JP4958554B2 - リンパ球増殖抑制因子の吸着材及び処理方法 - Google Patents

Description

本発明は、血液中の免疫担当細胞（特にリンパ球）を体外に取り出して培養し、これを刺激・活性化して増殖したものを、再び体内にもどすことにより、癌、感染症、免疫疾患の進行を抑制する活性化自己リンパ球療法等において、リンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除するための多孔質体、および該多孔質体を利用したリンパ球増殖用デバイスに関する。さらには、リンパ球増殖抑制因子濃度を低減させた体液を調製する方法、ならびに該体液を添加した培地を用いてリンパ球を増殖させる方法に関するものである。

近年、血液中の免疫担当細胞（特にリンパ球）を体外に取り出して培養し、これを刺激・活性化して増殖したものを、再び体内にもどすことにより、癌の進行を抑制する活性化自己リンパ球療法が注目を集めている。本方法は、副作用をほとんど伴わず、治療中においても高いＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）を維持出来ることから、特に癌治療分野において、主要な３大癌治療方法である外科的療法、放射線療法、化学療法に次ぐ第４の癌治療の選択肢として広く浸透しつつある。既に、テーラーメード型の高度先進医療の一つとして、大学病院、癌センター、専門のクリニックにて積極的に治療が行われており、さらなる拡大が期待されている。本方法は、通常、患者血液を採取した後に、リンパ球画分を密度勾配遠心法にて分取し、専用の培養液に自己血漿を添加して培養を行う。通常は一週間で初期培養リンパ球数の約１００倍前後増殖するが、なかには自己血漿ではリンパ球はほとんど増殖せず、他人の血漿（供血）で増殖可能な癌患者が存在することがわかってきている。癌細胞はトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータ（以下ＴＧＦ−βと略す）、インターロイキン４（以下ＩＬ４と略す），インターロイキン６（以下ＩＬ６と略す），インターロイキン１０（以下ＩＬ１０と略す）等のサイトカインや、プロスタグランジンＥ２（以下ＰＧＥ２と略す）等、細胞性免疫を抑制する因子を産生している。そこで該因子がリンパ球の増殖を抑制している可能性が考えられるが、これら因子は癌病巣局所での濃度は高いものの、癌患者の血液中の濃度は健常人と変わらない程度である。また、試薬として市販されている該因子を高濃度で血漿中に溶解させ、リンパ球の増殖性への影響を検討しても、ほとんど抑制がかからないこと等から、該因子以外による、何らかの未知のメカニズムの存在が示唆される。

実際、これまでに免疫抑制性酸性蛋白質（ＩＡＰ）を吸着除去する吸着体（特許文献１）、体液中のインターロイキン類を吸着除去する吸着体（特許文献２）、体液中のＴＧＦ−βを吸着する吸着体（特許文献３）等が開示されているが、いずれもサイトカイン類の吸着除去に限定されており、リンパ球の増殖性を向上させる吸着材の報告はない。また、近年、活性化リンパ球療法の著しい発展により、該治療を受ける患者数は年々増加の一途をたどってはいるものの、リンパ球増殖不良で供血に頼る患者数も増加している。供血の場合、患者の治療サイクルに合わせて、非自己血漿を確保する必要がある。また、感染の問題等、安全上考慮すべき課題も多く、他の有用な物質を損失することなく、簡便な操作でリンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除する方法の開発が望まれている。さらに、自己体液で増殖可能な癌患者においても、リンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除することにより、さらなる増殖率、サイトカイン産生能等の活性の向上が期待されているが、このような吸着材、多孔質体、デバイスおよび処理方法は存在しない。また、サイトカイン類等の免疫抑制性蛋白質を吸着する材料を、水不溶性担体に結合させた吸着材が開示されている（特許文献４、５、６）。しかし、該吸着材は、アミン残基とサイトカイン類等の免疫抑制性蛋白質のアフィニティに基づく。したがって、該吸着材は、アミン残基の存在を要する。

特開昭５６−０９２８２４号公報 特開平０８−２５７３９８号公報 特開２００１−２１８８４０号公報 特開２００３−３１０７５１号公報 特開２００３−３３９８５４号公報 特開２００４−７３６１８号公報

現在、活性化自己リンパ球療法等、活性化させたリンパ球を再び体内にもどすことにより治療効果が発揮される疾患の処置のためのリンパ球培養において、増殖不良状態にあるリンパ球の増殖を促進する処理が待望されている。そこで、本発明の目的は、当該リンパ球の増殖を促進する処理に有用な吸着材、その処理方法、および、該多孔質体で処理して増殖させたリンパ球を提供することである。

