JP2004249094A - 血液の免疫賦活用カラム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 免疫抑制性蛋白質吸着材を充填してなる担癌哺乳動物血液の免疫賦活用カラム。また、当該カラムは、血液のカラム処理によるリンパ球のフィトヘマアグルチニン幼若化反応の増加比率が10%以上であることが好ましく、カラムに充填する免疫抑制性蛋白質吸着材がトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータを吸着することが好ましい。
【選択図】 なし
Description
藤原大美著「腫瘍免疫学」中外医学社 1998年
すなわち、本発明は、免疫抑制性蛋白質吸着材を充填してなる担癌哺乳動物血液の免疫賦活用カラムに関する。
免疫賦活用カラム処理前後の血清について幼若化率を調べ、カラム処理により幼若化率が増加すれば、血液免疫能が向上したことになる。この増加比率が高いほどカラムの免疫賦活能力は優れている。
なお、本実施例における評価方法、担癌動物の調製、血中成分の分析は、以下の方法に従った。
1.PHA幼若化反応1
健康な哺乳動物の末梢血、リンパ節または脾臓からリンパ球を分離し、5%ウシ胎児血清添加RPMI1640培地に浮遊させ、5×105個/mL濃度とする。この細胞液を96穴マイクロプレートに0.2mLずつ分注する。そして、被検血清を追加分濃度5%になるように添加し、さらに、最終濃度1%になるようPHAを添加する。PHAを添加しないものをコントロールとする。37℃で3日間培養し、培養終了前24時間に1マイクロキューリー/穴(ウエル)のトリチウム標識サイミジンを加える。遠心分離して、上清を捨て、シンチレーションカウンターで細胞に取り込まれた放射能を測定する。PHA添加検体の放射能をH1、PHA非添加検体の放射能をH2とするとH1 / H2を幼若化率とする。
2.PHA幼若化反応2
正常ラットの脾臓から脾細胞を分離採取し、赤血球を溶血させた後、ウシ胎児血清10%、ペニシリン50単位/mL、ストレプトマイシン50μg/mL添加RPMI1640培地に浮遊させ、37℃で15h培養する。次に、細胞濃度が2×106個/mLになるようペニシリン50単位/mL、ストレプトマイシン50μg/mL添加RPMI1640培地に再浮遊させる。この細胞液を96穴マイクロプレートの各ウエルに0.18mLずつ分注し、検査する血清を0.02mLずつ添加し、0.2mg/mLPHA含有PBS溶液またはPBSを10μl添加する。37℃で3日間培養した後、セルカウンティングキット−8{同仁化学:石山ほか、Talanta、 44、 1299 (1997)}を20μlずつ加え、37℃で4h培養する。マイクロプレートリーダーで450mμの吸光度を測定する。PHA存在下の吸光度をA1、PHA不存下の吸光度をA2、細胞を含まない培地の吸光度をA0とした時の (A1−A0)/(A2−A0)を幼若化率とする。
3.増加比率
リンパ球のPHA幼若化反応の増加比率は、幼若化反応1、幼若化反応2ともに、被検血清(カラム処理後の血清)における幼若化率をコントロール血清(カラム処理前の血清)における幼若化率で除した数値を100倍し、100を差し引くことによって求めた。
4.担癌ラットの調製
9〜12週令のWKAH:Hkmラット(雄)の背部皮下に4−ジメチルアミノアゾベンゼン誘発肝癌細胞KDH−8{矢野 諭、北海道医誌、68巻5号、654−664(1993)}を2×106個接種した。担癌ラット血清調製のためには3週間後に頸動脈より全採血した。
5.血液中の成分の分析
TGFβ1濃度はゼンザイム・テクネ社のヒトTGF−β1免疫分析キットを使用して求めた。また、免疫抑制酸性蛋白の濃度およびPGE−2濃度は、臨床検査会社である株式会社エス・アール・エルに依頼し、免疫分析キットを使用して求めた。
進行性膵癌患者血清5mLに250mgの上記吸着材を入れ、37℃で2hr処理したところ、血清中のTGFβ1濃度が50.4ng/mLから10ng/mLまで低下し、IAP濃度が273μg/mLから218μg/mLまで低下し、PGE−2濃度が490pg/mLから180pg/mLまで低下した。また、担癌ラット血清2mLに100mgの吸着材を入れ、37℃で4h処理したところ、血清中のTGFβ1濃度が48.2ng/mLから23.2ng/mLまで低下した。
また、この吸着材200mgを5mLのカラムに充填し、この担癌ラット血清4mLを30分かけて通過させた。カラム通過前の血清のPHA幼若化率は0.911で、カラム通過後の血清のPHA幼若化率は1.62であった(PHA幼若化反応2を用いて測定した)。カラム処理によるPHA幼若化反応の増加比率は78%であった。また、同時に評価した正常ラット血清の幼若化率は1.47であった。このことから、PHA刺激で幼若化が起きなかった担癌血清が、カラム処理により正常ラット血清以上の幼若化を起こすようになることが分かる。
Claims (4)
- 免疫抑制性蛋白質吸着材を充填してなる担癌哺乳動物血液の免疫賦活用カラム。
- 血液のカラム処理によるリンパ球のフィトヘマアグルチニン幼若化反応の増加比率が10%以上であることを特徴とする、請求項1記載の免疫賦活用カラム。
- 前記免疫抑制性蛋白質吸着材が、トランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータを吸着する材料であることを特徴とする、請求項1または2記載の免疫賦活用カラム。
- 前記免疫抑制性蛋白質吸着材が、アミノプロピル化多孔質ガラスビーズ、ジエチルアミノエチル化セルロースビーズ、ジエチルアミノエチル化アガロースビーズ、あるいはそれらの混合物である、請求項1〜3いずれか1項記載の免疫賦活用カラム。
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2004
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