JP2004283295A - リガンド固定化材料およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】材料に生理活性物質が非特異的に吸着される問題を解決し、かつ簡単な作製方法で体外循環用途で利用できる滅菌されたリガンド固定化材料を提供する。
【解決手段】疎水性基材に疎水性部位を持つ生体物質を吸着させ、さらにリガンドが結合されたカチオン性高分子を吸着させたリガンド固定化材料。
【選択図】なし。

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中の有用物質あるいは病因物質を効率よく除去回収する、あるいは細胞分離、濃縮するための材料およびその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、リガンド、特に抗体を用いて、抗体と相互作用する特定の細胞を選択的に分離し、研究用・医療用に利用する試みがなされている。このような特定の細胞を分離回収、利用する技術として、例えばフローサイトメトリーによる方法や磁気ビーズ法などが提案されている（例えば、非特許文献１参照）が、いずれの方法も少量の細胞を対象としており、さらに、細胞と標識抗体とを反応させた後、分離作業をするという非常に煩雑な操作が必要であり、特定の細胞を大量に回収する際は、時間、コストがかかることが問題となっている。
【０００３】
そこで、近年では特定の細胞を簡単、大量に分離・回収するため、抗体を固定化した材料を担体として用い、ここに血液細胞などの細胞群を流すことにより、抗体と相互作用する特定の細胞だけを除去したり、回収したりする技術が検討されている。例えば、ヒト表面抗原を認識する抗体を不織布に固定化し、特定の血球成分を除去する技術（特許文献１参照）や還元剤により切断可能なジスルフィド結合を介して、リガンドを材料に固定化する方法も検討されている（特許文献２参照）。しかし、これらの検討技術では抗体などのリガンドを基材に固定化する際に有機合成反応の手法を用いている。医療用途製品としてこれらの材料を利用する場合、製品を滅菌する必要があり、抗体などのリガンドは放射線や熱による滅菌により失活し、その機能を失ってしまうため、有機合成反応により抗体などの生理活性物質を固定する手法で医療用具を製造する場合は、製造プロセスをすべて無菌状態で製造する必要があり、この場合莫大な製造コストがかかることが問題である。
【０００４】
また、一般に基材上に抗体などのリガンドを接触させると、基材にリガンドが非特異的に吸着されてしまうため、リガンドを基材に固定化する際の固定化量や基材から放出する際の放出量の制御ができず、これが問題となることがある。例えば、非特許文献２に記載された技術では還元剤によりジスルフィド結合を切断して、特定の細胞を捕捉したリガンドを放出させることができるが、放出されたリガンドが基材に再吸着してしまい、結果的に細胞を効率良く回収できないという問題点があった。
【０００５】
【非特許文献１】
ポール・Ｔ・シャープ（Ｐ．Ｔ．Ｓｈａｒｐｅ），「生化学実験法１３−細胞分離法−」，第１版，東京化学同人，１９９１年，ｐ１５１〜１９０
【０００６】
【特許文献１】
国際公開第９７／０２７８７８号パンフレット
【０００７】
【特許文献２】
国際公開第９６／３１７７６号パンフレット
【０００８】
【非特許文献２】
Ｈ．Ｋｉｅｆｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５巻，１９７５年，ｐ６２４〜６２７
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明では、上記従来技術の問題を解消するものであり、リガンドを材料に固定化する際の滅菌に関わる問題を解決し、かつ基材に対するリガンドの非特異的吸着を抑制することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は以下の構成を有する。すなわち、「疎水性基材に疎水性部位を持つ生体物質を吸着させ、さらにリガンドが結合されたカチオン性高分子を吸着させたリガンド固定化材料。」、「疎水性部位を持つ生体物質を水溶液状態で無菌ろ過滅菌し、別に滅菌された疎水性基材に無菌的に接触し吸着させ、さらに水溶液状態で無菌ろ過滅菌されたリガンドが結合されたカチオン性高分子を無菌的に接触し吸着させることを特徴とするリガンド固定化材料の製造方法。」である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、疎水性基材に疎水性部位を持つ生体物質を吸着させ、さらにリガンドが結合されたカチオン性高分子を吸着させたリガンド固定化材料である。
【００１２】
本発明で用いられる疎水性基材の形状としては、平膜状、粒子状、中空糸状、繊維状、カットファイバーなど何でもよいが、平膜状、繊維状、中空糸状が好ましく体外循環用途、血液浄化用途、細胞培養用途として使用する場合、閉鎖系で圧力損失を伴わず、血球細胞などの細胞を傷つけず循環できる利点から特に中空糸状が望ましい。また、表面積を確保する点からこれらは多孔質であることがのぞましい。多孔質として用いる場合は、透析やろ過機能を付与することができ、血液浄化用途のみならず、バイオリアクターなどの細胞培養用途として用いることができる。多孔質材料の場合は、製造条件を制御することにより孔の制御も可能である。
【００１３】
本発明における疎水性基材を構成する疎水性材料としては、医療用途として用いることができれば問題なく、具体的には、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレンセルロース、セルロースアセテート、セルローストリアセテート、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリアリレート、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリアミド、ポリスルホン系ポリマー、ゼラチン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、コラーゲン、アガロースなどの高分子化合物、ステンレス、チタン、白金などの金属、ハイドロキシアパタイト、トリカルシウムホスフェートなどが挙げられる。なかでも、加工性等の点から、高分子化合物が好ましい。