本発明者らは、リンパ球が増殖するために必要な有用物質等を極力損失せず、かかるリンパ球増殖が抑制されるのを解除する多孔質体について鋭意研究を行ったところ、水の接触角が約４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含んでなる水不溶性の多孔質体、または活性炭を含む多孔質体を用いて、あらかじめ対象由来の体液を処理することにより、リンパ球培養におけるリンパ球増殖率が大幅に向上することを見出し、本発明の完成に至った。

すなわち、本発明は、水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含んでなる、リンパ球培養においてリンパ球増殖を促進する体液処理用の多孔質体；活性炭からなる、リンパ球培養においてリンパ球増殖を促進する体液処理用の多孔質体に関する。
また、本発明は、上記多孔質体を容器内に含んでなるリンパ球培養においてリンパ球増殖を促進する処理用デバイスに関する。
さらに、本発明は、リンパ球の増殖方法；哺乳動物のリンパ球の生産方法；医薬組成物の製造方法；リンパ球培養時に培養液に添加する添加用体液；体外で活性化させた哺乳動物のリンパ球を体内にもどすことにより治療効果がある疾患の処置方法；リンパ球培養においてリンパ球増殖を促進する体液処理用の多孔質体を製造するための、活性炭または水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物の使用に関する。

まず、本発明の多孔質体について説明する。
本発明の多孔質体は、水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を含んでなる、リンパ球培養においてリンパ球増殖を促進する体液処理用の多孔質体である。

本発明における水の接触角は、主たる構成成分である高分子化合物よりなる平滑なフィルムを作製し、水平な状態でその上に微量注射器を用いて液滴を形成し、その接触角を室温で測定することにより求めることができる。また、多孔質体が有機溶媒に溶解可能な場合は、多孔質体を溶解後、溶解液を用いて平板上にキャストフィルムを作製して、接触角を測定することもできる。測定方法の詳細は、例えば「新実験化学講座１８ 界面とコロイド」（丸善株式会社、昭和５２年１０月２０日発行、初版）等を参照することができる。すなわち、鏡面仕上げの平滑度をもつ平板試片を、測定する液体の飽和蒸気で満たされるように水平に置き、その上へ微量注射器を用いて液滴を作る。液滴の大きさは、接触径が約３ｍｍ以下になるようにする。接触角は、液滴を、固体表面に対して前進させるとき（液体を試料上に展開し、液体が広がった後に、液滴がある大きさに落ち着いたとき）に形成される角度を、測角器のついた読みとり顕微鏡（倍率２０倍程度）で測定することができる。鏡筒を１−２度水平より下方に傾けておくと、像の鮮明度が極めてよくなる。滴は、前方から乳白ガラスを通した光あるいは熱線吸収ガラスを通した平行光で照明する。
なお、本発明においては、後述の実施例で記載の方法により、接触角を測定した。

水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある代表的な高分子化合物としては、例えば、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン１１、ポリエチレン、ポリ（塩化ビニリデン）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリ（トリフルオロエチレン）、ポリ（クロロトリフルオロエチレン）、ポリ（テレフタル酸エチレン）、ポリプロピレン、ポリアクリル酸エステル（ポリ（アクリル酸メチル）等）、ポリメタクリル酸エステル（ポリ（メタクリル酸メチル）等）、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアミド等の合成高分子化合物、セルロース等の水不溶性のものが挙げられるが、これらに限定されない。このうち、リンパ球増殖率の点から、芳香族系モノマー（例えば、メチルスチレン、エチルスチレン等の置換されても良いアルキルスチレン；ジビニルベンゼン；ジビニルナフタレン、ジビニルアントラセン等の置換されても良いベンゾ縮合環から選ばれるモノマー）を重合させた重合体または共重合体が好ましい。特に、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体が好ましい。

ポリスチレンとしては、任意の公知のポリスチレンを使用できる。ポリスチレンは任意のスチレンの重合体およびスチレンを主成分とする重合体である。
スチレン−ジビニルベンゼン共重合体は、上記スチレン化合物を、所望により置換されてもよいｍ−、ｏ−またはｐ−ジビニルベンゼンで架橋させて得ることができる。

上記高分子化合物は、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アルキルスルホニル等で所望により置換されてもよい。また、上記置換基は、アミン以外でさらに置換されることができ、上記置換基の置換基としては、アミド基、尿素基、エステル基、エーテル基以外が好ましい。

