JP4833443B2 - 造血幹細胞の採取方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、末梢循環血液中の造血幹細胞および／または造血前駆細胞（以下、末梢循環血液中の造血幹細胞および／または造血前駆細胞を、造血幹細胞、と略す）を増加させる方法、それに用いる器具および増加させた造血幹細胞を採取する方法に関する。得られた細胞は、造血幹細胞を用いて行う各種疾患の治療及び免疫学や細胞生物学などの基礎科学分野で用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】
造血幹細胞移植は、白血病や再生不良性貧血の根治療法として確立している。造血幹細胞移植の代表的なものは、骨髄にそのソースをもとめる骨髄移植であるが、近年、いわゆる末梢血幹細胞移植も注目を集めている。これは、通常は、ほとんど造血幹細胞が存在していない末梢循環血液中にも、ある種の薬剤を投与することによりその存在比率が増加するという現象に着目して、ドナー（自家移植の場合は移植患者自身）にある種の薬剤を投与し、末梢循環血液中の造血幹細胞を増加させてから遠心型血球採取装置により造血幹細胞を含む細胞集団を採取し、移植に用いるものである。
【０００３】
この方法は、骨髄移植の際に必要とされるドナーの全身麻酔を必要としないため、安全性が高いことが利点とされている。しかしながら、ここで用いられる薬剤は抗癌剤や顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）であるために、新たな問題点が存在する。すなわち、抗癌剤は臓器障害など、各種の重篤な副作用があるだけでなく、それ自身発癌性を有することが危惧されており、一方、Ｇ−ＣＳＦも骨痛などの副作用があるだけでなく、白血病細胞の増殖を刺激することが知られており、また長期の安全性については未確認である。さらに、これらの薬剤はいずれも高価なことも問題であり、昨今の医療費削減に逆行するものである。すなわち、従来の、薬剤を用いて末梢循環血液中の造血幹細胞を増加させる方法は安全上およびコストの面で問題を有しており、より安全で安価な造血幹細胞の増加方法が待望されている。
【０００４】
特公平８−２５８８７号公報には、ドナーの血液が生物学的に活性化され、その生体が一定の機能的な状態になるように、ドナーに１０分から２４時間にわたり作用を施した後、一定量の生物学的に活性な血液をこのドナーから採取し、これをインキュベーションし、血清を分離して保存する方法が開示されている。たとえば、睡眠作用血清を作るために、ドナーを２０〜２４時間眠らせずにおいてから血清を採取し、この血清を不眠症治療に用いることが記載されている。しかしながら、同技術は血清中の生理活性物質の増加を目的としたもので、循環末梢血液中の特定細胞の増加に関する記述はない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、安全性が高く、かつ、安価な循環末梢血液中の造血幹細胞を増加させる方法、それに用いられる器具および造血幹細胞を含む細胞集団を採取する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、かかる課題を解決すべく鋭意検討を進めた結果、造血幹細胞分野とは全く異分野で用いられている人工腎臓用血液透析器の利用に本発明の糸口を見出した。すなわち、血液透析治療においては、透析開始後に一過性の白血球減少が見られ、その後回復することはしばしば発生する事象であることが知られているが、本発明者はその回復期に、単に成熟した白血球が回復してくるだけなく、造血幹細胞が骨髄から動員され増加しており、それが成熟白血球の増加につながっており、したがって、血液透析を施行中の患者の循環末梢血中には造血幹細胞がきわめて高頻度に存在しているに違いないという大胆な仮説を立てた。そして、従来、血液透析分野では全く無縁であったＣＤ３４抗原陽性細胞の存在を、これも血液透析分野の研究では稀にしか活用されていないフローサイトメトリー法で解析することにより、そして透析分野では全く実施されていない造血コロニーアッセイを実施することにより上記の仮説を実証し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、末梢循環血液を、末梢循環血液中の白血球濃度を減少させる材料に接触させる工程を含むことを特徴とする末梢循環血液中の造血幹細胞を増加させる方法、末梢循環血液中の白血球濃度を減少させる材料が、液体導入口と液体導出口を具備する容器に充填されていることを特徴とする末梢血中の造血幹細胞増加器具および末梢循環血液を末梢循環血液中の白血球濃度を減少させる材料に接触させて末梢循環血液中の造血幹細胞の頻度を上昇させ、次いで、造血幹細胞を含む細胞集団を採取することを特徴とする造血幹細胞の採取方法である。
【０００８】