【００１４】
本発明で用いられる疎水性基材は、アニオン性表面を持つ基材であることが好ましい、これは表面をアニオン性にすることにより、リガンドが結合されたカチオン性高分子を静電相互作用により容易に吸着でき、さらに疎水性部位を持つ生体物質としてアルブミンの吸着量を増大することができるためである。
【００１５】
疎水性基材表面にアニオン性を付与するためには、化学反応、グラフト反応、放射線架橋、共重合、ブレンド、加熱処理、加水分解処理、酸・アルカリ処理、イオン注入、真空蒸着、コーティング、スパッタリング、プラズマ放電など材料表面にアニオン性を付与できる方法であればどのような方法を用いても良い。
【００１６】
これらの方法により、疎水性基材表面にアニオン性を付与するために用いられる物質としては、硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ＤＮＡ、ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、アクリル酸、ビニル硫酸、パラスチレンスルホン酸ナトリウムなど、アニオン性の官能基をもつ低分子や高分子物質が一般に用いられる。例えば、疎水性基材がポリスチレンからなる材料の場合は、濃硫酸で処理してやることにより、表面に硫酸基を導入でき、表面にアニオン性官能基を導入できる。また、ポリメチルメタクリレートを通常のラジカル重合によって得る際、カルボキシル基や、スルホン酸基などのアニオン性基を含有するビニルモノマーと共重合したものを、材料に成形することにより、材料表面にアニオン性を付与できる。また、アニオン性ポリマーをポリメチルメタクリレートのようなポリマーとブレンドして成形することによって材料表面にアニオン性を付与することができる。ナイロンやポリエステルにアクリル酸をグラフトすることによってもアニオン性を付与することができる。また、金属の負イオン注入によってもアニオン性を付与することができる。
【００１７】
特に、疎水性基材表面にアニオン性基として硫酸基を導入する場合、リガンド（例えば免疫グロブリンＧ）の該基材表面への吸着を抑制し、その反面、後で述べる疎水性部位を持つ生体物質（例えば血漿タンパクのアルブミン）をより多く吸着するようになるため、結果的にリガンドが結合されたカチオン性高分子を特異的により多く吸着させることができるので、アニオン性基として硫酸基を用いることが好ましい。また、アニオン性基として硫酸基を導入することは、後で述べる外部刺激によるリガンドの脱離後に、リガンドが基材に再吸着するのを防ぐことができるという点においても好ましい。
【００１８】
また、本発明でリガンド固定化材料を作成するために、アニオン性表面を持つ基材に疎水性部位を持つ生体物質を吸着させる。これにより、基材表面の疎水性部位を生体物質でブロックすることにより、リガンドが基材へ非特異的に吸着されることを抑制することができ、また、還元剤などで基材から脱離したリガンドが再び基材に吸着されることを防ぐことができる。
【００１９】
本発明に用いられる疎水性部位を持つ生体物質としては、フィブリノーゲン、アルブミン、グロブリンなどがあるが、特にアルブミンを用いることが好ましい。アルブミンは疎水性基材、特に硫酸基などのアニオン性表面を持つ疎水性基材に容易に吸着する。ここでいうアルブミンとは動植物の細胞や体液中の一連の可溶性タンパク質を指し、好ましく用いられるアルブミンの分子量は１００以上５万以下である。このようなアルブミンとして、ヒトやウシなどの血清アルブミン、オボアルブミン、ラクトアルブミン、ロイコシン、レグメリン、リシンなどがあげられるがこれらに限定されない。これらは精製されているものを用いても良いし、血清や血漿、ミルクなどのアルブミンを含む混合物を用いても良い。特に、医療用途に用いる場合は自己の血漿や血清を用いることが望ましい。
【００２０】
本発明において、アルブミンなどの疎水性部位を持つ生体物質を疎水性基材に吸着させるには、疎水性部位を持つ生体物質を含む溶液を疎水性基材の表面に接触させるだけでよい。
【００２１】
疎水性の基材には、抗体などの疎水性部位を持つリガンドが非特異的に吸着されやすく、このことにより、リガンドを基材に固定化する際の固定化量や基材から放出する際の放出量の制御ができず問題となることがある。しかし、アルブミンなどの疎水性部位を持つ生体物質を疎水性基材に予め吸着させておきブロッキングしておけば、疎水性基材にリガンドが非特異的に吸着されることを抑制することができる。
【００２２】
本発明では、以上のようにアニオン性表面を持つ疎水性基材に疎水性部位を持つ生体物質を吸着させた後、リガンドが結合されたカチオン性高分子を吸着させて、リガンド固定化材料を作製する。この際、リガンドを結合したカチオン性高分子の溶液を基材と混合するだけで基材に簡単にリガンドが結合されたカチオン性高分子を吸着させることができる。疎水性基材の表面がアニオン性であれば、リガンドが結合されたカチオン性高分子は静電相互作用により基材に良く吸着することができる。また、疎水性部位をもつ生体物質、例えばアルブミンを基材に吸着しておけば、このアルブミンにカチオン性高分子が吸着することにより、基材とリガンドが結合されたカチオン性高分子との固定化能が増大する。カチオン性高分子とアルブミンとは水溶液中での相互作用によりコンプレックスを形成するため、アルブミンを吸着させた疎水性基材はカチオン性高分子をより多く吸着する。なお、このとき、疎水性基材表面のアニオン性基として硫酸基を導入すると、リガンドが基材表面に吸着されるのを抑制することができるので、後で述べる外部刺激によるリガンドの脱離後にリガンドが基材表面に再吸着するのをある程度防ぐことができる。
【００２３】
本発明に用いられるカチオン性高分子は窒素原子を含有するポリマー、すなわち１級、２級、３級アミノ基、４級アンモニウム塩のいずれか１種以上を有するアミノ基含有ポリマー、イミノ基含有ポリマー、アミド基含有ポリマーなどが好ましく用いられる。これらのポリマーを構成する原料成分の共重合体またはノニオン、アニオン性化合物との共重合体なども好ましく使用される。ここで、該カチオン性ポリマーは直鎖状、分岐状、環状のいずれであってもよい。また、分子量は好ましくは６００以上１０００万以下である。
【００２４】