上記高分子化合物は、アミン残基を結合していないものであることが好ましい。アミン残基としては、例えば、アンモニア、第１〜３級アミン等が高分子化合物に化学的に結合した状態のもの等が挙げられる。
また、上記高分子化合物は、他の化合物が固定されていないものであることが好ましい。他の化合物としては、上記高分子化合物以外であれば特に限定されず、例えばアミン類、アルコール類、グリシジルエーテル類、カルボン酸類とその誘導体、酸ハロゲン化物、ハロゲン化物、ハロゲン化シラン類、チオール類、アルデヒド類、抗体等が挙げられる。

本発明の目的のために、つまりリンパ球増殖の促進の点から、上記水の接触角は、好ましくは６０°を超えて９６°以下、より好ましくは約７０°から９４°、さらに好ましくは約７５°から９１°である。
本発明において、多孔質体は水不溶性であることが好ましい。

また、本発明の多孔質体は、上記高分子化合物を約５０重量％以上、好ましくは約６０重量％以上、より好ましくは約７０重量％以上、さらに好ましくは約８０重量％以上含むものである。
多孔質体に含有させることのできる、水の接触角が４０°から９８°である上記高分子化合物以外の成分としては、例えば、ポリビニルアルコール（接触角３６°）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（同１３°）、パラフィン（同１０５−１０６°）等が挙げられる。
なお、水の接触角が４０°から９８°である上記高分子化合物を２種以上併用することや、水の接触角が４０°から９８°である上記高分子化合物を主原料とし、上記高分子化合物以外の成分を副原料として配合すること等により、得られる多孔質体の水の接触角を調節することができる。
また、多孔質体の水の接触角も、上記高分子化合物の水の接触角の範囲内であることが好ましい。つまり、多孔質体の水の接触角は、好ましくは４０°から９８°、より好ましくは６０°を超えて９６°以下、さらに好ましくは約７０°から９４°、特に好ましくは約７５°から９１°である。

本発明の多孔質体は、常温常圧で固体であり、かつ適当な大きさの細孔を有する、すなわち多孔構造を有するものである。
多孔質体中の細孔の大きさに関して、ポリスチレンビーズを用いた水不溶性多孔質体の排除限界分子量は、好ましくは１．５×１０^５以下である。より好ましくは１．４×１０^５以下のものが用いられる。排除限界分子量が１．５×１０^５より大きくなると非特異吸着が大きくなったり、体液中の有用蛋白質の損失が起こったり、リンパ球の増殖性が低くなり易い傾向がある。リンパ球の高い増殖率を維持しつつ、非特異吸着の影響をより少なくするためには、排除限界分子量は１．３×１０^５以下であることがさらに好ましい。特に好ましくは１．２×１０^５以下、最も好ましくは１．０×１０^５以下である。
排除限界分子量の調節は、例えば、多孔質体作製時に、多孔質体を構成する主たる上記高分子化合物の含量を調節することにより、容易に制御可能である。すなわち、上記高分子化合物含量が多くなれば、排除限界分子量は小さくなり、上記高分子化合物含量が少なくなれば、排除限界分子量は大きくなる。
なお、排除限界分子量とは、クロマトグラフィーにおいて細孔内に侵入できない（排除される）分子のうち、最も小さい分子量をもつものの分子量をいう。

排除限界分子量の測定は、以下のようにして行うことができる。粒子径の異なるポリスチレンビーズを、多孔質体が充填されたカラムに流し、流出してきたポリスチレンビーズの流出曲線により、孔のサイズを求める。次に、直径と分子量がわかっている球状蛋白質（デキストラン等）へ、上記孔のサイズを外挿することにより、当該球状蛋白質換算の分子量を求め、排除限界分子量とする。

多孔質体の形状としては、球状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸状等、いずれも有効に用いられるが、吸着性能面から球状または粒状がより好ましく用いられる。
多孔質体が球状または粒状である場合、その平均粒径は、約５μｍ〜１０００μｍが好ましく、より好ましくは約２０〜８００μｍ、さらに好ましくは約３０〜６００μｍである。
平均粒径の測定は、以下のようにして行うことができる。湿潤状態で、多孔質体をシャーレに展開し、ＣＣＤカメラにて数十粒を写真撮影する。次に、取り込んだ画像を、粒径測定ソフト（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．製）を用いて、平均粒径を算出する。

本発明の多孔質体は、例えば以下のようにして製造することができる。１種または２種以上の原料モノマー化合物を、適当な粘性の溶媒（例えば水）中に分散、懸濁させる。懸濁液を攪拌しつつ、公知方法によって懸濁重合させ、目的の多孔質体を得る。