【発明実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明でいう末梢循環血液とは、ヒトを含む動物の末梢血管を流れている血液のことである。
本発明でいう末梢循環血液中の白血球濃度を減少させる材料とは、白血球と接触した際に白血球が吸着する材料のことで、直接的に白血球濃度を減少させる材料や、白血球が材料と接触し、白血球の機能および／または構造が変化して生体内の何らかの組織に捕捉されるにより、いわば間接的に白血球濃度を減少させる材料があるが、そのどちらでもよい。具体的には、通常用いられている医用材料であればいかなる材料も使用できるが、成形性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタンなどの合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩などの天然高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニアなどの無機材料、ステンレス、チタン、アルミニムなどの金属などが挙げられる。
【０００９】
一般的に、合成高分子は直接的に白血球濃度を減少させる材料、セルロースや酢酸セルロースは間接的に白血球濃度を減少させる材料といわれている。後者は血液中の補体がこれらの材料に存在する水酸基（ＯＨ基）と接触することにより活性化され、それが白血球の活性化など表面構造変化につながるといわれている。これら材料の形状としては、中空糸、繊維塊、不織布、織布、スポンジ状多孔体（膜を含む）、ビーズなどが挙げられる。
【００１０】
本発明における造血幹細胞増加器具は、前記白血球濃度を減少させる材料を液体導入口と液体導出口を具備する容器に充填したものである。液体導入口と液体導出口を有する容器の材質としては、成形性や滅菌性に優れ、細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニルなどの合成高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニアなどの無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウムなどの金属が挙げられるが、これらに限定されるものではない。容器の構造としては、形状は直方体、立方体、円柱形、楕円柱形などが挙げられるが、いずれの形状でもよい。また滅菌済みの医療用具として市販されている血液透析器や白血球吸着器を用いることができるが、これらに限定されるものではなく、前述の材料を用いて適宜製造してもよい。
【００１１】
これらの方法により末梢循環血液中の造血幹細胞の頻度を上昇させた後、そのまま採血（全血）することによって造血幹細胞の頻度の高い血液を得ることができるが、ここには末梢血幹細胞移植においては不要の赤血球が多量に混入している。もちろん、この血液を比重遠心法や赤血球沈降法といったｉｎ ｖｉｔｒｏ法により赤血球除去してもよいが、遠心型血球分離装置を用いる方法や白血球吸着器を用いる方法を用いると新たに赤血球を除去する工程を付加する必要が無いのでより好ましい。
【００１２】
遠心型血球分離装置を用いる方法は、末梢循環血液中の造血幹細胞の頻度を上昇させた後に、末梢循環血液を遠心型血球分離装置に通液して造血幹細胞含有白血球画分を採取する。
白血球吸着器を用いる方法は、末梢循環血液を白血球吸着器に通液して造血幹細胞含有白血球画分を吸着させた後、吸着器を体外循環装置から取り外し、血液入口側または血液出口側から液体を導入して捕捉されている吸着した造血幹細胞含有白血球画分を回収する。導入する液体としては、細胞に悪影響を及ぼさない液体であればいかなる液体も使用可能であるが、いくつかを例示すると、生理食塩水、ダルベッコリン酸塩緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）やハンクス液（ＨＢＳＳ）などの緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０などの培地が挙げられる。これらの液体に、細胞保護、栄養補給、抗凝固性付与、凍結保存時の凍害防止、粘度向上（回収率向上に有効な場合がある）などの目的で、必要に応じてアルブミン、グロブリン、グルコース、サッカロース、トレハロース、クエン酸化合物、ＥＤＴＡ、ジメチルスルホキシド、デキストラン、ポリビニルピロリドン、グリセリン、キチン誘導体、ヒドロキシエチルデンプン、ゼラチンなどを添加してもよい。この液体には、液体単体のみならず、空気、アルゴン、窒素など細胞に悪影響を及ぼさない気体を混合したものも含まれる。
【００１３】
本発明で得られた造血幹細胞は、そのまま、あるいは必要に応じてさらなる分離精製、培養、活性化、分化誘導、増幅、遺伝子導入、凍結保存などの各種処理が施された後、各種疾患の治療及び免疫学や細胞生物学などの基礎科学分野の研究に用いられる。
