×(V1+V2)
の式を満足するよう、第1の液体中の増粘性多糖類濃度CY1を調整すればよい。
第2の液体は、連結物質として2価金属カチオンを含有する。2価金属カチオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、鉄イオン、銅イオン等が挙げられる。2価金属カチオンの種類は、第1の液体中に含まれる特定化合物が、当該2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することが可能であれば特に限定されないが、好ましくはカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、より好ましくはカルシウムイオンである。
第2の液体中の2価金属カチオン濃度は、最終的に得られる液状の培地組成物中の2価金属カチオン濃度と、第1の液体と第2の液体との混合比から算出することができる。
CY1×V1+CY2×V2=CY×(V1+V2)
の式を満足するよう、第2の液体中の増粘性多糖類濃度CY2を調整すればよい。
本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物は、第1の液体に含まれていた特定化合物が第2の液体に含まれていた連結物質(即ち、2価金属カチオン)を介して結びついてなる構造体を含有し、且つ該培地組成物中に該構造体が均一に分散されているので、当該培地組成物を用いると、浮遊状態を維持したまま、細胞や組織を培養することが可能である。
DAG又はその塩:0.005〜0.02%(好ましくは0.01〜0.02%)(w/v)
DAG以外の多糖類
キサンタンガム:0.1〜0.4%(w/v)
アルギン酸ナトリウム:0.0001〜0.4%(w/v)(好ましくは、0.1〜0.4%(w/v))
ネイティブジェランガム:0.0001〜0.4%(w/v)
ローカストビーンガム:0.1〜0.4%(w/v)
カラギーナン:0.05〜0.1%(w/v)
ダイユータンガム:0.05〜0.1%(w/v)
濃度[%(w/v)]=特定化合物の重量(g)/培地組成物の体積(mL)×100
本発明の製造方法は、上述の第1の液体及び第2の液体を濾過滅菌に付し、無菌の第1の液体及び無菌の第2の液体を得ることを含む。濾過滅菌の使用により、オートクレーブ滅菌が不要となり、オートクレーブ滅菌に伴う、細菌の死骸や、菌体の破壊によって遊離されるエンドトキシンが培地内に残存するリスクを回避することができる。濾過滅菌に使用する濾過膜としては、液体培地の濾過滅菌用に市販されているものを使用することができる。濾過膜の孔径は、通常0.1〜0.8μm、好ましくは0.2〜0.8μm、より好ましくは0.2〜0.45μm、更に好ましくは0.2〜0.22μmである。
第1の液体: 体積 V1
増粘性多糖類濃度 CY1
第2の液体: 体積 V2
増粘性多糖類濃度 CY2
液状の培地組成物:体積 V1+V2
特定化合物濃度 CX
増粘性多糖類濃度 CY
連結物質濃度 CZ
CY1×V1+CY2×V2=CY×(V1+V2)
の式を満足するよう、調整される。ここで、第1の液体及び第2の液体が、濾過滅菌に使用する濾過膜を通過し得るよう、CY1及びCY2は、0.422%(w/v)以下のメチルセルロース濃度に相当する粘度を液体に与える増粘性多糖類濃度とすることが好ましい。従って、CYも0.422%(w/v)以下のメチルセルロース濃度に相当する粘度を液体に与える増粘性多糖類濃度とすることが好ましい。
第1の液体中のDAG濃度は、上述の混合の結果として得られる液状の培地組成物中のDAG濃度に、(V1+V2)/V1(即ち、150/100〜300/100、好ましくは、160/100〜266/100、より好ましくは170/100〜242/100、更に好ましくは180/100〜225/100、より更に好ましくは190/100〜211/100(例えば、200/100))を乗じて得られる濃度である。
第2の液体中のカルシウムイオン濃度は、上述の混合の結果として得られる液状の培地組成物中のカルシウムイオン濃度に、(V1+V2)/V2(即ち、150/50〜300/200、好ましくは、160/60〜266/166、より好ましくは170/70〜242/142、更に好ましくは180/80〜225/125、より更に好ましくは190/90〜211/111(例えば、200/100))を乗じて得られる濃度である。