さらに、本発明の多孔質体は、活性炭からなるものであってもよい。
活性炭としては、例えば、フェノール系繊維状活性炭等の繊維状活性炭；ヤシ殻系活性炭、石油ピッチ系活性炭、ピート系活性炭、木炭系活性炭等の粒状活性炭等を使用することが出来る。
また、活性炭の平均粒径は特に限定されないが、約５μｍ〜１０００μｍが好ましく、より好ましくは約２０〜８００μｍ、さらに好ましくは約３０〜６００μｍである。

上記高分子化合物または活性炭からなる多孔質体の成分のうち、リンパ球増殖率の点から、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、活性炭が好ましく、特にスチレン−ジビニルベンゼン共重合体が好ましい。

上述のように、リンパ球培養においてリンパ球増殖を促進する体液処理用の多孔質体を製造するために、活性炭または水の接触角が４０°から９８°の範囲内にある高分子化合物を使用することができる。

次に、本発明の処理用デバイスは、上記多孔質体を容器内に含んでなる、リンパ球培養においてリンパ球増殖を促進する処理用デバイスである。

処理用デバイスに用いる容器の形態、大きさ、材質には特に限定はない。
形態は、球、コンテナ、バッグ、チューブ、カラム等、任意の形態であってよい。好ましい具体例としては、例えば、容量約０．１〜４００ｍｌ程度、直径約０．１〜１０ｃｍ程度の透明または半透明の筒状容器等が挙げられる。

容器は、任意の構造材料を使用して作成することができる。構造材料としては、具体的には、非反応性ポリマー、生物親和性金属、合金、ガラス等が挙げられる。
非反応性ポリマーとしては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。
容器の材料として有用な金属材料は、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、およびそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、窒化チタン被覆ステンレス鋼等が挙げられる。
特に好ましくは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的には、シリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。

処理用デバイスは、液の入口および出口を有し、かつ多孔質体の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、水不溶性多孔質体が充填されてなるものが好ましいが、これに限定されるものではない。
前記流出防止具としては、メッシュ、不織布、綿栓等のフィルターが挙げられる。

次に、本発明のリンパ球の増殖方法について説明する。
本発明のリンパ球の増殖方法は、上記多孔質体を体液と接触させること、および該多孔質体と接触させた体液を用いてリンパ球を培養することを含んでなる方法である。

本発明のリンパ球の増殖方法、つまり、リンパ球増殖を促進する処理方法としては、具体的には以下のような方法等が挙げられる。（１）上記処理用デバイス（体液の流入口および流出口を有し、体液は通過するが多孔質体は通過しないフィルターを流出口に装着した容器）へ多孔質体を充填し、これに体液を接触させた後、リンパ球を培養する方法。（２）予め多孔質体が入ったバッグに体液を採取して、一定時間接触させた後、多孔質体を濾別し、リンパ球を培養する方法。（３）リンパ球培養系に多孔質体を共存させ、培養の途中あるいは終了時に、リンパ球と多孔質体を濾別する方法。

（１）については、接触方法としては、体液を送液ポンプ等により還流状態で一定時間接触させる方法や、還流せずに一定時間接触させる方法等がある。接触時間は、１分間以上接触させることが好ましいが、吸着性能の面から約１５分間から６時間の接触がより好ましい。十分な吸着性能と細胞処理効率の面から、より好ましくは約２０分間から４．５時間、さらに好ましくは約３０分間から３時間、接触させることが好ましい。
（２）については、予め多孔質体が入ったバッグに直接体液を採取して、一定時間接触させる方法や；血液を遠心分離等で血漿または血清に調製後、これをバッグ内に注入して、多孔質体と一定時間接触させる方法等がある。接触時間は、約１分間以上接触させることが好ましく、吸着性能の面から、より好ましくは１０分間から１０時間、さらに好ましくは約１５分間から６時間である。十分な吸着性能と細胞処理効率の面から、特に好ましくは約３０分間から３時間の接触が好ましい。また、その他の方法として、患者血漿を添加した培養液でリンパ球を培養している系に、直接該多孔質体を添加、共存させて、所定時間後に、多孔質体は通過しないフィルターにて多孔質体とリンパ球を濾別することもできる。
上記（１）、（２）記載の多孔質体と体液を接触させる時の温度は、任意の温度を選択し得るが、好ましくは約４℃〜５０℃、より好ましくは約１０℃〜４５℃である。
（３）については、リンパ球培養容器中にリンパ球と共に多孔質体を共存させ、培地交換時あるいは培養終了時に、多孔質体とリンパ球を濾別する。接触時間は、最長でリンパ球の培養が終了するまで、多孔質体の添加量は、リンパ球の増殖が物理的に抑制されない程度のスペースを確保できる程度が好ましい。

本発明はこれらに限定されるものではないが、上記（１）の方法は操作も簡単であり、リンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除する方法として最も好ましい。

