CN107754764B - 一种高载量的蛋白a免疫吸附材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及血液净化材料技术领域，具体公开了一种高载量的蛋白A免疫吸附材料及其制备方法。蛋白A免疫吸附材料为亲水性凝胶微球与蛋白A偶联的高分子材料，该材料以亲水性凝胶微球为载体基质，通过环氧氯丙烷活化，或者高碘酸钠氧化后，与乙二胺反应得到氨基载体；得到的氨基载体与双缩水甘油醚反应后得到活性载体，最后与蛋白A进行偶联反应得到。该材料偶联的蛋白A含量高，对免疫球蛋白及其复合物的吸附效率高，可应用于临床上免疫吸附治疗。

Description

一种高载量的蛋白A免疫吸附材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及血液净化材料，尤其涉及一种高载量的蛋白A免疫吸附材料及其制备方法。
背景技术
各种自身免疫性疾病和器官移植排斥反应都是由于人体内产生自身抗体，对抗自身组织器官或移植器官，引起组织器官的损害而导致的一系列疾病，是目前国内外医学界面临的治疗难题之一。自身免疫性疾病是由于人体免疫系统发生紊乱而导致，具有相当高的致残率或病死率，常见的有系统性红斑狼疮(SLE)、血友病、类风湿关节炎(RA)、系统性硬化(SSc)、重症肌无力(MG)、干燥综合征(SS)等。移植排斥反应是器官移植失败的主要原因，这涉及到病人机体对移植的异源器官所产生的免疫不耐受，进而促使供体特异性抗体的产生。针对这类急危重症，传统的药物和手术治疗无能为力，而免疫吸附疗法通过选择性清除患者血液中致病性抗体，具有其独特的疗效，已成为近年来国内外的推荐疗法。
免疫吸附疗法利用亲和层析的原理，直接从患者血液中选择性或特异性地清除致病因子，从而达到净化血液，治疗疾病的目的。蛋白A是一种从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)提取出来的单链蛋白质，它对IgG抗体的Cγ2-Cγ3区域具有高度的选择性和亲和性。蛋白A的N端含有5个组成高度类似的IgG结合区：E、D、A、B、C，这五个结合区分别都能与IgG抗体的Fc段结合，且吸附能力相近。将蛋白A偶联到凝胶载体上，当患者的血液经过该吸附材料时，一些因抗体质与量的改变而导致的疾病就可得到缓解或治愈。临床应用结果表明，蛋白A免疫吸附治疗对自身免疫性疾病、器官移植排斥反应等具有很好的治疗效果。
2000年，美国食品药品管理局(FDA)批准德国Fresenius公司蛋白A免疫吸附柱Immunosorba用于治疗带有抑制因子的血友病和其它自身免疫性疾病。该吸附材料每毫升可吸附20mg抗体，每支吸附柱一次可吸附1.2g抗体(每支吸附柱填充62.5ml吸附剂)。一般而言，患者体内抗体总量为30～40g，为达到充分清除抗体的目的，治疗时两支吸附柱安装在配套设备：连续免疫吸附治疗监视与控制系统(CITEM 10)上使用，由预制电脑程序控制两个吸附柱交替“吸附－再生－吸附”，循环进行，每支吸附柱与患者血浆反复接触、吸附10次，每次治疗后(两支吸附柱各经过10次循环吸附)可清除抗体20克左右，实现对致病物质清除的连续性和相对非受限性。
目前，关于蛋白A免疫吸附材料合成方法的专利很多(CN1367181A，CN1365853A，CN101190409A，CN101185878A)，这些方法合成得到的吸附材料对抗体的吸附能力都在20mg/mL左右。由于吸附柱对抗体的吸附能力不高，吸附柱必须配套CITEM 10系统，这阻碍了蛋白A免疫吸附疗法在临床上的广泛应用。蛋白A免疫吸附材料的合成方法主要通过蛋白质上的氨基与载体上的活性基团反应，活性基团一般为醛基(CN101185878A，CN102000550A)、羰基咪唑(CN101190409A、CN1367181A)、环氧基(CN1365853A、CN101069751A)等，特别是环氧基与蛋白A反应后键接牢固，蛋白A不易脱落，适用于临床用蛋白A免疫吸附材料的制备。但由于环氧基与蛋白质反应的活性不高，偶联率较低，制备得到的蛋白A免疫吸附材料对抗体的吸附性能也较低。因此，本发明试图寻找一种新的反应活性很高的环氧基活化载体，实验发现通过在载体和环氧基之间键接12个碳以上的分子间隔臂后，能够制备高载量的蛋白A免疫吸附材料，同时该吸附材料对抗体的吸附量最高可达到60mg/g，这种高吸附性能对蛋白A免疫吸附疗法的广泛应用至为关键。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高载量的蛋白A免疫吸附材料。此外本发明还提供该蛋白A免疫吸附材料的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下方案实现：