アミノ基含有ポリマーの例としては、ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ジアルキルアミノアルキルデキストラン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、キトサン、ポリオルニチン、ポリリジン、アジリジン（エチレンイミン）化合物を有するポリマー、およびそれらに置換基の導入されたもの、およびこれらを構成するモノマー単位からなる共重合体などが挙げられる。
【００２５】
カチオン性高分子の中でも毒性の低さ、入手のしやすさ、取り扱いのしやすさ、アルブミンとの相互作用のしやすさなどから、直鎖状、分岐状のポリエチレンイミンやジエチルアミノエチルデキストランが特に好適に用いられる。
【００２６】
さらに、ポリエチレンイミン誘導体として、ポリエチレンイミンをアルキル化、カルボキシル化、フェニル化、リン酸化、スルホン化など、所望の割合で誘導体化したものを用いることもできる。
【００２７】
リガンドとカチオン性高分子を結合させるには、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、ジスルフィド結合など様々な結合が利用できるが、結合の形成が簡単で、かつ外部刺激で簡単に切り離せるジスルフィド結合を利用してリガンドとカチオン性高分子を結合させることが好ましい。外部刺激によりジスルフィド結合が分解し、リガンドが基材から脱離することにより、リガンドで補捉した物質や細胞などを基材から放出、回収することができる。
【００２８】
このようなジスルフィド結合を介してリガンドをカチオン性高分子に結合させるにはピリジルジスルフィド基を導入したカチオン性高分子とメルカプト基を持つリガンドの反応させることによって達成される。
【００２９】
この反応に利用するために、カチオン性高分子にピリジルジスルフィド基を導入するためには、通常、カチオン性高分子が持つアミノ基と反応する活性基とピリジルジスルフィド基を持つ架橋剤を利用することが好ましい。このような架橋剤としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートや水溶性のスルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートなどがあげられる。水に不溶性の架橋剤を用いる場合、ジメチルスルホキシドやメタノールなどの可溶性の有機溶媒に溶解後、カチオン性高分子を溶解した水系の反応液に添加することにより利用できる。カチオン性高分子へのピリジルジスルフィド基の導入率はカチオン性高分子１分子あたり１個以上であることが必要であるが、導入率を上げるためにピリジルジスルフィド化剤の仕込量を上げると失活したり、凝集したりするおそれがある。このため、仕込量はカチオン性高分子１モルあたり１０モル以下であることが望ましい。
【００３０】
また、カチオン性高分子がメルカプト基を持つ場合には、このメルカプト基に２，２’−ジチオジピリジン、４，４’―ジチオピリジンを反応させることによりピリジルジスルフィド基を導入できる。
【００３１】
また、メルカプト基を持つリガンドについては、そのリガンド上にメルカプト基の数を十分に有する場合、そのまま反応に使用することも可能だが、リガンドが生理活性物質の場合、一般的に生理活性物質上のメルカプト基の数は少なく、反応性に乏しいため、生理活性物質にメルカプト基を導入する必要がある。この場合、生理活性物質にメルカプト基を導入する方法として、メルカプト基と他の反応性基を併せ持つ化合物を生理活性物質に反応させる方法やＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートなどの架橋剤を利用してピリジルジスルフィド基を生理活性物質に導入した後、このピリジルジスルフィド基を還元してメルカプト基を導入する方法、あるいは、リガンドがタンパク質の場合には、還元剤によりタンパク質分子内のジスルフィド結合を還元してメルカプト基を生成する方法などがあげられる。
【００３２】
メルカプト基と他の反応性基を併せ持つ化合物としては、２−メルカプトエタノール、６−メルカプト−１−ヘキサノール、メルカプトウンデカノール、２−アミノエタンチオール、メルカプト酢酸、メルカプトプロピオン酸、メルカプトこはく酸、メルカプトウンデカン酸、メルカプト安息香酸、２−メルカプトスルホン酸、メルカプトフェノール、システインなどがあげられる、これら化合物のメルカプト基以外の反応性基を利用してリガンドに反応させれば、メルカプト基をリガンドに導入することができる。また、このような化合物以外にも２−イミノチオランを使用すれば、これがリガンドのアミノ基と反応して、リガンドにメルカプト基を簡単に導入することができる。
【００３３】
また、上記のピリジルジスルフィド基やタンパク質分子内のジスルフィド基を還元する際に使用する還元剤としては、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、システイン、メルカプトエチルアミン、還元型グルタチオンなどがあげられる。
【００３４】
また、リガンドが抗体の場合、抗体にピリジルジスルフィド基を導入して、還元する場合には、抗体自体の還元による失活を防ぐために、酢酸緩衝液中などで還元することにより抗体自身の還元を抑えることができる。
【００３５】
また、抗体をペプシンで消化切断した後、還元剤で還元し、プロテインＧカラムやゲルろ過カラムで精製することによって、抗体の可変部位にメルカプト基を導入したフラグメントを得ることも可能である。
【００３６】
リガンドとカチオン性高分子をジスルフィド結合を介して結合させるには、上記の方法でピリジルジスルフィド基を導入したカチオン性高分子を含む溶液とメルカプト基を持つリガンドを含む溶液をそれぞれ作成し、これらを常温で混合して反応させることにより、容易にジスルフィド結合を介してリガンドをカチオン性高分子に結合させることができる。リガンドを含む溶液の溶媒としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ハンクス緩衝液など各種緩衝液が好ましく、緩衝液にジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、メタノール、エタノールなどの有機溶媒を添加しても良い。
【００３７】