なお、前述したように、リンパ球増殖が抑制されるためには未知のメカニズムがあり得る。また、該メカニズムには、未知の「リンパ球増殖抑制性因子」の関与があり得る。したがって、本発明の多孔質体は、リンパ球増殖抑制性因子の吸着材として機能し得る。

上記リンパ球の増殖方法において、上記処理用デバイスを使用する場合には、抗凝固剤を用いることができる。
抗凝固剤としては、ヘパリン、低分子量ヘパリン、メシル酸ナファモスタット、メシル酸ガベキサート、アルガトロバン、アシッド・シトレート・デキストロース液（ＡＣＤ液）やシトレート・フォスフェート・デキストロース液（ＣＰＤ液）等のクエン酸含有抗凝固剤等、いずれを用いてもよい。なかでもヘパリンは、一般的に最も好ましく用いられる抗凝固剤として挙げることができる。
また、血清を調製する場合等は、上記抗凝固剤を含まなくてもよい。

本明細書において、体液としては、血液、血漿、血清を含む。加えて、体液は、その他の体液、例えば腹水、リンパ液、関節内液およびこれらから得られた画分成分、ならびにその他の生体由来の液性成分も含むものである。
本発明の目的のため、簡便には、血液を対象から採取し、所望により遠心分離等の手段によって血球フラクションと分別し、血漿を調製した後に使用する。さらに、血清調製後、使用してもよい。

また、該体液としては、血液、血漿、血清以外に、それらの稀釈液、あるいはフィコール、パーコール、バクティナーチューブ、リンフォプレップ等を使用し、比重密度遠心分離法により前処理を施した上清液等が使用できる。
該体液は、採血後すぐに使用することも可能であるが、冷蔵保存、凍結保存後の血液類についても使用できる。また、吸着材で該体液を処理した後に、冷蔵、凍結保存し、必要に応じて解凍後使用することもできるが、これらに限定されるものではない。

リンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除された体液は、本発明のリンパ球増殖を促進する処理の後に、多孔質体は通過しない出口側フィルターより、多孔質体と濾別することにより得られる。対象が血液の場合は、さらに遠心分離操作を行うことにより、目的の血漿が得られる。また、多孔質体処理後の血液から、フィコール、パーコール、バクティナーチューブ、リンフォプレップ等を使用し、リンパ球と目的の血漿を同時に得ることもできる。

本明細書において、リンパ球は、哺乳類末梢血、リンパ管、骨髄中のＴ細胞、Ｂ細胞等をいう。また、当該リンパ球は、Ｔ細胞でもＢ細胞でもない、例えばナチュラルキラー細胞等も含む。Ｔ細胞は、特に限定されないが、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、キラーＴ細胞を含む。

本発明において、リンパ球培養は、例えば以下のように実施することができる。哺乳動物の体液を用い、上記多孔質体に接触させた後、リンパ球培養液に播種する。該リンパ球培養液を、任意の温度（好ましくは約２０℃から４５℃、より好ましくは約３０℃から４０℃、さらに好ましくは約３７℃）で、任意の時間（例えば約３日間から３０日間、好ましくは約７日間から２１日間、より好ましくは約１０日間から１８日間、最も好ましくは約１４日間）培養する。その結果、リンパ球が増殖する。

リンパ球培養液としては、公知の培養液を使用できる。例えば、リンパ球培養液ＰＢ−ＭＡＸ培地，ＡＩＭ Ｖ培地，ＣＨＡＮＧ培地，ＬＧＭ−３培地，ＫＢＭ４００，ＧＩＴ，ＨａｍＦ−１２，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＭＥＭ，α−ＭＥＭ，ＭＥＭ，ＩＭＥＭ，ＲＰＭＩ−１６４０，ＭｃＣｏｙ‘Ｓ５Ａ培地等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
なお、リンパ球培養の際に、リンパ球を活性化させるために抗体等を使用することもできる。当該抗体としては、例えば抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）等が挙げられる。

また、上記体液が哺乳動物の自己体液であり、かつ該哺乳動物がリンパ球増殖不良を生じている際に、当該リンパ球の増殖方法がより有効である。

本発明でいうリンパ球増殖不良とは、患者体液をリンパ球培養系に添加した時のリンパ球増殖率が、健常人体液を使用して求めたリンパ球増殖率以下である場合を指す。
また、リンパ球増殖率とは、多孔質体で処理した患者体液、あるいは多孔質体未処理の健常人体液を、培養液中に０．１％（Ｖ／Ｖ）〜２０％（Ｖ／Ｖ）添加した培養液を用いて、リンパ球を３７℃で１週間培養した時の増殖率（７日後の細胞数／播種細胞数）をいう。