第2の液体中の培地構成成分の濃度は、上述の混合の結果として得られる液状の培地組成物中の培地構成成分の濃度に、(V1+V2)/V2(即ち、150/50〜300/200、好ましくは、160/60〜266/166、より好ましくは170/70〜242/142、更に好ましくは180/80〜225/125、より更に好ましくは190/90〜211/111(例えば、200/100))を乗じて得られる濃度である。
第1の液体及び第2の液体中のメチルセルロース濃度は、それぞれ、
CY1×V1+CY2×V2=CY×(V1+V2)
の式を満足するよう、調整される。ここで、CY1及びCY2は、0.422%(w/v)以下とすることが好ましい。CY1とCY2の差は、例えば、±30%以下(即ち、CY1=0.7×CY2〜1.3×CY2)、好ましくは±20%以下、より好ましくは±10%以下、更に好ましくは±5%以下である。
好ましい態様において、CY1、CY2、及びCYが実質的に同一である。
該液状の培地組成物には、DAGがカルシウムイオンを介して結びついてなる構造体及びメチルセルロースが均一に分散して含まれることにより、細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)ことができる。
滅菌精製水(ニプロファーマ社製)に、通常の使用濃度の2.11倍に相当するDMEM/F12粉末(12400−024、Life Technologies社製)と重炭酸水素ナトリウム(S5761−500G,Sigma社製)を溶解することにより、濃縮培地(2.11xDMEM/F12培地)を調製した。3%(w/v)のメチルセルロースを含有する培地組成物(HSC001、3% Methylcellulose in IMDM, R&D社製)を、上記2.11xDMEM/F12培地を用いて希釈し、含有するメチルセルロースの濃度が、それぞれ0.633%(w/v)、0.422%(w/v)、0.211%(w/v)となるように、調整した。
得られた各培地組成物50mLを、250mLスケールのフィルター濾過システム(0.2μm PES、Thermo Fisher社製)に添加して、フィルター濾過が可能か否か調べた。
(1)メチルセルロース水溶液の調製
メチルセルロース粉末(Methyl Cellulose 〜1500cps、0215549590、MP Biomedicals社製)と滅菌精製水(ニプロファーマ社製)を、500mL広口ガラス瓶に撹拌子とともに加え、121℃で20分オートクレーブ滅菌を実施した。オートクレーブ完了後、水溶液の温度が室温まで冷めるまで撹拌子により撹拌を行い、その後、冷蔵下(4℃)で1昼夜保存した。各メチルセルロース水溶液が透明になっていることを確認した後、さらに滅菌精製水を加え、メチルセルロース濃度を0.3%(w/v)および0.6(w/v)%に調整し、再度121℃で20分オートクレーブ滅菌を実施した。メチルセルロース水溶液を室温まで冷まし、再度冷蔵下(4℃)で一昼夜保存し、透明な水溶液を得た。
メチルセルロース粉末(Methyl Cellulose 〜1500cps、0215549590、MP Biomedicals社製)、脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG−LA、三晶株式会社製)及び滅菌精製水(ニプロファーマ社製)を、500mL広口ガラス瓶に撹拌子とともに加え、121℃で20分オートクレーブ滅菌を実施した。オートクレーブ完了後、水溶液の温度が室温まで冷めるまで撹拌子により撹拌を行い、その後、冷蔵下(4℃)で1昼夜保存させた。各メチルセルロース/脱アシル化ジェランガム水溶液が透明になっていることを確認した後、さらに滅菌精製水を加え、メチルセルロース濃度を0.3%又は0.6%に、脱アシル化ジェランガム濃度を0.075%に、それぞれ調整し、再度121℃で20分オートクレーブ滅菌を実施した。メチルセルロース/脱アシル化ジェランガム水溶液を室温まで冷まし、再度冷蔵下(4℃)で一昼夜保存し、透明な水溶液を得た。