また、本発明で使用するリガンドはターゲット物質と相互作用をもつものであれば、合成物質でも天然物質でもよいが、特異性の点から天然物質であることが望ましい。天然物質は、ａ）細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつものや、ｂ）抗血栓性を有するもの、ｃ）細胞を活性化するもの、ｄ）アポトーシスを誘導するもの、ｅ）増殖、分化因子、ｆ）サイトカイン、ｇ）接着因子などが好適に用いられる。
【００３８】
ａ）細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつもの：
細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつものの場合、特異性の点から抗体およびレセプターを好ましく用いることができる。用いる抗体としては、例えば、抗ＣＤ１ａ抗体、抗ＣＤ１ｂ抗体、抗ＣＤ１ｃ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤｗ１２抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１６ａ抗体、抗ＣＤ１６ｂ抗体、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２６抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４２ａ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４９ｄ抗体、抗ＣＤ５０抗体、抗ＣＤ５４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ５７抗体、抗ＣＤ５８抗体、抗ＣＤ６１抗体、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、抗ＣＤ６２Ｐ抗体、抗ＣＤ６６抗体、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＣＤ９５抗体、抗ＣＤ１０２抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ＣＤ１０９抗体、抗ＣＤｗ１１９抗体、抗ＣＤ１２０ａ抗体、抗ＣＤ１２０ｂ抗体、抗ＣＤ１２１ａ抗体、抗ＣＤｗ１２１ｂ抗体、抗ＣＤ１２２抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＣＤ１２６抗体、抗ＣＤｗ１２８ａ抗体、抗ＣＤ１３０抗体、抗ＣＤｗ１３１抗体、抗ＣＤ１３２抗体、抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＤ１３４抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１３８抗体、ＣＤ１５２抗体、抗ＣＤ１５４抗体、抗ＣＤ１９９抗体、抗低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）抗体、抗酸化ＬＤＬ抗体、抗β２ミクログロブリン抗体、抗ＣＣＲ１抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＣＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ５抗体、抗ＣＣＲ７抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体、抗ＣＸＣＲ５抗体、抗ＣＸＣＲ１抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。また、レセプターとしては例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ５等のサイトカインレセプターやＦｃγ、Ｆｃε等のイムノグロブリンレセプター、ＲＡＧＥ、ＬＤＬレセプター等のスカベンジャ−レセプター等、Ｔ細胞レセプターや主要組織適合性抗原等の細胞認識レセプター等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗体やレセプターは、単独で基材に固定化しても良いし、複数の抗体やレセプターを組み合わせても良い。抗体は、アフィニティーの高さからモノクローナル抗体が好ましい。
【００３９】
これら抗体やレセプターは目的によって種々選定することができ、例えば本発明の方法で作製した材料を血液中の有用物質や病因物質を特異的に除去、回収する用途に使用する場合には、細胞、無機物、タンパク質、ＤＮＡ、脂質、糖、ウィルスなどがターゲットとして挙げられる。例えば、抗ＣＤ２抗体を用いればＴ細胞およびＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ３抗体を用いればＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ４抗体を用いればヘルパーＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ８抗体を用いればサイトトキシックＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ１１ａ抗体を用いれば白血球を分離でき、抗ＣＤ１１ｂ抗体を用いれば単球を分離でき、抗ＣＤ１４抗体を用いれば単球やマクロファージを分離でき、抗ＣＤ１５抗体を用いれば顆粒球やミエロイド細胞を分離でき、抗ＣＤ１６抗体を用いれば好中球あるいは休止期ＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ１９抗体を用いればＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ２２抗体を用いればＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ２７抗体を用いればナイーブＢ細胞やメモリーＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ３０抗体を用いれば活性化Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞を分離でき、抗ＣＤ３３抗体を用いれば単球、顆粒球およびミエロイド細胞を分離でき、抗ＣＤ３４抗体を用いれば造血幹細胞を分離でき、抗ＣＤ４５抗体を用いれば白血球を分離でき、抗ＣＤ５６抗体を用いればＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ６１抗体を用いれば巨核球及びその前駆細胞を分離でき、抗ＣＤ６６抗体を用いれば顆粒球を分離でき、抗ＣＤ６９抗体を用いれば活性化Ｔ細胞や活性化Ｂ細胞やＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ７１抗体を用いれば赤芽球や活性化されたリンパ芽球を分離でき、抗ＣＤ１０５抗体を用いれば内皮細胞、抗ＣＤ１３３抗体を用いれば神経幹細胞を分離できる。