本多孔質体をカラムに充填して使用する場合、通液する際等に目詰まりを生じないことが重要である。そのためには、多孔質体は、充分な機械的強度が要求される。したがって、本発明に用いる多孔質体は、硬質であることがより好ましい。ここでいう硬質とは、例えば粒状ゲルの場合、ゲルを円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を流した際の圧力損失ΔＰと流量の関係が約０．３ｋｇ／ｃｍ^２までの直線関係にあるものをいう。もっとも、本多孔質体をバッグに入れて使用する場合は、軟質であってもよい。

次に、本発明の哺乳動物のリンパ球の生産方法は、哺乳動物の体液を、上記多孔質体と接触させること、該多孔質体と接触させた体液を用いてリンパ球を培養すること、および生産されたリンパ球を回収することを含んでなる方法である。

リンパ球の回収は、遠心分離、メンブラン濾過、クロマトグラフ等の任意の方法で実施することができる。

次に、本発明の医薬組成物の製造方法は、上記リンパ球の生産方法にしたがってリンパ球を生産すること、および、該リンパ球を製薬的に許容される添加剤と混合することを含んでなる方法である。
製薬的に許容される添加剤としては、例えば、抗凝固剤、ビタミン類等の栄養源、抗生物質等が挙げられる。
医薬組成物の製造は、許容される薬学的手法に従って、好適なガレヌス形態（例えば、輸血用、点滴用、注射用等）の組成物にもたらすことができる。

また、本発明の、リンパ球培養時に培養液に添加する添加用体液は、哺乳動物の体液を、上記多孔質体と接触させることにより得られるものである。
当該添加用体液は、例えば、リンパ球を体外で活性化させた後に体内にもどすことにより治療効果がある疾患に罹患した、または罹患しない哺乳動物の体液と、上記多孔質体を接触させることにより調製することができる。

さらに、本発明の、体外で活性化させた哺乳動物のリンパ球を体内にもどすことにより治療効果がある疾患の処置方法は、処置の必要のあるまたはない哺乳動物の体液を、上記多孔質体と接触させること、該多孔質体と接触させた体液を用いてリンパ球を培養すること、および得られたリンパ球を該哺乳動物に投与することを含んでなる方法である。

体外で活性化させたリンパ球を体内にもどすことにより治療効果がある疾患とは、癌、感染症、免疫疾患等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、活性化とは、リンパ球数の増加、増殖にともなうリンパ球ポピュレーションの変化、リンパ球本来の機能を向上させること等を含む。

本発明により、リンパ球を体外で活性化させた後に体内にもどすことにより治療効果がある疾患に罹患する対象、例えばリンパ球増殖不良癌対象の、体液中からリンパ球の増殖に必要な因子を吸着せずに、リンパ球増殖抑制因子を吸着し、リンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除し、リンパ球の増殖率を大幅に上昇させることが可能となった。本発明は、血液中の免疫担当細胞（特にリンパ球）を体外に取り出して培養し、これを刺激・活性化して増殖したものを再び体内にもどすことにより、疾患を処置するまたは疾患の進行を抑制する、例えば活性化自己リンパ球療法において、対象体液についてリンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除するための多孔質体、ならびにこの多孔質体を利用したリンパ球増殖方法として有用である。

以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

なお、下記実施例等において、水の接触角、排除限界分子量、平均粒径は以下のようにして測定した。
（１）水の接触角
高分子化合物の試料を、高圧で圧縮して平滑なフィルムを作製した。得られた平滑な平板試片を、水平に置き、その上へ微量注射器を用いて水滴を作った。水滴の大きさは、接触径が約１〜２ｍｍになるようにした。水滴を、固体表面に対して前進させるときに形成される角度を、測角器のついた読みとり顕微鏡（倍率２０倍程度）を用いて、室温（２０℃）で測定した。
（２）排除限界分子量
粒子径の異なるポリスチレンビーズを、多孔質体が充填されたカラムに流し、流出してきたポリスチレンビーズの流出曲線により、孔のサイズを求めた。次に、直径と分子量がわかっている球状蛋白質のデキストランへ、上記孔のサイズを外挿することにより、デキストラン換算の分子量を求め、排除限界分子量とした。
（３）平均粒径
湿潤状態で、多孔質体をシャーレに展開し、ＣＣＤカメラにて数十粒を写真撮影した。次に、取り込んだ画像を、粒径測定ソフト（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．製）を用いて、平均粒径を算出した。