一种蛋白A免疫吸附材料，它具有如下的化学结构：
Figure BDA0001453963810000021
其中，
Figure BDA0001453963810000022
为亲水性凝胶微球；X为CH2或者
Figure BDA0001453963810000023
基团；n为1或2或3；SPA为蛋白A。
所述蛋白A免疫吸附材料上含有10～15mg/g的蛋白A，对免疫球蛋白及其复合物的吸附性能为每克抽干微球可吸附50～60mg；所述亲水性凝胶微球可以为琼脂糖凝胶微球、纤维素微球或聚乙烯醇微球。
上述蛋白A免疫吸附材料的制备方法包括如下步骤：
S1：在亲水性凝胶微球上形成伯氨基；在亲水性凝胶微球上形成伯氨基有多种方法，如凝胶微球在二甲亚砜中(加入少量硼氢化钠防止氧化)，加入氢氧化钠后与环氧氯丙烷反应，可以在凝胶微球上形成环氧基，该环氧基载体在碱性条件下与乙二胺反应，可得到具有伯氨基的凝胶微球；或者凝胶微球在高碘酸钠溶液中反应，可以在凝胶微球上形成醛基，然后再与乙二胺在碱性条件下反应，硼氢化钠还原，也可得到具有伯氨基的凝胶微球。
S2：将步骤S1所得的产物置于碳酸盐缓冲溶液中，加入双缩水甘油醚，反应结束后获得活性载体；
S3：将步骤S2所得的活性载体置于硼酸缓冲溶液中，加入蛋白A反应；
S4：用封端试剂与步骤S3所得产物的残余的环氧基反应封端，得到蛋白A免疫吸附材料。
上述方法更具体的为：
步骤S1中：将亲水性凝胶微球置于二甲亚砜中混合后，加入氢氧化钠、硼氢化钠和环氧氯丙烷，在20～40℃反应2～6小时后，用水冲洗、抽干；加入0.2～1M的乙二胺溶液，调节pH为9～11，在20～40℃反应6～10小时后，用水冲洗、抽干，得到含有伯氨基的凝胶微球。
或者将亲水性凝胶微球与0.05～0.2M的高碘酸钠溶液混合后，在20～40℃反应1～4小时后，用水冲洗、抽干；加入0.2～1M的乙二胺溶液，调节pH为8～10，在20～40℃反应2～4小时后，加入硼氢化钠继续反应4～8小时，用水冲洗、抽干，得到含有伯氨基的凝胶微球。
步骤S2中：碳酸盐缓冲液为碳酸氢钠缓冲液；具体步骤为将步骤S1中所得产物加入0.1～0.5M的碳酸氢钠缓冲溶液中，调节pH至8～10，加入双缩水甘油醚，在20～40℃反应12～24小时，用水冲洗、抽干。所述双缩水甘油醚为乙二醇双缩水甘油醚、1,4-丁二醇双缩水甘油醚、1，6-己二醇双缩水甘油醚。
步骤S3中：将步骤S2中所得产物加入0.1～0.2M的硼酸缓冲溶液中，调节pH至7～8.5，加入蛋白A，在20～40℃反应12～24小时，用水冲洗、抽干。
步骤S4中：将步骤S3中所得产物加入0.1～1M的封端试剂溶液中，调节pH至8～10，在20～40℃反应6～12小时与残余的环氧基反应封端，用水冲洗、抽干，得到蛋白A免疫吸附材料。所述封端试剂为乙醇胺、巯基乙醇或甘氨酸。
反应方程式如下：
伯氨基凝胶微球的制备：
Figure BDA0001453963810000041
或
Figure BDA0001453963810000042
蛋白A免疫吸附材料的制备：
Figure BDA0001453963810000043
以上反应方程式中，
Figure BDA0001453963810000044
代表亲水性凝胶微球；X代表CH2或者
Figure BDA0001453963810000045
基团；n等于1或2或3；SPA代表蛋白A。
蛋白A是一个分子量约42kD大分子，蛋白A与凝胶微球偶联时，凝胶微球上的反应基团只有充分裸露在外面，蛋白A才能与反应基团无空间障碍地接触从而进行反应。由于凝胶微球上的羟基反应活性较低，双缩水甘油醚直接与羟基反应得到的活化载体上环氧基密度较低(如CN101069751A)。本发明中的双缩水甘油醚没有与凝胶微球上的羟基直接反应，而是先将凝胶微球上羟基转化成反应活性更高的伯氨基后，再与双缩水甘油醚反应，这样的优势有两点：一方面可以在凝胶微球上形成密度更高的环氧基，另一方面可以在凝胶微球和环氧基之间形成12个碳以上的分子间隔臂。这两个优势都可以增加环氧基与蛋白A的反应活性，从而可以制备载量更高的蛋白A免疫吸附材料，提高对免疫球蛋白及其复合物的吸附效率。本发明制备得到的蛋白A免疫吸附材料对抗体的吸附量可达到每毫升填料吸附50～60mg。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明制备得到的环氧基活性载体具有较长的分子间隔臂和较高的环氧基密度，这样使得环氧基与传统的环氧基载体相比较具有更高的反应活性，可以制备得到高载量的蛋白A免疫吸附材料。