【００４０】
ｂ）抗血栓性を有するもの：
リガンドにおいて、抗血栓性を有するものとしては、ヘパリン、トロンモボジュリン、ヒルジンなどがあげられる。これらを材料に固定化したものは、血液浄化用カラムやカテーテル、人工血管などに利用できる。
【００４１】
ｃ）細胞を活性化するもの：
細胞を活性化するものとして、インターフェロン、インターロイキン、抗ＣＤ３抗体やＴ細胞レセプター、主要組織適合性抗原等の細胞認識レセプター、スーパー抗原、フィトヘマグルチニン、リポポリサッカライド、コンナカバリンＡ、ピーナッツアグルチニン等が挙げられる。例えば、材料に抗ＣＤ３抗体を固定化したものを用いてリンパ球を培養すれば、培養によりリンパ球が活性化され、培養されたリンパ球をがん免疫療法に用いることができる。
【００４２】
ｄ）アポトーシスを誘導するもの：
アポトーシスを誘導するものとしては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＦａｓリガンドやＣＤ４０リガンドなどある。
【００４３】
ｅ）増殖、分化因子：
増殖、分化因子としては、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ−２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、オステオネクチン、アンジオポイエチン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、ノッチリガンド（Ｄｅｌｔａ１，Ｄｅｌｔａ３，Ｄｅｌｔａ４，Ｊａｇｇｅｄ１， Ｊａｇｇｅｄ２）などが挙げられる。また、同じ作用をもつ上記タンパクの遺伝子をもちいることもできる。
【００４４】
ｆ）サイトカイン：
サイトカインとして、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＭＣＰ−１、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）などが挙げられる。
【００４５】
がん細胞を認識するものとして、マンノース６リン酸などが挙げられ、癌患者の血中に存在するガン細胞を除去し、転移を抑制のための血液浄化カラムに用いることができる。
【００４６】
ｇ）接着因子：
接着因子として、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、カテニンやカドヘリン等のカドヘリンファミリー、Ｉ−ＣＡＭなどのＩｇスーパーファミリー、セレクチンファミリー、シアロムチンファミリーなどがあげられる。
【００４７】
以上用いる天然物質は市販の天然物質や医薬品を用いても良いし、抗体の場合には、ハイブリドーマから作製してもよい。
【００４８】
疎水性部位を持つ生体物質の水溶液を無菌ろ過滅菌し、別に滅菌された疎水性基材に無菌的に接触させて疎水性部位を持つ生体物質を吸着させ、さらに無菌ろ過滅菌されたリガンドが結合されたカチオン性高分子の水溶液を無菌的に接触させて吸着させることにより、容易に体外循環用のリガンド固定化材料を製造することができる。
【００４９】
疎水性部位を持つ生体物質やリガンドが結合されたカチオン性高分子は医薬品と同様、無菌ろ過により滅菌できる。方法は、疎水性部位を持つ生体物質やリガンドが結合されたカチオン性高分子を生理食塩水、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ハンクス緩衝液などの各種緩衝液やＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆ１６培地、ＤＦ培地などの各種培地、これら緩衝液や培地にジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、メタノール、エタノールなどの有機溶媒を添加した溶媒に溶解し、メンブレンフィルターに通過させてろ過滅菌する。メンブレンはニトロセルロース製、セルロース混合エステル製、ＰＶＤＦ製、ＰＴＦＥ製、ポリエーテルスルホン製などのメンブレンを使用することができ、メンブレンの孔径が０．４５μｍ以下、より好ましくは０．２２μｍ以下のメンブレンを使用する。水溶液が数１０ｍｌまでの少量場合は、シリンジフィルターを使用し、水溶液が１００ｍｌ以上の大量となるときは、陰圧、陽圧でろ過を行うボトルトップタイプフィルターやステンレス製のフィルターホルダーを利用することが好ましい。無菌ろ過滅菌された疎水性部位を持つ生体物質やリガンドが結合されたカチオン性高分子はそのまま水溶液の状態で保存してもよいし、滅菌後、凍結乾燥した状態で保存しても良い。凍結乾燥されたものであれば、疎水性基材に接触させる前に滅菌済みの生理食塩水、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ハンクス緩衝液など各種緩衝液やＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆ１６培地、ＤＦ培地などの各種培地、これら緩衝液や培地にジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、メタノール、エタノールなどの有機溶媒を添加した溶媒に再溶解してから用いられる。
【００５０】
上記体外循環用のリガンド固定化材料の製造方法において、疎水性基材は放射線滅菌、エチレンオキシドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、乾熱滅菌、煮沸滅菌、エタノールやグルタルアルデヒドによる化学薬品による滅菌などが医療用材料の滅菌において使用できるが、基材の性状を保つためにガンマ線や紫外線を用いた放射線滅菌を用いることが好ましい。