（実施例１）
（１）リンパ球の調製
翼付静注針に上記アダプターを接続し、アダプターのもう一端にホルダーを接続した。注射針を健常人上腕部に穿刺した後、リンパ球分離用チューブ（バクティナーチューブ（ベクトンディッキンソン製））に血液を約７．５ｍｌ採取した。採血後、バクティナーチューブを速やかに３０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，室温にて遠心分離した。リンパ球層を回収し、生理食塩液を４０ｍｌ加え、１５００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，４℃で遠心分離した。本操作を数回繰り返すことにより、リンパ球の洗浄を行い、ＫＢＭ４００培地（コージンバイオ製）に再懸濁し、所定濃度のリンパ球懸濁液を調製した。
（２）ＯＫＴ３固相化プレートの調製
ＯＫＴ３（大日本製薬製）を生理食塩液にて５μｇ／ｍｌの濃度に調製し、２４穴ポリスチレンマイクロプレート（住友ベークライト製）に５００μｌずつ注入した。室温で約２時間静置した後に、ＯＫＴ３溶液を除去し、等量の生理食塩液で２回洗浄を行うことにより、ＯＫＴ３固相化プレートを調製した。

（３）多孔質体の調製
工業用ジビニルベンゼン（ジビニルベンゼンの含有量５７％）１００重量部、トルエン１００重量部、イソアミルアルコール６０重量部、過酸化ベンゾイル（含有量７５％）１重量部からなるモノマー混合物を、水５７２重量部、塩化ナトリウム２３重量部、ポリビニルアルコール１重量部、亜硝酸ナトリウム０．０３重量部からなる水溶液に添加し、モノマー混合液の液滴が分散懸濁するよう撹拌を行いつつ、窒素雰囲気下、８０℃で５時間、重合を行った。生成した重合体粒子を濾過、水洗の後、溶媒、モノマー、開始剤等の残存物をアセトンで抽出除去し、再度水および熱水でよく洗浄して、体積平均粒子径が約４００μｍの多孔質スチレン−ジビニルベンゼン共重合体ビーズを得た（排除限界分子量が約８×１０^４、水の接触角約８５°）。
（４）血漿処理
該多孔質スチレン−ジビニルベンゼン共重合体ビーズを生理食塩液にて十分洗浄を行った後に、クライオチューブ内に０．１７ｍｌ計量した。該多孔質ビーズ中から生理食塩液を十分に除去し、癌患者血漿を１ｍｌ添加し、３７℃で２時間、ＭＩＸローター上で撹拌（４０ｒｐｍ）しながらインキュベートした。

（５）リンパ球の培養
上記方法にて処理を行った血漿を、リンパ球培養液ＫＢＭ４００（コージンバイオ製）に９％（Ｖ／Ｖ）になるように添加した。該培養液を用い、リンパ球数が１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調製し、先に調製したＯＫＴ３固相化プレートに４４４μｌ／ｗｅｌｌづつ播種した（ｎ＝３穴）。
培養７日目にリンパ球を回収し、血球計算盤にて細胞数をカウントし、リンパ球増殖倍数を下式１）にて求めた。
増殖倍数＝培養７日後のリンパ球数／播種時リンパ球数 １）
その結果、癌患者血漿を吸着材で処理した場合のリンパ球数は、播種時細胞数の１６．７倍（増殖倍数）まで上昇した。

（実施例２）
吸着材を多孔質スチレン−ジビニルベンゼン共重合体ビーズから粒径約５００μｍの石油ピッチ系活性炭に変えた他は、実施例１と同様の方法で、リンパ球増殖倍数を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の１０．６倍（増殖倍数）まで上昇した。

（実施例３）
排除限界分子量が１×１０^４以下、粒径約４００μｍのポリスチレン（水の接触角約８５°）多孔質ビーズを用いた以外は、実施例１と同様の方法で、リンパ球増殖倍数を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の１１．５倍（増殖倍数）まで上昇した。

（実施例４）
多孔質体の調製：粘度約１０００ｃＰのセルロース溶液に、振動数約２００００Ｈｚの振動を直接加えながら、均一液滴として気相中に噴出させた。液滴が球形になる飛行距離以上飛行させた後に、凝固浴に捕捉し、脱溶剤し、洗浄することにより、粒径約４００μｍのセルロース多孔質粒子を得た（排除限界分子量３×１０^４以下、水の接触角約５０°）。
該多孔質粒子を用いた以外は実施例１と同様の方法で、リンパ球増殖倍数を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の６．９倍（増殖倍数）まで上昇した。

（実施例５）
排除限界分子量が６×１０^４以下、粒径約４００μｍのセルロース（水の接触角約４０°）多孔質ビーズを用いた以外は、実施例１と同様の方法で、リンパ球増殖倍数を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の５．７倍（増殖倍数）まで上昇した。