2、本发明中制备的蛋白A免疫吸附材料上蛋白A含量可达到10～15mg/g，对抗体的吸附量可达到50～60mg/g，高于传统方法制备得到的蛋白A免疫吸附材料。
以上的优势在临床治疗上表现为提高了临床治疗效果、安全性和可靠性。体外血浆吸附试验数据表明，本发明的蛋白A免疫吸附材料对人体免疫球蛋白特别是IgG具有特异性吸附。
具体实施方式
为了让本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明作进一步阐述。
实施例1
一、含有伯氨基的凝胶微球的制备
取100mL琼脂糖凝胶微球(Sepharose 6FF)，用蒸馏水冲洗干净后，抽干，依次用20％、50％和80％的二甲亚砜冲洗，抽干，加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500mL二甲亚砜，10克氢氧化钠，0.3克硼氢化钠，100mL环氧氯丙烷，置于恒温摇床中，在40℃反应2小时后，依次用80％、50％、20％的二甲亚砜和蒸馏水冲洗，结束反应。用硫代硫酸钠法检测该载体上的环氧基团数量，测得每克载体上有100μmol的环氧基。
将上述产物加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500毫升1M的乙二胺溶液(用盐酸调pH为9)，在40℃反应6小时后，用蒸馏水冲洗、抽干，得到含有伯氨基的凝胶微球，测得每克载体上约有96μmol的伯氨基。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述产物加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500mL 0.1M的碳酸氢钠缓冲溶液中(调节pH为8)，100mL 1,4-丁二醇双缩水甘油醚，在40℃反应12小时，用蒸馏水冲洗、抽干。将产物加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入200mL 0.1M的硼酸缓冲溶液(调节pH为7)，1.6克蛋白A，在20℃反应24小时，通过测量反应前后上清液中蛋白A的浓度，测得偶联在上凝胶微球上的蛋白A为15mg/g。用大量蒸馏水冲洗，抽干，加入200毫升1M的乙醇胺溶液(用盐酸调pH值为8)，置于恒温摇床中，20℃反应12小时封端，最后用大量蒸馏水冲洗，抽干，获得蛋白A免疫吸附材料。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
采集上述蛋白A免疫吸附材料1毫升，加入健康人血浆10mL，在37℃振荡2小时进行吸附。将该混悬液用大量生理盐水冲洗，除去血浆，然后用50毫升0.1mol/L的柠檬酸溶液(pH＝2.5)洗脱吸附在材料上的IgG抗体，在280nm测试洗脱液的吸光度A。
作为对照试验，将1毫升琼脂糖凝胶代替蛋白A免疫吸附材料，与上述方法同法处理。
通过下式计算蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量。
Figure BDA0001453963810000061
A：吸附试验中洗脱液在280nm的吸光度
A0：对照试验中洗脱液在280nm的吸光度
计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为60mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
将上述蛋白A免疫吸附材料30毫升，放入烧杯中分别用0.1mol/L的氢氧化钠浸泡4小时，然后用无菌无内毒素的生理盐水浸泡2小时后，装于一根φ26×50mm的吸附柱(已高温蒸汽灭菌)中，用大量无菌无内毒素的生理盐水充分冲洗柱子(以上操作均在超净工作台进行)。以动物实验狗(体重约为10kg)为试验对象，将狗麻醉后，建立体外循环。从狗的股动脉中以60ml/min的速度引出血液，经过血浆分离器分离出血浆，经另一个泵驱动以25ml/min的速度进入吸附柱进行IgG吸附，经过吸附柱的血浆与血细胞混合一同泵入狗的股动脉中。吸附1小时后，完成吸附试验。试验动物狗在免疫吸附后当天恢复正常生理活动，试验后一周未发现异常症状。
分别抽取试验前和试验后狗的血浆进行IgG浓度的测试，计算IgG的下降率。IgG下降率按照以下公式计算：
下降率＝(Cb-Ca)/Cb×100％
Cb为试验前狗的IgG浓度
Ca为试验后狗的IgG浓度
计算结果表示，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为50％。
实施例2
一、含有伯氨基的凝胶微球的制备