各種メチルセルロース粉末(1.ナカライテスク社製(メチルセルロース#1500、22223−65)、2.純正化学社製(メチルセルロース1500、74208−9001)、3.東京化成社製(メチルセルロース、M0294))を、TeSR−E8 basal medium(ST−05940,Stem Cell Technologies社製)に加え、メチルセルロース粉末によるダマがほとんどなくなるまで撹拌子で撹拌したのち、冷蔵下で一昼夜保存することにより、透明な、各メチルセルロース含有TeSR−E8培地(メチルセルロース濃度:0.325%(w/v))を得た。
純水250mLに、通常の使用濃度の2.11倍量に相当するDMEM/F12粉末(12400−024、Life Technologies社製)と重炭酸水素ナトリウム(純正化学社製)を加えて溶解させることで、濃縮培地(2.11xDMEM/F12培地)を調製し、4℃で保管した。次に、70℃に加熱した純水25mLへ、メチルセルロース(純正化学社製、メチルセルロース1500、74208−9001)0.79gを加え、均一に懸濁させた後に、得られた懸濁液を撹拌しながら、氷水で冷却した。メチルセルロースが溶解して、上記懸濁液が透明になったら、先に調製して4℃で保管した濃縮培地を、メチルセルロース水溶液へ添加し、撹拌することにより均一にし、得られた混合液を再度、4℃で保管した。
Claims (9)
- 以下の工程を含む、無菌の液状の培地組成物の製造方法:
(I)下記(i)の特定化合物及び増粘性多糖類を含有する第1の液体を濾過滅菌に付し、無菌の第1の液体を得ること;
(II)下記(ii)の連結物質及び前記増粘性多糖類を含有する第2の液体を濾過滅菌に付し、無菌の第2の液体を得ること;及び
(III)工程(I)で得られた無菌の第1の液体と、工程(II)で得られた無菌の第2の液体とを混合し、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体及び前記増粘性多糖類を均一に分散した状態で含有する無菌の液状の培地組成物を形成すること:
(i)2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物、
(ii)2価金属カチオンである連結物質、
ここで、前記液状の培地組成物中の増粘性多糖類濃度が、0.422%(w/v)以下のメチルセルロース濃度に相当する粘度を該液状の培地組成物に与える濃度であることを特徴とする、製造方法。 - 前記(ii)の連結物質を含有する液体と、前記増粘性多糖類を含有する液体とを混合し、前記第2の液体を得ることを更に含む、請求項1に記載の製造方法。
- 前記液状の培地組成物中の増粘性多糖類濃度が、0.2%(w/v)以上のメチルセルロース濃度に相当する粘度を該液状の培地組成物に与える濃度である、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記第1の液体及び前記第2の液体中の増粘性多糖類濃度が、0.422%(w/v)以下のメチルセルロース濃度に相当する粘度を該液体に与える濃度である、請求項1〜3の何れか1項に記載の製造方法。
- 前記第1の液体、前記第2の液体、及び前記液状の培地組成物中の増粘性多糖類濃度が、実質的に同一である、請求項1〜4の何れか1項に記載の製造方法。
- 前記増粘性多糖類がメチルセルロースである、請求項1〜5の何れか1項に記載の製造方法。
- 前記(i)の特定化合物が脱アシル化ジェランガムであり、第1の液体が該脱アシル化ジェランガム及び前記増粘性多糖類を含有する水溶液であり、
前記(ii)の連結物質が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、第2の液体が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方、及び前記増粘性多糖類を含有する液体培地であるか、または、該液体培地の濃縮液である、
請求項1〜6の何れか1項に記載の製造方法。 - 濾過滅菌に使用する濾過膜の孔径が0.2〜0.22μmである、請求項1〜7の何れか1項に記載の製造方法。
- 高圧蒸気滅菌工程を含まない、請求項1〜8の何れか1項に記載の製造方法。
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