（比較例１）
吸着材と接触させていない患者血漿を使用した以外は、実施例１と同様の方法で、リンパ球増殖倍数を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の３．９倍（増殖倍数）であった。

（比較例２）
実施例４で使用した多孔質粒子に、デキストラン硫酸をエピクロルヒドリンにて結合した（排除限界分子量３×１０^４以下、水の接触角約３５°）以外は、実施例１と同様の方法で、リンパ球増殖倍数を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の３．６倍（増殖倍数）であった。

（比較例３）
実施例５で使用した多孔質粒子に、デキストラン硫酸をエピクロルヒドリンにて結合した（排除限界分子量３×１０^４以下、水の接触角約３０°）以外は、実施例１と同様の方法で、リンパ球増殖倍数を求めた。その結果、リンパ球数は、播種時細胞数の３．２倍（増殖倍数）であった。

なお、実施例１〜５、比較例１〜３のリンパ球増殖倍数を評価した結果を表１に示した。この結果より、本発明の特定の多孔質体に体液を接触させたものを用いてリンパ球を培養した場合は、当該多孔質体（吸着材）を用いない場合や、デキストラン硫酸を固定化して高分子化合物が親水化された場合に比べて、リンパ球の増殖率を大幅に上昇できたことがわかる。

本発明により、リンパ球を体外で活性化させた後に体内にもどすことにより治療効果がある疾患に罹患する対象、例えばリンパ球増殖不良癌対象の、体液中からリンパ球の増殖に必要な因子を吸着せずに、リンパ球増殖抑制因子を吸着し、リンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除し、リンパ球の増殖率を大幅に上昇させることが可能となった。本発明は、血液中の免疫担当細胞（特にリンパ球）を体外に取り出して培養し、これを刺激・活性化して増殖したものを再び体内にもどすことにより、疾患を処置するまたは疾患の進行を抑制する、例えば活性化自己リンパ球療法において、対象体液についてリンパ球培養におけるリンパ球増殖が抑制されるのを解除するための多孔質体、ならびにこの多孔質体を利用したリンパ球増殖方法として有用である。

Claims (13)

1. 水の接触角が４０°から９８°の範囲内にあり、
   排除限界分子量が１．５×１０ ^５ 以下である、
   ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体または活性炭からなる高分子化合物を含んでなる、リンパ球の体外培養においてリンパ球増殖を促進する体液処理用の多孔質体。
2. 高分子化合物の水との接触角が７５°から９１°の範囲内にあり、
   排除限界分子量が１．０×１０ ^５ 以下である、
   請求項１に記載の多孔質体。
3. 高分子化合物の平均粒径が５μｍ〜１０００μｍである、
   請求項１または２に記載の多孔質体。
4. 高分子化合物がアミン残基を結合していないものである、請求項１から３のいずれかに記載の多孔質体。
5. 高分子化合物に他の化合物が固定されていないものである、請求項１から３のいずれかに記載の多孔質体。
6. 請求項１から５のいずれかに記載の多孔質体を容器内に含んでなる、リンパ球培養においてリンパ球増殖を促進する処理用デバイス。
7. 該容器が液の入口および出口を有してなるものである、請求項６に記載のデバイス。
8. 請求項１から５のいずれかに記載の多孔質体を体液と接触させること、および該多孔質体と接触させた体液を用いてリンパ球を培養することを含んでなる、リンパ球の増殖方法。
9. 該体液が哺乳動物の自己体液であり、かつ、該哺乳動物がリンパ球増殖不良を生じているものである、請求項８記載のリンパ球の増殖方法。
10. 哺乳動物の体液を請求項１から５のいずれかに記載の多孔質体と接触させること、該多孔質体と接触させた体液を用いてリンパ球を培養すること、および生産されたリンパ球を回収することを含んでなる、哺乳動物のリンパ球の生産方法。
11. 請求項１０に記載の生産方法にしたがってリンパ球を生産すること、および、該リンパ球を製薬的に許容される添加剤と混合することを含んでなる、医薬組成物の製造方法。
12. 哺乳動物の体液を、請求項１から５のいずれかに記載の多孔質体と接触させることにより得られてなる、リンパ球培養時に培養液に添加する添加用体液。
13. リンパ球の体外培養においてリンパ球増殖を促進する体液処理用の多孔質体を製造するための、活性炭、または水の接触角が４０°から９８°の範囲内にあり、排除限界分子量が１．５×１０ ^５ 以下である、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体または活性炭からなる高分子化合物の使用。