【００５１】
疎水性基材に上記の無菌ろ過滅菌した疎水性部位を持つ生体物質やリガンドが結合されたカチオン性高分子の水溶液を無菌的に接触させる操作は、操作をクリーンベンチ内あるいは滅菌した器具を用いた閉鎖系内で行い無菌操作する。この操作の際、疎水性基材に疎水性部位を持つ生体物質やリガンドが結合されたカチオン性高分子を効率よく吸着させるには、ろ過滅菌したこれらの水溶液中に疎水性基材を浸漬し、攪拌機や振とう機を用いて水溶液を攪拌、振とうする、あるいは、疎水性基材をモジュールに充填してこれらの水溶液を通液し、環流するなどの方法を採ることにより達成できる。また、疎水性部位を持つ生体物質やリガンドが結合されたカチオン性高分子をさらに効率よく吸着させるために、加温雰囲気下でこれらの操作を行っても良いし、逆に、リガンドなどの熱変性を防ぐために低温条件下で操作行っても良い。このため、これらの操作を行う望ましい温度条件は４℃以上３７℃以下で行うことが好ましい。
【００５２】
本発明のリガンド固定化材料を利用すれば、上記で示したようなターゲットとなる有用物質や病因物質をリガンドにより捕捉できる。さらに、リガンドとカチオン性高分子をジスルフィド結合を介して結合していれば、還元剤による外部刺激によりリガンドを材料から脱離させることができ、リガンドにより捕捉した有用物質や病因物質を回収する事が可能である。また、ターゲット物質を捕捉あるいは回収する際に使用する溶媒として、様々なｐＨ値のリン酸、酢酸、クエン酸などの緩衝液をもちいることができ、さらに緩衝液の中にウシ血清アルブミンや抗体などのタンパク質あるいはカチオン性、アニオン性などのポリマーなどを含有していても良い。リガンドを材料から脱離させる際の還元剤としては、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、システイン、メルカプトエチルアミン、還元型グルタチオンなどがあげられる。
【００５３】
血球系の細胞を回収する際は全血と作用させてもよいし、血漿分画や単核球分画などにした後、作用させてもよい。
【００５４】
以上のような方法で、本発明の材料により回収した有用物質、病因物質を分析に用いることが可能である。また、細胞の場合はそれを培養し、分析や治療などに利用できる。例えば、リガンドとして抗ＣＤ４抗体を使用し、このリガンドを固定化した本発明の材料に血液を通してＣＤ４陽性のＴ細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤で生理活性物質を脱離することにより、捕捉した細胞を大量に回収し、この細胞に様々な刺激を加えて活性化させ体内に戻すことにより、癌、アレルギー、感染症、臓器移植、あるいは自己免疫疾患の治療やワクチンとしてもちいることができる。また、材料上にＣＤ４陽性細胞を補足したまま培養し、ＣＤ４陽性細胞の大量培養を行うこともできる。
【００５５】
また、例えば、リガンドとして抗ＣＤ３４抗体を使用し、このリガンドを固定化した本発明の材料に臍帯血を通して、造血幹細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤で生理活性物質を脱離することにより、造血幹細胞を大量に回収し、回収した造血幹細胞を培養して輸血医療に用いたり、様々な組織幹細胞に分化させることにより、肝疾患や神経疾患、血管傷害などの細胞療法に用いることができる。
【００５６】
また、例えば、リガンドとして抗ＣＤ１３３抗体を使用し、このリガンドを固定化した本発明の材料に臍帯血を通して、神経幹細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤で生理活性物質を脱離することにより、神経幹細胞を大量に回収し、回収した神経幹細胞を培養して神経幹細胞移植に用いたり、様々な神経細胞に分化させることにより、パーキンソン病やアルツハイマー病など神経疾患、脳梗塞により壊死した神経細胞の修復などの細胞療法に用いることができる。
【００５７】
【実施例】
以下に実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５８】
１．メルカプト基を持つヒト免疫グロブリン誘導体の作製
ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５ｍｇ／ｍｌに溶解した精製ヒト免疫グロブリンＧ（シグマ社製）にＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（以下、ＳＰＤＰと略す）を２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液をヒト免疫グロブリンＧ１モルに対して１０モル添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。ヒト免疫グロブリンＧ１モルあたりのＳＰＤＰ導入量は４．２モルであった。再度ＰＤ−１０カラムを用いて酢酸緩衝液（０．５Ｍ酢酸、０．５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）に置換し、合成したＳＰＤＰ化ヒト免疫グロブリンを２５ｍＭのジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略す）を含む酢酸緩衝液中で還元反応を行い、メルカプト基を有するヒト免疫グロブリン誘導体（以下、ＨＳ−ＩｇＧと略す）を合成した 。
【００５９】
２．ピリジルジスルフィド基を持つポリエチルイミンの作製
１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にポリエチレンイミン（数平均分子量１００００、以下ＰＥＩ）を５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。この溶液３ｍｌに、Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアース社製、以下ＳＰＤＰ）を２０ｍＭになるように溶解したジメチルスルホキシド溶液を０．５ｍｌ添加し、室温で３０時間撹拌した。反応させた溶液をＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製し、ピリジルジスルフィド基を持つポリエチルイミン（以下、ＳＤＰＤ−ＰＥＩと略す）を作製した。