以下に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００１４】
【実施例１】
市販のセルロース製透析器（膜厚約１５μｍ、内径約１８０μｍのセルロース中空糸を膜面積１．５ｍ²になるように、ポリカーボネート製円筒容器に充填したもの。この円筒容器は長手方向の両端のキャップに血液導入口と血液導出口を有し中空糸内部に血液が導入、導出されるようになっている。また容器側面には中空糸外側に透析液を通液する透析液導入口と透析液導出口を具備している）による透析（抗凝固剤としてヘパリンを使用、血液流量２００ｍｌ／分、透析液流量５００ｍｌ／分）を行っている慢性腎不全患者から、透析開始直後と開始１時間後に透析回路のサンプリングポートを通じて１０ｍｌの血液を採血した。この血液をフローサイトメトリー法によるＣＤ３４陽性細胞解析とメチルセルロース培地を用いたコロニーアッセイ法に供した。
【００１５】
フローサイトメトリー法によるＣＤ３４陽性細胞測定はＦＩＴＣ標識ＣＤ３４抗体を用い、ＳＳＣ−ＦＩＴＣに展開する方法（宮崎、他：日常診療と血液、５巻２号、２１〜２３ページ、１９９５年）により測定した。コロニーアッセイ法はあらかじめサイトカイン類が添加されているメチルセルロース培地であるＭｅｔｈｏＣｕｌｔ ＧＦ４４３４Ｖ（商標）（ベリタス社製）を用い、同社の操作マニュアルにしたがって培養を実施（５×１０⁴有核細胞を播種）し、２週間後に顕微鏡下でＣＦＵ−ＧＭ（顆粒球・マクロファージ系前駆細胞）、ＢＦＵ−Ｅ（赤血球系前駆細胞）およびＣＦＵ−Ｍｉｘ（前記２種よりも未分化な前駆細胞）を計数した。その結果を表１に示す。
【００１６】
この結果から、本発明の方法により得られた細胞集団には、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４陽性細胞が通常状態の末梢血よりも高率に存在し、またその細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ造血活性を有していることが明らかになった。
【００１７】
【実施例２】
末梢循環血液よりも造血幹細胞の頻度が上昇した血液を白血球吸着器で採取する例のモデル実験を行った。
１．モデル血液
通常の末梢循環血液よりはるかに多量の造血幹細胞を含有するといわれている臍帯血を造血幹細胞の頻度が上昇した血液のモデルとして用いた。
２．白血球吸着器
容器外寸（縦×横×厚み）４１×４１×１８ｍｍで液体流出口と液体流入口を対角線上に持つポリカーボネート製容器に、平均繊維径２．３μｍのポリエステル不織布１８枚と平均繊維径１２μｍのポリエステル不織布１６枚を充填し白血球吸着器を製作した。
３．細胞分離回収操作
２．の白血球吸着器の入口側と出口側に、先端にルアーロックアダプター（メス）を具備した塩化ビニル製チューブを接続した。入口側のルアーロックアダプター（メス）に臍帯血の入った１００ｍｌのディスポーザブルシリンジを接続し、シリンジのプランジャーを押すことで血液を白血球吸着器に通液した。なお、出口側には１００ｍｌのプラスチックビーカーを置き、出口側から導出される血液を受けとめた。全ての血液を通液し終わった後、出口側のルアーロックアダプター（メス）に生理食塩水５０ｍｌが入った５０ｍｌのディスポーザブルシリンジを接続し、プランジャーを強く押すことで、白血球吸着器の中に生理食塩水を導入し、吸着されている細胞を入口側に接続されているディスポーザブルシリンジに回収した。
４．分析及び結果
実施例１と同様のフローサイトメトリー法で分析を行った。その結果を表２に示す。
【００１８】
この結果から、モデル血液として用いた臍帯血は通常の末梢循環血よりもはるかに高頻度で造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）を含むため、本実施例のモデルとして適切であること、また本モデル血液を通液した白血球吸着器から造血幹細胞を高率に回収できることが明らかになった。
【００１９】
【表１】

【００２０】
【表２】

【００２１】
【発明の効果】
本発明によれば、すでに医療用具として使用されている市販の血液透析器や白血球吸着器を用いることにより、末梢循環血液中の造血幹細胞の比率を増加させることができるので、安全性が高く、簡便、かつ、安価に循環末梢血液中の造血幹細胞を増加させ、造血幹細胞を採取することができる。したがって、本発明は、末梢血幹細胞移植の発展に寄与するところがきわめて大きい。

Claims (3)

1. 末梢循環血液中の白血球濃度を減少させる材料が、液体導入口と液体導出口を具備する容器に充填されていることを特徴とする末梢血中の造血幹細胞増加器具。
2. 末梢循環血液中の白血球濃度を減少させる材料が、中空糸、繊維塊、不織布、織布、多孔体およびビーズから選ばれた少なくとも一種である請求項１記載の末梢血中の造血幹細胞増加器具。
3. 末梢循環血液中の白血球濃度を減少させる材料が補体活性化能を有するものである請求項１記載の末梢血中の造血幹細胞増加器具。