取100mL琼脂糖凝胶微球(Sepharose 4FF)，用蒸馏水冲洗干净后，抽干，加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500mL 0.2M的高碘酸钠溶液，在40℃反应1小时后，用大量蒸馏水冲洗，结束反应。通过反应前后高碘酸钠的浓度，测得每克载体上有110μmol的醛基。
将上述产物加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500毫升0.2M的乙二胺溶液(用盐酸调pH为8)，在20℃反应4小时后，加入1克硼氢化钠继续反应4小时，用蒸馏水冲洗、抽干，得到含有伯氨基的凝胶，测得每克载体上约有110μmol的伯氨基。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述产物加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500mL 0.5M的碳酸氢钠缓冲溶液中(调节pH为10)，100mL乙二醇双缩水甘油醚，在20℃反应24小时，用蒸馏水冲洗、抽干。将产物加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入200mL 0.2M的硼酸缓冲溶液(调节pH为8.5)，1.1克蛋白A，在40℃反应12小时，通过测量反应前后上清液中蛋白A的浓度，测得偶联在上凝胶微球上的蛋白A为10mg/g。用大量蒸馏水冲洗，抽干，加入200毫升0.1mol/L的巯基乙醇溶液(用碳酸钠调pH值为8)，置于恒温摇床中，40℃反应6小时封端，最后用大量蒸馏水冲洗，抽干，获得蛋白A免疫吸附材料。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
测试方法如实施例1，计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为52mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
测试方法如实施例1，计算结果表明，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为45％。
实施例3
一、含有伯氨基的凝胶微球的制备
取100mL纤维素微球(MT500，80-100μm)，用蒸馏水冲洗干净后，抽干，依次用20％、50％和80％的二甲亚砜冲洗，抽干，加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500mL二甲亚砜，10克氢氧化钠，0.3克硼氢化钠，100mL环氧氯丙烷，置于恒温摇床中，在20℃反应6小时后，依次用80％、50％、20％二甲亚砜、大量蒸馏水冲洗，结束反应。用硫代硫酸钠法检测该载体上的环氧基团数量，测得每克载体上有80μmol的环氧基。
将上述产物加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500毫升0.2M的乙二胺溶液(用盐酸调pH为11)，在20℃反应10小时，用蒸馏水冲洗、抽干，得到含有伯氨基的凝胶微球，测得每克载体上约有78μmol的伯氨基。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述产物加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500mL 0.1M的碳酸氢钠缓冲溶液中(调节pH为9)，100mL 1,6-己二醇双缩水甘油醚，在30℃反应12小时，用蒸馏水冲洗、抽干。将产物加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入200mL 0.1M的硼酸缓冲溶液(调节pH为7)，1.1克蛋白A，在20℃反应24小时，通过测量反应前后上清液中蛋白A的浓度，测得偶联在上凝胶微球上的蛋白A为10mg/g。用大量蒸馏水冲洗，抽干，加入200毫升1mol/L的甘氨酸溶液(用碳酸钠调pH值为10)，置于恒温摇床中，25℃反应10小时封端，最后用大量蒸馏水冲洗，抽干，获得蛋白A免疫吸附材料。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
测试方法如实施例1，计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为50mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