【００６０】
３．ジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを結合させたポリエチルイミンの合成
１．で得られたＳＨ−ＩｇＧを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液と、２．で得られたＳＤＰＤＰ−ＰＥＩを２．１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液をモル比で１：１になるように混合し、室温で１４時間反応させ、ヒト免疫グロブリンＧをポリエチルイミンにジスルフィド結合を介して結合させた。結合は反応液を高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣ、測定条件は、カラム：東ソーＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ、溶出液：０．５Ｍ酢酸バッファー、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて分析し、高分子量側にシフトすることにより確認した。さらに、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体の溶液にＤＴＴを２５ｍＭとなるように添加して複合体を還元後再びＨＰＬＣ測定すると、もとのヒト免疫グロブリンＧとポリエチレンイミンのピークになることが確認され、複合体が分離していることがわかった。得られたジスルフィド結合を介して複合化されたＰＥＩ化抗体は無菌ろ過滅菌により滅菌した。
【００６１】
４．表面アニオン性繊維の製造方法
５０重量比の海成分（４６重量比のポリスチレンと４重量比のポリプロピレンの混合物）と５０重量比の島成分（ポリプロピレン）とからなる海島型複合繊維（厚さ：２．６デニール、島の数１６）を溶融紡糸した。その繊維を３ｍｍに切断した。９８％硫酸１１２０ｍｌ中に９５％ＰＦＡ９．９ｇを投入した。その中に３ｍｍに切断した繊維５０ｇを投入し、５時間反応を行った。イオン交換水、温イオン交換水で洗浄し、表面アニオン性繊維を得た。この繊維に１０ｋＧｙのガンマ線を照射することにより滅菌を行った。
【００６２】
５．実施例１
１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌにウシ血清由来アルブミン（生化学工業株式会社製）を５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、ろ過滅菌により滅菌した。この溶液１ｍｌに４．で作製した繊維をクリーンベンチ内で浸漬、振とうし、室温で３０分反応させた。反応後の反応液に含まれるウシ血清由来アルブミンの濃度の吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、繊維にアルブミンが吸着していることが確認できた。このアルブミン吸着繊維を３．で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合化したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬、振とうさせた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ＰＥＩ複合体がアルブミン吸着繊維に固定されていることが確認された。また、この繊維を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元反応し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により固定したヒト免疫グロブリンＧ９０％以上がアルブミン固定化繊維から溶液中へ脱離された。
【００６３】
６．比較例１
実施例１において、繊維にウシ血清由来アルブミンを吸着させずに、ヒト免疫グロブリンＧを複合化したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少したが、この繊維を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元反応し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、ヒト免疫グロブリンＧは繊維から溶液中へ脱離されなかった。
【００６４】
７．硫酸基をもつ平膜の作製
ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）Ｐ−３５００）１８重量部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製”Ｋ３０”（登録商標））９重量部をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２重量部、水１重量部に加え、９０℃、１４時間加熱溶解した。この溶液を０．１ｍｍスペーサー付きのガラス板に塗布し、ドクターブレードにて溶液を引き延ばしたものを水中にいれて、凝固させ、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンドからなる平膜状の材料を作製した。上記のポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド材料を十分水洗した後、１ｗｔ％のデキストラン硫酸（分子量５０万、和光純薬製）水溶液に浸漬して、２５ｋＧｙにてγ線照射して、表面に硫酸基をもつ平膜を作製した（滅菌を兼ねる）。
８．ヒト血漿の分離
ヒト末梢血（ヘパリン含有）を１５ｍｌチューブに６ｍｌ採血し、２０００回転で２０分遠心し、薄黄色の血漿層を回収した。この血漿をＰＳｔ製の細胞培養用のフラスコ中で３７℃で３０分インキュベートして、血小板を吸着させて除去した後、５７℃の温浴で３０分処理して非働化を行った。
【００６５】
９．実施例２
８．で作製したヒト血漿を１０％含むリン酸緩衝液をろ過滅菌し、クリーンベンチ内でこの溶液１ｍｌに、７．で作製したアニオン性平膜浸漬、振とうし、室温で３０分反応させアルブミンを含む血漿成分を吸着させた。この平膜を３．で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合化したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬、振とうさせ、２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、反応液の吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧとポリエチレンイミンの複合体が平膜に固定されていることが確認された。続いて、この平膜を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元反応し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により７．６μｇ／ｃｍ２ヒト免疫グロブリンＧがアニオン性平膜から溶液中へ脱離されることが確認された。
【００６６】
１０．比較例２
実施例２において、平膜にヒト血漿成分を吸着させずに、ヒト免疫グロブリンＧとポリエチレンイミンの複合体を０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少していたが、この平膜を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元反応し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、ヒト免疫グロブリンＧの平膜から溶液中への脱離は確認できなかった。
【００６７】
【発明の効果】
本発明により、基材に対する生理活性物質（リガンド）の非特異的吸着を抑制することができ、リガンド脱離後の再吸着を防ぐことができる。また、体外循環用の材料として滅菌に関わる問題を解決したリガンド固定化材料を提供することができる。

Claims (21)

1. 疎水性基材に疎水性部位を持つ生体物質を吸着させ、さらにリガンドが結合されたカチオン性高分子を吸着させたリガンド固定化材料。
2. 疎水性基材に疎水性部位を持つ生体物質を吸着させ、さらに該疎水性部位を持つ生体物質にリガンドが結合されたカチオン性高分子を吸着させたリガンド固定化材料
3. 疎水性基材の形状が平膜状あるいは繊維状または中空糸状であることを特徴とする請求項１または２に記載のリガンド固定化材料。
4. 疎水性基材が多孔質であることを特徴とする請求項３記載のリガンド固定化材料。
5. 疎水性基材がポリスチレン、ポリスルホン、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリルからなる群より選択される１つ以上の高分子化合物からなることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のリガンド固定化材料。
6. 疎水性基材がアニオン性表面を持つことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のリガンド固定化材料。
7. 疎水性基材のアニオン性表面について、アニオン性が硫酸基由来であることを特徴とする請求項６記載のリガンド固定化材料。
8. 疎水性部位を持つ生体物質が蛋白質および／またはペプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のリガンド固定化材料。
9. 蛋白質および／またはペプチドがアルブミンであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のリガンド固定化材料。
10. リガンドとカチオン性高分子がジスルフィド結合を介して結合していることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のリガンド固定化材料。
11. ジスルフィド結合が、ピリジルジスルフィド基を導入したカチオン性高分子とメルカプト基を持つリガンドの反応によるものであることを特徴とする請求項１０記載のリガンド固定化材料。
12. カチオン性高分子がアミノ基を有する高分子であり、これにＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートを反応させてピリジルジスルフィド基を導入することを特徴とする請求項１１記載のリガンド固定化材料。
13. カチオン性高分子がポリエチレンイミンを含むことを特徴とする請求項１２記載のリガンド固定化材料。
14. メルカプト基をもつリガンドが、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートを反応させた後、還元して得られたリガンドであることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれかに記載のリガンド固定化材料。
15. メルカプト基をもつリガンドが、２−イミノチオランを反応させて得られたリガンドであることを特徴とする請求項１４記載のリガンド固定化材料。
16. メルカプト基をもつリガンドが、リガンドを還元して得られたリガンドであることを特徴とする請求項１４に記載のリガンド固定化材料。
17. リガンドが蛋白質および／またはペプチドであることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載のリガンド固定化材料。
18. 蛋白質および／またはペプチドが、抗体、レセプター、サイトカイン、分化因子、増殖因子および接着因子からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１７記載のリガンド固定化材料。
19. 体外循環用途に用いられる請求項１〜１８のいずれかに記載のリガンド固定化材料。
20. 疎水性部位を持つ生体物質の水溶液を無菌ろ過滅菌し、別に滅菌された疎水性基材に無菌的に接触させ、さらに無菌ろ過滅菌されたリガンドが結合されたカチオン性高分子の水溶液を無菌的に接触させることを特徴とするリガンド固定化材料の製造方法。
21. 疎水性基材が放射線で滅菌されることを特徴とする請求項２０記載のリガンド固定化材料の製造方法。