测试方法如实施例1，计算结果表明，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为43％。
实施例4
一、含有伯氨基的凝胶微球的制备
取100mL纤维素微球(MT500，80-100μm)，用蒸馏水冲洗干净后，抽干，加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500mL 0.05M的高碘酸钠溶液，在20℃反应4小时后，用大量蒸馏水冲洗，结束反应。通过反应前后高碘酸钠的浓度，测得每克载体上有90μmol的醛基。
将上述产物加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500毫升1M的乙二胺溶液(用盐酸调pH为10)，在40℃反应2小时后，加入1克硼氢化钠继续反应8小时，用蒸馏水冲洗、抽干，得到含有伯氨基的凝胶微球，测得每克载体上约有90μmol的伯氨基。
二、蛋白A免疫吸附材料的制备
将上述产物加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入500mL 0.1M的碳酸氢钠缓冲溶液中(调节pH为9)，100mL 1,4-丁二醇双缩水甘油醚，在30℃反应12小时，用蒸馏水冲洗、抽干。将产物加入到1000mL的圆底烧瓶中，加入200mL 0.1M的硼酸缓冲溶液(调节pH为7)，1.6克蛋白A，在20℃反应24小时，通过测量反应前后上清液中蛋白A的浓度，测得偶联在上凝胶微球上的蛋白A为15mg/g。用大量蒸馏水冲洗，抽干，加入200毫升1mol/L的乙醇胺溶液(用盐酸调pH值为10)，置于恒温摇床中，25℃反应10小时封端，最后用大量蒸馏水冲洗，抽干，获得蛋白A免疫吸附材料。
三、蛋白A免疫吸附材料的IgG吸附能力评价
测试方法如实施例1，计算结果表明，蛋白A免疫吸附材料对IgG抗体的吸附量为56mg/g填料。
四、体外循环柱一次灌流的动物试验
测试方法如实施例1，计算结果表明，动物试验狗经过体外循环吸附试验后，体内IgG抗体下降率为46％。
上述实施例仅为本发明的其中具体实现方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种蛋白A免疫吸附材料的制备方法，其特征在于，
所述蛋白A免疫吸附材料具有如下化学结构：
Figure 848965DEST_PATH_IMAGE002
其中，
Figure 31685DEST_PATH_IMAGE004
为亲水性凝胶微球；X为CH2或者
Figure 467214DEST_PATH_IMAGE006
基团；n为1或2或3；SPA为蛋白A；
所述制备方法包括如下步骤：
S1：在亲水性凝胶微球上形成伯氨基；
S2：将步骤S1所得的产物置于碳酸盐缓冲溶液中，加入双缩水甘油醚，反应结束后获得活性载体；
S3：将步骤S2所得的活性载体置于硼酸缓冲溶液中，加入蛋白A反应；
S4：用封端试剂与步骤S3所得产物的残余的环氧基反应封端，得到蛋白A免疫吸附材料；
步骤S1中：将亲水性凝胶微球置于二甲亚砜中混合后，加入氢氧化钠、硼氢化钠和环氧氯丙烷，在20～40℃反应2～6小时后，用水冲洗、抽干，加入0.2～1M的乙二胺溶液，调节pH为9～11，在20～40℃反应6～10小时后，用水冲洗、抽干，得到含有伯氨基的凝胶微球；或者，将亲水性凝胶微球与0.05～0.2M的高碘酸钠溶液混合后，在20～40℃反应1～4小时后，用水冲洗、抽干，加入0.2～1M的乙二胺溶液，调节pH为8～10，在20～40℃反应2～4小时后，加入硼氢化钠继续反应4～8小时，用水冲洗、抽干，得到含有伯氨基的凝胶微球；
步骤S2中：碳酸盐缓冲液为碳酸氢钠缓冲液，将步骤S1中所得产物加入0.1～0.5M的碳酸氢钠缓冲液中，调节pH至8～10，加入双缩水甘油醚，在20～40℃反应12～24小时，用水冲洗、抽干；
步骤S3中：将步骤S2中所得产物加入0.1～0.2M的硼酸缓冲溶液中，调节pH至7～8.5，加入蛋白A，在20～40℃反应12～24小时，用水冲洗、抽干；
步骤S4中：将步骤S3中所得产物加入0.1～1M的封端试剂溶液中，调节pH至8～10，在20～40℃反应6～12小时与残余的环氧基反应封端，用水冲洗、抽干，得到蛋白A免疫吸附材料。
2.根据权利要求1所述的蛋白A免疫吸附材料的制备方法，其特征在于，所述双缩水甘油醚为乙二醇双缩水甘油醚、1,4-丁二醇双缩水甘油醚、1,6-己二醇双缩水甘油醚。
3.根据权利要求1所述的蛋白A免疫吸附材料的制备方法，其特征在于，步骤S4中的封端试剂为乙醇胺、巯基乙醇或甘氨酸。
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